LUẬN văn sư PHẠM hóa xác ĐỊNH dư LƯỢNG CHẤT KÍCH THÍCH TĂNG TRƯỞNG họ b AGONISTS TRONG THỊT gà BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG GHÉP 2 lần KHỐI PHỔ (LC MS MS)

GVC Phan Thành Chung, ThS... Ví d&, dùng lo i detector UV hay UV–VIS thì pha ng ph i trong su t trong các vùng ph, ó, hay dùng detector hu'nh quang thì pha ng ph i không có tính hu'nh qu

L I C M N

Lu n v n t t nghi p c hoàn thành trong kho ng sáu tháng v i s n l c tìm tòi

h c h i c a chính b n thân Nh ng t c k t qu t t thì th y cô luôn là nh ng

ng i d n ng còn gia ình, b n bè và m i ng i xung quanh luôn ng viên, giúp tôi trong su t quá trình th c hi n tài này Nhân ây, tôi xin g i l i c m n chân thành n:

– ThS GVC Nguy n Th Thu Th y (B môn Hóa H c – Khoa S Ph m) là giáo viên

h ng d n tôi Cô luôn chia s nh ng n i v t v trong công vi c c a tôi, cô ã giúp cho tôi r t nhi u v ki n th c, k n ng h c t p c!ng nh nh ng kinh nghi m t" th c ti n

cu c s ng

– PGS TS Nguy n Nh t Xuân Dung (B môn dinh d ng – Khoa Nông Nghi p), cô ã ch# d n tôi v cách b trí thí nghi m, cách ph i tr n th c n nuôi gà cho n các

ph ng pháp th ng kê s li u

– TS Tr n Kim Tính (Tr ng phòng thí nghi m chuyên sâu – $ i H c C n Th ) ã t o

i u ki n cho tôi làm vi c t i phòng thí nghi m và h ng d n tôi các thao tác c!ng nh

nh ng k thu t s% d&ng máy móc – thi t b

– ThS GVC Phan Thành Chung, ThS GVC Hu'nh Kim Liên (B môn Hóa H c – Khoa

S Ph m) ã dành th i gi áng l( ngh# ng i mà c giúp tôi b n th o, giúp tôi k p

th i ch#nh s%a, hoàn t t lu n v n

– Gia ình anh Nguy n Hoàng Nhanh cùng ch Bùi Th H ng ( p Th i An A, xã Th i

An, P Th i An $ông, Q Bình Th y, TP C n Th ) $ây là n i tôi ã l)p *t chu+ng nuôi

gà và nh anh ch trông coi v m*t an ninh

– Anh Tr n Thanh S n (chi c&c thú y qu n Bình Th y) ã giúp tôi thu th p gà con qua

ki m d ch, h ng d n tôi cách phòng và tr b nh Anh S n c!ng là ng i c p cho tôi gi y phép nuôi gà và gi y phép v n chuy n gà v a i m gi t m,

– Anh Nguy n Qu c Phong (t, s)c ký – phòng thí nghi m chuyên sâu) ã nhi t tình

h ng d n tôi phân tích m u b-ng h th ng LC/MS/MS Cùng các anh ch là nhân viên phân tích m u luôn giúp tôi trong vi c s% d&ng d&ng c&, hóa ch t c!ng nh các thao tác thí nghi m c n thi t

– Th y cô, gia ình, b n bè luôn ng viên giúp tôi, t o cho tôi ni m tin v ng vàng trong các ho t ng

