ĐÁNH GIÁ độ SAI số TRONG PHÂN TÍCH TỒNG NITƠ (TN) BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL và PERSULFATE

TÓM TẮT Kjeldahl và Persulfate là hai phương pháp xác định nitơ tổng số và phosphor tổng số được dùng phổ biến trong phân tích chất lượng nước nuôi trồng thủy sản.. So sánh và tìm những

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN

2012

LỜI CẢM TẠ

Hoàn thành tốt đề tài này :

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầy Huỳnh Trường Giang đã tận tình quan tâm, hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Gởi lời tri ân đến các quý thầy cô Khoa thủy sản trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm trong quá trình học tập Cảm ơn anh Nguyễn Thanh Tâm đã giúp đỡ, động viên cố gắn tạo mọi điều kiện trong quá trình thực hiện đề tài

Cảm ơn đến tập thể lớp Nuôi trồng thủy sản khóa 34 đã sang sẽ, động viên, kích lệ tôi trong học tập và thực hiện đề tài

Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, người thân và bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ, chia sẽ và động viên trong suốt thời gian tập trung tại trường

Chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

Kjeldahl và Persulfate là hai phương pháp xác định nitơ tổng số và phosphor tổng số được dùng phổ biến trong phân tích chất lượng nước nuôi trồng thủy sản Năm 1998, Gross và Boyd thực hiện nghiên cứu xác định hàm lượng phosphor ở môi trường môi trường acid và môi trường kiềm cho kết quả tương tự nhau Từ đó phương pháp persulfate được dùng xác định đồng thời chỉ tiêu TN và TP So sánh và tìm những lỗi dẫn đến sai số để khắc phục nhằm nâng cao độ chính xác trong việc xác định tổng nitơ của phương pháp

Kjeldah và Persulfate là mục tiêu của đề tài “Đánh giá độ sai số trong phân tích nitơ tổng số (TN) bằng phương pháp Kjeldahl và persulfate” Hai thí

nghiệm được tiến hành

Thí nghiệm 1 được bố trí với 5 nghiệm thức với 5 nồng độ chuẩn là acid glutamic khác nhau: 2 mgN/l, 5 mgN/l, 10 mgN/l, 20 mgN/l và 50 mgN/l

để so sánh kết quả giữa 2 phương pháp và xác định khoảng nồng độ công phá tối ưu Thí nghiệm 2 được bố trí với hai mẫu thực nghiệm: mẫu nước ngọt (nước ao nuôi cá Tra) và mẫu nước lợ (nước ao nuôi thẻ chân trắng) Kết quả đạt được cho thấy ở nồng độ 2 mgN/l phương pháp Persulfate cho kết quả (26,19±4,52) rất thấp so với chuẩn nhưng ở phương pháp Kjeldahl cho kết quả tốt hơn ( 82,1±4,95) Khoảng nồng độ từ 5 mgN/l─20 mgN/l cả hai phương pháp điều cho kết quả giống như và độ sai số nhỏ

Thí nghiệm 2 cho thấy mẫu nước ao nuôi cá tra nằm trong khoảng 2 mgN/l cho nên kết quả đạt được của phương pháp Persulfate thấp hơn với mức

có ý nghĩa (1,07 mgN/l) so với Kjeldahl (1,9 mgN/l) đối với nước ao nuôi thẻ chân trắng nồng độ nitơ tổng số nằm trong khoảng 5 mgN/l nhưng kết quả đạt được từ quá trình phân tích Persulfate lại thấp có ý nghĩa (3,26±0,88) so với Kjeldahl (4,47±0,84) từ đó ta kết luận được rằng độ mặn có ảnh hưởng đến quá trình công phá

MỤC LỤC

Mục Trang

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.Giới thiệu 1

2.Mục tiêu nghiên cứu 2

3.Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về nitơ 3

2.1.Chu trình nitơ trong ao nuôi thủy sản 3

2.2.1.Hấp thu của thực vật 3

2.2.2 Sự phản nitơ trong hợp chất hữu cơ 4

2.2.3 Quá trình nitrate hóa 4

2.2.4 Quá trình phản nitrate hóa 5

2.2.5 Sự bay hơi của ammonia trong ao nuôi 5

2.2.6 Sự cố định đạm trong trong tự nhiên và trong ao nuôi 5

2.2 Sơ lược về phương pháp Kjeldahl (APHA 1999 Method 4500-N org B) 7

2.3 Sơ lược về phương pháp Persulfate(APHA 1999 Method 4500-NH3 C)….9 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 11

3.1 Vật liệu nghiên cứu 11

3.1.1 Dụng cụ 11

3.1.2 Hóa chất 11

3.2 Phương pháp nghiên cứu 11

3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 11

3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 11

3.2.3 Phương pháp phân tích mẫu 13

Phương pháp Persulfate 17

3.2.4 Phương pháp thu và xử lý số liệu 17

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18

4.1 Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình oxi hóa lên hiệu suất phân tích nitơ của phương pháp Persulfate 18

