BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 62 42 02 01 PHẠM THỊ NGỌC NGA NGHIÊN CỨU SỰ DI TRUYỀN CÁC ĐỘT BIẾN GÂ
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã ngành: 62 42 02 01
PHẠM THỊ NGỌC NGA
NGHIÊN CỨU SỰ DI TRUYỀN CÁC ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH Ở BỆNH NHÂN BETA-THALASSEMIA VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG BẰNG
KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ
Cần Thơ, 2017
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn chính: PGS.TS Nguyễn Trung Kiên
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường
Họp tại:………, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … giờ … ngày … tháng … năm …
Phản biện 1:
Phản biện 2:
Phản biện 3:
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1 Phạm Thị Ngọc Nga, Nguyễn Trung Kiên (2017), “Sự
di truyền bệnh Beta thalassemia trong 12 gia đình ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long”, Tạp chí Y học Việt Nam Số 1/2017, tr.197-201
2 Phạm Thị Ngọc Nga, Nguyễn Trung Kiên (2017),
“Các kiểu đột biến gen gây bệnh Beta thalassemia trên bệnh nhân nhi khu vực Đồng bằng sông Cửu Long năm 2014-2016”, Tạp chí Y học Việt Nam Số 2/2017, tr 140-144
3 Phạm Thị Ngọc Nga, Nguyễn Trung Kiên (2017),
“Kết quả can thiệp bằng tư vấn di truyền cho những người mang gen bệnh Beta thalassemia trong 12 phả hệ nghiên cứu ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long”, Tạp chí Y học Thực hành Số 9 (1056)/2017, tr 59-61
4 Phạm Thị Ngọc Nga, Nguyễn Minh Tuấn, Nguyễn Trung Kiên (2017), “Các kiểu đột biến gen gây bệnh Beta thalassemia trên bệnh nhân nhi đang điều trị tại bệnh viện Nhi đồng I, năm 2016”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh Số 6 (21), tr 395-401
Trang 4Chương 1 GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Thalassemia là bệnh Hemoglobin (Hb) di truyền đơn gen theo kiểu
Mendel phổ biến nhất Bệnh do đột biến (ĐB) trên gen globin gây ra 71%
quốc gia trên thế giới có bệnh lưu hành với 7% dân số thế giới mang gen bệnh
Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh cao Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành cho thấy tần suất mang gen bệnh β-Thal khoảng 1,7-25% tùy từng vùng miền và dân tộc Theo hiệp hội Tan huyết Việt Nam, hiện có khoảng hơn 20.000 bệnh nhân nặng cần điều trị, mỗi năm có khoảng gần 2.000 trẻ sinh ra bị bệnh Và theo báo cáo của Chi hội Tan máu bẩm sinh khu vực Tây Nam Bộ, năm 2015, Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 2.105 người bị Thalassemia được các bệnh viện chẩn đoán
Với tỷ lệ lưu hành cao, Việt Nam rất cần một chương trình quản lý
và phòng chống bệnh thalassemia Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh
học phân tử để tìm hiểu rõ các đột biến gây bệnh; sự di truyền bệnh trong
các gia đình là hết sức cần thiết Ngoài ra, tư vấn cho người mang gen bệnh sẽ góp phần giúp nâng cao kiến thức Người mang gen có thể chủ động tìm tư vấn, lựa chọn tiền hôn nhân, chẩn đoán trước sinh trong trường hợp cần thiết Đây là giải pháp quan trọng nhất để phòng bệnh và
hạn chế sự chào đời của các trẻ β-Thal thể nặng Đó lý do đề tài “Nghiên cứu sự di truyền các đột biến gây bệnh ở bệnh nhân Beta thalassemia
