THU THẬP và ĐỊNH DANH các CHỦNG nấm METARHIZIUM và ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ đối với SÙNG KHOAI LANG , cylas formicarius fab và rầy nâu, nilaparvata lugens stal

1.3.5 Triệu chứng và cách gây hại 18 2.2.2 Thử hiệu lực của các chủng nấm xanh Metarhizium vừa được phân lập trên rầy nâu trong điều kiện nhà lưới 23 2.2.3 Thử hiệu lực của các chủng nấ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG

THU THẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG NẤM

METARHIZIUM VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐỐI VỚI SÙNG KHOAI LANG, Cylas formicarius Fab

VÀ RẦY NÂU, Nilaparvata lugens Stal

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT

Cần Thơ – 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

THU THẬP VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG NẤM

METARHIZIUM VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐỐI VỚI SÙNG KHOAI LANG, Cylas formicarius Fab

VÀ RẦY NÂU, Nilaparvata lugens Stal

Cần Thơ – 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Chứng nhận đã chấp thuận luận văn tốt nghiệp đính kèm với đề tài: “Thu thập

và định danh các chủng nấm Metarhizium và khảo sát hiệu quả đối với sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal)”

Do sinh viên NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG thực hiện và đề nạp

Kính trình hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày tháng năm 2012

Cán bộ hướng dẫn

PGS.TS TRẦN VĂN HAI

Ts TRỊNH THỊ XUÂN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn đính kèm với đề tài:

“Thu thập và định danh các chủng nấm Metarhizium và khảo sát hiệu quả đối với sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và rầy nâu (Nilaparvata

lugens Stal)”

Do sinh viên NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG thực hiện và bảo vệ trước

hội đồng ngày tháng năm 2012

Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức

Ý kiến hội đồng:

Cần Thơ, ngày tháng năm 2011

CHỦ NHIỆM KHOA NN & SHƯD

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa được ai công bố trong bất

kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

(ký tên)

NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG

LƯỢC SỬ CÁ NHÂN

- o O o -

Họ tên sinh viên: NGUYỄN THỊ THÙY DƯƠNG

Sinh ngày 13 tháng 08 năm 1990, Tỉnh Tiền Giang

Con ông NGUYỄN VĂN HẢI và bà TRẦN THỊ HẰNG

Đã tốt nghiệp phổ thông trung học năm 2008, tại Trường PTTH Đốc Binh Kiều, tỉnh Tiền Giang

Đã vào Trường Đại Học Cần Thơ năm 2008 thuộc Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, ngành Bảo Vệ Thực Vật, khóa 34

Tốt nghiệp Kỹ sư Nông Nghiệp chuyên ngành Bảo Vệ Thực Vật năm 2011

LỜI CẢM TẠ

Kính dâng!

Cha, Mẹ đã hết lòng nuôi con khôn lớn nên người

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến!

Tất cả mọi người trong gia đình đã động viên và chăm lo cho em

Thành kính biết ơn!

PGS TS Trần Văn Hai và Ths Trịnh Thị Xuân đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, gợi ý và cho những lời khuyên hết sức bổ ích trong việc nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Đặc biệt biết ơn!

Ths Bùi Thị Cẩm Thu, Ks Nguyễn Thị Diệu Hương, Ks Nguyễn Chí Long, Ks Châu Nguyễn Quốc Khánh đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo em trong suốt thời gian

thực hiện đề tài

Các thầy cô Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

đã hết lòng truyền đạt những kiến thức quý báo cho em trong suốt bốn năm học

Chân thành cám ơn!

Các bạn lớp Bảo Vệ Thực Vật khóa 34, các bạn, các anh chị cùng phòng thí nghiệm đã động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn tốt nghiệp

Nguyễn Thị Thùy Dương

MỤC LỤC

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu nấm Metarhizium ký sinh côn

trùng

2

1.1.2 Đặc điểm nhận biết nấm Metarhizium ký sinh trên

côn trùng gây hại cây trồng

1.1.3.2 Độc tố diệt côn trùng của nấm Metarhizium 5

1.1.3.3 Cơ chế tác động của nấm Metarhizium lên

1.1.4 Một số kết quả nghiên cứu về khả năng ký sinh gây

bệnh của nấm Metarhizium trên côn trùng gây hại

cây trồng

8

1.1.4.2 Kết quả nghiên cứu trên thế giới 10

1.1.4.3 Chế phẩm sinh học từ nấm Metarhizium 11

1.3 Sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) 15

1.3.3 Đặc điểm hình thái và sinh học của sùng khoai lang

(Cylas formicarius Fab

16

1.3.5 Triệu chứng và cách gây hại 18

2.2.2 Thử hiệu lực của các chủng nấm xanh Metarhizium

vừa được phân lập trên rầy nâu trong điều kiện nhà lưới

23

2.2.3

Thử hiệu lực của các chủng nấm xanh Metarhizium

vừa được phân lập trên thành trùng sùng khoai lang trong điều kiện phòng thí nghiệm

25

3.1 Phân lập các chủng nấm xanh Metarhizium anisopliae bằng

phương pháp cổ điển

27

3.1.3 Kết quả phân lập chủng nấm Ma_SXL-TV 31

3.2 Thử hiệu lực của các chủng nấm xanh Metarhizium vừa

được phân lập trên rầy nâu trong điều kiện nhà lưới

36

3.3 Thử hiệu lực của các chủng nấm xanh Metarhizium vừa

được phân lập trên thành trùng sùng khoai lang trong điều kiện phòng thí nghiệm

38

PHỤ CHƯƠNG

DANH SÁCH HÌNH

1.2 Thành trùng đực của sùng khoai lang (Cylas formicarius Fab.) 17

1.4 Triệu chứng trên củ do sùng khoai lang (Cylas formicarius

Fab.)

19

2.1 Mẫu nấm sau khi phân lập được nuôi cấy trên lam và sau đó

đem quan sát bào tử, cành bào đài dưới kính hiển vi

23

2.2 Thí n hiệm p u nấm Metarhizium trên ấu trù g rầy nâu tại n à lư i

Bộ mô BVTV, thán 0 năm 2 1 1

24

2.3 Thí nghiệm xử lý nấm Metarhizium trên thành trùng SKL

trong điều kiện phòng thí nghiệm, Bộ môn BVTV, tháng 08

năm 2011

26

3.1 Nấm Metarhizium ký sinh trên một số côn trùng gây hại cây

trồng:A/ Sâu ăn tạp (Spodoptera litura); B/ Rầy nâu hại lúa

(Nilaparvata lugens), C/ Sâu xếp lá đậu phộng (Archips

micacerana); D/ Rầy đầu vàng hại mía (Eoeurysa

flavocapitata); E/ Bọ hại dừa (Bronstispa longissima); F/ Rầy

Bướm cam quýt (Lawana conspersa)

28

3.2 Khuẩn lạc của Ma_SAT-CT ở 10 ngày sau khi cấy mặt trước

(trái) và mặt sau (phải)

29

3.3 Hình dạng bào tử (trái) và cấu trúc cành bào đài (phải) của mẫu

phân lập Ma_SAT-CT chụp qua KHV điện tử

29

3.4 Khuẩn lạc của Ma_RN-ST ở 10 ngày sau khi cấy mặt trước

(trái) và mặt sau (phải)

30

3.5 Hình dạng bào tử (trái) và cấu trúc cành bào đài (phải) của mẫu

phân lập Ma_RN-ST chụp qua KHV điện tử

30

3.6 Khuẩn lạc của Ma_SXL-TV ở 10 ngày sau khi cấy mặt trước

(trái) và mặt sau (phải)

31

3.7 Hình dạng bào tử (trái) và cấu trúc cành bào đài (phải) của mẫu

phân lập Ma_SXL-TV chụp qua KHV điện tử

31

3.8 Khuẩn lạc của Ma_RĐV-ST ở 10 ngày sau khi cấy mặt trước

(trái) và mặt sau (phải)

32

3.9 Hình dạng bào tử (trái) và cấu trúc cành bào đài (phải) của mẫu

phân lập Ma_RĐV-ST chụp qua KHV điện tử

32

3.10 Khuẩn lạc của Ma_BD-KG ở 10 ngày sau khi cấy mặt trước

(trái) và mặt sau (phải)

33

3.11 Hình dạng bào tử (trái) và cấu trúc cành bào đài (phải) của mẫu

phân lập Ma_BD-KGG chụp qua KHV điện tử

33

3.12 Khuẩn lạc của Ma_SKL-VL ở 10 ngày sau khi cấy mặt trước

(trái) và mặt sau (phải)