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 26

5.1 Kết luận 26

5.2 Đề xuất 26

TÀI LIỆU THAM KHẢO 27

PHỤ LỤC……… 28

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Hiệu quả thu hồi khi xác định N bằng phương pháp Kjeldahl và Persulfat 22

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Kết quả oxy hóa mẫu chuẩn 10 mgN/l ở khoảng thời gian khác nhau18 Hình 2 Hiệu suất thu hồi NO3- bằng phương pháp phân tích NO3- khác nhau19 Hình 3 Hiệu quả thu hồi tổng N bằng 2 phương pháp khác nhau ở nồng độ mẫu chuẩn 2 mg/l 20 Hình 4 Hiệu quả thu hồi tổng N bằng 2 phương pháp khác nhau ở nồng độ chuẩn 5 mg/l 20 Hình 5 Property control chart Persulfate mẫu chuẩn 5 mg/l 21 Hình 6 Property control chart Kjeldahl mẫu chuẩn 5 mg/l 21 Hình 7 Hiệu quả thu hồi tổng N bằng 2 phương pháp khác nhau ở nồng độ chuẩn 10 mg/l 22 Hình 8 Property control chart Persulfate mẫu chuẩn 10 mg/l 22 Hình 9 Property control chart Kjeldahl mẫu chuẩn 10 mg/l 22 Hình 10 Hiệu quả thu hồi tổng N bằng 2 phương pháp khác nhau ở nồng độ chuẩn 20 mg/l 23 Hình 11 Property control chart Persulfate mẫu chuẩn 20 mg/l 23 Hình 12 Property control chart Kjeldahl mẫu chuẩn 20 mg/l 23 Hình 13 Hiệu quả thu hồi tổng N bằng 2 phương pháp khác nhau ở nồng độ chuẩn 50 mg/l 24 Hình 14 Kết quả phân tích TN mẫu nước ngọt bằng 2 phương pháp khác nhau 25 Hình 15 Kết quả phân tích TN mẫu nước lợ bằng 2 phương pháp khác nhau25

CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Giới thiệu

Duy trì chất lượng nước luôn ổn định ở điều kiện thích hợp cho sự phát triển của vật nuôi là mục tiêu trong công tác quản lý chất lượng nước ao nuôi thủy sản Cùng với phosphor nitơ đóng vai trò quan trọng trong ao nuôi thủy sản là hai yếu tố giới hạn sự phát triển của tảo, nếu quản lý hai yếu tố này không hợp lý thì dể gây ra hiện tượng phú dưỡng và làm giảm chất lượng nước (Boyd và Clay 1998; Hein 2002) Vì vậy xác định hàm lượng nitơ có ý nghĩa rất lớn trong việc đánh giá hàm lượng dinh dưỡng hay mức độ ô nhiễm môi trường ao nuôi thủy sản, đồng thời là cơ sở xác định hàm lượng đạm thực phẩm trong công tác điều tra chất lượng thực phẩm, định lượng hàm lượng đạm trong thức ăn chăn nuôi giúp chúng ta điểu chỉnh hàm lượng đạm thích hợp cho từng đối tượng và giai đoạn phát triển của chúng và là phương tiện hổ trở cho lĩnh vực khoa học khác

Trong những năm qua với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật nhiều phương pháp phân tích đã được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực Phổ biến là hai phương pháp phân tích tổng nitơ Kjeldahl và Persulfate, cả hai phương pháp này điều có cùng một nguyên tắc là sử dụng chất oxy hóa mạnh

để oxy hóa hoàn toàn hợp chất hữu cơ có chứa nitơ trong điều kiện nhiệt độ cao Sản phẩm cuối cùng của phương pháp Kjeldahl dưới dạng ammonium và của persulfate dưới dạng nitrate Vì thế vấn đề đặt ra là hiệu quả phân tích của hai phương pháp trên có tương đương nhau không

Đối với công tác phân tích, nghiên cứu việc phân tích đòi hỏi độ chính xác, tin cậy nhất định Vấn đề này ngoài phụ thuộc vào thao tác phân tích, thiết bị phân tích, hóa chất sử dụng việc lựa chọn phương pháp phân tích phù hợp còn là vài trò quyết định đến độ chính xác, tin cậy của công tác phân tích, nghiên cứu Đặc biệt nếu cùng một chỉ tiêu phân tích nhưng đồng thời có nhiều phương pháp phân tích được sử dụng thì việc so sánh đánh giá giữa các phương pháp để tìm ra phương pháp phân tích tối ưu, mức độ sai số nhỏ nhất

