PHÂN lập và xác ĐỊNH đặc điểm SINH hóa của VI KHUẨN PHÂN lập từ cá rô ĐỒNG (anabas testudineus)

TÓM TẮT Đề tài “Phân lập và xác định đặc điểm sinh học bệnh của vi khuẩn phân lập từ cá rô đồng Anabas testudineus” được thực hiện nhằm tìm hiểu một số đặc điểm sinh lý, sinh hóa, kiểu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THỊ HƯƠNG THẢO

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA

VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ RÔ ĐỒNG (Anabas

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THỦY SẢN

NGUYỄN THỊ HƯƠNG THẢO

PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA

VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ RÔ ĐỒNG (Anabas

LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thủy Sản đặc biệt là các thầy cô thuộc bộ môn Sinh học và Bệnh học Thủy sản đã truyền đạt những kiến thức, những kinh nghiệm quý báo trong suốt quá trình em học tập và nghiên cứu tại trường

Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc cô Đặng Thị Hoàng Oanh, đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kiến thức cho em trong quá trình làm đề tài tốt nghiệp

Chân thành cám ơn chị Trương Quỳnh Như và các anh, chị trong bộ môn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn Nguyễn Thị Thu Hằng cùng các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K34 đã động viên và hỗ trợ em trong thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp

i

TÓM TẮT

Đề tài “Phân lập và xác định đặc điểm sinh học bệnh của vi khuẩn phân lập từ

cá rô đồng (Anabas testudineus)” được thực hiện nhằm tìm hiểu một số đặc

điểm sinh lý, sinh hóa, kiểu huyết thanh và xác định khả năng gây bệnh của vi

khuẩn phân lập từ cá rô đồng

Vi khuẩn được phục hồi từ tủ âm 80o có 6 chủng (cá1 não1, cá1 não2, cá1 não3, cá2 não, cá3 não, cá4 não) Qua kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản như nhuộm gram, tính di động, oxydase, catalase, tiến hành định danh theo phương pháp truyền thống và kit API 20 Strep được cả 5/6 chủng là

Streptococcus agalactiae Tuy nhiên kết quả kiểm tra API lại sai khác đối với

một số chỉ tiêu (GLYG, RIB)

Kháng sinh đồ được thực hiện trên cả 6 chủng Streptococcus agalactiae với 12 loại thuốc kháng sinh Kết quả chỉ có kháng sinh

Cefazoline, Florfernicol, Neomycine thể hiện tính nhạy Các loại kháng sinh còn lại thể hiện tính nhạy trung bình hoặc kháng với các chủng vi khuẩn trên Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn với các kháng sinh Cefalecin, Enrofloxacin, Trimethoprim/Sulfamethoxazol Kết quả chỉ có Cefalecin, Enrofloxacin là còn nhạy, nhưng giá trị MIC vẫn còn ở mức cao Vi khuẩn thể hiện tính kháng với kháng sinh Trimethoprim/Sulfamethoxazol

ii

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm tạ i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh sách hình v

Danh sách bảng vi

Phần 1 : Giới thiệu 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu 2

1.3 Nội dung 2

Phần 2 : Tổng quan tài liệu 3

2.1 Tổng quan về cá rô đồng và tình hình nuôi cá rô đồng ở ĐBSCL 3

2.2 Tình hình dịch bệnh trên cá rô đồng 4

2.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae 5

2.4 Phản ứng kháng nguyên- kháng thể 7

2.5 Các nhóm thuốc kháng sinh thường dùng trong NTTS 7

Phần 3 : Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 10

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 10

3.2 Vật liệu nghiên cứu 10

3.3 Phương pháp nghiên cứu 10

Chương 4 : Kết quả và thảo luận 21

4.1 Kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống 21

4.2 Kết quả định danh bằng bộ kit API20 Strep 22

4.3 Kết quả ngưng kết miễn dịch 23

4.4 Kết quả kháng sinh đồ 23

4.5 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 25

4.6 Kết quả thí nghiệm gây cảm nhiễm 27

iii

Phần 5 : Kết luận và đề xuất 30

5.1 Kết luận 30

5.2 Đề xuất 30

Tài liệu tham khảo 31

Phụ lục .33

iv

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Cá rô .3

Hình 4.1 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae được phục hồi trên BHIA 21

Hình 4.2 Nhuộm Gram vi khuẩn có dạng hình cầu và không gây tan huyết21 Hình 4.3 Kết quả API20 Strep 22