34

3.13 Hình dạng bào tử (trái) và cấu trúc cành bào đài (phải) của các

mẫu phân lập Ma_SKL-VL chụp qua KHV điện tử

34

3.14 Khuẩn lạc của Ma_RB-CT ở 10 ngày sau khi cấy mặt trước

(trái) và mặt sau (phải

35

3.15 Hình dạng bào tử (trái) và cấu trúc cành bào đài (phải) của các

mẫu phân lập Ma_RB-CT chụp qua KHV điện tử

35

3.16 Kết quả phun nấm Metarhizium trên rầy nâu trong điều kiện

nhà lưới tháng 08 năm 2011

38

3.17 Kết quả xử lý nấm Metarhizium trên thành trùng SKL trong

điều kiện phòng thí nghiệm, tháng 08 năm 2011 (A, C và E:

Thành trùng SKL bị nấm ký sinh ở thời điểm 5 NSXL; B:

Thành trùng SKL chết ở NT đối chứng và NT có xử lý nấm; D

và F: Thành trùng SKL bị nấm ký sinh ở thời điểm 7 NSXL)

40

DANH SÁCH BẢNG

3.1 Các nguồn nấm Metarhizium đã phân lập định danh được trên một

3.2

Hiệu lực của các mẫu phân lập nấm Metarhizium trên ấu trùng rầy

nâu ở các ngày sau khi phun (NSKP) trong điều kiện nhà lưới, Bộ

môn BVTV, tháng 08/2011

36

3.3

Hiệu lực của các mẫu phân lập Metarhizium trên thành trùng SKL ở

các ngày sau xử lý (NSXL) trong điều kiện PTN, Bộ môn BVTV,

tháng 08/2011

39

Nguyễn Thị Thùy Dương, 2011: “Thu thập và định danh các chủng nấm

Metarhizium và khảo sát hiệu quả đối với sùng khoai lang (Cylas formicarius

Fabricius) và rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal)” Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành

Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ

TÓM LƯỢC

Đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2010 đến tháng 09 năm 2011 nhằm mục đích: định danh tên loài từ chi nấm Metarhizium ký sinh côn trùng bằng phương pháp truyền thống dựa trên các đặc điểm hình thái học Đánh giá hiệu lực của các mẫu nấm Metarhizium đối với rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal) và sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius)

Kết quả phân lập, định danh theo phương pháp truyền thống đã xác định 7 mẫu phân lập Metarhizium thuộc loài Metarhizium anisopliae thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes

Kết quả đánh giá hiệu lực của các mẫu phân lập nấm Metarhizium trong nghiên cứu cho hiệu lực rất cao trên ấu trùng rầy nâu và thành trùng sùng khoai lang Đối với sùng khoai lang, các mẫu phân lập cho hiệu lực cao hơn, đạt từ 96,5 % đến 100% ở 5 ngày sau xử lý Hiệu lực đối với ấu trùng rầy nâu của 7 mẫu phân lập cũng đạt rất cao; các mẫu nấm Ma_BD-KG, Ma_SXL-TV, Ma_SAT-CT ký sinh từ 86,0 - 89,8%; riêng các mẫu nấm Ma_RN-ST, Ma_RĐV-ST, Ma_SKL-VL, Ma_RB-CT ký sinh tới 90,3% - 92,2% ở 11 ngày sau khi phun Hai thí nghiệm trên rầy nâu và sùng khoai lang cho thấy, cả 7 loại nấm Metarhizium phân lập được đều có hiệu lực giết chết ký chủ cao, điều này cho thấy có sự hiện diện các cá thể nấm trong tự nhiên và chúng có thể phát triển thích nghi theo hướng có phổ ký chủ rộng

Từ khóa: Metarhizium anisopliae , Nilaparvata lugens, Cylas formicarius

MỞ ĐẦU

Từ ngày xưa con người đã biết thuần hóa cây trồng lấy sản phẩm phục vụ nhu cầu hàng ngày Cùng đồng hành với sự phát triển cây trồng là sự xâm hại của sâu bệnh thì nông dân đã sử dụng thuốc hóa học là biện pháp phòng trừ dịch hại phổ biến kể từ khi hóa học bảo vệ thực vật ra đời Việc sử dụng lâu dài và lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật đã để lại hậu quả xấu làm dịch hại tái bộc phát nhanh chóng và ngày càng trở nên kháng thuốc, môi trường bị hủy hoại nghiêm trọng

do dư lượng còn tồn tại trong đất, nước…Và ngày nay con người càng khó tính hơn trong việc lựa chọn sản phẩm từ cây nông nghiệp phục vụ nhu cầu hàng ngày Xu hướng tiêu dùng thay đổi không chỉ cần chất lượng mà còn phải an toàn cho sức khỏe

Từ những thách thức trên đòi hỏi người sản xuất nông nghiệp phải thay đổi dần thói quen chỉ sử dụng thuốc hóa học trong phòng trừ dịch hại Nhằm góp phần hạn chế việc sử dụng thuốc hóa học các nhà khoa học đã đưa ra rất nhiều biện pháp phòng trừ kết hợp trong đó có phòng trừ sinh học là một trong các biện pháp nhằm giảm tối thiểu sử dụng thuốc hóa học và tiến dần đến thay thế trong tương lai Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng các loại

nấm ký sinh côn trùng đã mang lại hiệu quả khá cao Nấm Metarhizium là một

trong những tác nhân ký sinh gây bệnh trên nhiều nhóm côn trùng dịch hại Hai

loài Metarhizium anisopliae, Metarhizium flavoviridae được nghiên cứu và ứng

dụng phổ biến trong phòng trừ sinh học, ít gây hại tới thiên địch, hệ sinh thái…

Tuy nhiên, ngoài tự nhiên có nhiều loài thuộc chi Metarhizium ký sinh lên côn

trùng ngoài hai loài nêu trên

Việc xác định, phân loại, định danh những loài nấm thuộc chi Metarhizium từ

những côn trùng nhiễm nấm tự nhiên dựa trên đặc điểm hình thái học sẽ là nền

tảng cơ bản về nghiên cứu ứng dụng nấm Metarhizium trong phòng trừ sinh học

Đề tài “Thu thập và định danh các chủng nấm Metarhizium và khảo sát hiệu quả đối với sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) và rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal)” được thực hiện nhằm mục tiêu thu thập và xác định

loài nấm thuộc chi Metarhizium ký sinh trên côn trùng bị nhiễm nấm thu được và

đánh giá hiệu lực của những chủng nấm phân lập được đối với rầy nâu trong điều kiện nhà lưới, sùng khoai lang trong điều kiện phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về nấm ký sinh côn trùng Metarhizium

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu nấm Metarhizium ký sinh côn trùng

Từ năm 2700 trước công nguyên, nhà triết học Hy Lạp Aristotle đã tìm hiểu về hiện tượng ong bị chết hàng loạt 200 năm sau, các nhà khoa học đã chứng minh được côn trùng và một số động vật không xương sống khác bị chết là do bị nhiễm một số loại vi nấm Năm 1709, Balisneri là người đầu tiên mô tả về nấm gây bệnh côn trùng, mở ra hướng nghiên cứu về bệnh lý côn trùng Đến thế kỷ

18, các nhà khoa học đã chứng minh nấm gây bệnh côn trùng là loại vi sinh vật

có khả năng lan truyền bệnh từ vật chủ này sang vật chủ khác (Nguyễn Lân

Dũng, 1981; Phạm Thị Thùy, 2004; Trần Văn Mão, 2004; Luangsa-ard et al., 2006) Metschnikoff (1845-1916) đã phát hiện và phân lập được Entomophthora anisopliae trên sâu non bộ cánh cứng hại lúa mì (Anisopliae austrinia), qua 6 lần đổi tên đến năm 1883, Sorokin đặt tên là Metarhizium anisopliae Sau đó, vài

loài được mô tả mới bởi Petch 1931, 1935, qua nhiều năm kiểm tra đến năm

1976, Tulloch đề nghị tên gọi nấm M anisopliae với hai dạng dưới loài là M anisopliae var Anisopliae và M anisopliae var Major qua phân lập và từ một số

mẫu côn trùng thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera) và cánh bằng (Isoptera) (Tigano

et al., 1995) Đến nay, trên thế giới đã mô tả được hơn 700 loài nấm gây bệnh

côn trùng hầu hết thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes và Entomophthorales

trong tổng số 100000 loài nấm được biết (Phạm Thị Thùy, 2004; Callaghan et al., 1969; Luangsa-ard et al., 2006)

1.1.2 Đặc điểm nhận biết nấm Metarhizium ký sinh trên côn trùng gây hại cây trồng