M t l n n a, tôi chân thành c m n

Sinh viên th c hi n

Tr n Th o Ph ng

M C L C

Nh n xét và ánh giá lu n v n

L i c m n 1

M&c l&c 2

Danh m&c các hình nh và bi u b ng 4

Tóm t)t n i dung 5

Ph n I M u 6

1 Lý do ch n tài 6

2 M&c ích nghiên c u 6

3 Gi thuy t c a tài 6

4 Ph m vi gi i h n c a tài 6

5 Ph ng pháp nghiên c u 7

6 Tóm t)t quá trình th c hi n tài 7

7 Nh ng thu n l i và khó kh n trong quá trình th c hi n tài 7

Ph n II N i dung 9

1 Lý thuy t 9

1.1 Lý thuy t v ch t kích thích t ng tr ng h –agonists 9

1.1.1 S l c v clenbuterol 9

1.1.2 S l c v salbutamol 10

1.1.3 Tác d&ng c a clenbuterol và salbutamol lên ng v t nuôi và con ng i 10

1.2 Lý thuy t v ph ng pháp s)c ký l ng ghép 2 l p kh i ph, 10

1.2.1 S)c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) 10

1.2.1.1 Gi i thi u v máy s)c ký l ng hi u n ng cao 10

1.2.1.2 Nguyên t)c c a quá trình s)c ký 11

1.2.1.3 Các b ph n c a máy 12

1.2.1.4 Các lo i pha t/nh nh+i c t s)c ký 19

1.2.2 $ u dò kh i ph, 25

2 Ph n th c nghi m 28

2.1 B c 1: Ti n hành nuôi gà 28

2.1.1 Th i gian – a i m 28

2.1.2 $ i t ng thí nghi m 28

2.1.3 Th c n thí nghi m 28

2.1.4 Hóa ch t – thi t b 29

2.1.5 B trí thí nghi m 29

2.2 B c 2: Theo dõi s t ng tr ng c a gà nuôi 32

2.2.1 Th ng kê l ng ch t kích thích t ng tr ng ã cung c p cho gà nuôi 32

2.2.2 Kh o sát s t ng tr ng c a gà nuôi 33

2.3 B c 3: Thu m u phân tích 35

2.4 B c 4: Phân tích m u 35

2.4.1 Chu0n b 35

2.4.1.1 Hóa ch t – d&ng c& 35

2.4.1.2 C t SPE 36

2.4.1.3 Pha ng ch y máy 36

2.4.1.4 $i u ki n ch y máy 36

2.4.1.5 Quy trình phân tích clenbuterol và salbutamol trong m u th t 37

2.4.1.6 Xây d ng ng chu0n 38

2.4.2 Ti n hành phân tích m u và x% lý s li u 40

2.4.2.1 K t qu phân tích clenbuterol trong các m u 41

2.4.2.2 K t qu phân tích salbutamol trong các m u 42

2.4.2.3 Th o lu n 43

Ph n III K t lu n và ngh 44

1 K t lu n 44

2 $ ngh 44

2.1 V phía ng i tiêu dùng 44

2.2 V phía các c quan ch c n ng 45

2.3 V phía nhà ch n nuôi 45

Ph& l&c 47

Tài li u tham kh o 54

-* -

DANH M C CÁC HÌNH NH VÀ BI U B NG

TRÌNH BÀY TRONG LU N V N

-* - HÌNH NH

Hình 1 Các b ph n c a máy s)c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) Trang 11

Hình 4 Mô t máy tr n dung môi v i phân c c t ng d n Trang 14

Hình 6 Ch n lo i c t HPLC phân tích h p ch t tan c trong n c Trang 20 Hình 7 S + t,ng quát máy s)c ký l ng ghép kh i ph, (LC/MS) Trang 26 Hình 8 Ph m vi áp d&ng LC/MS v i các giao di n khác nhau Trang 26 Hình 9 Giao di n ion hóa áp su t khí quy n trong máy LC/MS Trang 27 Hình 10 Ph i h p LC/MS v i APCI phân tích h n h p g+m 5 ch t Trang 28

