TUYỂN CHỌN VI KHUẨN VÙNG rễ THUỘC CHI BACILLUS đối KHÁNG với VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM gây BỆNH THỐI củ GỪNG

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT Hội ñồng chấm luận văn tốt nghiệp ñã chấp nhận luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật với t

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÝ THU THẢO

TUYỂN CHỌN VI KHUẨN VÙNG RỄ THUỘC CHI

Luận văn tốt nghiệp Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Cần Thơ, 2010

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT

Tên ñề tài:

TUYỂN CHỌN VI KHUẨN VÙNG RỄ THUỘC CHI

Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS Trần Vũ Phến Lý Thu Thảo

Lớp: BVTV K32

MSSV: 3064975

Cần Thơ, 2010

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Chứng nhận luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo vệ Thực vật với ñề tài:

“TUYỂN CHỌN VI KHUẨN VÙNG RỄ THUỘC CHI BACILLUS ðỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM GÂY BỆNH

THỐI CỦ GỪNG”

Do sinh viên Lý Thu Thảo thực hiện

Kính trình lên hội ñồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 Cán bộ hướng dẫn

TS Trần Vũ Phến

TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT

Hội ñồng chấm luận văn tốt nghiệp ñã chấp nhận luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Bảo vệ Thực vật với tên:

“TUYỂN CHỌN VI KHUẨN VÙNG RỄ THUỘC CHI BACILLUS ðỐI KHÁNG VỚI VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM GÂY BỆNH

THỐI CỦ GỪNG”

Do sinh viên Lý Thu Thảo thực hiện và bảo vệ trước hội ñồng

Ý kiến của hội ñồng chấm luận văn tốt nghiệp:

Luận văn tốt nghiệp hội ñồng ñánh giá ở mức:

DUYỆT KHOA Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

Chủ tịch Hội ðồng

LƯỢC SỬ CÁ NHÂN

Họ và tên: Lý Thu Thảo

Năm sinh: 19/09/1987

Nơi sinh: huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long

Họ và tên cha: Lý Văn Cang

Họ và tên mẹ: Cao Thị Nghiệp

Quê quán: xã Bình Ninh, huyện Tam Bình, tỉnh Vĩnh Long

Quá trình học tập:

1993 – 1998: học tiểu học tại trường tiểu học Bình Ninh B, Tam Bình, Vĩnh Long

1998 – 2002: học THCS tại trường THCS Ngãi Tứ A, Tam Bình, Vĩnh Long

2002 – 2005: học THPT tại trường THPT chuyên Nguyễn Bỉnh Khiêm, Phường 4, Vĩnh Long

2005 – 2006: Luyện thi ñại học tại thành phố Hồ Chí Minh

2006 – 2010: học ñại học tại trường ñại học Cần Thơ, ngành Bảo vệ Thực Vật khóa

32, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

Chân thành biết ơn,

Anh Trần Văn Nhã, chị Trần Thị Thúy Ái và các anh chị trong bộ môn Bảo

vệ Thực vật ñã tạo ñiều kiện cho em hoàn thành tốt thí nghiệm

MỤC LỤC

Lược sử cá nhân i

Cảm tạ ii

Mục lục iii

Danh sách bảng vi

Danh sách hình vii

Tóm lược viii

Mở ñầu 1

CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

1.1 Vài nét về cây gừng 2

1.2 Bệnh thối xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum 2

1.2.1 Triệu chứng bệnh héo xanh 2

1.2.2 ðặc tính của vi khuẩn gây bệnh 2

1.2.3 ðiều kiện phát sinh phát triển bệnh 5

1.2.4 Cây ký chủ 5

1.2.5 Biện pháp phòng trị 5

1.3 Vi sinh vật vùng rễ 6

1.3.1 Khái niệm 6

1.3.2 Vai trò của vi sinh vật vùng rễ 7

1.3.3 Mối quan hệ của các chủng vi sinh vật trong ñất 8

1.4 Sự ñối kháng 8

1.5 Quản lý bệnh có nguồn gốc từ ựất bằng biện pháp sinh học 10

1.5.1 định nghĩa biện pháp sinh học 10

1.5.2 Một số nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong ựất ựể quản lý bệnh có nguồn gốc trên cây trồng 10

1.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong ựất ựể quản lý bệnh héo xanh thối củ gừng 11

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP 12

2.1 Phương tiện 12

2.1.1 Thời gian và ựịa ựiểm 12

2.1.2 Vật liệu và thiết bị 12

2.2 Phương pháp 13

2.2.1 điều tra, thu mẫu 13

2.2.2 Chuẩn bị nguồn gây bệnh và ựối kháng 13

2.2.2.1 Phân lập tác nhân gây bệnh 13

2.2.2.2 Phân lập vi khuẩn dòng Bacillus 14

2.2.3 Các thắ nghiệm khảo sát trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm 14

2.2.4 Phân tắch số liệu 17

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 18

3.1 Thắ nghiệm 1: đánh giá khả năng gây bệnh thối củ của 3 chủng vi khuẩn Ralstonia solanacearum trong môi trường nuôi cấy 18

3.2 Thắ nghiệm 2: đánh giá khả năng ựối kháng của các chủng vi khuẩn chọn lọc sơ khởi ựối với vi khuẩn gây bệnh Ralstonia solanacearum trong ựĩa petri 20

3.3 Thắ nghiệm 3: đánh giá khả năng ựối kháng của các chủng vi khuẩn có triển vọng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh thối củ gừng 24

KẾT LUẬN - ðỀ NGHỊ 34

1 Kết luận 34

2 ðề nghị 34

3.1 Mức ñộ gây bệnh thối củ của 3 chủng R solanacearum trong

môi trường nuôi cấy

20

3.2 ðặc ñiểm phân lập của các chủng vi khuẩn ñối kháng qua chọn

lọc sơ khởi

21

3.3 Khả năng ñối kháng của 41 chủng vi khuẩn vùng rễ với R

solanacearum (chủng Rs TT4) trên môi trường King’B cóagar

23

3.4 Khả năng ức chế sự phát triển của 3 chủng vi khuẩn R

solanacearum của các chủng vi khuẩn ñối kháng ở 24 giờ sau thí

nghiệm

25

3.5 Khả năng ức chế sự phát triển của 3 chủng vi khuẩn R

solanacearum của các chủng vi khuẩn vùng rễ ở 48 giờ sau thí

nghiệm

26

3.6 Khả năng ức chế sự phát triển của 3 chủng vi khuẩn R

solanacearum của các chủng vi khuẩn vùng rễ ở 72 giờ sau thí

nghiệm

27

3.7 Khả năng tiết siderophores của một số chủng vi khuẩn 30

3.8 ðặc ñiểm khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn ñối kháng triển