Chi nấm Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) thuộc lớp nấm bất toàn, loài Metarhizium anisopliae được mô tả lần đầu tiên bởi Metschnikoff (1879) dưới tên gọi Entomophthora anisopliae, sau đó được đổi tên thành Metarhizium bởi Sorokin (1883) Sự chỉnh sửa tên là Metarhizium lần đầu tiên được thực hiện

bởi Tulloch (1976) dựa vào các đặc điểm phân loại chính là các đặc điểm hình

thái học Chi nấm Metarhizium được xác định dựa trên sự sắp xếp của các chuỗi

mang thể bình và các cột chứa bào tử khô, màu xanh, hình trụ hoặc hơi bầu dục, các cột được tạo thành do sự kết hợp của các chuỗi bào tử Tolloch đã chấp nhận

Metarhizum anisopliae và Metarhizium flavoviride là hai loài duy nhất của chi, đồng thời cũng phân biệt loài và dưới loài của Metarhizium anisopliae dựa trên

kích thước bào tử: (1) Metarhizium anisopliae var anisopliae có bào tử ngắn,

chiều dài khoảng 5–8 m Sợi nấm khi phát triển bên trong cơ thể côn trùng có chiều rộng khoảng 3–4 m, dài 20 m chia thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào

có thể thấy rõ nhiều giọt mỡ (Liu et al., 2002); (2) Metarhizium anisopliae var major có bào tử dài, chiều dài khoảng 10–14/16 m Nhóm này sau được Rombach et al (1986) đổi tên thành Metarhizium anisopliae var majus Metarhizium flavoviride được mô tả lần đầu tiên bởi Grams và Rozsypan (1973) Loài này khác M anisopliae ở chỗ bào tử có màu xanh vàng hoặc xanh xám và

bề ngang bào tử lớn hơn Hai loài chính này được ghi nhận bởi Hunber (1997),

Rombach et al (1986), Rombach et al (1987) đã đưa ra một bảng tóm tắt khái quát về các loài trong chi Metarhizium và được chấp nhận bao gồm các nhóm phân loại sau: M album; M anisopliae var anisopliae; M anisopliae var major;

M flavoviride và M Flavoviride var flavoviride và M flavoviride và M flavoviride var minus

Dựa trên màu sắc và các đặc điểm hình thái khác nhau, một số nhóm phân loại

mới đã được mô tả ở Trung Quốc như M cylindrosporae (Jenkins & Priorand, 1993) và dạng sinh sản hữu tính là Cordyceps taii (Liang et al., 1991) Tuy

nhiên, việc các nhóm phân loại này có được chấp nhận là các loài của chi

Metarhizium riêng biệt không thì vẫn chưa hiểu rõ

Trong những năm vừa qua, ngoài đặc điểm hình thái học, các loài nấm của chi

Metarhizium đã được xác định bằng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử cũng như

các kỹ thuật khác Các nhà nghiên cứu đã sử dụng RAPD marker để nghiên cứu

tính đa dạng di truyền của các mẫu nấm Metarhizium phân lập từ một số loại côn

trùng ký chủ và từ các khu vực trồng mía khác nhau ở Australia Kết quả là đã

quan sát được sự đa dạng di truyền cao ở 31 mẫu nấm nghiên cứu (Fegan et al.,

1991) Các marker PCR có mồi chuyên biệt cũng được sử dụng để nghiên cứu đa

dạng di truyền của các mẫu Metarhizium phân lập từ đất và côn trùng ở Braxin (Tiago- Malani et al., 1995) Ngoài ra, Curran et al (1994) nhận thấy có sự khác

biệt giữa các loài dựa trên PCR, RAPD cũng được sử dụng để đánh giá sự đa dạng trong kiểu gen của các loại nấm gây bệnh côn trùng khác nhau, bao gồm cả

Metarhizium (Bidochka et al., 1994) Cũng ở cùng thời điểm đó, Rath et al (1995b) đã chứng minh rằng có thể phân biệt 16 mẫu Metarhizium bằng hệ thống

API50CH, bao gồm việc sử dụng 49 loại carbohydrates Các tác giả này kết luận rằng việc sử dụng carbohydrates là một tiêu chuẩn phân loại có liên quan tới sinh

học và rất hữu ích để phân biệt các loài của chi Metarhizium Phân tích RFLP

phức hợp gen rDNA và mtDNA cũng là công cụ hữu ích để xác định đặc điểm

của các mẫu nấm Metarhizium Điều này cũng được chứng minh bởi Mavridou et

al (2000) trong khi nghiên cứu các khác biệt trong phạm vi loài dựa trên vùng 28S-rDNA của 25 mẫu M anisopliae var anisopliae phân lập từ nhiều côn trùng

ký chủ và vùng địa lý khác nhau

Driver et al (2000) bắt đầu tiến hành đánh giá lại quá trình phân loại của chi Metarhizum bằng cách sử dụng dữ liệu trình tự và các bản đồ RAPD từ 123 mẫu nấm đã được công nhận là Metarhizium anisopliae và Metarhizium flavoviride hoặc Metarhizium album Dữ liệu này đã khẳng định tính phát triển đơn nhánh (monopoly) của nhóm M anisopliae và nhận thấy nhóm này bao gồm 4 nhánh nhỏ, trong đó có 2 nhánh tương ứng với 2 nhóm M anisopliae var anisopliae và

M anisopliae var major, còn 2 nhánh còn lại chỉ mới phân biệt được dựa trên trình tự vùng ITS Hai chi mới này được đặt tên là M anisopliae var lepidiotum

và M anisopliae var acridum Bên cạnh M album, M flavoviride var flavoviride và M flavoviride var minus, 3 nhánh còn lại còn đại diện cho 2 chi mới dựa trên trình tự ITS là M flavoviride var novazealandicum và M flavoviride var pemphigum

Gần đây, các nghiên cứu về phân loại và quá trình lịch sử, ảnh hưởng tới sự phân

bố hiện tại của nấm này đã được thực hiện bởi Bidochka và Smal (2005) Dựa trên các nghiên cứu về di truyền quần thể, các tác giả kết luận: (1) sự kết hợp các

kiểu gen của Metarhizium cùng với sự lựa chọn loại môi trường sống xảy ra ở các vùng cực và vùng ôn đới; (2) sự kết hợp các kiểu gen của Metarhizium cùng

với loại côn trùng ký chủ ưa thích xảy ra ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; (3)

Metarhizium thực sự do sự kết hợp của 10 – 15 loài chưa được xác định, bao gồm

cả 3 loài Metarhizium anisopliae, Metarhizium flavoviride và Metarhizium album Trong đó, có những đơn vị phân loại tuy không khác biệt về mặt hình thái

nhưng lại khác biệt về quan hệ phát sinh loài và (4) Đông Nam Á có thể là nguồn

gốc của sự tiến hóa và đa dạng của Metarhizium Hơn nữa, ở một số dòng nấm Metarhizium anisopliae còn phát hiện thấy có RNA sợi kép tương đồng (Bidochka et al., 2000; Bogo et al., 1996; Leal et al., 1994)

Trong một thời gian dài người ta không tìm thấy dạng sinh sản hữu tính nào của

Metarhizium Do đó, Metarhizium được xếp vào nhóm Deuteromycota (nấm bất toàn) thuộc Hyphomycetes (nấm sợi) Liang et al (1991) đã mô tả loài Cordyceps taii có một giai đoạn sinh sản vô tính và được gọi là Metarhizium taii Sau đó Liu et al (2002) đã chứng minh loài này là dạng sinh sản hữu tính của Metarhizium anisopliae var major Do đó, chi Metarhizium ngày nay được xếp vào nhóm Nectriaceae, Hypocreales và Ascomycetes (Ferron et al., 1991)

Nhìn chung, từ khi phát hiện đến nay có khoảng 8 loài trong chi Metarhizium

được nhận biết, tuy nhiên chỉ có 2 loài được xác định là ký sinh gây bệnh cho nhiều loại côn trùng và đã được sử dụng như là tác nhân sinh học trong việc

phòng trừ côn trùng gây hại là M anisopliae và M flavoviride

1.1.3 Độc tố, cơ chế tác động của nấm Metarhizium đối với côn trùng

1.1.3.1 Triệu chứng côn trùng bị bệnh do nấm Metarhizium

Khi bị nấm tấn công, côn trùng sẽ ngừng vận động 2 – 3 ngày, màu sắc của thân thay đổi, ngay tại vị trí nấm phát triển, bên trong thân của sâu non xuất hiện những vệt đen, không có hình thù nhất định Cơ thể có màu hồng, vàng nhạt và trắng, thân hơi cứng, màu sắc thay đổi phụ thuộc vào màu sắc của bào tử nấm gây bệnh Kích thước cơ thể bị ngắn lại hoặc bị khô do hệ thống tiêu hóa bị tổn thương hoặc do thiếu thức ăn và chết Hiện tượng này gắn liền với hiện tượng tiêu hủy mô, là đặc trưng của bệnh do nấm và trải qua 2 giai đoạn:

Hiện tượng chấn thương: các mô bị tổn thương do nấm gây ra, các lympho máu

đọng lại và tái sinh được tạo thành bên trên bề mặt, một phần thân côn trùng bị tổn thương

Hiện tượng nhiễm trùng máu: do lympho chứa đầy sợi nấm, ở giai đoạn này xảy

ra hiện tượng thực bào do các tế bào bao vây nuốt một phần tiểu thể nhất định tạo thành những hợp bào và các tế bào khổng lồ làm cho côn trùng chết (Nguyễn Thị Lộc, 2009; Phạm Thị Thùy, 2004)

1.1.3.2 Độc tố diệt côn trùng của nấm Metarhizium

Tumura (1964), Cuyama (1965-1966) đã phát hiện trong huyết tương của côn

trùng bị nhiễm nấm Metarhizium và trong dịch nuôi cấy nấm này có sự hiện diện của độc tố Độc tố diệt côn trùng của nấm Metarhizium gồm một số ngoại độc tố

có tên là destruxin A và destruxin B, là một phức hợp có nhiều đồng phân, là sản phẩm thứ cấp depxipeptide Destruxin A có công thức nguyên tử là C29H47O7N5

có điểm sôi là 1880C Destruxin B có công thức nguyên tử là C30H50O7N5, có điểm sôi là 2340C Cấu trúc cơ bản gồm 5 aminoacid và một hytroxy acid Destuxin gây chán ăn, gây ngộ độc cho côn trùng sau khi hấp thụ vào da (Amiri

et al., 1999) Một số destruxin làm tê liệt côn trùng và một số destruxin khác gây

ức chế miễn dịch (Cerenius et al., 1990) Từ những năm 1961-1962, Kodaira và

cộng sự đã tách được một số destruxin A và destruxin từ dịch nuôi cấy

Metarhizium Trong khoảng thời gian từ năm 1965-1970, Tamura và cộng sự đã

tách được những độc tố trên từ môi trường Czapek – Dox có chứa 0,5% pepton

và từ 1 lít dịch nuôi cấy có thể nhận được từ 13 – 15 mg độc tố destruxin A và B Đến năm 1971, đã tổng hợp nhân tạo được destruxin B (Phạm Thị Thùy, 2004)

Pais et al (1981) đã xác định được 14 loại depxipeptide từ môi trường nuôi cấy nấm Metarhizium Trong đó có 5 loại đã được biết trước đó là destruxin A, B, C,

D, và desmethyldestruxin B Cấu trúc của các hợp chất mới được đặt tên là Destruxin E, A1, A2, B1, B2, C2, D1, D2 và E1 Các khác biệt nằm ở chuỗi peptide, ví dụ như chứa pipecolic acid thay vì proline và chứa valine thay vì

isoleucine Trong khi Strasser et al (2000); Vey et al (2001) cho rằng có hơn 28

loại destruxin thuộc các nhóm A (9), Nhóm B (10), nhóm C (3), nhóm D (3),

nhóm E (7), nhóm F (1) và 1 nhóm mới (gồm 2 pseudodestruxin) Liu et al

(2004) cũng cho biết có hơn 35 loại destruxin khác nhau đã được xác định đặc điểm

Các loại destruxin có rất nhiều hoạt tính sinh học và các hoạt tính này đã được

mô tả chi tiết bởi Roberts (1981); Strasser et al (2000); Vey et al (2001); Pedras

et al (2002) Các hoạt tính quan trọng nhất của các loại destruxin:

(1) Tác động lên côn trùng và có liên quan tới tính độc

(2) Tác động lên các tế bào khác nhau cũng như các dòng tế bào khác nhau (3) Tác động lên động vật có xương sống

(4) Tương tác với thực vật

Hoạt tính diệt côn trùng của các loại destruxin đã được thử nghiệm trên nhiều

loài côn trùng khác nhau Theo Pedras et al (2002), các nghiên cứu đã được tiến hành với các loại sâu hại: Bemisia argentifolii, Bombyx mori, Brevicoryne brassiaae, Cetonia aurata, choristoneura fumiferana, Coptotermes formosanus, Culex pipiens, Dekia antigena, Drosophila melanogastar, Empoasca vitis, Epilachna sparsa, Galleria mellonella, Heliothis viescens, Manduca sexta, Musca domestica, Plutella xylostella, Rhagoletis pomonella, Rhopalosiphum padi và Schistocerca gregaria Các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng tính nhạy cảm

của các loại côn trùng với destruxin khác nhau rất nhiều khi chất này được tiêm vào khoang máu Ở loại côn trùng cánh vảy, triệu chứng xảy ra là triệu chứng uốn ván và nếu sử dụng ở các liều cao hơn sẽ gây ra chứng liệt

Destruxin E được xem là loại độc tố có hoạt tính diệt côn trùng nhóm chích hút cao nhất Robert và Riba (1989) cho biết khoảng 50% cá thể rệp bị chết khi sử dụng destruxin E ở liều lượng 0,4 m/cm2 Tính ăn của rệp hại bắp cải

Brevicoryne brassicae bị giảm khi cho 8,8 ppm destruxin E vào thức ăn Hoạt

tính diệt côn trùng của destruxin E cũng được chứng minh bởi Poprawski et al (1994), nhộng của Empoasca vitis rất nhạy cảm với destruxin E khi phun trên lá khoai tây hay phun trực tiếp lên côn trùng Ấu trùng Pieris brassicae và Agrotis segetum tuổi 1 cũng được thử nghiệm phun dịch trích destruxin chết hơn 70%

Trong khi đó, destruxin A được báo cáo là có ít hoạt tính nhất đối với các loại côn trùng này Trong các thí nghiệm khác nhau, các tính chất làm côn trùng chán

ăn khi dùng các loại destruxin A, B và E liều thấp cũng được ghi nhận bởi Amiri

et al (1999) Nguồn thức ăn là lá bắp cải có phun destruxin A, B và E sẽ làm giảm tính ăn của ấu trùng Plutella xylostella và Phaedon cochlearia một cách

đáng kể Cũng trong báo cáo này, destruxin B được ghi nhận là không có hoạt tính ở nồng độ 400ppm

1.1.3.3 Cơ chế tác động của nấm Metarhizium lên côn trùng

Khi tiếp xúc với lớp kitin ngoài của côn trùng, bào tử Metarhizium sẽ nảy mầm

tạo thành ống mầm, túi ngoại bào hoặc túi áp suất xuyên qua lớp kitin tới lớp kitin non (procuticle), đỉnh đĩa bám (appressorium) phình to thành các phiến xâm nhiễm phát triển phân nhánh tạo nên một dạng sợi nấm chằng chịt bên trong cơ thể và tiết các độc tố destruxin A, B để giết chết côn trùng (Callaghan, 1969)

Bào tử nấm Metarhizium xâm nhập vào lớp kitin của côn trùng được là do sự

phối hợp của các enzyme phân hủy kitin và áp lực cơ học Đầu tiên, các enzyme làm mềm lớp sáp trên vỏ kitin và tạo ra các lỗ thủng chung quanh vòi xâm nhiễm giúp cho ống mầm xâm nhập sâu vào bên trong khoang ruột và tế bào máu của

ký chủ Nhóm phân hủy kitin gồm có subtilisin-like protease, esterase, lipase trysin, aminopeptidase và chitinase Enzyme phân hủy protein là một loại endoprotease Pr1 (vì các protein bao bọc các sợi kitin phải được phân hủy trước khi men chitinase hoạt động) Pr1 chủ yếu được tổng hợp trong quá trình hình thành đĩa bám trên bề mặt rắn hay trên lớp kitin của côn trùng Ngoài Pr1 còn có một số endoprotease khác như Pr1b, pr2, Pr3, Pr4 và metalloprotease hổ trợ cho Pr1 hoạt động và vai trò của Pr1 là nhân tố chính làm tăng khả năng xâm nhiễm của nấm, kết hợp với cyclodepsipeptide (destruxin) giết chết côn trùng một cách

nhanh chóng (Joshi et al., 1997; Leal et al., 1997; Wang et al., 2002)