BI U B NG

B ng 1 M t s dung môi th ng dùng cho HPLC Trang 14

B ng 2 Tính ch t *c tr ng c a m t s lo i u dò Trang 18

B ng 3 M t s pha t/nh có bán trên th tr ng Trang 24

B ng 4 S + b trí thí nghi m trên th c t Trang 30

B ng 5 Ghi nh n l ng th c n và l ng ch t kích thích t ng tr ng Trang 32

B ng 6 Theo dõi t c t ng tr ng trung bình c a gà sau m i tu n Trang 33

B ng 7 S t ng tr ng trung bình c a gà sau 3 tu n nuôi Trang 34

B ng 8 K t qu phân tích s)c ký c a các chu0n Trang 39

B ng 9 K t qu phân tích clenbuterol trong các m u Trang 41

B ng 10 K t qu phân tích salbutamol trong các m u Trang 42

TÓM T T N I DUNG

$ tài “Xác nh d l ng ch t kích thích t ng tr ng h .– agonists trong th t gà b-ng ph ng pháp s)c ký l ng ghép 2 l n kh i ph,” c th c hi n b-ng vi c nuôi gà

v i th c n có tr n m t l ng xác nh ch t kích thích t ng tr ng (tiêu bi u là salbutamol và clenbuterol) S l ng gà c nuôi là 24 con và chia làm 4 nghi m th c

Gà c theo dõi s thay ,i kh i l ng sau m i tu n cho n ánh giá nh h ng c a

ch t kích thích t ng tr ng lên lên s t ng tr ng

Sau th i gian 3 tu n nuôi, gà c m, l y th t r+i em xác nh d l ng c a clenbuterol và salbutamol b-ng ph ng pháp s)c ký l ng ghép 2 l n kh i ph, (LC/MS/MS) So sánh d l ng c a ch t kích thích t ng tr ng v i hàm l ng ban u

ã tr n vào th c n ánh giá kh n ng l u t+n c a chúng trong th t gà K t qu b c

u xác nh c d l ng trung bình c a clenbuterol và salbutamol trong th t gà kho ng 52% D l ng c a ch t kích thích t ng tr ng s( gây nh h ng n s c kh e

ng i tiêu dùng T" ó, tài nêu lên nh ng khuy n cáo cho ng i ch n nuôi và ng i tiêu dùng

$ánh giá kh n ng l u t+n c a clenbuterol và salbutamol trong th t gà, khuy n cáo

vi c s% d&ng ch t kích thích t ng tr ng i v i ng i ch n nuôi và ng i tiêu dùng

Ph n I M U

1 LÝ DO CH N TÀI

Trong siêu th hi n nay các m*t hàng th c ph0m nh th t heo, th t gà làm s2n c bày bán trông r t “b)t m)t”, chúng c p á, t i rói, nh ng mi ng th t có l p n c sát

da, s n ch)c, r t ít m và t t nhiên nó s( c ng i tiêu dùng ch n mua ngay N)m c

ý thích c a khách hàng nên nhi u nhà ch n nuôi ã m nh d n cho ra nhi u s n ph0m th t

có “ch t l ng” nh th b-ng cách tr n ch t kích thích t ng tr ng vào th c n ch n nuôi Ch t kích thích t ng tr ng tiêu bi u ây là clenbuterol và salbutamol, chúng là

2 M C ÍCH NGHIÊN C!U

$ tài này c th c hi n v i mong mu n nêu ra c m t ph ng pháp xác nh

d l ng ch t kích thích t ng tr ng h p lý, ánh giá c m c l u t+n c a chúng trong th c ph0m th t và m r ng ph m vi phân tích t" ó ph ng pháp phân tích s(

c h u d&ng, ch t l ng th c ph0m th t s( c ánh giá chính xác, nghiêm minh và

cu i cùng là s c kh e con ng i c m b o

3 GI THUY"T C#A TÀI

Theo lý thuy t, ch t kích thích t ng tr ng clenbuterol và salbutamol sau khi vào

c th con gà thì 40% s( b tiêu t n cho các quá trình chuy n hóa, làm cho t ng l ng

n c, th t s n ch)c Còn 60% s( tích tr l i trong th t, gan, th n… L ng ch t còn l i này s( gây h i cho con ng i n u dùng ph i th t gà ã nuôi b-ng ch t kích thích t ng tr ng