Hình 4.3 Kết quả ngưng kết miễn dịch dương tính .23

Hình 4.4 Giá trị MIC đối với cefazoline 26

Hình 4.5 Sự kháng thuốc của vi khuẩn với Trimethoprim/Sulfamethoxazol 27

Hình 4.6 Gốc vây ngực bị xuất huyết 27

Hình 4.7 Xoang bụng chứa dịch đỏ 27

Hình 4.8 Kính phết mẫu thận cá rô bệnh do gây cảm nhiễm 28

Hình 4.9 Biểu đồ tỷ lệ cá chết tích lũy (%) theo ngày cảm nhiễm .28

Hình 4.10 Vi khuẩn phân lập từ cá gây cảm nhiễm 39

v

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ 15

Bảng 3.2 Thao tác pha loãng thuốc kháng sinh .17

Bảng 3.3 Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau 18

Bảng 4.1 Độ nhạy của vi khuẩn với thuốc kháng sinh 24

Bảng 4.2 Kết quả MIC 25

Bảng 4.3 Số cá chết ở mỗi bể 28

Bảng 5 Kết quả định danh vi khuẩn Streptococcus agalactiae bằng phương pháp sinh lý, sinh hóa truyền thống 36

Bảng 6 Kết quả định danh bằng bộ kíp AIP20 Strep 37

Bảng 7 Kết quả kháng sinh đồ 38

Bảng 8 Giá trị MIC của các chủng vi khuẩn 38

Bảng 9 Cách đọc kết quả định danh bằng bộ kíp AIP20 Strep 39

Bảng 10 Kết quả nhuộm Gram của vi khuẩn phân lập từ cá bệnh 40

vi

1

PHẦN 1 GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu

Trong các nước xuất khẩu thủy sản trên thế giới, Việt Nam được coi là một trong những nước có tốc độ tăng trưởng thủy sản nhanh nhất, với tốc độ tăng trưởng trung bình trong giai đoạn1998-2008 đạt 18%/năm Mặt hàng thủy sản của Việt Nam cũng đã và đang có mặt ở nhiều quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới

Đóng góp quan trọng này không thể không kể đến Đồng Bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) một nơi được thiên nhiên ưu ái cho phát triển thủy sản đặc biệt là thủy sản nước ngọt ĐBSCL có bờ biển dài trên 700 km với diện tích khoảng 360.000km 2 hệ thống sông ngòi chằn chịt, hàng năm bị ngập lũ gần 50% diện tích từ 3 - 4 tháng tạo nên những điều kiện thuận lợi cho việc đánh bắt, nuôi trồng thủy sản

Việc ứng dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật, thâm canh hóa, đa dạng các đối tượng nuôi đã góp phần nâng cao hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản Bên cạnh các đối tượng chủ lực như cá tra, cá basa, cá điêu hồng… một số đối tượng mới

đã được người dân đưa vào mô hình ao nuôi và thâm canh hóa như cá lóc, sặc rằn, rô đồng, lươn…được nuôi ngày càng phổ biến góp phần tăng thu nhập cho người nuôi Tuy nhiên việc mở rộng diện tích nuôi cũng như việc đa dạng đối tượng nuôi và thâm canh hóa đối tượng nuôi đã phát sinh nhiều vấn đề quan tâm như: môi trường, con giống, thức ăn, quản lý ao nuôi và dịch bệnh

Cá rô đồng (Anabas testudineus) là loài cá bản địa vùng ĐBSCL và có tiềm

năng lớn, thịt cá thơm ngon, có giá trị và được mọi người ưa chuộng Chúng được nuôi nhiều ở các nước như Thái Lan, Lào, Campuchia Ở nước ta, cá rô đồng được nuôi chủ yếu ở các tỉnh ĐBSCL như An Giang, Đồng Tháp, Sóc

Trăng (Phuong et al., 2002; Hien et al., 2003; Trieu và Long, 2001) Do chủ

động được con giống, thức ăn và nước cấp nên mô hình nuôi cá rô đồng ngày được thâm canh hóa mang lại lợi nhuận cao

Bên cạnh việc nuôi thâm canh hóa với mật độ cao thì vấn đề quản lý chất lượng nước ao nuôi, quản lý dịch bệnh là rất khó khăn nên bệnh xuất hiện trong quá trình nuôi là không thể tránh khỏi Tuy nhiên, hiện nay thông tin về bệnh ở cá

rô đồng còn rất hạn chế và nhất là các nghiên cứu bài bản về bệnh ở đối tượng nuôi này còn rất hiếm Vì vậy, việc xác định tác nhân gây bệnh để tìm ra phương pháp trị bệnh phù hợp nhằm giảm bớt thiệt hại khi mầm bệnh tái xuất hiện trong quá trình nuôi là cần thiết Do đó đề tài “Phân lập và xác định đặc

1.3 Nội dung đề tài

Phục hồi và định danh vi khuẩn bằng phương pháp truyền thống và kit API 20 Strep

Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với 6 chủng vi khuẩn

Bố trí thí nghiệm để tiềm hiểu khả năng gây bệnh của vi khuẩn phân lập từ cá

rô đồng

3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cá rô đồng và tình hình nuôi cá rô đồng ở ĐBSCL

Sơ lược đặc điểm sinh học của cá rô đồng (Theo Bloch, 1972 Fishbase, 2010)

Cá rô đồng (Anabas testudineus) thuộc:

Ngành có dây sống: Chordata Lớp cá xương: Actinopterygii

Cá rô đồng là loài có phân bố rộng, chúng có thể sống ở các thủy vực nước ngọt và nước lợ Chúng phân bố nhiều ở các quốc gia trên thế giới như Ấn Độ, Philippin, Thái Lan, Lào, Campuchia, Trung Quốc, Việt Nam…và nhiều quốc gia Châu Á khác

Cá rô đồng sống chủ yếu ở kênh, rạch, ao, hồ, đầm lầy và cửa sông Chúng cũng có thể được tìm thấy ở các con sông lớn, những nơi ngập lụt và nơi tù đọng Do cá có cơ quan hô hấp khí trời nên có thể chịu đựng được các điều kiện bất lợi của môi trường như thiếu oxy, những ao tù đọng Cá rô đồng có thể vùi mình dưới bùn vào mùa khô để chờ những cơn mưa xuống, chúng cũng có thể di chuyển trên cạn bằng hai nắp mang để tìm nơi cư trú thích hợp (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993; Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hổ, 2003; Fishbase, 2010)

Hình 1 Cá rô đồng

4

Ngoài tự nhiên cá rô đồng ăn mùn bã hữu cơ, các phiêu sinh vật, cá, tôm nhỏ (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993; Fishbase, 2010) Mùa vụ sinh sản của cá từ tháng 4-10, đẻ tập trung vào đầu mùa mưa, tháng 6-7 (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hổ, 2003) Sau 5-6 tháng tuổi thì cá bắt đầu bắt cặp sinh sản

Cá được nuôi dưới nhiều hình thức từ nuôi trong ao, trong ruộng lúa, nuôi ghép với nhiều loại cá khác và đang là một trong những đối tượng giúp người dân thoát nghèo Do việc nuôi cá rô đồng mang lại năng suất và lợi nhuận cao trong những năm gần đây nên một số tỉnh đã đầu tư để phát triển loài thủy sản này

Cá rô đồng được nuôi với mật độ 50-60 con/m2 (Dương Nhựt Long và ctv., 2003) Các nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh sản, sinh trưởng trên cá rô đồng khá nhiều nhưng những nghiên cứu về bệnh trên cá rô đồng để giúp người nuôi khắc phục trong quá trình nuôi chưa nhiều

2.2 Tình hình dịch bệnh trên cà rô đồng

Cá rô đồng dễ nuôi, có giá trị thương phẩm cao, do đó mật độ nuôi đã được tăng tối đa nhằm tăng năng suất và lợi nhuận cho vụ nuôi Cá rô đồng cũng như các loại cá khác, khi sống trong điều kiện môi trường xấu đến các chức năng sinh lý, hoạt động của các cơ quan, tổ chức trong cơ thể sẽ bị ảnh hưởng

Một số nghiên cứu cho thấy độc tố nước thải có thể làm phá hoại tổ chức mang

của cá rô đồng (Narian et al., 1990)

Một thí nghiệm cảm nhiễm 3 giống nấm Achlya, Aphanomyces và Saprolegnia

phân lập từ 21 loài cá lên cá rô đồng, trong vòng 3-7 ngày kể từ thời điểm cảm nhiễm các sợi nấm phát triển nhanh chóng tại các vết thương và làm cá chết trong vòng 5-10 ngày (Srivastava, 1980)

Bệnh nấm nhớt xảy ra trên cá rô đồng thương phẩm sau 3 tháng nuôi đã được báo cáo xuất hiện ở 2 tỉnh Cần Thơ và Hậu Giang (Trần Ngọc Tuấn, 2010) Bệnh nấm nhớt xuất hiện cùng với sự giảm sút của chất lượng nước ao nuôi vào các tháng cuối vụ, làm giảm giá trị thương phẩm của cá và làm giảm năng suất cũng như ảnh hưởng đến kinh tế của người nuôi

Bên cạnh đó, vi khuẩn cũng là một tác nhân gây thiệt hại nghiêm trọng trên cá

rô đồng Pal và Pradhan (1990), đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn, 2 chủng

thuộc giống Pseudomonas với các chỉ tiêu hóa, lý gần với P fluorescens và P aeruginosa, một chủng Aeromonas hyrophila anaerogens (biotype II) và chủng Micrococcus variance trên 129 mẫu cá rô đồng có dấu hiệu lâm sàng với các đóm đỏ trên cơ thể và vết loét trên da Đến năm 2005, vi khuẩn A aeruginosa

cũng đã được phân lập từ ruột cá rô đồng bị bệnh với các biểu hiện lâm sang

những tổn thương ở da, cơ (Das et al., 2006)