1.1.3.4 Sự phát triển của nấm Metarhizium trong cơ thể côn trùng

Giai đoạn phát triển của nấm từ khi xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết là giai đoạn sống ký sinh của nấm Ở giai đoạn này, nấm thường tạo rất nhiều sợi nấm ngắn, phân tán khắp cơ thể theo dịch máu Trước khi nấm sinh sản phát triển trong máu, phải vượt qua phản ứng phòng vệ của côn trùng và

sự tạo độc tố của nấm có thể làm suy yếu phản ứng tự vệ của côn trùng Côn trùng có thể phản ứng với sự xâm nhiễm của nấm bằng cách sử dụng dịch thể như phenoloxidase, lectins, peptide và protein, hoặc sử dụng cơ chế của vách tế bào như sự thực bào hoặc kết nang (Nguyễn Thị Lộc, 2009; Boucias & Pendland, 1998) Côn trùng chết có thể là kết quả của sự phối hợp các hoạt động như làm giảm dinh dưỡng, làm tắc nghẽn cơ thể hoặc xâm lấn của các cơ quan và tác

động của độc tố với côn trùng Đối với nấm Metarhizium tạo độc tố destruxin làm tê liệt côn trùng (Dumas et al., 1996b) hoặc gây ức chế miễn dịch (Cerenius

et al., 1990) Sau khi côn trùng chết, nấm thường phát triển ngoại ký sinh trong

ký chủ Gặp điều kiện thích hợp tạo thành từng lớp bào tử ở bề mặt cơ thể vật chủ và bị phóng thích đi Bào tử phát tán thụ động nhờ gió, mưa và những yếu tố khác

1.1.4 Một số kết quả nghiên cứu về khả năng ký sinh gây bệnh của nấm Metarhizium trên côn trùng gây hại cây trồng

1.1.4.1 Kết quả nghiên cứu trong nước

Các kết quả nghiên cứu sử dụng Metarhizium (Mat) để trừ sâu hại cây trồng của

các nhà khoa học Viện Bảo Vệ Thực Vật từ năm 1995 – 2004 đã khẳng định được vị trí trong phòng trừ sâu hại trên nhiều loại cây trồng của chế phẩm Mat Hiệu lực trừ sâu róm ăn lá thông tại Thanh Hóa, Sơn La năm 1996 – 1998, tại Bắc Giang, 1998 – 2000, tại Nghệ An, Hà Tĩnh, 2003 đạt hiệu lực 70% - 90% và dập dịch sau 2 – 3 tháng phun (Phạm Thị Thùy, 2004) Hiệu lực trừ sâu đo xanh hại cây đay tại Hưng Yên trên 70% - 90% sau 7 – 10 ngày phun, có 45 – 50% sâu

bị mọc nấm trở lại (Phạm Thị Thùy, 1992) Hiệu lực trừ sâu xanh ăn lá bồ đề

Fentonia sp đạt trên 70% sau 4 tuần phun tại Yên Bái năm 2002 Năm 2003, điều

kiện phòng thí nghiệm, trừ bọ hà hại khoai lang, hiệu lực của nấm đạt 58,6 – 75,6% và trừ sâu hại rau họ thập tự 70% - 95% sau 7 – 15 ngày phun (Phạm Thị Thùy, 2004)

Chế phẩm Mat và Mf được xem là loại thuốc chủ lực trong việc trừ dịch châu chấu ở Hòa Bình, hại bắp ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai, Tây Ninh và Hòa Bình với hiệu lực phòng trừ đạt 68,5% - 94% sau 2 – 3 tuần phun và sau 2 – 3 năm phun nấm, hiệu lực trừ bọ hung hại mía đạt 65% sau 10 ngày phun (Phạm

Thị Thùy, 2004) Kết quả thực nghiệm về hiệu lực của nấm M anisopliae trên

sâu hại đậu tương và đậu xanh tại Hà Tĩnh và Đồng bằng Sông Hồng cho thấy

sau 7 – 10 ngày phun tỷ lệ sâu chết là 69,2% - 75,1% đối với Metarhizium (Phạm Thị Thùy và ctv., 2005)

Từ những năm 2000 trở lại đây, bọ cánh cứng hại dừa phát sinh gây hại nặng tại các tỉnh Bến Tre, Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Quảng Nam, Đà Nẵng và các tỉnh Tây Nguyên trên diện rộng làm giảm năng suất và sản lượng dừa Các nhà khoa học của Viện Bảo Vệ Thực Vật sử dụng chế phẩm Mat đã làm giảm được mật số bọ dừa một cách đáng kể với hiệu lực phòng trừ cao từ 75,4% - 88,5% sau 1-2 tháng phun (Phạm Thị Thùy, 2000; Phạm Thị Thùy, 2002; Phạm Thị Thùy

và Nguyễn Văn Tuất, 2003; Phạm Thị Thùy, 2004) Năm 2002 – 2004, Viện Bảo

Vệ Thực Vật phối hợp với Trường Đại Học Tây Nguyên sử dụng nấm M anisopliae để trừ rệp sáp trên cây cà phê cho hiệu lực rất khả quan Trong điều

kiện phòng thí nghiệm, sử dụng ở nồng độ 108 bt/ml hiệu quả từ 70-100% sau

5-10 ngày phun Kết quả thí nghiệm trong chậu vại hiệu lực đạt 75% sau 7 ngày phun và có 45% số rệp bị nấm ký sinh Ngoài đồng ruộng, với phương pháp phun

1 lít dịch bào tử nấm vào 1 kg phân chuồng hoai + 0,5kg vỏ cà phê bón vào gốc

cà phê và giữ ẩm, hiệu quả đạt 90% sau 4 tuần và kéo dài đến 12 tháng với hiệu lực trên 70% (Nguyễn Xuân Niệm, 2009)

Theo Phạm Thị Thùy (2004), trong điều kiện nhà lưới, sử dụng nấm M anisopliae để trừ rầy nâu hại lúa ở nồng độ 200 triệu bào tử/ml trở xuống sẽ cho

hiệu lực trừ rầy nâu thấp, nồng độ 500 triệu bào tử trở lên hiệu lực sẽ cao hơn Tỷ

lệ rầy non tuổi 3 chết 75% do M anisopliae, nếu nồng độ lên 600 triệu bào tử/ml

sẽ cho hiệu lực từ 65 - 80% Đối với sâu cắn gié lúa, hiệu lực diệt sâu là 70,3%,

với bọ xít đen (Scotinophora lurida Burn.) là 69,2% sau 15 ngày phun

Nấm M anisopliae đã được báo cáo là có hiệu lực rất cao khi sử dụng để trừ bọ

cánh cứng hại dừa Kết quả khảo nghiệm trên bọ cánh cứng hại dừa ở Ô Môn cho

thấy mẫu nấm M anisopliae phân lập từ rầy nâu, bọ xít và bọ dừa nhiễm bệnh tự

nhiên có hiệu lực trừ bọ dừa rất tốt và đạt từ 71,6 – 79,1% ở 14 ngày sau phun nấm Ở ngoài đồng ruộng, sử dụng ở nồng độ 1,7x107

bào tử/ml để trừ bọ cánh cứng hại dừa cũng đạt hiệu lực cao từ ngày thứ 7 và kéo dài đến 21 ngày sau phun với hiệu lực lên đến 85% (Nguyễn Thị Lộc, 2004) Theo Nguyễn Xuân

Niệm (2009), chế phẩm Mat, M anisopliae có hiệu lực trừ bọ hại dừa đạt 71,03%

ở 10 ngày sau xử lý, 73,34% ở 14 ngày sau xử lý và duy trì hiệu lực đến 21 ngày sau xử lý 69,19%

Trên cây rau, hiệu lực của M anisopliae trong phòng trừ sâu tơ hại rau từ 67,4 –

76,1%, trừ rầy mềm 91,6 – 97,8%, với bọ nhảy đạt ở mức trung bình 60,4 – 67,6%, trừ rầy mềm hại khổ qua 60,4% Hiệu lực trừ sâu ở các loại rau họ thập tự như bắp cải, suplơ, cải xanh như sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh bướm trắng, sâu xanh đục quả cà chua tại Hà Nội, Hải Phòng và Thái Nguyên, đã đạt hiệu quả kỹ

thuật 70 – 95% sau 7 – 15 ngày phun (Phạm Thị Thùy, 2004) Hiệu lực trừ sâu

khoang hại rau cải xanh (Spodoptera litura F.) đạt trên 70% sau 7 ngày và kéo dài đến 14 ngày sau xử lý (Võ Thị Thu Oanh và ctv., 2007)

Trong điều kiện phòng thí nghiệm, các chủng nấm xanh Metarhizium anisopliae

(Ma) với nồng độ 108

bào tử/ml có khả năng phòng trừ sâu xếp lá đậu phộng

Archips micacerana Độ hữu hiệu của các chủng nấm Ma7-CT, Ma9-TV và Ma11

-TV có hiệu lực trên 92% sau 17 ngày xử lý Trong điều kiện nhà lưới, các chể phẩm điều tỏ ra khá cao trong phòng trừ sâu xếp lá từ 55% đến 80% sau 12 ngày

phun (Trần Văn Hai và ctv., 2009) Trong điều kiện phòng thí nghiệm, nấm xanh Metarhizium anisopliae có khả năng ký sinh lên thành trùng sùng khoai lang đạt trên 98% ở thời điểm 7 ngày sau khi nhiễm chủng (Phạm Kim Sơn và ctv., 2010)