là điều hết sức cần thiết Gross và Boyd (1998) đã thử nghiệm giữa phương pháp phân tích phosphor tổng bằng phương pháp persulfate Ở hai môi trường oxi hóa khác nhau, thí nghiệm thứ nhất xảy ra trong môi trường acid và thí nghiệm thứ hai xảy ra trong môi trường bazơ Với 70 mẫu nước thu được từ ao nuôi cá da trơn Kết quả thu được của hai phương pháp trên khác biệt không

có ý nghĩa thống kê Hiện nay chưa có nghiên cứu cụ thể nào về việc so sánh giữa phương pháp phân tích đồng thời nitơ tổng số và phosphor tổng số bằng

hai phương pháp trên Đề tài “Đánh giá độ sai số trong phân tích tổng Nitơ (TN) bằng phương pháp Kjeldahl và Persulfate” được thực hiện để so sánh

mức sai số giữa phương pháp Kjeldahl và Persulfate trong phân tích nitơ tổng

số

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá độ sai số giữa hai phương pháp phân tích nitơ tổng số khác nhau để hoàn thiện quy trình phân tích mẫu, đạt được độ chính xác cao nhất trong phân tích tổng đạm trong môi trường nước ao nuôi thủy sản

3 Nội dung nghiên cứu

 Xác định thời gian oxy hóa trong phân tích tổng nitơ bằng phương pháp Persulfate

 Đánh giá độ sai số giữa hai phương pháp khử cột Cadmium và Salicylate trong phân tích NO3- (thành phần trong tổng đạm)

 So sánh độ sai số trong phân tích tổng nitơ giữa phương pháp Kjeldahl

và phương pháp Persulfate

 Kiểm tra độ sai khác giữa mẫu nước ngọt và mẫu nước lợ bằng hai phương pháp phân tích trên

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về nitơ

Cùng với phosphor nitơ đóng vai trò quan trọng, quyết định đến năng suất thủy vực, hai yếu tố giới hạn sự phát triển của tảo Việc quản lý hai yếu tố này không hợp lý sẽ dẫn đến tình trạng phú dưỡng gây giảm chất lượng nước

ao nuôi (Boyd và Clay 1998; Hein 2002) Theo Boyd (2002) hàm lượng tổng đạm không được vượt quá 3 mg/l cùng với tổng lân không nên vượt quá 0,1

mg/l để hạn chế sự ô nhiễm nguồn nước Gross et al.(2000) và Xia et al.(2004)

theo dõi nguồn N và P trong ao nuôi thủy sản đã khẳng định rằng hàm lượng

N cùng với hàm lượng P tăng dần theo tuổi của ao nuôi

Nitơ trong ao nuôi thủy sản có nhiều nguồn gốc khác nhau, nitơ có thể đi vào ao nuôi từ không khí dưới dạng phân tử, nước mưa có chứa nitrate và các dạng nitơ khác nhau đi vào qua quá trình cấp nước Các nitơ vô cơ được đưa vào từ phân bón và hữu cơ được đưa vào môi trường ao nuôi bằng con đường thức ăn, phân hữu cơ và xác động thực vật bị phân hủy Ngoài ra phân tử nitơ được tảo lam và một số vi khuẩn cố định trong nước và dưới dạng các chất hữu cơ có chứa nitơ trong cơ thể Trong nước, nitơ trãi qua sự biến đổi theo hoạt động sinh học gọi là chu trình nitơ

Đặng Ngọc Thanh và Hồ Thanh Hải (2007) cho rằng chu trình nitơ là một quá trình sinh hóa phức tạp, trong đó nitơ với các dạng khác nhau được luân phiên biến đổi bởi sự cố định, sự đồng hóa và sự khử nitrate Trong thực

tế, chu trình nitơ là quá trình vi sinh vật diễn ra trong tự nhiên Chu trình nitơ bao hàm sự cân bằng giữa lượng nitơ đầu vào và nitơ đầu ra từ hệ sinh thái thủy vực

2.1 Chu trình nitơ trong ao nuôi thủy sản

Theo Boyd (1998) sự chuyển hóa nitơ trong ao nuôi bao gồm các quá trình: hấp thu của thực vật, sự phân hủy nitơ trong hợp chất hữu cơ, nitrate hóa, phản nitrate hóa và sự bay hơi của ammonia

2.2.1.Hấp thu của thực vật

Thực vật sử dụng nitrate, ammonium để tổng hợp hợp chất hữu cơ cần thiết cho sự phát triển của chúng bằng hình thức tự dưỡng, thực vật phù du hấp thu một lượng lớn ammonium và trở thành nhân tố chi phối giới hạn ammonia trong ao nuôi Trong cơ thể thực vật, nitơ bị khử thành dạng ammonia kết hợp với các carbon hữu cơ tạo thành acid amin, các acid amin liên kết với nhau tạo thành protein Nitơ được động vật dị dưỡng sử dụng gián tiếp thông qua chuỗi thức từ thực vật phù du, sau khi động vật, thực vật chết

khi sẽ phóng thích một lượng đáng kể nitơ vào môi trường thông qua quá trình phân hủy hợp chất hữu cơ có chứa nitơ Nếu trong đất, sự cố định nitơ bởi sinh vật và tạo thành một lượng nitơ lớn thì trong thủy vực sự cố định nitơ được thực hiện bởi vi sinh vật trong nước và tảo lam tạo ra một lượng ít nitơ hơn, sự

cố định nitơ của tảo lam bao giờ cũng lớn hơn so với sự cố định nitơ của vi khuẩn