5

Đặc biệt các nghiên cứu gần đây đã chứng minh sự hiện diện của vi khuẩn

Edwardsiella tarda trên loài cá này cùng với sự suy giảm chất lượng nước, hàm

lượng chất hữu cơ cao, nhiệt độ môi trường thay đổi làm cá bị stress, nuôi với mật độ cao (Mohanty và Shoo, 2007) Một số thí nghiệm cảm nhiễm trước đó

cũng đã chứng minh khả năng gây bệnh của E tarda trên cá rô đồng, kết quả

gây cảm nhiễm ở nhiệt độ nước 20-22oC cho thấy cá mẫn cảm với mầm bệnh

E tarda ở mật độ 107 và 108 tế bào, cá bệnh có biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ, bụng cá trương to có màu vàng ánh đến hơi đỏ, xuất huyết bề mặt cơ thể và các vây Cá chết 100% ở mật độ 109 tế bào trong vòng 3 ngày (Sahoo et al., 2000)

Một loài vi khuẩn gram âm khác cũng đã được công bố là gây bệnh trên cá rô

đồng Vi khuẩn Flavobacterium columnare hình que, di động trượt đã được phân lập trên cá rô đồng (Sarker et al., 2002; Dash et al, 2009) Kết quả cảm

nhiễm cho thấy ở mật độ 107 và 108 CFU/ml, cá mẫn cảm nhanh với mầm bệnh

và chết 50-100% trong vòng 7 ngày, riêng ở mật độ F columnare 106 CFU/ml, sau 7 ngày cá chết 10-30% Các điều kiện bất lợi như thiếu thức ăn cùng với độc lực của vi khuẩn gây bệnh đủ mạnh thì bệnh sẽ xảy ra với tốc độ nhanh và

các tổn thương khá đặc trưng (Sarker et al., 2002; Sahoo et al., 2010)

2.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus

2.3.1 Dấu hiệu bệnh lý

Cá bệnh có một số biểu hiện bên ngoài là cơ thể sậm màu, một bên hoặc hai bên mắt bị lồi và đục, xuất huyết ở các vây và xương nắp mang Cá bị bệnh vận động khó khăn, bơi không có định hướng, não, thận và tỳ tạng là những cơ quan bị làm tổn thương nhiều nhất và đây là lý do gây chết cá Cá bệnh cấp tính

sẽ chết nhanh với tỉ lệ chết cao Tuy nhiên, cá có thể bị bệnh mãn tính, chỉ có một vài nốt xuất huyết trên thân mà không có hiện tượng thương tổn nội tạng (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011)

2.3.2 Tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh là vi khuẩn thuộc giống Streptococcus Đây là nhóm khuẩn

hình cầu hoặc ovan, kích thước khá nhỏ, bắt màu gram dương, không di động,

lên men trong môi trường glucose Streptococcus sinh trưởng tốt trong môi

trường Trypyicase Soy Agar (TSA) có thêm 5% glucose, môi tường BHIA (Brain Heart Ifnusion Agar), môi trường THBA (Todd Hewitt Broth Agar), môi trường thạch máu ngựa (Horse Bood Agar) Nuôi cấy ở 20-30oC, sau 24-48 giờ hình thành khuẩn lạc nhỏ đường kính 0.5-1.0mm, màu hơi vàng, hình tròn hơi

lồi Các tế bào vi khuẩn Streptococcus thường ghép với nhau thành chuỗi dài,

nên được gọi là liên cầu khuẩn (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004)

6

2.3.3 Phân bố và lan truyền bệnh

Bệnh có thể xảy ra ở một số loài cá nước ngọt như: cá basa (Pangasius bocourti), cá rô phi (Oreochrromis niloticus), cá chép (Cyprinus carpio) và một

số loài cá biển như cá chẽm (Lates calcarifer) Bệnh Streptococcus thường

Theo Robinson và Meyer (1966) bệnh có thể lây nhiễm trực tiếp bằng cách gây cảm nhiễm khi ngâm cá vào bể kính với mật độ vi khuẩn 106CFU/ml trong 10 phút (trích dẫn Inglis, 1993)

Trần Thị Viên (2007) nghiên cứu một số bệnh trên cá rô phi (Oreochromis sp)

Thí nghiệm được thực hiện qua các bước như: thu thập thông tin, tiếp theo là thu và bảo quản mẫu, phân tích và định danh mầm bệnh, kiểm tra kháng sinh

đồ và viết báo cáo Kết quả tìm thấy chủ yếu là Trichodina và Gyrodactylus Bên cạnh đó kết quả phân tích vi sinh đã định danh được bốn loài vi khuẩn S iniae, S agalactiae, Vibrio proteolyticus, V cholerae và 1 giống Staphylococcus sp Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ cho thấy các loài vi khuẩn

này nhạy với doxycyline và ofloxacin, nhưng kháng lại với trimethoprim

sulfamethoxazole-Đặng Thụy Mai Thy và sulfamethoxazole-Đặng Thị Hoàng Oanh (2010) nghiên cứu đặc điểm mô

học ở cá điêu hồng nhiễm vi khuẩn S agalactiae trong điều kiện thí nghiệm Thí nghiệm được thực hiện với chủng vi khuẩn S agalactiae S09-01 phân lập

từ cá điêu hồng, gây cảm nhiễm trên cá khỏe với mật độ 4.23x101 – 4.23x106CFU/ml Mẫu thu vào ngày thứ 1, 3, 5, 10, 14 sau khi gây cảm nhiễm Kết quả kính phết mẫu tươi mô gan thận và tỳ tạng tất cả các mẫu đều phát hiện vi khuẩn hình oval hoặc hình cầu, kích thước khá nhỏ, gram (+) không có sự biến đổi mô da, cơ của các mẫu cá thu Mô thận và tỳ tạng ở cá nhiễm mật độ 4.23x