vu ̀ng Đồng bằng sông Cửu Long bằng kỹ thuật sinh học phân tử” được
thực hiện
1.2 Mục tiêu đề tài
(1) Xác định tỷ lê ̣ các kiểu đột biến gen β-globin gây bệnh và các thể bệnh trên bê ̣nh nhân β-Thal vùng Đồng bằng sông Cửu Long bằng các
kỹ thuật sinh học phân tử
(2) Xây dựng phả hệ di truyền 3 thế hệ của một số bệnh nhân β-thal
và xác định tỷ lệ người mang gen bệnh, các kiểu đột biến, các thể bệnh thal, kiểu hình huyết học của các thể bệnh trong phả hệ
β-(3) Đánh giá kết quả can thiệp bằng tư vấn về di truyền cho những người mang gen bệnh β-thal trong các phả hệ nghiên cứu
Trang 51.3 Ý nghĩa của luận án
* Ý nghĩa về mặt khoa học, phục vụ công tác đào tạo:
- Có thêm số liệu khoa học về tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh
Thal; sự di truyền bệnh trong phả hệ của một số gia đình bệnh nhân Thal khu vực Đồng bằng sông Cửu Long
β Làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo
* Ý nghĩa về mặt xã hội:
- Góp phần nâng cao hiểu biết của người dân về bệnh -Thal từ đó giúp giảm tỷ lê ̣ mắc bê ̣nh và nâng cao chất lươ ̣ng sống, kéo dài tuổi tho ̣ cho người bị bệnh thalassemia
- Sàng lọc và chẩn đoán trước sinh hạn chế chào đời các bé thể nặng, giảm gánh nă ̣ng cho gia đình và xã hô ̣i
1.4 Tính mới của luận án
- Nghiên cứu về bệnh -Thal trên cả 4 nhóm dân tộc: Kinh, Chăm, Khmer, Hoa ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long
- Nghiên cứu thực hiện theo định hướng mới:
+ Phối hợp nhiều kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau để xác định
nhiều nhất các đột biến gây bệnh trên bệnh nhân -Thal một cách hiệu
quả, nhanh chóng
+ Nghiên cứu khá toàn diện về bệnh -Thal: nguyên nhân gây bệnh (kiểu đột biến), sự di truyền bệnh qua các thế hệ, tư vấn di truyền kết hợp chẩn đoán trước sinh cho người mang gen
Trang 6Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng cho mục tiêu 1: xác định tỷ lệ kiểu đột biến gen
Đối tượng là bệnh nhân không phân biệt tuổi và giới tính, có hộ khẩu ở 13 tỉnh và thành phố thuộc khu vực ĐBSCL được chẩn đoán mắc bệnh -Thal dựa theo kết quả điện di Hb
Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu
hoặc người giám hộ của bệnh nhân là trẻ em không đồng ý tham gia
nghiên cứu
3.1.2 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 2: xây dựng phả hệ
Đối tượng là bệnh nhân mắc bệnh -Thal ở mục tiêu 1 và tất cả người thân có mối quan hệ huyết thống trong phạm vi 3 thế hệ
Tiêu chuẩn loại trừ: Những người vắng mặt trong thời gian nghiên
cứu, người không đồng ý tham gia nghiên cứu, người không xác định được nơi cư trú, những người sống ở nước ngoài hoặc quá xa không thể
tiếp cận để lấy mẫu xét nghiệm
3.1.3 Đối tượng nghiên cứu cho mục tiêu 3: tư vấn di truyền cho người mang gen bệnh -Thal
Đối tượng là người mang gen bệnh -Thal được phát hiện trong phả
hệ ở mục tiêu 2, có độ tuổi từ 18-65 tuổi
Tiêu chuẩn loại trừ: Người mang gen bệnh là người không thể trả
lời phỏng vấn như: không hiểu rõ tiếng Việt, câm, điếc, , người vắng mặt trong thời gian nghiên cứu, người không đồng ý tham gia nghiên cứu