3.10 Kích thước nội bào tử và tế bào sinh dưỡng của các chủng vi

khuẩn ñối kháng triển vọng

33

DANH SÁCH HÌNH

2.2 Phương pháp trắc nghiệm khả năng ñối kháng của vi khuẩn ñối

với vi khuẩn Ralstonia solanacearum trên môi trường King’B

16

3.1c Khuẩn lạc Ralstonia solanacearum vạch trên môi trường TZC 18

3.1d Triệu chứng rễ củ gừng bị thối và ñối chứng sau khi chủng bệnh 19

3.1e Triệu chứng thân củ gừng bị thối và ñối chứng sau khi chủng

Lý Thu Thảo 2010 “Tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ thuộc chi Bacillus ñối kháng

với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh thối củ gừng” Luận văn tốt

nghiệp Kỹ sư Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng, ðại học Cần Thơ Cán bộ hướng dẫn TS Trần Vũ Phến

TÓM LƯỢC

ðề tài: “Tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ thuộc chi Bacillus ñối kháng với vi

khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh thối củ gừng” ñược tiến hành từ tháng

12/2009 ñến tháng 04/2010 trong ñiều kiện phòng thí nghiệm tại Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng ðề tài ñược thực hiện với mục tiêu phân lập và ñánh giá khả năng ñối kháng của một số chủng vi khuẩn vùng rễ ñối với vi khuẩn Ralstonia solacearum gây bệnh thối củ gừng ðồng thời, ñề tài cũng bước ñầu khảo sát cơ chế ñối kháng của các chủng vi khuẩn ñối kháng ñã phân lập ñược, hổ trợ cho các nghiên cứu kế tiếp cũng như tìm ra phương hướng sản xuất hiệu quả kinh tế hơn, làm giảm ảnh hưởng xấu ñến môi trường và mang lại hiệu quả kinh tế cao trong việc ñiều trị bệnh thối củ gừng hiện nay

Nguồn vi khuẩn ñược phân lập từ rễ, mẫu ñất vùng rễ của những bụi gừng khỏe có biểu hiện vượt trội trên các ruộng gừng thuộc các huyện Chợ Mới, Tri Tôn, tỉnh An Giang và Thành phố Hồ Chí Minh theo phương pháp pha loãng huyền phù

vi khuẩn, ñược chà trên môi trường King’B có agar và có xử lý nhiệt 900C trong 15

phút ñể chọn vi khuẩn nhóm Bacillus Vi khuẩn gây bệnh héo xanh thối củ gừng Ralstonia solanacearum (Rs CM4, Rs TT2, Rs TT3) ñược phân lập từ bụi gừng bị bệnh ñiển hình qua tiến hành quy trình Koch ñược sử dụng cho các thí nghiệm thử ñối kháng trong ñĩa petri

Thí nghiệm 1 ñánh giá khả năng gây bệnh thối củ gừng của 3 chủng vi khuẩn

Ralstonia solanacearum ñược tiến hành trong bình tam giác 500 ml với môi trường

MS vô trùng Kết quả khảo sát cho thấy 100% gừng trong thí nghiệm ñã bị nhiễm bệnh sau 7 ngày chủng bệnh với chỉ số bệnh giữa các chủng vi khuẩn không khác biệt ý nghĩa

Thí nghiệm 2 ñánh giá khả năng ñối kháng qua chọn lọc sơ khởi với 199

chủng vi khuẩn vùng rễ, chọn lọc ñược 41 chủng có khả năng ñối kháng với R solanacearum gây bệnh thối củ gừng chiếm 20,6% Chọn ra ñược 10 chủng vi khuẩn ñối kháng biểu hiện sớm và bền có triển vọng là Tt 5.3, Tt 5.5, Tt 5.9 et, Tt 5.10 et, Tt 5.12 t, Tt 6.2 et, Tt 7.3 e, Tt 7.4 et, Tt 7.7 et, Tt 8.1 t

Tiếp tục sử dụng 10 chủng vi khuẩn vùng rễ trên cùng với 5 chủng vi khuẩn

vùng rễ có khả năng ñối kháng tốt với R solanacearum gây bệnh héo xanh trên cà

chua (PGPR 1, PGPR 3, PGPR 6, PGPR 14, PGPR 17), thử ñối kháng với 3 chủng

trên cà chua nhưng lại không biểu hiện ñối kháng tốt với R solanacearum trên gừng

Hầu hết các chủng vi khuẩn còn lại ñều biểu hiện khả năng ñối kháng ở các mức ñộ khác nhau Các chủng vi khuẩn ñối kháng có triển vọng là PGPG1, PGPR 3, Tt 8.1 t,

Tt 5.3, Tt 5.10 et, Tt 7.3 e, Tt 5.12 t ñều là vi khuẩn thuộc chi Bacillus

Thí nghiệm 4 ñược thực hiện nhằm ñánh giá khả năng tiết siderophores của các chủng vi khuẩn ñối kháng Kết quả có 9/14 chủng có khả năng này

MỞ ðẦU

Gừng ñược dùng tươi như một loại gia vị và chế biến thành nhiều sản phẩm

như mứt, kẹo, rượu, thuốc, Ở nước ta, cây gừng (Zingiber officinale) ñược trồng

phổ biến trong các hộ gia ñình với quy mô nhỏ Vài năm trở lại ñây, do nhu cầu gừng trên thị trường ngày càng tăng, nhiều nơi ñã trồng phổ biến trên diện tích rộng, gừng ñã trở thành cây có giá trị kinh tế khá cao, ngoài tiêu thụ nội ñịa còn ñể xuất khẩu (Nguyễn Mạnh Chinh và Nguyễn ðăng Nghĩa, 2007)