104 - 4.23x 106 CFU/ml bị thay đổi vào ngày thứ 3, biến đổi nặng vào ngày thứ

5 và bị phá hủy vào ngày thứ 10 Mô gan biến đổi chậm bắt đầu bị biến đổi vào ngày thứ 5 ở mật độ 4.23x 105 - 4.23x 106 CFU/ml, cấu trúc mang ít bị biến đổi

Vì kháng thể không nhìn thấy bằng mắt thường nên kháng thể chỉ có thể được xác định khi chúng gắn với kháng nguyên đặc hiệu Phản ứng kháng nguyên-kháng thể có thể được xác định thông qua sự ngưng kết, sự cố định bổ thể, sự phát quỳnh quang, hoạt tính enzyme hay gắn với đồng vị phóng xạ

Cơ chế phản ứng kết hợp kháng nguyên- kháng thể : Khi kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể đặc hiệu tương ứng thì phản ứng kết hợp kháng nguyên- kháng thể sẽ xảy ra, có thể thấy được bằng mắt thường dưới hình thức lên bông, kết tủa hay ngưng kết Sự kết hợp này dù không phải là liên kết đồng hóa nhưng lại có nhiều lực tác dụng vì thế chúng cũng trở nên khá mạnh Sự kết hợp có sự tác động của các lực: lực tĩnh điện, lực của cầu nối hydro, lực Vander walls, lực liên kết kỵ nước

Ngưng kết miễn dịch là hiện tượng kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau để hình thành đám ngưng kết đủ to để mắt thường nhìn thấy được Sự hình thành một mạng lưới giữa kháng nguyên và kháng thể chỉ có thể xuất hiện với các kháng thể có ít nhất 2 hóa trị Phản ứng ngưng kết miễn dịch đòi hỏi kháng nguyên hữu hình Đó là kháng nguyên có kích thước lớn như: hồng cầu,

và tế bào vi sinh vật Kháng nguyên hữu hình có epitop bề mặt có thể kết chéo với các kháng thể tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy được bằng mắt thường Kháng thể trong phản ứng này gọi là kháng thể gây ngưng kết Phản ứng ngưng kết nhạy hơn phản ứng kết tủa nên được dùng để định tính và bán định lượng kháng thể trong huyết thanh Có hai loại ngưng kết miễn dich là ngưng kết chủ động và ngưng kết thụ động

2.5 Các nhóm thuốc kháng sinh thường dùng trong nuôi trồng thủy sản Nhóm Tetracylin

Là nhóm kháng sinh có tác dụng kiềm khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao, có tác dụng đối với vi khuẩn gram (-) và (+) (Bùi Thị Tho, 2003) Nhóm này được chia làm 2 thế hệ Thế hệ I bao gồm các loại kháng sinh như: tetracylin, chlotetracylin và oxytetracylin Đây là những loại thuốc có thời gian

8

tác động ngắn và trung bình Thế hệ II bao gồm các chất bán dược tổng hợp gần đây có thời gian tác động dài như: doxycyclin, minocyclin (Poole, 2004) Trong đó, tetracylin được dùng để điều trị nhiễm khuẩn toàn thân và nhiễm trùng ruột Độc tính của tetracylin là có thể gây xáo trộn tiêu hóa, xáo trộn chức năng gan, thận… Khi điều trị bệnh không nên kết hợp với các loại kháng sinh ampicillin, colistin…vì nó sẽ làm giảm tác dụng điều trị và gây ra hiện tượng kháng thuốc (Bùi Kim Tùng, 2001)

Nhóm Sulfonamid

Thuốc có phổ kháng khuẩn rộng, bao gồm nhiều vi khuẩn Gram âm và Gram dương Tuy nhiên sự đề kháng của vi khuẩn với thuốc nhanh Đại diện cho nhóm này là: sulfadiazine, sulfadimidine, sulfamethoxazone Sulphamid với liều kiềm khuẩn sẽ ức chế sự sinh sản phát triển của vi khuẩn do thuốc cạnh tranh với acid para amonozenzoic một yếu tố sinh trưởng của mọi loài tế bào trong đó có tế bào vi khuẩn (Bùi Thị Tho, 2003)