2.2.2 Sự phản nitơ trong hợp chất hữu cơ

Hầu hết động thực vật chết đi cùng với các hợp chất hữu cơ, điều trở thành chất nền cho vi khuẩn làm thức ăn Ammonia được sinh ra từ vi khuẩn

dị dưỡng được xem là sản phẩm sơ cấp và sản phẩm cuối cùng của sự phân hủy protein và các hợp chất hữu cơ chứa nitơ khác Sự phân hủy các xác hữu

cơ còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường như nhiệt độ, pH, hàm lượng oxy hòa tan, bản chất của chất hữu cơ Sự phân hủy hợp chất hữu cơ tăng cùng với nhiệt độ đến 40 oC trong khoảng nhiệt độ này, nếu nhiệt độ tăng lên 10 oC thì quá trình phân hủy diễn ra nhanh hơn gấp đôi Trong khoảng pH 7-8 là môi trường thích hợp cho quá trình phân hủy, cho nên ở các ao nuôi có độ acid cao cần bón thêm vôi để điều chỉnh pH thích hợp kích thích sự phân hủy hợp chất hữu cơ trong thủy vực tránh trường hợp các phân hữu cơ không phân hủy nằm dưới đáy ao và phản ứng kỵ khí sinh ra khí độc Vật chất hữu cơ có hàm lượng nitơ cao hơn so với hàm lượng carbon của nó thì quá trình phân hủy diễn ra nhanh hơn và ngược lại hàm lượng carbon nhiều hơn khó phân hủy Hàm lượng ammonia được biểu thị bằng ion NH4+ và sẳn sàng được thực vật đồng hóa trong tầng sinh sản dinh dưỡng

2.2.3 Quá trình nitrate hóa

Trong điều kiện hiếu khí, vi khuẩn nitrate đã chuyển hóa ammonia thành nitrite và chuyển thành nitrate Quá trình nitrate hóa, vi khuẩn tham gia vào là

vi khuẩn tự dưỡng hóa tổng hợp Vai trò trực tiếp của động vật trong chu trình nitơ là rất nhỏ Tuy nhiên trong một điều kiện nhất định, động vật ăn thực vật

có thể ảnh hưởng đến quần thể vi sinh vật và tốc độ chuyển hóa nitơ cũng như

tỉ lệ sử dụng nitơ bởi các cơ thể có khả năng tồng hợp Sự oxy hóa ammonium

bởi giống vi khuẩn Nitrosomonas là bước đầu của quá trình nitrate hóa:

NH4+ + ½ O2 = NO2- + 2H+ + H2O

Bước tiếp theo là nitrite bị oxy hóa bởi vi khuẩn Nitrobacter chuyển

nitrite thành nitrate: NO2- +1/2O2 = NO3

-Các vi khuẩn này sử dụng năng lượng từ việc chuyển hóa nitrate này để khử O2 thành carbon hữu cơ, nói cách khác là vi khuẩn này có khả năng hóa tự

dưỡng Quá trình nitrate hóa là một loại quá trình quan trọng bởi nó giúp loại

bỏ dạng độc của nitơ trong thủy vực chuyển sang dạng chất dinh dưỡng, hai loại vi khuẩn trên được ứng dụng cấy vào bể lọc sinh học để làm giảm bớt các khí độc trong ao nuôi Tuy nhiên quá trình nitrate hóa sinh ra H+ và sử dụng oxy, cho nên sẽ hàm cho môi trường mất oxy và pH giảm

2.2.4 Quá trình phản nitrate hóa

Trong điều kiện thiếu oxy nhiều vi sinh vật yếm khí có khả năng sử dụng nitrate hay hợp chất nitơ oxy hóa khác như nguồn oxy và điện tử nhận hydro trong quá trình hô hấp Vì vậy, sự phân hủy hợp chất hữu cơ trong điều kiện thiếu oxy có thể xảy ra và quá trình dị dưỡng này gọi là quá trình khử nitrate hay phản nitrate hóa, bởi vì khí N2 được sử dụng như là chất trao đổi và mất khỏi ao Về mặt sinh lý, quá trình này được gọi là quá trình hô hấp nitrate Phản nitrate xảy ra trong đất ao nuôi có hàm lượng oxy hòa tan thấp, và làm mất một lượng lớn nitơ trong ao:

6NO3 + 5CH3OH = 5CO2 + 3N2 + 7H2O + 6OH

-Trong ao nuôi thủy sản, cần hạn chế quá trình phản nitrate xảy ra Quá trình phản nitrate làm mất một lượng lớn N2, sinh ra khí độc Cho nên chúng ta cần cung cấp một lượng oxy nhất định trong quá trình nuôi Cày, bừa phơi đáy

ao tốt, kích thích vi khuẩn hiếu khí phát triển

2.2.5 Sự bay hơi của ammonia trong ao nuôi

Hàm lượng N2 trong nước bao giờ cũng cân bằng với hàm lượng N2trong khí quyển Nhưng trong một số trường hợp khi áp lực khí ammonia trong nước lớn hơn áp lực ammonia trong không khí thì ammonia thoát trực tiếp ra khỏi ao vào không khí Quá trình này xảy ra nhiều ở pH bằng 9 (Boyd, 1998) Sự bay hơi của ammonia không có ý nghĩa, bởi ở pH bằng 9 điều không thích hợp cho việc nuôi trồng thủy sản Nhưng rất có ý nghĩa trong phòng thí nghiêm, trong việc phân tích các chỉ tiêu tổng đạm

2.2.6 Sự cố định đạm trong trong tự nhiên và trong ao nuôi

Ngoài các quá trình chuyển hóa nitơ trong ao nuôi được Boyd đề cập trên, quá trình cố định N2 đóng vai trò quan trọng trong thủy vực chưa được đề cập Đặc biệt là sự cố định N2 ở tảo lam, bao giờ cũng lớn hơn so với sự cố đinh N2 ở vi khuẩn Sự phát triển quá mức của tảo Lam (Vũ Ngọc Út, 2008) ở hầu hết tất cả các điểm khảo sát cho thấy có sự mất cân bằng về chất dinh dưỡng giữa tỉ lệ TN và TP Trong thủy vực tỉ lệ N:P thấp thường là điều kiện thích hợp cho sự phát triển của tảo Lam, tảo này ít xuất hiện trong điều kiện tỉ

lệ N:P vượt quá 29:1 (Gross & Pfiester, 1988)

Cố định đạm trước hết đòi hỏi sự hoạt hoá phân tử nitơ để tách nó thành

2 nguyên tử, trong cố định nitơ sinh học thì đó là bước đòi hỏi năng lượng là

160 Cal/mol Khi kết hợp nitơ với hydro tạo thành amoniac Tất cả các sinh vật cố định nitơ đều cần năng lượng từ bên ngoài, mà các hợp chất cacbon đóng vai trò đó để thực hiện những phản ứng nội nhiệt (Endothermic) Trong quá trình cố định đạm, vai trò điều hoà chính là 2 loại enzym: nitrogenase và hydrogenase; chúng đòi hỏi nguồn năng lượng rất thấp

Trong tự nhiên, cố định đạm xảy ra bằng con đường hoá - lý và sinh học, trong đó con đường sinh học có ý nghĩa nhất và cung cấp 1 khối lượng lớn đạm dễ tiêu cho môi trường đất Sự cố định đạm bằng điện hoá và quang hoá trung bình hàng năm tạo ra 7,6 triệu tấn (4-10kg/ha/năm), còn bằng con đường sinh học khoảng 54 triệu tấn

Những sinh vật có khả năng cố định đạm là vi khuẩn và tảo Chúng gồm

2 nhóm chính: Nhóm sống cộng sinh (phần lớn là vi khuẩn, một số ít tảo và nấm) và nhóm sống tự do (chủ yếu là vi khuẩn và tảo) Vi khuẩn cố định đạm sống cộng sinh gặp nhiều trong đất, ngược lại các loài cố định đạm sống tự do lại gặp nhiều trong nước và trong đất Song nhóm cộng sinh về mặt số lượng

có vai trò quan trọng hơn, gấp trăm lần nhóm sống tự do Ngoài những vi khuẩn cố định đạm cần năng lượng lấy từ nguồn cacbon bên ngoài, còn có loài

vi khuẩn tía (Rhodopseudomonas capsulata) có thể sinh sống bằng nitơ phân

tử trong điều kiện kỵ khí mà ánh sáng được sử dụng như một nguồn năng lượng (Madigan, 1979) Trong môi trường nước, vi sinh vật cố định nitơ khá phong phú Ở đây thường gặp những loài vi khuẩn kỵ khí thuộc các chi