3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ năm 2013–2016, tại 6 bệnh viện có đủ điều kiện chẩn đoán, điều trị bệnh -Thal thuộc khu vực ĐBSCL và bệnh viện Nhi Đồng I thành phố Hồ Chí Minh (bệnh viện tuyến cuối về nhi khoa của các tỉnh trong khu vực)
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Thiết kế nghiên cứu
Sử dụng thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang và can thiệp bằng
TVDT
3.3.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu
3.3.2.1 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 1
* Xác định cỡ mẫu: áp dụng công thức
Trang 7n = Z(1-α/2)2 x p(1-p)/d2
Trong đó: Z = 1,96; p=0,333 là tỷ lệ các kiểu ĐB ở bệnh nhân
-Thal theo nghiên cứu của Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007); d = 0,05
Vậy cỡ mẫu cần nghiên cứu: n =341 bệnh nhân
* Phương pháp chọn mẫu:
Có 4 nhóm dân tộc chính đang sinh sống tại vùng ĐBSCL: dân tộc Kinh khoảng 90%, Khmer khoảng 6%, Hoa khoảng 2%, Chăm khoảng 2% Đến thời điểm thực hiện nghiên cứu, chúng tôi vẫn chưa tìm được số liệu về tỷ lệ mắc bệnh β-Thal trên các nhóm dân tộc được công bố Do vậy, nghiên cứu đã chọn mẫu gián tiếp qua tỷ lệ các dân tộc Kết quả có:
307 bệnh nhân Kinh, 20 bệnh nhân Khmer, 7 bệnh nhân Hoa và 7 bệnh nhân Chăm cần lấy mẫu Nghiên cứu chọn mẫu thuận tiện theo danh sách quản lý bệnh nhân β-Thal tại các bệnh viện cho đến khi đủ số lượng theo từng dân tộc
3.3.2.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 2
* Xác định cỡ mẫu nghiên cứu: áp dụng công thức
3.3.2.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 3
Chọn tất cả những người mang gen bệnh β-Thal trong độ tuổi cần tư vấn (18-65 tuổi) để tiến hành tư vấn di truyền (TVDT); tư vấn chẩn đoán
trước sinh cho các cặp vợ chồng mang gen đang có thai ở giai đoạn đầu (≤
24 tuần)
Thực tế có 75 đối tượng tham gia TVDT và 3 cặp vợ chồng mang gen bệnh đang mang thai tham gia sàng lọc trước sinh
Trang 83.3.3 Nội dung nghiên cứu
3.3.3.1 Tỷ lệ các kiểu đột biến và các thể bệnh (n=341)
* Tỷ lệ các kiểu đột biến gen β-globin: ghi nhận từ kết quả xét
nghiệm gen β-globin bằng các kỹ thuật sinh học phân tử và ghi theo quy
ước quốc tế
* Các thể bệnh:
Đồng hợp tử: bệnh nhân mang 2 ĐB giống nhau
Dị hợp tử kép: bệnh nhân có 2 kiểu ĐB khác nhau
Thể dị hợp tử: bệnh nhân có 1 kiểu ĐB trên gen β-globin
Thể phối hợp HbE/β-Thal: bệnh nhân có một ĐB gây HbE (Cd26 G>A) kết hợp với một ĐB khác trên gen β-globin
3.3.3.3 Xây dựng phả hệ, xác định tỷ lệ người mang gen bệnh và kiểu hình huyết học trong phả hệ (n=263)
* Phả hệ: là sơ đồ mô tả mối quan hệ của các thành viên trong gia
đình, phả hệ ở nghiên cứu này gồm 3 thế hệ và được xây dựng dựa vào các ký hiệu quốc tế sau khi đã xác định thể bệnh của từng thành viên trong gia đình
* Tỷ lệ mang gen bệnh: được xác định dựa vào chỉ số MCV/MCH,
điện đi Hb và kết quả tìm được ĐB bằng các kỹ thuật sinh học phân tử (Sơ
đồ 3.1)
* Kiểu hình huyết học: được khảo sát ở môt vài thông số
Số lượng hồng cầu; chỉ số Hct; chỉ số MCV; chỉ số MCH; chỉ số Hb được ghi nhận từ kết quả của xét nghiệm công thức máu 18 thông số
Tỷ lệ HbA, HbA2, HbF, HbE được ghi nhận từ kết quả điện di Hb
3.3.3.4 Tư vấn di truyền (n=75)