Phần lớn tác nhân làm thất thu năng suất trên gừng là do bệnh hại, trong ñó bệnh thối củ ñang là vấn ñề ñáng quan tâm hiện nay vì chưa có thuốc ñặc trị hữu hiệu (Trần Thị Ba, 2006)

Một số biện pháp nhằm chống lại bệnh hại ñã ñược thực hiện nhưng không mang lại hiệu quả như mong muốn Chọn giống kháng bệnh là một hướng ñi ñúng nhưng khó áp dụng do chi phí ñầu tư cao (Nguyễn Trọng Cần, 2007) Biện pháp phòng trừ sinh học là một trong những chiến lược ñể phòng trừ các bệnh hại có nguồn gốc từ ñất ða số các nghiên cứu ñã bắt ñầu và tập trung chủ yếu trên vi

khuẩn phát huỳnh quang Pseudomonas flourescens và các vi khuẩn gram âm, trong

ñó cũng có nhiều chủng vi khuẩn vùng rễ có khả năng kích thích tăng trưởng (plant

growth-promoting rhizobacteria (PGPR)) Ngoài ra, dòng Bacillus chống héo xanh

do vi khuẩn cũng ñã ñược nghiên cứu nhiều và tạo ra các chế phẩm vi sinh vật có triển vọng, ñáp ứng cho chương trình sản xuất rau sạch hiện nay (Nelson, 2004)

Từ ñó ñề tài “Tuyển chọn vi khuẩn vùng rễ thuộc chi Bacillus ñối kháng

với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây bệnh thối củ gừng” ñược thực hiện ñể

ñánh giá khả năng ñối kháng của các chủng vi khuẩn vùng rễ ñối với vi khuẩn

Ralstonia solanacearum gây bệnh thối củ gừng ðồng thời, ñề tài cũng bước ñầu

khảo sát cơ chế ñối kháng của các dòng Bacillus này nhằm giúp sản xuất hiệu quả

kinh tế hơn, làm giảm ảnh hưởng xấu ñến môi trường và mang lại hiệu quả kinh tế cao trong việc ñiều trị bệnh thối củ gừng hiện nay

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY GỪNG

Gừng có nguồn gốc từ đông Nam Châu Á, Ấn ựộ, Jamaica, Trung Quốc, Srilanka, Malaysia, Indonesia, Nhật Bản, các nước Tây Phi, Trung Mỹ trồng nhiều gừng nhất (Phan Hữu Trinh và ctv., 1986) Ở Việt Nam, gừng trồng rất sớm từ thế

kỷ thứ 2 trước công nguyên Hiện nay, gừng có mặt khắp các ựịa phương, từ vùng núi cao ựến vùng ựồng bằng và cả ngoài các hải ựảo Gừng ựược xếp vào lớp thực vật một lá mầm, là loại cây thảo sống lâu năm, cao từ 8 cm -80 cm (đỗ Huy Bắch và ctv., 2005) Còn theo Mai Văn Quyền và ctv (2007) thì gừng cao 50 cm -100 cm, tuỳ loại ựất có nơi cao 150 cm Gừng cho năng xuất cao 60 tấn/ha (đỗ Huy Bắch và ctv., 2005) Gừng ựược sử dụng làm cây gia vị, làm thuốc và còn ựược sử dụng nhiều trong công nghệ bánh kẹo

Thân rễ (củ) của gừng chứa 2-3% tinh dầu với các thành phần chủ yếu là: anpha-camphen, beta-phelandren, một cacbua là zingiberen, một rượu sesquitecpen Ngoài ra, nó còn chứa các chất nhựa dầu (5%), chất béo (3,7%), tinh bột và các chất cay như: zingeron, zingerola và shogaola (Võ Văn Chi, 2005)

1.2 BỆNH THỐI XANH DO VI KHUẨN RALSTONIA SOLANACEARUM

1.2.1 Triệu chứng bệnh thối xanh

Cây xuất hiện các triệu chứng héo rủ vào buổi trưa nắng, chiều tươi lại Giai ựoạn sau, lá chuyển sang màu vàng duỗi thẳng ra, về sau tất cả các lá ựều bị ảnh hưởng Lá dưới vàng trước, thân bị nhũn nước và rời khỏi củ Mô dẫn nước sẫm màu, củ sậm màu hơn và xuất hiện các vùng nhũn nước chứa các túi dịch như sữa Chất dịch ứa ra mặt cắt của củ (Nguyễn Thị Nghiêm, 2006) Cây bị chết vài ngày sau ựó

Theo Trần Văn Hòa và ctv (2000), bệnh rất khó phát hiện sớm vì vi khuẩn thường tấn công phần củ và phần non của củ, khi củ bị thối sẽ lan ựến thân nhất là măng gừng Khi thân bị thối mềm cây bị héo và chết, nhổ bụi gừng lên gần như tất

cả phần non bị thối, phần già bị thối chậm hơn

1.2.2 đặc tắnh của vi khuẩn gây bệnh

Vi khuẩn là loài có tắnh chuyên hóa rộng, có nhiều chủng sinh học khác nhau, gây hại trên nhiều loại cây trồng, ựặc biệt các cây thuộc họ cà (cà chua, cà phổi), khoai tây, thuốc lá, chuối, gừng và gần ựây ựã phát hiện ựược trên nhiều loại cây trồng khác (Hayward, 2000)

Theo Buddenhagen (1962), dựa trên sơ sở phổ cây ký chủ và vùng ñịa lý

phân bố của R solanacearum, người ta ñã xác ñịnh ñược: Race 1 (Biovar 1, 3, 4)

gây hại trên các cây họ cà, họ ñậu; Race 2 (Biovar 2, 3) gây hại trên chuối; Race 3 (Biovar 2) chủ yếu gây hại trên khoai tây; Race 4 (Biovar 3, 4) gây hại cây gừng và Race 5 (Biovar 5) gây hại trên cây dâu tằm (trích bởi Vũ Triệu Mân và Lê Lương

Tề, 1999) Cũng theo OEPP (2004) thì R solanacearum Race 4 là tác nhân gây

bệnh trên gừng

Theo Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề (1999) thì:

Vi khuẩn có hình gậy, hai ñầu hơi tròn, kích thước trong khoảng 0,9-2 x 0,8 µm, chuyển ñộng có lông roi (1-3 roi).Vi khuẩn nhuộm gram âm Trên môi trường Kelman (1954) khuẩn lạc màu trắng kem nhẵn bóng, nhờn (vi khuẩn có tính ñộc gây bệnh) Nếu khuẩn lạc chuyển sang kiểu khuẩn lạc nâu, răn reo là isolat vi khuẩn mất tính ñộc (nhược ñộc) ðể phát hiện dòng vi khuẩn có tính ñộc thường dùng môi trường TZC Trên môi trường này, isolat vi khuẩn có tính ñộc sẽ có khuẩn lạc ở giữa màu hồng rìa trắng

0,5-Vi khuẩn gây hại mạnh trong ñiều kiện nhiệt ñộ và ẩm ñộ cao 0,5-Vi khuẩn sinh trưởng thích hợp trong khoảng nhiệt ñộ từ 26-300C, nhiệt ñộ tối ña là 410C, tối thấp

là 100C và nhiệt ñộ làm vi khuẩn chết là 550C Vi khuẩn gây bệnh phát triển trong phạm vi pH khá rộng (6-8), thích hợp nhất là 6,8-7,2

Vi khuẩn có khả năng phân giải làm lỏng gelatin, có dòng có khả năng khử nitrat, không có khả năng thủy phân tinh bột, esculin, có khả năng tạo ra axit khi phân giải một số loại ñường, hợp chất cacbon v.v

Theo ðỗ Tấn Dũng (2004) thì vi khuẩn R solanacearum có những ñặc ñiểm

hình thái, ñặc tính sinh lý, sinh hóa như sau:

Bảng 1.1 Những ựặc ựiểm hình thái, ựặc tắnh sinh lý, sinh hóa của R solanacearum (đỗ Tấn

Dũng, 2004)

Chỉ tiêu theo dõi

Chủng vi khuẩn R solanacearum

Cà chua Khoai tây Thuốc lá Lạc Cây cà

Màu sắc khuẩn lạc trên TZC hồng

nhạt hồng nhạt

hồng nhạt

hồng nhạt

hồng nhạt Hình dạng tế bào vi khuẩn gậy gậy gậy gậy gậy

ựầu ở một ựầu

ở một ựầu

ở một ựầu

ở một ựầu

Tạo bong bóng trong H 2 O 2

đông hóa arginine làm kiềm

Tạo hạt nhỏ li ti trên môi

*

Vi khuẩn tồn tại chủ yếu trong ñất, tàn dư cây bệnh, vật liệu giống nhiễm bệnh, một số cây ký chủ phụ như họ cà, họ ñậu… và cỏ dại Chúng trở thành nguồn bệnh cho vụ sau năm sau Ở trong ñất, vi khuẩn có thể bảo tồn sức sống lâu dài tới 5-6 năm hoặc 6-7 tháng tùy thuộc vào ảnh hưởng của nhiệt ñộ, ñộ ẩm, loại ñất, các yếu tố sinh vật và các yếu tố khác (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999), nếu vi khuẩn bám dính trên bề mặt hạt giống chỉ tồn tại trong vòng hai ngày (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998)

1.2.3 ðiều kiện phát sinh phát triển bệnh

Bệnh phát triển thuận lợi ở nhiệt ñộ 26-300C, pH từ 6,8-7,2 (Tạ Thu Cúc, 2005) Bệnh lây truyền trong ñiều kiện ẩm ướt và cả ñất bám trên nông cụ (Nguyễn Thị Nghiêm, 2006) Cây thể hiện triệu chứng sau khi vi khuẩn xâm nhập vào rễ qua vết thương Bệnh lan truyền trên ñồng ruộng từ cây này sang cây khác, từ vùng có ổ bệnh sang vùng xung quanh bằng nhiều con ñường khác nhau: nhờ nước mưa, nước tưới, không khí, truyền lan qua hạt giống nhiễm bệnh và qua các hoạt ñộng chăm

sóc của con người Ngoài ra, tuyến trùng Meloidogyne incognita và các tuyến trùng

khác hoạt ñộng trong ñất cũng tạo vết thương cho vi khuẩn truyền bệnh (Lê Lương

Tề và Vũ Triệu Mân, 1999) Bệnh phát triển và gây hại trong ñiều kiện nhiệt ñộ cao,

ẩm ñộ cao, mưa gió bão nhiều Bệnh thường phát sinh gây hại nặng trên các chân ñất cát, thịt nhẹ và các chân ñất nhiễm bệnh (Nguyễn Văn Viên và ðỗ Tấn Dũng, 2003) Còn theo ðường Hồng Dật (1997) bệnh thường xuất hiện mùa mưa và các chân ñất thịt, nhiệt ñộ cao cũng là ñiều kiện thuận lợi cho bệnh phát triển

1.2.4 Cây ký chủ

Bệnh gây hại trên 200 loài thuộc 44 họ cà chua, cà tím, gừng, huệ ta, ớt, cải bắp (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999; Nguyễn Văn Viên và ðỗ Tấn Dũng, 2003) Ngoài ra, cỏ dại cũng là ký chủ của bệnh

1.2.5 Biện pháp phòng trị

Theo Nguyễn Văn Viên và ðỗ Tấn Dũng (2003) thì vi khuẩn gây bệnh là loài ký sinh ña thực với nhiều chủng nòi khác nhau, phân bố rộng, truyền lan trên ñồng ruộng bằng nhiều con ñường khác nhau Bởi vậy ñể phòng chống bệnh có hiệu quả, nhằm hạn chế sự phát sinh và tác hại thì cần phải áp dụng các biện pháp phòng trừ tổng hợp như: chọn giống khỏe, luân canh cây trồng không là ký chủ của mầm bệnh, làm tốt công tác vệ sinh ñồng ruộng, sử dụng phân cân ñối kết hợp với phân hữu cơ Khi bệnh nặng, nhổ bỏ cây và tiêu ñộc bằng nước vôi bột hoặc nước muối 15-20% (Tạ Thu Cúc, 2005)