Clostridium, Methano, Bacterium, Methanococcus, Desulfovibrio và một số vi

sinh vật quang hợp khác Ở những nơi thoáng khí thường gặp các đại diện của

Azotobacteriaceae (như Azotobacter) và các loài tảo (vi khuẩn lam) thuộc các

giống Anabaena, Aphanozinemon, Nostoc, Microcystis, Nodularia, Gloeocapsa Để hoạt hoá nitơ, những sinh vật tự dưỡng sử dụng năng lượng

của quá trình quang hoá hoặc hoá tổng hợp, còn các vi sinh vật dị dưỡng sử dụng năng lượng chứa trong các hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trường Sự

cố định nitơ của tảo lam bao giờ cũng lớn hơn so với sự cố định nitơ của vi khuẩn Sự cố định nitơ của tảo lam phụ thuộc vào ánh sáng và bao giờ cũng phù hợp với sự phân bố theo không gian và thời gian của tảo lam

Nếu trong đất, sự cố định nitơ bởi vi sinh vật tạo thành một lượng nitơ lớn thì trong thủy vực sự cố định nitơ vởi vi sinh vật và tảo ít hơn Các cơ thể

cố định nitơ chuyển nitơ thành các phân tử nitơ khí quyển thành ammonia Quá trình cố định nitơ là một quá trình tạo năng lượng thừa thãi nhưng một số lượng lớn các cơ thể sinh vật đã thực hiện được điều đó bao gồm cả vi khuẩn

quang tổng hợp và dị dưỡng trong điều kiện hiếu khí lẫn trong điều kiện yếm khí Quá trình này có thể diễn ra trong điều kiện cộng sinh lẫn không cộng sinh (Đặng Ngọc Thanh, Hồ Thanh Hải, 2007)

Theo Đặng Ngọc Thanh và Hồ Thanh Hải nitơ hữu cơ hòa tan (DON) thường chiếm 50% tổng lượng nitơ hòa tan trong nước ngọt Trên một nửa DON là chất nitơ amino, hầu hết dưới dạng polypeptit và hợp chất nitơ phức hợp Tỷ số của DON với nitơ dạng hạt (PON) ở suối và hồ bao giờ cũng từ 5/1 đến 10/1 với hồ phú dưỡng hơn thì tỷ số DON/PON giảm Sự phân bố nitơ trong hồ có thể biến đổi nhanh chống Thí dụ, sự phân bố nitơ ở tầng nước sâu biểu thị rằng hồ đang trơ nên có khả năng sản sinh hơn, hàm lượng của nitrate

và NH4+ trong tầng sản sinh dinh dưỡng có thể bị giảm chút ít bởi sự đồng hóa quang tổng hợp Tảo lam có khả năng cố định nitơ có thể trở nên chiếm ưu thế Trong tầng nước sâu, yếm khí, hàm lượng NH4+ được tích lụy trầm tích trong điều kiện yếm khí

Có nhiều nitơ tổng số trong lớp trầm tích dưới dạng không có khả năng

sử dụng sinh học Trong số đó, có một số có khả năng sử dụng dưới dạng hòa tan trong tầng nước và trong khối nưới sát trầm tích đáy (và cả thảm thực vật ven bờ của hồ có khả năng sản sinh) Tốc độ xoay vòng NH4+ diễn ra nhanh trong nước nhưng chậm trong lớp trầm tích Ngược lại, NO3 vay vòng chậm trong nước nhưng nhanh trong lớp trầm tích mà ở đó, trong điều kiện yếm khí

ở hồ phú dưỡng, NO3- nhanh chống bị khử thành N2

Lượng nitơ vô cơ tăng trong sông, hồ bởi các hoạt động nông nghiệp, hoặc từ nước thảy và từ ô nhiễm khí quyển do con người tạo ra Trong các hồ nghèo dinh dưỡng, không có khả năng sản sinh thì phosphor lại là chất dinh dưỡng giới hạn sự phát triển của thực vật Lượng phosphor tới các thủy vực nước ngọt tăng lên làm cho thủy vực đó có khả năng sản sinh hơn thì nitơ lại

trở thành chất dinh dưỡng giới hạn phát triển thực vật

2.2 Sơ lược về phương pháp Kjeldahl (APHA 1999 Method 4500-N org B)

Phương pháp Kjeldahl được nhà hóa học người Đan Mạch, Johan Christoffer Thorsager Kjeldahl (1849-1900) phát triển vào năm 1883 Để xác định hàm lượng nitơ trong một số hợp chất hữu cơ bằng kỹ thuật phòng thí nghiệm (laboratory technique) và sau này gọi là phương pháp Kjeldahl

Nguyên tắc của phương pháp kjeldahl là các dạng đạm hữu cơ bị oxy hóa bởi acid H2SO4 đậm đặc với chất xúc tác là K2SO4 và CuSO4 hoặc H2O2 trong điều kiện nhiệt độ cao (375-385 oC) hợp chất sẽ chuyển hóa hoàn toàn thành đạm ammonium (NH4+), ammonia cũng chuyển thành ammonium, sau khi

thêm dung dịch baz, ammonium sẽ hòa tan trong kiềm và bị hấp thụ bởi acid boric hay acid sulfuric, ammonia có thể xác định bằng phương pháp so màu quang phổ Indophenol blue