* Tư vấn di truyền về kiến thức bệnh β-Thal
Các đối tượng mang gen 18-65 tuổi trong cùng 1 phả hệ sẽ được tư vấn di truyền Đánh giá kiến thức liên quan đến bệnh β-Thal theo bộ 13 câu hỏi tự điền và được soạn sẵn Kiến thức được đánh giá trước và sau khi bác sĩ tư vấn trên 3 lĩnh vực: kiến thức về bệnh (5 câu hỏi); kiến thức
về chăm sóc bệnh nhân mắc bệnh (5 câu hỏi); kiến thức về phòng bệnh (3 câu hỏi)
* Tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng mang gen và đang mang thai giai đoạn đầu (<24 tuần): cặp vợ chồng mang gen bệnh đồng ý
nghiên cứu sẽ thực hiện chẩn đoán trước sinh khi thai nhi đạt 15-20 tuần tuổi tại bệnh viện Từ Dũ
Trang 93.3.4 Các xét nghiệm và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu
* Mục tiêu xác định kiểu đột biến gen
- 50% số mẫu máu của bệnh nhân được ly trích DNA bằng kít QIAamp DNA Blood Mini và xác định 22 kiểu ĐB phổ biến ở khu vực Đông Nam Á dựa vào nguyên lý của kỹ thuật lai dò ngược Reverse Dot Blot (RDB) tại trung tâm nghiên cứu Thalassemia, trường đại học Mahidol, Thái Lan bằng kít β-globin StripAssay SEA™ của ViennaLab Diagnostics GmbH, Vienna, Austria Các mẫu bệnh chưa có kết quả sẽ tiếp tục giải trình tự gen β-globin
- 40% số mẫu máu của bệnh nhân được ly trích DNA và thực hiện
kỹ thuật giải trình tự tại trung tâm Y - Sinh học phân tử, trường đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh
- 10% số mẫu máu của bệnh nhân được thực hiện RDB và giải trình
tự để đối chiếu kết quả của 2 phương pháp Các mẫu bệnh chưa có kết quả bằng giải trình tự sẽ được gửi đến khoa xét nghiệm Di truyền Y học, bệnh viện Từ Dũ để thực hiện kỹ thuật MLPA bằng kít MLPA Probemix P102 HBB cho nhóm gen globin ® của MRC – Holland để tìm ĐB ngoài gen β-globin
* Mục tiêu xây dựng 12 phả hệ
- Người có quan hệ huyết thống 3 đời với bệnh nhân sẽ làm công thức máu 18 thông số tại Khoa Huyết học, bệnh viện trường Đại học Y Dược Cần Thơ
- Đối tượng có kết quả dương tính với chỉ số MCV và/hoặc MCH sẽ được thực hiện kỹ thuật điện di Hb tại Trung tâm chẩn đoán Y khoa Medic, thành phố Hồ Chí Minh để tìm người mang gen bệnh
- Người mang gen bệnh sẽ được ly trích DNA và thực hiện xác định
22 kiểu ĐB bằng các kỹ thuật như mục tiêu 1 để xác định thể bệnh β-Thal
và GAP-PCR tìm ĐB gây α-Thal
Trang 103.3.5 Sơ đồ nghiên cứu
Sơ đồ 3.1 Các bước chính trong nghiên cứu
Trang 11Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Trong thời gian 1/6/2013 đến 30/6/2016, có 341 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh β-Thal tham gia xác định đột biến Có 12 gia đình bệnh nhân với 263 thành viên đồng ý tham gia nghiên cứu sự di truyền bệnh qua phả hệ Có 75/93 (80,6%) người mang gen bệnh đủ điều kiện tham gia tư vấn di truyền Sau tư vấn có 3 cặp vợ chồng mang gen và đang có thai giai đoạn đầu đồng ý chọc ối chẩn đoán trước sinh xác định thể bệnh cho thai nhi
4.1 Ty ̉ lê ̣ các kiểu đột biến gen gây bệnh và thể bệnh β-Thal ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long
4.1.1 Các kỹ thuật sinh học phân tử đã dùng xác định đột biến gen β-globin
Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường phổ biến ở Việt Nam Có hơn 200 đột biến gây bệnh β-Thal đã được công