Theo Trần Văn Hòa và ctv (2000) thì nên lên liếp cao, thoát nước tốt, bón

Bên cạnh ñó việc trồng với mật ñộ hợp lý cũng là một giải pháp ñể tránh bệnh Khi thấy gừng chớm bệnh, nhổ lên và tiêu hủy ngay Dùng vôi bột hoặc CopperZinC 85

WP hay COC 85 rải xuống ñất nơi bụi gừng vừa nhổ lên Tưới một trong các loại thuốc sau xung quanh buội gừng bị bệnh: Kasuran 50 WP, New Kasuran 16,6 WP, Kasumin 2L, Starner 20 WP, với liều lượng 50-100cc (g)/10lít, tưới 7-10 ngày/lần

1.3 VI SINH VẬT VÙNG RỄ

1 3.1 Khái niệm

Bộ rễ của cây rất phức tạp ñồng thời ảnh hưởng của bộ rễ ñối với môi trường chung quanh cũng thay ñổi tùy theo loại cây và thời kỳ sinh trưởng của cây Vùng

rễ (rhizosphere) là vùng bao quanh bộ rễ của thực vật, khái niệm này ñược Hiltner

ñề ra từ năm 1904, tuy nhiên cho ñến nay chúng ta vẫn chưa có phương pháp thống nhất xác ñịnh phạm vi của hệ rễ (Phạm Văn Kim, 2006)

Rhizosphere là thể tích ñất bao chung quanh và chịu ảnh hưởng của hệ rễ cây,

và rhizoplane là diện tích mặt rễ cây có ái lực mạnh với các phần tử ñất Trong các nghiên cứu về vi sinh vật ñất, thuật ngữ rhizophere bao hàm cả phần rhizoplane Vi khuẩn vùng rễ (rhizobacteria) là những vi khuẩn sống ở vùng rễ và ñịnh vị ñược ở

rễ cây; chúng có khả năng sinh sôi và chiếm lĩnh các ổ sinh thái ở rễ vào tất cả các giai ñoạn phát triển của cây Có khoảng 2-5% vi khuẩn vùng rễ, khi ñược chủng vào ñất có hệ vi sinh vật cạnh tranh, biểu hiện ảnh hưởng có lợi cho sự tăng trưởng của cây (plant growth promoting rhizobacteria – PGPR) (Antoun và Prévost, 2005; ñược trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Hằng, 2008)

Theo Vessey (2003) có hai kiểu liên hệ giữa cây chủ và các PGPR (vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh vùng rễ):

• Vi sinh vật quanh rễ cây

Nhiều vùng rễ non ñược ñịnh cư bởi vi khuẩn, nơi ñây có nhiều hốc sinh thái

thích hợp mà những vi khuẩn thuộc các loài như Arthorobacter, Azotobacter, Bacillus và Pseudomonas có thể phát triển Nhiều bảng báo cáo về vi khuẩn vùng rễ cho thấy: vi khuẩn vùng rễ ảnh hưởng có lợi lên sự tăng trưởng của cây do chúng có

khả năng kiềm chế hay chiếm chổ của mầm bệnh (Lambert et al.,1987; ñược trích dẫn bởi Cavaglieri et al., 2004)

• Vi sinh vật nội sinh rễ

PGPR thường là các vi khuẩn sống tự do, nhưng một số loài trong ñó có thể xâm nhập vào mô cây sống mà không làm cây biểu hiện triệu chứng bị xâm nhiễm ñược gọi là các vi khuẩn nội sinh rễ (endophytes), và ñể thâm nhập vào rễ, trước hết chúng phải là những vi khuẩn vùng rễ (Antoun và Prévost, 2005; ñược trích bởi

Vi khuẩn nội ký sinh rễ thường là những vi khuẩn ñược tách ra từ mô cây ñã

khử trùng bề mặt hoặc ñược trích ra từ phía trong của cây (Hallmann et al, 1997;

ñược trích dẫn bởi Kloepper et al., 2006)

1.3.2 Vai trò của vi sinh vật vùng rễ

Theo Phạm Văn Kim (2006) thì vi sinh vật ở hệ rễ thực vật giữ vai trò khá quan trọng:

- Vi sinh vật tiết ra CO2, các acid hữu cơ và acid vô cơ trong quá trình hoạt ñộng của chúng, có tác ñộng lớn ñối với việc làm cho các khoáng chất hoặc các chất như lân dưới dạng không tan, sẽ chuyển hóa thành dạng ñơn giản, dễ tan và dễ ñược cây hấp thụ Vi khuẩn hòa tan lân theo một số cơ chế khác nhau bao gồm việc tạo ra các acid hữu cơ, giúp tăng lượng lân hữu dụng cho cây, ñặc biệt trong các ñất có hàm lượng lân tích tụ cao (Goldstein, 1986) Một số vi sinh vật trong ñất có khả năng gia tăng lân nhiều hơn bằng cách tạo ra các enzym phosphatase ñể cắt dạng lân hữu cơ hay tạo ra các acid hữu cơ trong quá trình biến dưỡng hòa tan lân khó tan Chúng sử dụng nguồn lân khó tan ñể phát triển tạo nhiều sinh khối, làm giàu lượng chất hữu cơ trong ñất giúp cây trồng phát triển nhanh; do ñó cây trồng có thể ñủ dinh dưỡng ñể phát triển và chống lại ñược mầm bệnh tấn công (Vessey, 2003 trích bởi Nguyễn Trọng Cần, 2007)