Các dạng lân hữu cơ cũng bị oxy hóa trong điều kiện tương tự như đạm hữu cơ, sẽ chuyển hóa hoàn toàn thành orthophosphate Orthophosphate có thể được xác định bằng phương pháp so màu quang phổ ascorbic acid hay xanh molypden Do đó, để oxi hóa tổng đạm và tổng lân ta có thể oxi hóa cùng một mẫu, sau đó tiến hành phân tích hai chỉ tiêu bằng phương pháp phân tích các chỉ tiêu muối đạm và muối lân vô cơ

Thiết bị:

Để thực hiện quá trình vô cơ hóa đạm, lân hữu cơ, chúng ta cần dùng máy oxi hóa mẫu (digestion apparatus) Hiện nay trên thị trường có bán rất nhiều máy oxi hóa mẫu, có thể cài đặt chương trình điều khiển trong quá trình oxi hóa mẫu

Tiến trình oxi hóa mẫu

Chuẩn bị các mẫu nước (V = 50 ml hoặc 100 ml) cho vào các ống oxi hóa, sử dụng 2-3 ống mẫu trăng (nước cất), thêm 2-3 viên sỏi loại chuyên dụng cho quá trình oxi hóa (chống nước bị bắn ra khi sôi) vào mỗi ống Thêm mỗi ống và mẫu nước trắng 10 ml H2SO4 đặm đặc, trộn điều, đợi đến khi mẫu nguội lại

Sau khi nguội, thêm 10 ml H2O2 đậm đặc (có thể dùng 6,7g K2SO4 và 0,365g CuSO4, để mẫu qua đêm trước khi oxi hóa

Mở máy oxi hóa và máy hút (quá trình oxi hóa nước bốc hơi nên thường dùng máy hút)

Cài đặt chương trình điều khiển nhiệt độ:

- Temp 1: 110 oC, giữ nhiệt độ này khoảng 20 phút(không tính thời gian lúc nhiệt độ từ nhiệt độ phòng tăng lên đến 110 oC)

- Temp 2: 200 oC, giữ nhiệt độ này trong 20 phút (không tính thời gian nhiệt

độ từ 110 oC lên đến 200 oC)

- Temp 3: 300 oC, giữ nhiệt độ này đến khi mẫu oxi hóa có màu trắng, chú ý

có thể tăng nhiệt độ oxi hóa lên đến 375 oC, nhiệt độ càng cao thì thời gian oxi hóa mẫu càng ngắn

- Tổng thời gian oxi hóa ở 3 bước trên ước tính khoảng 90 phút

- Sau khi quá trình oxi hóa hoàn thành, tắt máy, để nguội

Khi các mẫu đã được oxi hóa và nguội hoàn toàn, pha loãng phần acid còn dư trong quá trình oxi hóa với 25 ml nước cất không đạm rồi đổ toàn bộ nước này vào ống đông (V = 250 ml) trung hòa dung dịch bằng cách nhỏ từng giọt NaOH 40% (10M) có sự hiện diện của chất chỉ thỉ para-nitro-phenol (4-nitro-phenol), sau đó chuẩn lại môi trường acid bằng vài giọt H2SO4 20%, dung dịch sau cùng được thêm vào 1 giọt H2SO4 20% để giữ dung dịch có môi trường

Nếu trước khi oxi hóa mẫu, chúng ta loại bỏ TAN bằng cách nâng pH của mẫu nước lên 9,5 Khi đó NH4+ sẽ chuyễn hóa hoàn toàn thành NH3 Đun nhẹ mẫu NH3 sẽ thoát ra công khí, sau đó mới oxi hóa mẫu Trong trường hợp này kết quả hàm lượng đạm thu được chính là hàm lượng đạm hữu cơ

Hàm lượng lân thu được từ phương pháp kjeldahdl thu được chính là tổng lân

2.3 Sơ lược về phương pháp Persulfate(APHA 1999 Method 4500-NH 3 C)

Trong môi trường kiềm ở nhiệt độ 110 oC, đạm hữu cơ và đạm vô cơ bị oxy hóa bởi K2S2O8 sẽ chuyển hóa thành nitrate (NO3-), lân hữu cơ cũng bị oxy hóa thành orthophosphate

Thuốc thử:

NaOH 1M: hòa tan 40 gam NaOH trong 800 ml nước cất, để nguội rồi pha

thành 1000 ml

Thuốc thử oxy hóa: hòa tan 50 gam Potassium peroxodisulfate và 30 gam acid

boric trong 350 ml NaOH 1M rồi pha thành 1000 ml với nước cất, bảo quảng trong chai nút mài

Tiến trình

Dùng lọ nhựa 30ml, cho vào 25ml mẫu nước và mẫu chuẩn, rồi thêm 3,3 ml thuốc oxy hóa, trộn điều