bố trên thế giới Việc phát hiện các kiểu đột biến gen sẽ giúp chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền hạn chế sự xuất hiện của các trẻ mắc thể nặng Để tìm ĐB cho bệnh nhân β-Thal khu vực ĐBSCL, nghiên cứu đã kết hợp cả 3 kỹ thuật sinh học phân tử: RDB, giải trình tự và MLPA theo
sơ đồ 4.1 Kết quả: 100% bệnh nhân đã tìm được ĐB phù hợp với kết quả điện di và lâm sàng
- 8/22 kiểu ĐB được phát hiện bằng kỹ thuật reverse dot blot (RDB) trên các mẫu bệnh nhân: -28 A>G, Cd17 A>T, Cd26 G>A, IVS1.1 G>T, Cd41/42 –TTCT, Cd71/72 +A, Cd95 +A và IVS2.654 C>T
- Có 15 kiểu ĐB được phát hiện bằng giải trình tự Ngoài 8 đột biến phổ biến tìm gặp tương tự như RDB, còn có thêm 4 đột biến hiếm: IVS1.5 G>C (βIVS1.5), Cd26 G>T (βCd26), Cd15 G>A (c.48 G>A) (βCd15), Cd11 G>A (Hb Hamilton) (βCd11) và 3 đột biến mới: IVS2.499 C>T; IVS2.636 A>C là hai ĐB thay thế nucleotide ở vùng intron 2 của gen β-globin tại lần lượt các vị trí c.316-42C>T và c.316-179A>C; Đột biến Cd38-39 ACCCAG>CCCAA (βCd38/39) xảy ra tại vị trí c.115 đến c.120, 6 nucleotide thuộc 2 codon 38 và 39 ACC-CAG (Thr- Gln-) bị thay bằng 5 nucleotide là CCCAA (Pro-) Kết quả, khung giải mã bị dịch chuyển từ vị trí c.115 về sau (Hình 4.1)
- 35 (10%) bệnh nhân thực hiện cả 2 kỹ thuật giải trình tự và RDB Đối chiếu kết quả: 100% bệnh nhân cho kết quả tương tự nhau ở cả 2
Trang 12phương pháp Như vậy, cả hai kỹ thuật đều có độ đặc hiệu cao và tuy tốn nhiều thời gian thực hiện hơn nhiều so với RDB, kỹ thuật giải trình tự đã phát hiện được tất cả các ĐB trong vùng gen β-globin khảo sát với chi phí xét nghiệm tương tự Đó là lý do, ngày nay giải trình tự được sử dụng khá phổ biến để tìm ĐB gen gây bệnh β-Thal.
Hình 4.1 Đột biến Cd38-39 ACCCAG>CCCAA được phát hiện bằng SEQ
- Có 2 kiểu mất đoạn lớn trong cụm gen β-globin được phát hiện trên 2 bệnh nhân bằng kỹ thuật MLPA: (1) Đột biến mất đoạn từ exon 3 thuộc gen Delta (HbD) đến 0,5kb sau của exon 3 thuộc gen β-globin (δβ)del; (2) Đột biến mất một đoạn từ vị trí promoter đến hết exon1 của gen β-globin (-pro)del
Sơ đồ 4.1 Các kỹ thuật sinh học phân tử và số lượng mẫu đã thực hiện.
Trang 134.1.2 Tỷ lệ đột biến gây bệnh β-Thal ở khu vực ĐBSCL
Có 609/682 alen của 341 bệnh nhân tìm được ĐB Trong đó, có 268/341 bệnh nhân thuộc dạng truyền máu phụ thuộc, mỗi bệnh nhân sẽ
có cả 2 alen mang ĐB và 73/341 bệnh nhân thuộc dạng không cần truyền máu, mỗi bệnh nhân chỉ có 1 alen mang ĐB
17 kiểu ĐB được xác định: 97,2% các ĐB thuộc 8 kiểu phổ biến của Việt Nam; 9 kiểu ĐB thuộc dạng không phổ biến chiếm 2,8% Ba đột biến mới chiếm 0,6% Các kiểu ĐB được gặp với nhiều tần số khác nhau Trong 17 kiểu đột biến: βHbE chiếm tỷ lệ cao nhất 33,8%, kiểu βCd41/42 và
βCd17 đạt lần lượt 23,3% và 21% Thấp nhất là các kiểu: βIVS2.499, βCd11,
βIVS2.636, βCd38/39, (-pro)del và (δβ)del có tỷ lệ giống nhau 0,2%
Bảng 4.1 Tỷ lệ đột biến gây bệnh β-Thal ở khu vực ĐBSCL
* Các đột biến mới phát hiện
Có 3 bệnh nhân mang 3 đột biến mới được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự 100% các bệnh nhân là dân tộc Kinh Trong đó, có 2 bệnh