1.1.4.2 Kết quả nghiên cứu trên thế giới

Việc nghiên cứu sử dụng các loài nấm để kiểm soát côn trùng hại cây trồng đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên hơn 70 loại cây trồng để phòng trừ

nhiều dịch hại khác nhau Các kết quả nghiên cứu sử dụng M anisopliae phòng

trừ sâu đục thân bắp, ấu trùng bọ hung và các sâu hại nguy hiểm khác hại cây trồng nông nghiệp, lâm nghiệp và cây ăn trái đã được báo cáo bởi rất nhiều nhà

khoa học trên thế giới Đến những năm 80, 90 của thế kỷ này, nấm M anisopliae

đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trên thế giới để trừ sâu đục thân ở

Tasmania, trừ mối Nasutitermes exitiousus ở Đức và trừ mối Coptotermes ở Úc (Milner & Staples, 1996)

Nhiều nghiên cứu đã sử dụng bào tử nấm M anisopliae trong chương trình IPM

với Baculovirus để phòng trừ nhiều loại sâu hại cây trồng nông nghiệp chiến lược

với nhiều chế phẩm vi sinh sản xuất từ loại nấm này Metequino (M anisopliae) trừ muỗi sốt rét Lubilosa, trừ châu chấu Schistocerra gregaria Hiệu lực của nấm

M anisopliae để trừ rầy nâu trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài đồng đạt

hiệu quả trên 80% và cao hơn một cách có ý nghĩa so với việc xử lý thuốc ở cuối

vụ (Aguda et al., 1988; Gillespie, 1986; Rombach et al., 1986) Rệp Blissus antillus là loài dịch hại nguy hiểm và rất dễ kháng thuốc hóa học trên đồng ruộng

ở Braxin Kết quả nghiên cứu độc tính của M anisopliae đối với trứng của rệp Blissus antillus (Hemiptera: Lygaeidae) trong phòng thí nghiệm bằng phương

pháp xử lý trực tiếp với dịch bào tử ở nồng độ 1 x 104 và 5 x 106 bào tử/ml cho

thấy nấm M anisopliae có độc tính rất cao ngay ở nồng độ thấp với tỷ lệ nhiễm

96,7%, mật số bào tử trung bình 11,6 x 105 bào tử/trứng Khi nghiên cứu khả

năng diệt trứng của 8 mẫu nấm M anisopliae gây bệnh trên sâu đục vỏ đậu Maruca vitrata và Clavigralla tomentosicollis trong điều kiện phòng thí nghiệm

ở nồng độ 1 x 108bt/ml, Ekesia (1999); Ekesia et al (2002) đã chọn lọc 2 mẫu M anisopliae có hiệu lực cao trên trứng của sâu đục vỏ đậu Maruca vitrata với tỷ lệ

chế đạt 89 – 100%

Theo Liu et al (1998), hiệu lực của M anisopliae sử dụng ở nồng 2,15 x 107 bào

tử/ml để trừ bọ cánh cứng hại dừa (Brontispa longissima) là 100% sau 8 ngày

phun nấm (ở cả 3 pha sinh trưởng), ngay cả ở nồng độ 2,2 x 103 bào tử/ml tỷ lệ

ấu trùng bọ dừa chết khoảng 47% và nhộng chết 60% Sử dụng ở nồng độ 3 x 106

bào tử/cm3 để trừ mối Reticulitermes flavipes và Coptotermes formosanus đạt tỷ

lệ chết 100%, ở nồng độ 1,5 x 108 và 3 x 108 bào tử/gram trộn với bột cellulose làm thức ăn cho thấy khả năng chống lại hai loài mối này là rất cao (Chang &

Powell, 2004; Shimizu & Motoko, 2003; Jianzhong et al., 2003)

1.1.4.3 Chế phẩm sinh học từ nấm Metarhizium

* Chế phẩm sinh học từ nấm Metarhizium trên thế giới

Nhiều nước trên thế giới đã sản xuất thành công các chế phẩm sinh học từ nấm

M anisopliae như: Bio-Blast, AgoBio.Metarhizium 50, Biogreen, Bio 1020,

Green Muscle, Metarhizium Schweizer, Bio-Magic, Metaquino, Bio-Path, Metarhisa WP, Biocotrol, Conican (Marcos & Stephen, 2007)

* Các chế phẩm sinh học từ Metarhizium ở Việt Nam

Từ M anisopliae như: Bemetent, Metament, Vimetazim 95 DP, Ometar, Dimez,

Metavina 10DP, Metavina 90DP, đã đăng ký vào danh mục thuốc BVTT được phép sử dụng ở Việt Nam năm 2010

1.1.5 Phổ ký chủ của nấm Metarhizium

Theo Goettel et al (1990), phổ ký chủ của M anisopliae bao gồm Symphyla, bộ

cánh thẳng (Orthoptera), bộ cánh bằng (Isoptera), bộ 2 cánh (Diptera), bộ cánh màng (Hymenoptera), bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ Homoptera, heteroptera, Siphonaptera, bộ Lepidoptera và cả các loại côn trùng khác thuộc các bộ Malacostrata (Amphipoda), Acari và Ephemeroptera

Trong khi Metarhizium anisopliae là loài có phổ ký chủ rộng thì một số loài có phổ ký chủ hạn chế hơn, ví dụ M flavoviride, M acridium (Bidochka & Small, 2005; Ferron et al., 1972; Rombach et al., 1986) Ngoài ra, các mẫu nấm cũng có

độc tính cao hơn khi được phóng thích ở ngoài đồng ruộng so với điều kiện

nghiên cứu trong phòng thí nghiệm (Jaronski et al., 2003) Theo Rombach et al (1986); Bidochka & Small (2005); Ferron et al (1972), một số nhóm di truyền của Metarhizium có nguồn gốc nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới, đặc biệt là các mẫu

thuộc loài M anisopliae var major, M flavoviride và M album có khuynh

hướng chọn ký chủ và theo báo cáo thì chúng lần lượt đặc hiệu cho côn trùng bộ

cánh cứng, bộ cánh thẳng và bộ cánh nửa cứng Trong số 8 mẫu M anisopliae (6 mẫu thuộc loài major và 2 mẫu thuộc loài anisopliae) dùng thử nghiệm phòng trừ

9 loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, hầu hết các loại côn trùng này chỉ nhạy cảm

với mẫu nấm phân lập từ các côn trùng cùng loài Các loài Oryctes chỉ nhạy cảm với tất cả các mẫu nấm Metarhizium phân lập từ Oryctes Trái lại, các mẫu nấm

phân lập từ đất được nhận thấy là có độc tính cao đối với các loại côn trùng chuyên biệt, ví dụ như đối với bọ trĩ hại hoa và rau hay đối với rệp hại đậu

Clavigralla tomentosicollis (Ekesia et al., 1998 ; Ekesia, 1999)

Rombach et al., (1986) cũng cho rằng có sự chuyên hóa và gây bệnh cho một số loại côn trùng ở 3 loài Metarhizium đã được công nhận, ví dụ: M anisopliae chuyên hóa với bộ cánh cứng, M flavoviride chuyên hóa với bộ cánh thẳng và M album chuyên hóa với bộ cánh nửa M anisopliae thể hiện tính chuyên hóa ký

chủ thường phân bố ở vùng nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới, ban đầu thích nghi với môi trường sống sau tiến hóa dần theo hướng chuyên hóa với một số côn trùng

ký chủ nhất định và dần tiến hóa theo hướng có phổ ký chủ rộng Như vậy các

mẫu nấm Metarhizium ở vùng nhiệt dới đới và cận nhiệt đới có thể tiến hóa tính

chuyên hóa ký chủ trong khi các mẫu nấm ở vùng ôn đới và hàn đới thích nghi với môi trường sống hơn là thích nghi với ký chủ (Michael & Cherrie, 2005)

1.2 Rầy nâu

1.2.1 Phân loại, phân bố

* Phân loại

Rầy nâu có tên khoa học: Nilaparvata lugens Stal

Họ Rầy Thân: Delphacidae

Bộ Cánh Đều: Homoptera

Loài Nilaparvata lugens được Stal đặt tên lần đầu tiên vào năm 1854, từ đó đến nay có khoảng 15 tên khác nhau như Delphax lugens Stal (1854), Nilaparvata oryzae Esaki & Mashimoto (1932), Nilaparvata sorde scens Kawayama (1945) (Nguyễn Xuân Hiển và ctv, 1979) …