Nhóm Quinolone

Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn, chúng có tác dụng ức chế tổng hợp ADN Các thuốc thuộc nhóm này được phát triển qua 2 thế hệ với phổ kháng sinh và cơ chế kháng khuẩn khác nhau Thế hệ I có phổ kháng khuẩn hẹp, tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn Gram âm Thế hệ II có phổ kháng khuẩn vừa nhanh, vừa mạnh, tác dụng trên cả Gram âm và Gram dương Đại diện cho nhóm này là: enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin , ciprofloxacin, oxolinic acid… (Bùi Thị Tho, 2003) Trong nuôi trồng thủy sản các kháng sinh thuộc nhóm quinolone được sử dụng khá phổ biến trong điều trị

bệnh mủ gan do vi khuẩn E ictaluri như: enrofloxacin, norfloxacin rất có hiệu

quả (Từ Thanh Dung và ctv., 2005)

Nhóm Phenicol

Đây là nhóm kháng sinh có tác dụng kìm khuẩn nhưng cũng có tác dụng diệt khuẩn trong một số trường hợp bệnh truyền nhiễm với những điều kiện nhất định và nồng độ cao hơn Thuốc có tác dụng ức chế vi khuẩn với nồng độ thấp, hoạt phổ của nó rất rộng, tác dụng trên nhiều loài vi khuẩn Gram âm và Gram dương (Bùi Thị Tho, 2003)

Nhóm Beta-Lactamin

Là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn tương đối rộng, đại diện thông dụng

là ampicilin, amoxicilin Nhóm có tính diệt khuẩn bằng cách ức chế giai đoạn

10

Phần 3:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian thực hiện đề tài : từ tháng 02/2012 đến tháng 05/2012

- Địa điểm nghiên cứu : phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản, Khoa Thủy Sản, Đại học Cần Thơ

3.2 Vật liệu nghiên cứu

- Nguồn vi khuẩn : được phục hồi từ tủ - 80oC từ bộ sưu tập vi khuẩn thuộc bộ môn Sinh Học và Bệnh Thủy Sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại học Cần Thơ Vi khuẩn được phục hồi trên môi trường BHIA, ủ trong tủ ấm ở 30oC Sau 24 – 48 giờ, quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, kiểm tra tính thuần

- Thiết bị : tủ cấy vô trùng, nồi Autoclave, kính hiển vi, cân điện tử, bếp nhiệt, máy li tâm, máy vortex , tủ lạnh, tủ ấm…

- Môi trường : Brain heart ifusion agar, Brain heart ifusion broth

- Hóa chất: cồn, nước cất, ethanol, NaCl, paraffin, hóa chất nhuộm Gram, hóa chất dùng để test các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa, định danh vi khuẩn, kíp API20 Strep…

- Kháng sinh

- Gồm các loại kháng sinh: cefazoline, Neomycine, Ciprofloxacine, flofenicol, Gentamycine, Ampiciline, Norfloxacine, tetracyline, trimethoprim /sufamethoxazole, enrofloxacine , docyxiline, Amoxiciline

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Nguồn vi khuẩn được phục hồi từ tủ - 80oC gồm 6 chủng vi khuẩn: Cá1 Não1,

Cá1 Não2, Cá1 Não3, Cá2 Não, Cá3 Não và Cá4 Não

Nhuộm Gram: Nhỏ một giọt nước cất hoặc nước muối sinh lý 0,85% đã được

tiệt trùng lên lame, dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn trải đều lên giọt nước Để mẫu khô tự nhiên, sau đó hơ lướt lame mẫu trên ngọn lửa đèn cồn để

cố định mẫu Tiến hành nhuộm qua các bước :

1 Nhỏ dung dịch Crytal violet (dung dịch I) lên lame Để yên 1 phút Rửa lại bằng nước cất cho vết hết màu tím, vẩy cho ráo nước

4 Nhỏ dung dịch Safranin (dung dịch IV) lên lame Để yên 2 phút Sau đó rửa lại bằng nước cất và để mẫu khô ở nhiệt độ phòng

5 Đọc kết quả : tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi 100X có giọt dầu

 Vi khuẩn bắt màu xanh hoặc tím : Gram dương

 Vi khuẩn bắt màu hồng hoặc đỏ : Gram âm

Quan sát tính di động: Nhiều loại vi khuẩn có khả năng di động nhờ vào tiêm

mao Sự di động này có thể quan sát bằng phương pháp giọt ép Nhỏ một ít nước cất hoặc nước muối sinh lý 0,85% đã được tiệt trùng lên lame, dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn trải đều lên giọt nước Đậy lamenla lại và quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X có giọt dầu

Phản ứng Oxydase: Dùng que cấy tiệt trùng phết một ít vi khuẩn lên giấy tẩm

cytochrome oxydase Quan sát mẫu trong 30 giây Kết quả: vi khuẩn cho phản ứng oxydase (+) sẽ làm giấy tẩm cytochrome oxydase chuyển sang màu tím đậm (so màu theo hướng dẫn của nhà sản xuất) và ngược lại

Phản ứng Catalase: Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn để lên lame

rồi nhỏ một giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame Kết quả: vi khuẩn cho phản ứng catalase (+) sẽ gây ra hiện tượng sủi bọt trong dung dịch 3% H2O2 và ngược lại

Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (OF test): Chuẩn bị 2 ống

nghiệm chứa môi trường OF đã tiệt trùng Dùng que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn cấy thẳng đứng từ trên xuống đáy của 2 ống nghiệm Cho khoảng 0,5 – 1,0 ml dầu parafffin Tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí (F) Ống còn lại không phủ paraffin Để trong tủ ấm ở nhiệt độ 28 – 30oC Đọc kết quả sau 24 – 48 giờ (Bảng 1) (có thể kiểm tra kết quả trong 7 ngày)

12

Bảng 1 Bảng kiểm tra kết quả test O/F

Khả năng phát triển của vi khuẩn ở nồng độ muối 6,5%: Lấy một ít vi

khuẩn cho vào ống nghiệm TSB có chứa 6,5% NaCl Để trong tủ ấm ở 30oC Sau 2 – 4 ngày môi trường đục cho kết quả (+) và ngược lại

Khả năng sử dụng máu (tan huyết): Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi

khuẩn cấy ria trên môi trường Blood agar có bổ sung 5% máu cừu Ủ mẫu ở tủ

ấm 30oC Đọc kết quả sau 24 – 48 giờ

 Tan huyết dạng Alpha: vi khuẩn phá vỡ một phần tế bào máu, tạo thành khu vực màu xanh quanh khuẩn lạc

 Tan huyết dạng Beta: vi khuẩn phá vỡ hoàn toàn tế bào máu trên môi trường nuôi cấy

 Tan huyết dạng Gamma: vi khuẩn không sử dụng máu trên môi trường nuôi cấy

Phương pháp ngưng kết miễn dịch:

Sử dụng bộ kít Streptococcus Strep – B – Latex, gồm các bước:

Chuẩn bị: Ống nghiệm chứa 3 – 5 mL nước muối sinh lý 0,9% và tăm tiệt

trùng

Thực hiện: Dùng que cấy nhặt từ 3 – 5 khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa

nước muối sinh lý Nhỏ một giọt dung dịch kháng nguyên lên lame Nhỏ tiếp

10 µl dung dịch vi khuẩn Trộn đều vi khuẩn với dung dịch kháng nguyên

Kết quả: Phản ứng cho kết quả dương tính khi có sự kết dính giữa vi khuẩn và

dung dịch chứa kháng nguyên sau 5 – 10 giây Nếu phản ứng xảy ra sau hơn 30 giây thì kết quả là dương tính giả

Ống tiếp xúc không khí Ống phủ dầu paraffin Kết quả

glucose Xanh lơ ở phần trên Xanh lá cây Phản ứng kiềm tính

13

Phương pháp làm tiêu bản kính phết

- Dùng kim tiêm lấy máu, nhỏ một giọt máu ở đầu lame, kế tiếp dùng một lame sạch khác đặt vào ngay giọt máu hợp một gốc 45o để máu lan ra sau đó kéo về phía cuối lame

- Dùng nhíp tiệt trùng lấy một ít cơ quan từ gan, thận, tỳ tạng phết đều lên lame sạch

- Để khô nhiệt độ phòng

- Cố định trong methanol trong thời gian 1 phút

- Để ở ngăn mát (nếu chưa nhuộm liền)

- Nhuộm mẫu theo phương pháp Humason, 1979 trích dẫn bởi Rowley, 1990 + Cho lame vào dung dịch Wright trong 3-5 phút

+ Chuyển mẫu sang dung dịch pH 6,2-6,8 từ 5-6 phút

+ Sau đó cho vào dung dịch Giemsa trong 20-30 phút

+ Cho mẫu vào dung dịch pH từ 15-30 phút

- Đọc kết quả dưới kính hiển vi vật kính 100X có giọt dầu

Kit API20 Strep :

Chuẩn bị: Dùng pipet hút 5 mL nước cất cho vào khuôn nhựa để giữ ấm trong

suốt quá trình ủ trong tủ ấm Đặt bộ kíp API20 Strep vào khuôn nhựa Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào ống chứa 2 mL API Suspension Medium (dung dịch gốc) Xác định mật độ vi khuẩn bằng cách so độ đục của dung dịch gốc với ống chuẩn McFarland số 4 Hút 500 µl dung dịch gốc cho vào API GP Medium (dung dịch 1) Lắc trộn đều vi khuẩn

Thực hiện: Dùng pipet tiệt trùng hút 100 µl dung dịch vi khuẩn của dung dịch

gốc cho đầy vào các ô VP, HIP, ESC, PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP Và cho đầy (nữa ô bên dưới) vi khuẩn vào ô ADH Cho đầy (nữa ô bên dưới) vi khuẩn từ dung dịch 1 vào các ô còn lại (từ ô RIB đến GLYG) Tiếp tục cho dầu (mineral oil) đã được tiệt trùng (nữa ô bên trên) vào các ô từ RIB → GLYG Đậy nắp khuôn nhựa Ủ bộ kíp ở nhiệt độ 35oC +2oC

Kết quả :