4 PH M VI GI$I H N C#A TÀI

$ tài c th c hi n trong th i gian t ng i h3p t" tháng 10/2007 n tháng 5/2008 và kinh phí thì h n ch cùng v i các v n khác nh a i m ch n nuôi thì khá

xa, an ninh ph c t p, n n d ch cúm H5N1 có th bùng phát b t c lúc nào,… Chính vì th

mà tài ch# c th c hi n trên m t lo i gia c m là gà v i s l ng 24 con và chia làm

4 nghi m th c

Ch t kích thích t ng tr ng trong ch n nuôi là thu c lo i hóa ch t c m s% d&ng

c a B Nông Nghi p và Phát Tri n Nông Thôn cho nên r t khó kh n trong vi c tìm ki m chúng tr n vào th c n nuôi gà Chính vì v y mà tài ch# th c hi n vi c xác nh d

l ng c a 2 ch t kích thích t ng tr ng tiêu bi u là clenbuterol và salbutamol

5 PH NG PHÁP NGHIÊN C!U

– Tham kh o tài li u

– V n d&ng quy trình phân tích clenbuterol và salbutamol b-ng ph ng pháp s)c

ký l ng ghép 2 l n kh i ph, vào th c nghi m phân tích m u

5.1 Ph%&ng pháp t'o m(u và thu m(u

– Th c nghi m nuôi gà t o m u

– Sau m t th i gian nuôi gà b-ng th c n có tr n ch t kích thích t ng tr ng, gà

c m, l y th t ph n c phân tích

– M u th t c xay nhuy n, cho vào túi nh a hàn kín và tr trong t l nh

– Các m u th t c thu l y và b o qu n m t cách c l p t"ng m u, không nhi m b0n v i nhau

5.2 Ph%&ng pháp phân tích m(u

– Phân tích hàm l ng c a clenbuterol và salbutamol trong m u th t b-ng ph ng pháp s)c ký l ng ghép 2 l n kh i ph, (LC/MS/MS)

6 TÓM T T QUÁ TRÌNH TH)C HI*N TÀI

$ tài c th c hi n t" tháng 10/2007 n tháng 05/2008 v i s phân b th i gian nh sau:

– Tháng 10; 11; 12/2007: v ch k ho ch công vi c, thu th p tài li u, ti n hành xây

$ tài c th c hi n v i nh ng thu n l i sau:

– S quan tâm ch# b o c a giáo viên h ng d n, s giúp c a các anh ch k thu t viên trong phòng thí nghi m chuyên sâu

– S ng h nhi t tình c a b n bè, ng i thân

– S giúp c a ng i dân trong vi c ch n nuôi gà

– S n l c, ch u khó, ham h c h i c a chính b n thân

7.2 Khó kh n

Bên c nh nh ng m*t thu n l i, v n còn m t s khó kh n sau:

– $ tài t ng i dài nh ng th i gian th c hi n và kinh phí còn h n ch

– S ràng bu c gi a gi gi c b n thân (do còn ph i i th c t p s ph m) v i gi

gi c c a phòng thí nghi m chuyên sâu

Ph n II N I DUNG

1 LÝ THUY"T

1.1 Lý thuy,t v ch-t kích thích t ng tr% ng h .– agonists

M t s lo i ch t kích thích t ng tr ng thu c h – agonists nh :

CH3OH, C2H5OH, tan ít trong CHCl3, không tan trong C6H6

CH3OH; C2H5OH, tan ít trong CHCl3; ether, không tan trong C6H6

Tên g i 4–(2–(tert–butylamino)–1–hydroxyethyl)–2–(hydroxymethyl)phenol

1.1.3 Tác d ng c a clenbuterol và salbutamol lên ng v t nuôi và con ng i

Clenbuterol và salbutamol là nh ng hormon t ng tr ng có tác d&ng kích thích gia súc, gia c m t ng tr ng nhanh Nó có tác d&ng làm giãn ph qu n, giãn c tr n cu ng ph,i, i u khi n các ch t dinh d ng h ng t i mô c , t ng quá trình t,ng h p protein tích l!y n c và gi m s tích l!y m trong c th Chính vì s t ng tr ng nhanh mà th i gian ch n nuôi c rút ng)n, gi m c chi phí th c n, thu c men