* Phân bố

Rầy nâu xuất hiện ở tất cả các nước trồng lúa, nhất là các nước ở đồng bằng nhiệt đới châu Á như Ấn Độ, Bangladesh, Đài Loan, đảo Solomon, Indonesia,

Fiji, Malaysia, Nhật, Phillipines, Thái Lan, Sri-Lanka, Tân Guinea, Triều Tiên, Trung Quốc, Việt Nam…(Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

Ở Việt Nam, rầy nâu được ghi nhận xuất hiện hầu hết ở các tỉnh trồng lúa trong

cả nước, từ đồng bằng đến vùng trung du miền núi, từ Đồng bằng sông Hồng đến Đồng bằng sông Cửu Long (Phạm Văn Lầm, 2006)

1.2.2 Đặc điểm hình thái và vòng đời

Rầy nâu có cơ thể màu nâu vàng, đỉnh đầu nhô ra phía trước Phần gốc râu có 2 đốt nở to, đốt roi râu dài và nhỏ Cánh trong suốt, giữa cạnh sau của mỗi cánh trước có 1 đốm đen, khi 2 cánh xếp lại 2 đốm này chồng lên nhau tạo thành 1 đốm đen to trên lưng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

Rầy đực có cơ thể dài từ 3,6 – 4 mm Rầy cái màu nâu nhạt có kích thước cơ thể

to hơn rầy đực; chiều dài cơ thể từ 4 – 5 mm, bụng to tròn, ở khoảng giữa mặt dưới bụng có bộ phận đẻ trứng bén nhọn màu đen (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

Theo Nguyễn Đức Khiêm (2006), rầy trưởng thành có hai dạng cánh:

Cánh dài che phủ cả thân và chủ yếu dùng để bay đi tìm thức ăn do đó rầy cánh dài thường xuất hiện vào giai đoạn lúa chín

Hình 1.1: Thành trùng rầy nâu cánh dài

(Nguồn:http://thienho.com/w1/index.php?title=T%E1%BA%ADp_tin:Nilaparvata_lugens.jpg)

Cánh ngắn phủ đến đốt thứ 6 của thân mình; dạng cánh này xuất hiện phổ biến trước lúc trổ bông, nếu thức ăn đầy đủ đúng vào thời tiết thích hợp thì loại hình

cánh ngắn xuất hiện nhiều, có thể lên tới 100% Sự biến đổi về hình thái này nhằm thể hiện điều kiện môi trường thuận lợi nhiều hay ít

Nếu môi trường bình thường sẽ xuất hiện cánh dài với tỉ lệ đực cái là 1:1, còn trong điều kiện môi trường thuận lợi thì xuất hiện rầy cánh ngắn với tỉ lệ đực cái

là 1:3

Đời sống trung bình của thành trùng Rầy nâu khoảng từ 10-20 ngày, trong thời gian đó một rầy cái cánh dài đẻ khoảng 100 trứng và rầy cái cánh ngắn đẻ từ 300 – 400 trứng Nếu điều kiện thích hợp, một rầy cái có thể đẻ đến cả nghìn trứng (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

Trứng rầy nâu được đẻ thành từng hàng vào bên trong bẹ cây lúa, mỗi hàng có từ

8 – 30 trứng Trứng rầy giống hình hạt gạo, dài 0,3 – 0,4 mm, mới đẻ màu trắng trong, sắp nở màu vàng Phía trên đầu trứng có bộ phận che lại gọi là nắp trứng Thời gian ủ trứng từ 5 – 14 ngày (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

Ấu trùng rầy nâu hay còn gọi là rầy cám, khi mới nở rất nhỏ, màu trắng sữa, càng lớn rầy càng chuyển thành màu nâu nhạt Ấu trùng có 5 tuổi, phát triển trong thời gian từ 14 – 20 ngày, ở tuổi 5 rất giống thành trùng cánh ngắn nhưng cánh ngắn hơn và đục, trong khi cánh của thành trùng cánh ngắn thì trong suốt với các gân màu đậm (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004) Mỗi tuổi kéo dài 2 – 3 ngày (Nguyễn Văn Luật, 2002)

1.2.3 Tập quán sinh sống và cách gây hại

Sau khi vũ hóa từ 3 – 5 ngày thành trùng cái bắt đầu đẻ trứng, chúng rạch bẹ lá hoặc gân chính của phiến lá gần cổ lá đẻ trứng vào bên trong mô thành từng hàng tạo nên những đốm nhỏ màu trắng đục, thường tập trung đẻ nhiều ở gốc lúa cách mặt nước từ 10-15 cm và đẻ vào buổi chiều Rầy cánh dài có tính hướng quang mạnh do đó vào những đêm tối trời, lặng gió, trời nóng bức chúng dễ bị bẫy đèn thu hút Rầy thường bay vào đèn nhiều nhất từ 20 – 23 giờ (Nguyễn Văn Huỳnh

và Lê Thị Sen, 2004)

Cả thành trùng và ấu trùng rầy nâu đều chủ yếu sống tập trung ở gần gốc lúa, chích hút nhựa cây lúa Rầy có tập quán bò quanh thân cây lúa, khi bị khuấy động mạnh có thể nhảy lên các bộ phận khác của cây hoặc rơi xuống nước sau vài giây lại bò lên gốc lúa Rầy nâu thích tấn công cây lúa còn nhỏ, nhưng nếu mật số cao có thể gây hại mọi giai đoạn tăng trưởng của cây lúa Trong quá trình sống rầy tiết nước bọt phân hủy mô cây, tạo thành một bao chung quanh vòi chích hút, cản trở sự di chuyển nhựa nguyên liệu và nước lên phần trên cây lúa làm cây lúa bị khô héo, gây hiện tượng “cháy rầy” chất thải là môi trường cho

nấm phát triển Rầy trưởng thành cánh ngắn không bay được, bám ở gốc lúa để hút nhựa cây và sinh sản (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

Theo Nguyễn Đức Khiêm (2006), thì rầy nâu phát sinh gây hại đầu tiên xuất hiện thành từng vạt giữa ruộng sau đó lan dần ra xung quanh ruộng Khi mật số cao, trong ruộng thường xuất hiện “váng rầy” là váng mỏng lan tỏa khắp ruộng

Theo Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen (2004), ngoài ảnh hưởng trực tiếp như trên, rầy nâu còn gây hại gián tiếp cho cây lúa như:

Các vết chích hút và nơi đẻ trứng của rầy nâu trên thân cây lúa bị hư do sự xâm nhiễm của nấm bệnh và vi khuẩn

Phân rầy tiết ra các chất đường thu hút nấm đen tới đóng quanh gốc lúa, cản trở

sự quang hợp ảnh hưởng đến sự phát triển của cây lúa

Rầy nâu thường truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá cho cây lúa

1.3 Sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius)

1.3.1 Phân loại và phổ ký chủ

* Phân loại

Theo Nguyễn Thị Thu Cúc (2004), sùng khoai lang gây hại ở Việt Nam có tên

khoa học là Cylas formicarius Fabricius (còn được gọi là bọ hà hay mọt khoai

lang)

Loài này được phân loại như sau:

Lớp (Class): Insecta

Bộ (Order): Coleoptera (Cánh cứng)

Họ (Family): Curculionidae (Họ Vòi voi)

Giống (Genus): Cylas

Loài (Species): formicarius Fab

* Phổ ký chủ

Ngoài khoai lang, loài này còn phá hại trên một số loại cây thuộc họ bìm bìm

như rau muống (Ipomoea aquatica) (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

1.3.2 Phân bố

Theo Ames et al (1997), có 3 loài thuộc giống Cylas gây hại trên cây khoai lang

Ba loại này là Cylas formicarius, Cylas puncticollis và Cylas brunneus Trong

đó, thành trùng Cylas puncticollis và Cylas brunneus được tìm thấy ở châu Phi còn Cylas formicarius hiện diện ở châu Á và một phần Caribbean

Sùng khoai lang (Cylas formicarius Fabricius) là loài có vùng phân bố rất rộng,

được phát hiện tại nhiều nước thuộc Châu Á và nhiều nước thuộc Châu Phi, Châu Mỹ và Châu Âu (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

Theo Nguyễn Đức Khiêm, 2006 ghi nhận ở Việt Nam, sùng khoai lang chỉ có

một loài là Cylas formicarius Fab Đây là loài gây hại phổ biến trên khoai lang

và xuất hiện ở hầu hết các vùng trồng khoai lang trong cả nước và vào các mùa khô như ở một số tỉnh phía Nam của nước ta (Nguyễn Đức Khiêm, 2006)

1.3.3 Đặc điểm hình thái và sinh học của sùng khoai lang (Cylas formicarius

Fabricius)