- Vi sinh vật tiết ra các kích thích tố tăng trưởng của thực vật giúp rễ thực vật

phát triển ñược tốt Một số loại thuộc chi Pseudomonas và Agrobacterium có khả

năng tiết ra các indol-acetic-acid (IAA) kích thích cây trồng ra rễ Các chất kích thích tố tăng trưởng này có trong ñất với nồng ñộ rất thấp, chưa có ảnh hưởng ñến cây, tuy nhiên nếu bón phân hữu cơ cho ñất, chúng ta làm gia tăng mật số vi sinh vật trong ñất, tức gia tăng nồng ñộ chất kích thích tố sinh trưởng, ñiều này có ảnh hưởng tốt ñối với bộ rễ thực vật IAA có thể trực tiếp làm gia tăng sự phát triển của

rễ bằng cách kích thích sự kéo dài, phân cắt tế bào, hoặc gián tiếp thông qua ảnh hưởng của hoạt tính men 1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid (ACC) Deaminase của vi khuẩn làm phá hủy ACC (tiền chất của ethylen), nên ngăn cây tạo ra lượng ethylen ở mức ức chế sự phát triển của rễ (Antoun & Prévost, 2005 trích bởi Nguyễn Thị Thu Hằng, 2008)

Có 80% vi khuẩn phân lập từ vùng rễ có khả năng sản sinh IAA, chúng không chỉ có hiệu ứng sinh lý lên cây trồng mà còn có thể có vai trò của phytohocmon ñáp ứng sự tương tác vi khuẩn - thực vật; vì vậy mà chúng ñược

nghiên cứu nhiều Vi khuẩn Bacillus phân lập từ ñất trồng có khả năng sinh tổng

hợp IAA, có thể thay ñổi theo thời gian và từng chủng IAA ñược tiết ra trong ñiều

số lượng rễ lông hút và các rễ bên (Okon và Kapulnik, 1986) Theo Frankenberger

và Arshad (1991) sinh tổng hợp IAA trong ñất do vi sinh vật gia tăng nhờ vào trytophan trong dịch tiết từ rễ hoặc tế bào phân giải

1.3.3 Mối quan hệ giữa các chủng vi sinh vật trong ñất

Theo Phạm Văn Kim (2006) thì những vi sinh vật trong ñất chúng có những tác ñộng với nhau như sau:

- Không có tác ñộng lẫn nhau (neutralism) những chủng vi khuẩn không có tác ñộng lẫn nhau hoặc tác ñộng với nhau quá nhỏ không ñáng kể

- Cạnh tranh (competition) hai chủng tranh nhau nguồn dinh dưỡng hoặc không gian phát triển

- Tác ñộng hổ trợ hay tương trợ (mutalism) hai chủng tác ñộng lẫn nhau, làm cho sự phát triển của chúng ñều tăng lên so với lúc sống riêng lẽ

- Tác ñộng tích cực một chiều (commensalism) một chủng tác ñộng tích cực lên chủng thứ hai

- Tác ñộng tiêu cực một chiều (amensalism) chủng này tác ñộng tiêu cực lên chủng kia và không ngược lại

1.4 SỰ ðỐI KHÁNG

Theo Nelson (2004) thì vi khuẩn ñối kháng là những vi khuẩn hạn chế ñược

sự phát triển của các tác nhân gây bệnh thực vật bằng nhiều cách theo những cơ chế như: tiết chất kháng sinh, tiết enzyme, phân hủy vách tế bào hoặc cạnh tranh thức ăn

và nơi ở với vi sinh vật gây bệnh Ngoài những cơ chế trên thì Nelson (2004) còn cho rằng vi khuẩn ñối kháng còn có khả năng sản xuất siderophore (phức liên kết ion sắt) làm cho chúng không hữu dụng ñối với mầm bệnh, ñể ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh Ngoài ra, các vi sinh vật này còn tổng hợp enzyme thủy phân chitinases, glucanase hoặc HCN

Vi khuẩn tạo siderophore kích thích cây tăng trưởng một cách gián tiếp qua việc cô lập lượng sắt có giới hạn trong vùng rễ, ñặc biệt trong ñất trung tính và ñất kiềm, làm giảm lượng sắt hữu dụng cho sự tăng trưởng của mầm bệnh (Subba Rao, 1999) Sắt (Fe) trong ñất khá phong phú dưới dạng sắt oxides kết tinh, vô ñịnh hình

và khoáng có Fe khác Sự hòa tan các dạng khoáng này cho hai dạng Fe hòa tan,

Fe2- và Fe3+, có thể hữu dụng cho cây và vi sinh vật Sự hòa tan này phụ thuộc vào ñiện thế oxy hóa-khử của ñất (soil redox potential) và pH Dưới ñiều kiện thoáng khí (oxidizing) ở pH trung tính-kiềm, Fe hiện diện chủ yếu dưới dạng khoáng sắt Fe (III), Fe(OH)3, thường không hòa tan (Kso = 10-38; Lindsay và Schwab, 1982) Dưới những ñiều kiện này, các sinh vật sử dụng ñất là nguồn cung cấp khoáng duy

nhất, rất nhạy cảm với sự thiếu Fe Thực vật và vi sinh vật ñã tiến hóa những cơ chế khác nhau nhằm có thể tìm ñược Fe dưới các ñiều kiện Fe bị giới hạn Siderophore

cơ bản ñược tiết ra từ vi khuẩn, nấm và cây một lá mầm ñể chống lại tình trạng thiếu sắt (Ratledge and Dover, 2000) Các hợp phức này có thể ñược xem như là các phân tử nhỏ (<1000 Da, cũng có một số có trọng lượng phân tử lớn hơn) ñược tổng hợp rất nhanh trong một khoảng thời gian ngắn nhưng hoàn toàn có thể xác ñịnh ñược (Neilands, 1981, 1995)

Theo Phạm Văn Kim (2000) thì vi sinh vật ñối kháng trong ñất có vai trò rất quan trọng lên dịch bệnh của cây trồng, chúng có thể kìm hãm sự phát triển của mầm bệnh Các yếu tố môi trường vừa tác ñộng lên mầm bệnh vừa tác ñộng lên nhóm sinh vật ñối kháng, vì vậy mà các yếu tố môi trường không thuận lợi cho sự phát triển của sinh vật ñối kháng sẽ là ñiều kiện tốt cho mầm bệnh phát sinh và phát triển Vi sinh vật ñối kháng theo các cơ chế như: kháng sinh và tiêu sinh (ngoại tiêu sinh và nội tiêu sinh), sự cạnh tranh, sự ký sinh và bắt mồi

Theo Podile và Kishore (2006) thì cơ chế ñối kháng của PGPR bao gồm:

• Sự kháng sinh:

Các chất kháng sinh có thể là ammonia, butyrolactones, 2,4-diacetyl phloroglucinol (DAPG), kanosamine, oligomycin A, oomycin A, phenazine-1-carboxylic acid, pyoluteorin, pyrrolnitrin, viscosinamide, xanthobaccin, and zwittermycin A Trong ñó, nhiều chất có phổ tác ñộng rộng và ñược chú ý nhiều nhất là DAPG

• Cạnh tranh dưỡng liệu

PGPR sử dụng nguồn dưỡng liệu một cách có hiệu quả và tăng trưởng nhanh hơn so với vi sinh vật gây bệnh cây trồng Ví dụ vi khuẩn có khả năng tiết siderophore ñể cạnh tranh sắt với vi sinh vật gây bệnh

• Ký sinh hoặc phân giải

PGPR ký sinh và tạo ra các enzymes thủy phân phân hủy vách tế bào vi sinh vật gây bệnh Trong ñó quan trọng nhất là enzymes chitinases và glucanases

• Ức chế enzymes hoặc ñộc tố của mầm bệnh

Một số enzymes ngoại bào của mầm bệnh như pectolytic enzymes (exo- and endo- polygalacturonases, pectin lyases), cellulases và cutinase bị ức chế bởi

endoproteinase của vi khuẩn

1.5 QUẢN LÝ BỆNH CÓ NGUỒN GỐC TỪ ðẤT BẰNG BIỆN PHÁP SINH

HỌC

1.5.1 ðịnh nghĩa biện pháp sinh học

Biện pháp sinh học trong phòng trị bệnh cây là ñiều khiển môi trường, cây trồng và vi sinh vật ñối kháng một cách thích hợp, ñể tạo nên một cách cân bằng sinh học cần thiết, giúp giảm mật số của mầm bệnh xuống ngưỡng gây hại Nhờ ñó, bệnh của cây trồng chỉ xuất hiện ở mức ñộ nhẹ, không gây ảnh hưởng quan trọng về mặt kinh tế (Phạm Văn Kim, 2000)

1.5.2 Một số nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong ñất ñể quản lý bệnh có nguồn gốc từ ñất trên cây trồng

(Trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Hằng, 2008)

Trên thế giới nhiều sản phẩm từ vi sinh vật vùng rễ ñã ñược ñưa vào nghiên cứu, thử nghiệm và ứng dụng thực tế ñem lại nhiều thành công trong sản xuất nông nghiệp

Ở Thái Lan, những nghiên cứu trong nhà kính cho thấy vi khuẩn nội sinh

Bacillus có gợi lên tính kích kháng ISR trong cây (Jetiyanon và Kloepper, 2002), ñây là thành công ñầu trong việc ứng dụng vi khuẩn nội sinh – kích kháng ISR (kích kháng lưu dẫn cảm ứng do PGPRs) trong nông nghiệp ở vùng nhiệt ñới Với mục tiêu tìm ra hỗn hợp vi khuẩn nội sinh có hình thành nội bào tử và có sự gợi ISR, trong nghiên cứu này ñã sử dụng bốn hệ thống mầm bệnh và cây ký chủ khác nhau

gồm: cà chua (Lycopencium esculentum Mill) và Ralstonia solanacearum, ớt sừng trâu (Capsicum annuum var acuminatum) và Colletotrichum gloeosporioides, cải

bẹ xanh (Brassica chinensis var parachinensis) và Rhizoctonia solani và dưa leo (Cucumis sativus L.) với CMVt Kết quả cho thấy có một chủng (B amyloliquefaciens IN937a) và bốn hỗn hợp bao gồm: IN937a + B subtilis IN937b; IN937b + B pumilus SE34; IN937b + B pumilus SE49; và IN937b + B pumilus

INR7 làm giảm tỷ lệ bệnh và tính ñộc của cả bốn bệnh một cách ñáng kể Kết quả này ñáng ghi nhận ở hai lý do: kết quả chỉ ra rằng ISR ñược gợi lên bằng những chủng vi khuẩn nội sinh ñặc biệt có thể bảo vệ cây ký chủ dưới ñiều kiện nhiệt ñới; hỗn hợp kết hợp hai chủng vi khuẩn tốt hơn một chủng vi khuẩn ñộc lập trong việc gợi sự bảo vệ một cách có hiệu quả trong nhiều cây ký chủ chống lại những mầm bệnh khác nhau (Kloepper và Ryu, 2006)

Ba cánh ñồng thử nghiệm ñược áp dụng ba công thức khác nhau của các

chủng nội sinh IN937a, IN937b và SE34 (Murphy et al., 2000) nhằm xác ñịnh khả

năng của chúng về việc gợi lên ISR chống lại bệnh Tomato mottle virus (ToMoV)

với vector truyền bệnh là rầy phấn trắng (Bremisia argentifolii) Cánh ñồng bị

nhiễm với ToMoV qua sự truyền lan của rầy phấn trắng trưởng thành mang ñộc tố gây bệnh từ những cây cà chua kề bên có khả năng kháng bệnh ToMoV ñã ñược chủng nhiễm bệnh Tỷ lệ bệnh và tính ñộc của bệnh giảm một cách ñáng kể theo một hoặc nhiều công thức của chủng nội sinh

Theo Võ Minh Luân (2007) thì sản phẩm Yield Shield với thành phần hoạt

chất là nội bào tử của Bacillus pumilus, chủng GB34 ñã ñược ñăng ký tại Mỹ vào năm 2003 ñể phòng trị bệnh trên ñậu nành Chủng B pumilus T4 cũng kích thích tạo ISR chống lại bệnh trên dưa leo do vi khuẩn Erwinia tracheiphila, cũng như bệnh do nấm Rhizoctonia và Fusarium Sản phẩm Bio Yield với thành phần hoạt chất là hai chủng vi khuẩn Bacillus bao gồm: B amyloliquefaciens GB99 và B subtilis GB122, ñược khuyến cáo dùng ñể kích kháng trên cây cà chua, ớt, cải bắp, cải bông, dưa leo, dưa hấu nhằm chống lại tác nhân gây bệnh và kích thích tăng trưởng

1.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn ñối kháng ñể quản lý bệnh héo xanh thối củ gừng