Đậy nắp lọ nhựa rồi cho vào nồi autoclave, khoảng 20 phút ở 1210C và

áp suất 15 psi cho phép làm lạnh 1 giờ

Thực hiện ít nhất 3 mẫu trắng bằng nước cất trong suốt

Xác định hàm lượng tổng đạm(TN)

Hàm lượng tổng đạm có thể xác định được bằng phương pháp phân tích các chỉ tiêu NO3- Lân hữu cơ cũng bị oxy hóa thành orthophosphate và xác định bằng phương pháp xanh Molypden ( kết quả hàm lượng đạm phân tích được trong phương pháp Persulfate là tổng đạm (bao gồm: nitrite, nitrate, TKN) và hàm lượng lân thu được là tổng lân

Phương pháp Griess llosvay, Diazonium

Nguyên tắc:

NO2 trong môi trường acid mạnh sẽ hình thành HNO2, HNO2 mới hình

thành kết hợp với acid sulfanilique cho ra muối Diazonium sulfanilique

O H NaCl Cl

N N H C HSO NH

H C HSO HCl

Sau đó muối diazonium sulfanilique sẽ kết hợp với thuốc thử napthylamine diazinium sulfanilique

-HClNHHCNNHCHSONH

HCClNNH

C

HSO3 6 4    10 9 2 3 6 4   10 9 2

-Napthylamine diazonium sulfanilique là một hợ chất có màu hồng Cường

độ đậm nhạt phụ thuộc vào hàm lượng NO2-có trong mẫu lúc đầu Nồng độ

NO2- được đo bằng phương pháp so màu quang phổ ở bước sóng 543 nm

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Dụng cụ

 Máy oxi hóa đạm kjeldahl DK 20

 Máy oxi hóa đạm persulfate: Autoclave SA 232

 Máy đo quang phổ

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

Đề tài được thực hiện từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2012 Tại Phòng thí nghiệm phân tích chất lượng nước, Khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ

3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Nghiên cứu bao gồm 4 thí nghiệm

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của thời gian lên quá trình oxi hóa lên hiệu suất

phân tích nitơ của phương pháp oxi hóa Persulfate

Mục tiêu của thí nghiệm là nhằm xác định thời gian oxi hóa thích hợp để

để đạt được hiệu xuất thu hồi cao nhất Acid glutamic chứa 10 mgN/L dùng làm mẫu chuẩn với 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức phân tích 20 mẫu lặp lại

+ Nghiệm thức 1: oxi hóa 20 phút

+ Nghiệm thức 2: oxi hóa 40 phút

+ Nghiệm thức 3: oxi hóa 60 phút

Mỗi nghiệm thức lặp lại 20 lần, sản phẩm cuối cùng sinh ra dạng NO3được xác định bằng phương pháp cột khử Cadmium

-Thí nghiệm 2: Đánh giá độ sai số giữa hai phương pháp khử cột Cadmium và

Salicylate trong phân tích NO3- (thành phần trong tổng đạm)

Mục tiêu của thí nghiệm là lựa chọn phương pháp xác định hàm lượng

NO3- sau quá trình oxi hóa mẫu theo phương pháp Persulfate hoàn tất Acid Glutamic có nồng độ 10 mgN/L được dùng làm mẫu chuẩn, tiến hành oxi hóa bằng phương pháp Persulfate với khoảng thời gian thích hợp được xác định ở thí nghiệm 1 Sau khi kết thúc, hàm lượng NO3- sinh ra được xác định bằng hai phương pháp Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức phân tích

20 mẫu lặp lại Acid glutamic 10 mgN/L được dùng làm mẫu chuẩn để phân tích

+ Nghiệm thức 1: Phương pháp xác định khử Cadmium và so màu Diazonium + Nghiệm thức 2: Phương pháp xác định thông qua tạo muối Salicylate

Thí nghiệm 3: So sánh độ sai số trong việc phân tích tổng đạm bằng phương

pháp oxi hóa Kjeldahl và Persulfate

Thí nghiệm bao gồm 5 thí nghiệm nhỏ với các nồng độ của acid glutamic

ở các nồng độ khác nhau Nếu hai phương pháp cho kết quả thu hồi giống nhau ta dùng biểu đồ kiểm soát (Property control chart) để kiểm tra sai số

trong quá trình phân tích

Thí nghiệm 3.1: acid glutamic chuẩn 2 mgN/L

Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức phân tích 20 mẫu lặp

+ Nghiệm thức 1: Phương pháp Persulfate

+ Nghiệm thức 2: Phương pháp Kjeldalh

Thí nghiệm 3.2: acid glutamic chuẩn 5 mgN/L

Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức phân tích 20 mẫu lặp

+ Nghiệm thức 1: Phương pháp Persulfate

+ Nghiệm thức 2: Phương pháp Kjeldalh

Thí nghiệm 3.3: acid glutamic chuẩn 10 mgN/L

Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức phân tích 20 mẫu lặp