* Trứng

Trứng được đẻ rải rác trong các hốc (do chúng đục) ở gần gốc của dây khoai hoặc theo những kẽ nứt của đất chúng chui xuống đẻ trứng trên củ Trứng nhỏ, bóng, có hình bầu dục dài từ 0,5-0,7 mm Lúc mới đẻ trứng có màu trắng sữa, trước lúc nở trứng có màu vàng, thời gian ủ trứng từ 5-10 ngày (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004)

* Ấu trùng

Ấu trùng sùng khoai lang có hình ống dài, 2 đầu thon nhỏ, đầu nâu, thân trắng, không chân, bụng chia đốt rất rõ ràng, chiều dài cơ thể khoảng 5-8,5 mm, ấu trùng có 5 tuổi, phát triển từ 15-25 ngày (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2004) Nếu trứng được đẻ trên dây khoai lang thì sau khi nở ấu trùng đục vào trong dây và phá hại, làm dây khoai tại vị trí đục bị dị dạng, phình to, chúng ăn chất dinh dưỡng và thải phân ngay trong đó, thời gian sống của ấu trùng có thể kéo dài từ 37-50 ngày (Nguyễn Đức Khiêm, 2006)

Nhiệt độ là nhân tố chủ yếu ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của ấu trùng Ở điều kiện nhiệt độ 30oC và 24oC thì sự phát triển của ấu trùng tương ứng khoảng 10

ngày và 35 ngày (Capinera, 1998)

* Nhộng

Theo Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen (2004) thì nhộng của sùng khoai lang là nhộng trần, dài từ 4-8 mm, cơ thể có màu trắng sữa, về sau chuyển sang màu vàng Vòi cúi gập về phía mặt bụng Ở mút bụng có một đôi gai lồi, hơi cong

Thời gian nhộng phát triển từ 4-10 ngày Nhộng Cylas fomicarius dài khoảng

6,5mm, lúc đầu có màu trắng sữa, sau chuyển dần xám với mắt và chân đen hơn

Theo Capinera (1998), trong điều kiện phòng thí nghiệm khi được cung cấp thức

ăn đầy đủ, ở 15oC thành trùng có thể sống hơn 200 ngày hoặc 3 tháng ở 300C trong điều kiện phòng thí nghiệm Ngược lại, ở 30oC thành trùng sống khoảng 90 ngày nếu có thức ăn và 8 ngày nếu thiếu thức ăn

(Nguồn:http://bugguide.net/images/raw/krozxrdz7r3zmrjzrzdl6rkhgrhh7z0hprlhmz1l2rbl8rzh4r 0h6rvlmzkhmr3zlzozxr3z2rol0z.jpg)

Hình 1.2: Thành trùng của sùng khoai lang (Cylas formicarius Fab.)

1.3.4 Tập quán sinh sống

Theo Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen (2004), sùng khoai lang sau khi vũ hóa khoảng 6-8 ngày thì bước vào thời kỳ giao phối và sau đó từ 2-3 ngày mới đẻ trứng Trong một củ khoai lang, nhiều ấu trùng có thể cùng chung sống và các

ấu trùng này không di chuyển sang củ khoai khác trong suốt gia đoạn phát triển Thành trùng đẻ trứng trên củ, một ít có thể đẻ vào đoạn thân sát gốc, chúng dùng miệng đục một lỗ nhỏ trên bề mặt củ rồi đẻ trứng vào đấy, thông thường mỗi lỗ

chỉ đẻ 1 trứng Sau đó dùng nước bọt lấp lỗ trứng lại

Khả năng hoạt động của sùng khoai lang có liên quan chặt chẽ với tình hình khí hậu và thời tiết Thời gian các giai đoạn phát triển của sùng khoai lang ở điều kiện nhiệt độ 25oC và 30oC là 46 và 31 ngày Nhộng vũ hóa rải rác trong ngày Nếu nhiệt độ thấp khoảng 10-15oC, sùng khoai lang vẫn nằm yên trong đường đục Ở nhiệt độ cao (khoảng trên dưới 30o

C), sùng khoai lang hoạt động mạnh nhất Sùng khoai lang di chuyển chủ yếu bằng hình thức bò, nhiệt độ càng cao sùng khoai lang bò càng nhanh Những ngày mưa chúng thường ngưng hoạt động Khi thời tiết nóng nực, chúng có thể bay một quảng ngắn Loài này cũng

có phản ứng giả chết như nhiều loài cánh cứng khác (Nguyễn Đức Khiêm ,2006) Theo Miyatake (2001) thì sự giả chết của thành trùng sùng khoai lang chịu ảnh hưởng của việc thiếu thức ăn Khi thành trùng sùng khoai lang không đói, tỉ lệ giả chết cao hơn đáng kể so với sùng đói ở cả hai giới tính đực và cái Tuy nhiên,

để giảm tỉ lệ giả chết, con cái cần giai đoạn thiếu ăn dài hơn con đực Sự khác nhau này là do sự khác nhau về khả năng chịu đựng đối với sự thiếu thức ăn, con đực chết sớm hơn con cái khi bị đói

1.3.5 Triệu chứng và cách gây hại

Cả thành trùng và ấu trùng đều gây hại đối với cây khoai lang:

Thành trùng có thể ăn gặm phần thân, mầm hoặc lá khoai lang non, nhưng chúng thích nhất là củ khoai lang, vì vậy những củ lồi lên khỏi mặt đất hay lộ qua khe đất nứt thường dễ bị thành trùng tấn công Các vết đẻ trứng của thành trùng sẽ là nơi xâm nhập của nấm và vi khuẩn và làm dây khoai bị suy yếu (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen ,2004)

Ấu trùng đục vào bên trong gây hại chủ yếu cho củ khoai Ấu trùng lớn lên đục thẳng vào bên trong củ tạo thành những đường hầm Theo Capinera,1998 thì trên 90% ấu trùng được tìm thấy ở 15cm trên củ và 10cm trên dây Vào đầu vụ, số

lượng ấu trùng được tìm thấy ở dây và củ là tương dương nhau, nhưng vào cuối

vụ thì hầu hết là trên củ Ấu trùng là đối tượng gây thiệt hại chủ yếu do chúng phát triển bên trong củ nhưng năng suất giảm còn do sự gây hại của cả ấu trùng

và thành trùng trên dây khoai (Sutherland, 1986) Nếu bị tấn công khi củ còn non

củ sẽ bị lép, không phát triển được, năng suất giảm Nếu bị tấn công khi củ đã lớn, năng suất không giảm nhiều nhưng mất phẩm chất do phần thịt chung quanh đường đục bị chuyển sang màu tím, có mùi hôi, có vị đắng nên không thể ăn được và cũng không thể làm thức ăn cho gia súc nên gây tổn thất rất lớn cho người trồng khoai (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen , 2004)

Theo Nguyễn Đức Khiêm (2006), kết quả nghiên cứu ở nước ta và một số nước Đông Nam Á cho thấy tình hình phát sinh phát triển của loài sâu hại này có quan

hệ chặt chẽ với điều kiện khí hậu thời tiết, đất đai và chế độ canh tác Kết quả theo dõi cho thấy thời tiết khô và nóng là điều kiện thích hợp cho loài sâu này phát sinh và phát triển mạnh Sùng khoai lang là loài sâu hại dưới đất, điều kiện khô hạn rất thuận lợi cho sự hoạt động của chúng Khô hạn còn làm đất nứt nẻ, thành trùng có thể tìm đến các củ khoai để đẻ trứng một cách dễ dàng (Hà Quang Hùng, 2005)

(Nguồn:http://keys.lucidcentral.org/keys/sweetpotato/key/Sweetpotato%20Diagnotes/Media/Ht ml/TheProblems/Pest-Root&StemInsects/SPWeevilsOther/weevil%20damageNS.jpg)

Sau khi thu hoạch, ấu trùng vẫn tiếp tục tấn công khoai lang tồn trữ do chúng được nở từ trứng đã có sẵn trong củ khoai hoặc đôi khi do thành trùng tấn công trong kho Ngoài ra, việc sử dụng các hom khoai trồng trên ruộng bị sùng hại từ

vụ trước cũng có thể lây lan sang vụ sau (Nguyễn Văn Huỳnh và Lê Thị Sen, 2003) Ngoài ra, Theo Nguyễn Đức Khiêm, 2006 cho rằng các tàn dư của cây khoai (củ, thân) ở vụ trước sẽ là nơi mà sùng có thể tiếp tục sinh sống và trở thành nguồn lưu tồn và lây lan cho vụ sau Vì vậy, những ruộng khoai lang được

Hình 1.3: Triệu chứng trên củ do sùng khoai lang (Cylas formicarius Fab.)