Ravindran và Nirmal Babu (2005) ñã tổng hợp ñược một số nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn ñối kháng ñể quản lý bệnh héo xanh thối củ gừng có hiệu quả như:

Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas glumae , Pseudomonas cepacia, các dòng Bacillus và các dòng Erwinia

Một số tác nhân sinh học khác cũng ñã ñược nghiên cứu nhưng ứng dụng chưa rộng rãi vì khả năng quản lý bệnh của chúng không cao hơn so với việc sử dụng vi khuẩn ñối kháng (Chen and Echandi, 1984) Các vi khuẩn ñối kháng tìm ñược từ các cây gừng không bị héo xanh trong ruộng gừng bị héo xanh thì có tiềm năng tốt về khả năng ñối kháng bệnh (Frey et al., 1993)

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP

- Dụng cụ thu thập mẫu: bọc, dao, cồn, viết…

- Tủ lạnh, tủ cấy vi sinh, tủ ñịnh ôn, tủ thanh trùng khô autocave, máy lắc ngang, nồi hấp

- Kính hiển vi, micropipette, ñĩa petri, ống nghiệm, lam ñếm

- Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm:

+ Môi trường King’B

+ Môi trường O-CAS (Overlaid CAS)

Hexadecyltrimetyl amonium bromide (HDTMA) 72,9 mg

Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) 30,24 mg

1 mM FeCl3.6H2O trong 10 mM HCl 10 ml

Agarose 0,9%

+ Môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962)

- Các dòng vi khuẩn vùng rễ ñối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum

gây bệnh héo xanh trên cà chua từ các nghiên cứu của Trần Vũ Phến và ctv (2008, 2009) ñã ñược trữ nguồn tại nhà lưới Bộ Môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông Nghiệp

và Sinh học ứng dụng

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 ðiều tra, thu mẫu

- Chọn ruộng ñiều tra: Chọn những ruộng (10 ruộng) trồng gừng có diện tích

>1000 m2

- Thu thập mẫu: chọn thu 5 ñiểm (mẫu) /ruộng, với 4 mẫu khỏe, mỗi mẫu là 1 cây sinh trưởng, phát triển vượt trội nhất trong ruộng có bệnh thối củ gồm rễvà ñất bám vào rễ, cho vào bọc nylon riêng, ghi ký hiệu (= ký hiệu phiếu ñiều tra) và 1mẫu cây bệnh (mẫu cây khỏe gần mẫu cây bệnh) Mẫu ñược bảo quản ở 2-50C

2.2.2 Chuẩn bị nguồn gây bệnh và ñối kháng

2.2.2.1 Phân lập tác nhân gây bệnh:

Mẫu củ mới bị nhiễm bệnh ñược chọn và cắt ra thành từng ñoạn dài khoảng

lần cho vào ựĩa petri có lót giấy thấm và nước cất vô trùng, ủ trong tủ ựịnh ôn ở

30oC

Sau 2 ngày, tách ròng vi khuẩn và vạch trên môi trường TZC; nếu là

Ralstonia solanacearum thì khuẩn lạc thể hiện màu ựặc trưng (rìa trắng ựục, tâm ựỏ tắm)

Tiến hành thực hiện qui trình Koch (Engelkirk P.G và Burton G.R.W, 2003)

ựể khẳng ựịnh tác nhân gây bệnh

- Gừng mọc mầm ựược khoảng 1 cm ựược khử trùng bằng chlorin 0,5% trong

15 phút và trồng trong bình tam giác có chứa 100 ml môi trường MS Sau 7 ngày, gừng ra lá non thì tiến hành chủng 1 ml (106 cfu/ml) huyền phù vi khuẩn ựã phân lập vào môi trường

- Quan sát cây cây gừng bị nhiễm bệnh, triệu chứng biểu hiện tương tự triệu chứng ghi nhận ựược ngoài ựồng khi thu mẫu

- Tái phân lập vi khuẩn từ củ gừng nhiễm bệnh trong bình tam giác chứa môi trường MS Khuẩn lạc vi khuẩn lúc này phải tương tự với khuẩn lạc vi khuẩn trước khi chủng bệnh

- Sau khi hoàn tất, vi khuẩn phân lập ựược ựã ựược xác ựịnh là tác nhân gây bệnh thối củ gừng

2.2.1.2 Phân lập vi khuẩn dòng Bacillus

Rễ (0,2g) thu từ cây khoẻ cho vào ống nghiệm có chứa 10 ml nước cất vô trùng Sau ựó lắc trong 2 giờ, vi khuẩn ựược phân lập từ huyền phù ựược tách ròng theo phương pháp chà trên mặt môi trường trong ựĩa petri chứa môi trường KingỖB

có agar, xử lý nhiệt ở 90oC trong 15 phút Sau ựó ủ trong tủ ựịnh ôn ở 30oC

Rễ (từ ống nghiệm bên trên), sau khi ựược khử trùng mặt ngoài (chlorin 1%, trong 1 phút, rửa với nước cất vô trùng 3 lần), nghiền trong cối ựã khử trùng với cồn, thu huyền phù mẫu rễ chà và cũng xử lý nhiệt như trên

Quan sát, mô tả dạng khuẩn lạc ựể chọn những khuẩn lạc rời rạc

Các dạng khuẩn lạc khác nhau ựược chọn và chuyển sang môi trường KingỖB trong ống nghiệm, kiểm tra lại sự tinh ròng

Nhuộm nội bào tử, ựể xác ựịnh vi khuẩn thuộc dòng Bacillus

Các chủng vi khuẩn ựã tinh ròng ựược trữ ở 4oC, trong ống eppendoft dùng

làm vật liệu khảo sát khả năng ựối kháng với vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây

bệnh thối củ gừng

2.2.3 Các thắ nghiệm khảo sát trong ựiều kiện phòng thắ nghiệm

Thắ nghiệm 1: đánh giá khả năng gây bệnh thối củ gừng của 3 chủng vi khuẩn

Ralstonia solanacearum trong môi trường nuôi cấy

Mục ựắch:

đánh giá cấp bệnh, chỉ số bệnh gây ra trên gừng của ba chủng vi khuẩn gây