1.2.1.1 Gi i thi u v máy s)c ký l ng hi u n ng cao

N m 1967, Horvath C là tác gi u tiên ã t o ra máy HPLC nghiên c u v nucleotit Ngày nay, v i các u i m nh áp su t cao, phân gi i cao, v n t c s)c ký nhanh,… Máy HPLC c s% d&ng r ng rãi trong r t nhi u l/nh v c nghiên c u a d ng

nh phân tích d c ph0m, các d ch sinh lý, polymer thiên nhiên ho*c t,ng h p, d l ng các lo i ch t trong môi tr ng, nhi u lo i h p ch t vô c , các lo i nguyên t hi n di n trong m u phân tích d ng v t,… H n n a, các lo i u dò cho HPLC không làm h h i

m u phân tích (ngo i tr" u dò MS) nên sau khi phân tích, có th thu h+i m u th c

hi n các lo i nghiên c u khác nh phân tích ph,, th% thu c nh tính, th% nghi m ho t tính sinh h c,…

HO

OH

Hình1 Các b ph n c a máy s)c ký l ng hi u n ng cao (HPLC)

1.2.1.2 Nguyên t)c c a quá trình s)c ký

$ ti n hành tách s)c ký, pha t/nh ph i c nh+i vào c t tách theo m t k thu t

nh t nh phù h p Pha t/nh là m t y u t quan tr ng quy t nh b n ch t c a quá trình s)c ký và lo i s)c ký N u pha t/nh là ch t h p ph& thì ta có s)c ký h p ph& pha th ng ho*c pha ng c (NP–HPLC ho*c RP–HPLC), n u pha t/nh là ch t trao ,i ion, thì ta có s)c ký tao ,i ion (IE–HPLC)… Cùng v i pha t/nh, r%a gi i ch t phân tích ra kh i c t tách, ta ph i c n m t dung môi r%a gi i, ó là pha ng Nh v y, n u ta n p m u phân tích g+m 2 ch t A và B vào c t tách, thì khi b m pha ng qua c t tách, các quá trình s)c

ký c a các ch t A và B s( x y ra, ngh/a là có s tách các ch t A và B ra kh i nhau sau khi

i qua c t tách Quy t nh hi u qu c a s tách s)c ký là t,ng c a các m i t ng tác sau:

T ng tác gi a ch t phân tích và pha t/nh

T ng tác gi a ch t phân tích và pha ng

T ng tác gi a pha t/nh và pha ng

T,ng 3 l c t ng tác trong 3 m i t ng tác này s( là y u t quy t nh ch t nào

c r%a gi i ra kh i c t tách s)c ký tr c hay sau Ch t nào có l c t ng tác l u gi F

nh nh t thì s( c r%a gi i ra kh i c t tách tr c tiên Còn ch t nào có l c t ng tác

l u gi l n nh t thì s( c r%a gi i ra kh i c t tách sau cùng Ta có th minh h a quá trình tách s)c ký c a 2 ch t A và B theo s + sau:

là gi ch t phân tích l i trên c t tách, t c là trên pha t/nh Khi ó, l c thành ph n F2

l i kéo ch t phân tích ra kh i c t tách Nh v y, v i m i ch t khác nhau thì l c thành

ph n F1 và F2 là khác nhau Vì th , F1 và F2 là 2 y u t quy t nh s l u gi c a ch t tan trong m t h pha Nh th có ngh/a là pha t/nh và pha ng là 2 y u t quy t nh