Sau 4 – 4,5 giờ, cho thuốc thử vào các ô:

14

- VP : 1 giọt VP1 + 1 giọt VP2

- HIP : 2 giọt NIN

- PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP : 1 giọt Zym A + 1 giọt Zym B

- Lưu ý : đọc kết quả của các phản ứng sau 10 phút

Sau 24 giờ:

- Đọc kết quả các ô ESC, ADH, RIP → GLYG Không đọc lại kết quả các ô HIP, PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL, LAP

Phương pháp lập kháng sinh đồ (theo Geert Huys, 2002)

Lập kháng sinh đồ với 12 loại kháng sinh là Neomycin (N/30µg), Florfenicol (FFC/30 µg), Ciprofloxacin (CIP/5µg), Gentamicin (GM/10µg), Doxycycline (DO/30µg), Cefazolin (CZ/30µg), Ampicillin (AMP/25µg), Amoxicillin (AML/25µg), Trimethoprim + sulfamethoxazole (SXT/1.25/23.75 µg), Tetracycline (TE/30 µg), Norfloxacin (NOR/5 µg), Enrofloxacine (ENR/5 µg)

Phương pháp xác định mật số vi khuẩn dựa vào ống chuẩn McFarland số

độ đục với ống McFarland số 3 (9,7ml 1% H2SO4 và 0,3ml 1% BaCl2) Nếu

độ đục thấp hơn ống chuẩn McFarland thì tiếp tục cho khuẩn lạc vào, ngược lại độ đục cao hơn thì cho nước muối sinh lý vào cho đến khi độ đục ngang bằng với ống chuẩn McFarland Khi đó mật độ vi khuẩn trong ống nghiệm khoảng 9 x 108 cfu/ ml

Sau khi đã xác định mật số vi khuẩn thì cho dung dịch vi khuẩn lên môi trường thạch bằng cách dùng pipet tiệt trùng hút lần lượt 0.1ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi trường thạch MHA có bổ sung 1.5% NaCl Dùng que trãi thủy tinh tiệt trùng trãi đều đến vừa khô Sau đó để yên khoảng 1 phút rồi dùng pel tiệt trùng lấy đĩa kháng sinh đặt vào đĩa petri sao cho khoảng cách giữa hai tâm của đĩa thuốc kháng sinh khoảng 24mm và khoảng cách giữa tâm đĩa kháng sinh với mép đĩa petri khoảng 10-15mm Mỗi đĩa thạch dán tối đa 6 đĩa kháng sinh Sau khi hoàn tất việc dán đĩa thuốc kháng sinh thì đặt đĩa vào tủ ấm ở 30 ºC Đọc kết quả sau 24 – 48 giờ

15

Bảng 3.1 Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ

Kháng sinh Chuẩn đường kính vòng vô trùng

(Công ty Biorad & Oxoid) Kháng Trung bình Nhạy

Đọc kết quả: Đo đường kính vô trùng (mm) và dựa vào chuẩn đường kính

vòng vô trùng của nhà sản xuất (Bảng 3.1) để xác định loại thuốc kháng sinh nhạy, trung bình nhạy và kháng

(Nguồn: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011)

định MIC và vi khuẩn đối chứng (E coli LMG 8223)

Kiểm tra sự thuần chủng của vi khuẩn bằng cách quan sát sự đồng nhất về hình dạng, kích thước, màu sắc của khuẩn lạc và nhuộm Gram Chọn 5 khuẩn lạc riêng lẻ trên đĩa TSA + 1.5% NaCl cho vào ống nghiệm chứa 10 ml TSB + 1.5% NaCl, ủ ở 30°C, 24 giờ (có thể ủ lâu hơn nếu thấy vi khuẩn chưa phát triển)

Mỗi lần xác định MIC có 10 chủng vi khuẩn trong đó có chủng đối chứng

Ngày thứ ba

Pha thuốc: Pha 2 ống nghiệm thuốc gốc, mỗi ống 50ml (là kháng sinh hay

thuốc cần thí nghiệm), ống thứ nhất có hàm lượng thuốc là 1024ppm và ống thứ hai có hàm lượng thuốc là 256ppm Thuốc phải được pha bằng dung môi phù hợp (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) Pha loãng thuốc với độ pha loãng 2 lần từ 4- 1024ppm trong ống nghiệm 50ml (Bảng 3.2) Hàm lượng thuốc 512

và 256ppm phải được pha từ ống thuốc gốc thứ nhất (1024ppm) bằng cách thêm nước muối sinh lý Hàm lượng thuốc 128, 64, 32,16,8 và 4 ppm được pha

từ ống gốc thứ hai (256 ppm)

Thể tích của dung dịch kháng sinh

Thể tích nước muối sinh lý

Phải lắc đều dung dịch trước khi pha loãng ở nồng độ tiếp theo Điều cần chú ý

là ở mỗi độ pha loãng, hàm lượng thuốc sẽ giảm đi phân nữa sau khi cho dung dịch vi khuẩn vào (Bảng 3.3)