hi u su t c a quá trình s)c ký trong k thu t HPLC

1.2.1.3 Các b ph n c a máy

a Bình ch a dung môi r%a gi i c t

H dung môi r%a gi i c t c hút ra t" 2 bình ch a dung môi Bình c làm b-ng ch t li u tr , th ng là b-ng th y tinh Bình luôn luôn có n)p b o v không cho b&i r i vào, n)p có l h bình luôn thông v i khí tr i Trong bình, có m t ng d n dung môi t" bình vào ng s)c ký, u này có g)n m t nút l c b-ng kim lo i v i m&c ích l c dung môi và c!ng ng luôn d i m*t thoáng c a ch t l ng Các nhà s n

xu t có nh ng bình chuyên dùng cho nút l c b-ng kim lo i nói trên l t vào m t l

gi ng, b o m u ng luôn ch m sát áy bình có th s% d&ng n gi t dung môi cu i cùng trong bình

F3

F2 F1

Ch t phân tích

Tr c khi l)p m t bình dung môi vào v trí ho t ng, c n ph i lo i b ph n không khí ã hòa tan vào dung môi tr c ó, g i là kh% b t khí, b i vì n u còn l n nh ng

b t không khí vào trong lu+ng dung môi i vào máy s( làm cho máy b m và u dò ho t

th ng i u khi n, máy b m hút 2 dung môi trong 2 bình a vào h p ph i tr n Ví d&,

nh các h dung môi CH3OH : H2O 70/30 (v/v) ho*c CH3CN : H2O 80/20 (v/v),… Nó c!ng có th là dung môi H2O có ch a các ch t m pH, ch t t o ph c, ch t làm ch m,…

v i n+ng nh t nh Nói chung, v i m i lo i s)c ký s( có m t h dung môi r%a gi i riêng, phù h p v i nó có th thu c hi u qu tách t t nh t

– Có 2 ki u s% d&ng pha ng trong vi c r%a gi i: r%a gi i n n+ng và r%a gi i n+ng t ng d n tuy n tính

+ R%a gi i n n+ng : v i 1 pha ng l a ch n (m t dung môi ho*c m t h n

h p 2 dung môi pha tr n tr c v i t5 l xác nh) c s% d&ng su t quá trình s)c ký c t

Mu n thay ,i qua m t lo i pha ng khác thì ph i ng ng quá trình s)c ký, thay bình

ch a dung môi r+i cho pha ng ho t ng tr l i

+ R%a gi i n+ng t ng d n tuy n tính: trong quá trình s)c ký, tính phân c c c a pha ng c thi t k t ng d n lên m t cách t" t" và u *n T ng t nh s)c ký khí, nhi t c a c t phân tích c ch#nh t ng d n lên

– Trong s)c ký l ng, tính phân c c c a pha ng gi vai trò quan tr ng trong vi c tách ch t Vi c i u ch#nh pha ng có tính phân c c t ng d n tuy n tính c th c

hi n b i 1 máy tr n dung môi, i u khi n b i h i u hành c a máy K thu t viên ch#

c n ánh l nh vào máy tính v i ch ng trình mong mu n

nút l c b-ng kim lo i

*t l t trong gi ng

n i vào máy b m

Hình 4 Mô t máy tr n dung môi v i phân c c t ng d n

Do ó, v i m t pha t/nh ã ch n r+i, n u nh ta ch n c pha ng có thành

– Pha ng ph i hòa tan c ch t m u Có nh th m i làm cho ch t m u c

v n chuy n t t trong c t tách hay khi th c hi n quá trình r%a gi i

– Pha ng ph i b n v ng theo th i gian, ngh/a là nó không b phân h y hay thay ,i không theo ý mu n khi ch y s)c ký

– Pha ng ph i nhanh t cân b-ng trong quá trình s)c ký, nh cân b-ng h p ph&, phân b , trao ,i ion, tùy theo b n ch t c a t"ng lo i s)c ký

– Pha ng ph i phù h p v i lo i detector dùng phát hi n các ch t phân tích, không làm h h i n flowcell c a detector Ví d&, dùng lo i detector UV hay UV–VIS thì pha ng ph i trong su t trong các vùng ph, ó, hay dùng detector hu'nh quang thì pha ng ph i không có tính hu'nh quang

– T t c dung môi pha ng ph i có tinh khi t cao, t tiêu chu0n, không có l n b&i b0n Tr c khi g)n vào máy HPLC, dung môi ph i c lo i b khí, có th lo i b khí b-ng cách s&c m nh khí Heli vào bình v i v n t c 300 ml/phút kéo dài trong vài phút, bong bóng khí Helium s( u,i b t không khí ra kh i bình Dung môi bão hòa khí Heli không làm nh h ng gì n quá trình s)c ký C!ng có th kh% khí b-ng cách *t bình ã

c m n)p vào b+n siêu âm và cho máy ho t ng trong vòng 5 n 10 phút

– $i u ki n cu i cùng là pha ng ph i thông d&ng, không quá )t T t nhiên, y u

t này trong s)c ký i u ch thì có ý ngh/a r t l n Trong phân tích, không ít tr ng h p

ta ph i ch p nh n pha ng )t ti n m b o k t qu phân tích chính xác, *c bi t là

vi c phân tích l ng v t bên c nh m t l ng l n ch t khác

$ó là các yêu c u c n thi t i v i m t h pha ng trong k thu t tách HPLC cho

s tách và phân tích m t h n h p m u nh t nh T t nhiên, các i u ki n ó c n c xem xét c& th trong m i tr ng h p c a h n h p m u phân tích, xem có th b qua

c y u t nào, và t" ó ch n m t pha ng t t nh t cho i t ng nghiên c u

V i h h p ph& pha th ng (NP – HPLC): pha t/nh th ng là các silica tr n, phân

c c, pha ng là các dung môi h u c không phân c c, k6 n c, ngh/a là n c không tan

c vào pha ng ó Ví d&: n–hexane, tetrachlorocarbon, chloroform, benzene… Nó là

nh ng dung môi không phân c c hay ít phân c c hay h n h p c a các dung môi ó v i t5

l nh t nh Trong quá trình s)c ký, cho quá trình tách ,n nh, ng i ta th ng ph i bão hòa pha ng tr c khi ch y s)c ký b-ng n c N u không thì nh h ng c a hàm

l ng n c n th i gian l u c a ch t m u là r t rõ r t và s tách khó l*p l i Nh ng dù sao, ó c!ng là m t nh c i m c a h pha th ng Do v y, h pha th ng không c

ng d&ng ph, bi n nh h pha ng c

V i h h p ph& pha ng c (RP – HPLC): pha t/nh th ng là các silica ã c alkyl hóa, nó là không phân c c, pha ng là h dung môi phân c c, nó là nh ng dung môi tan t t trong n c và trong r t nhi u tr ng h p thì n c l i là thành ph n chính c a pha ng Tiêu bi u và c dùng khá ph, bi n trong h pha ng c là các dung môi

CH3OH, CH3CN hay h n h p CH3OH / H2O, CH3CN / H2O hay có thêm các ch t t o

ph c, ch t i n ly, ch t m pH,… Nói chung, các dung môi pha ch pha ng cho h pha ng c là n c c t, các alcol, các cetone có m ch carbon ng)n, m t s acid hay base

h u c , m t vài amine hay aminoacid tan t t trong n c

Chính nh có *c tính trên, cho nên h h p ph& pha ng c c s% d&ng r t ph,

bi n tách nhi u lo i h n h p m u t" vô c n h u c , t" các ch t không phân c c n phân c c và k c ch t có liên k t ion nh vi c tách các acid, base hay tách các ion kim

c C t s)c ký và c t b o v

– C t HPLC c làm b-ng thép không g#, th ng dài kho ng 10–25cm và có

ng kính bên trong t" 2.1–4.6 mm C t s)c ký c nh+i th t ch*t b i nh ng h t nh

có ng kính 7 58m, t tiêu chu0n > 10 000 mâm lý thuy t / mét

– Tr c khi pha ng i vào c t phân tích, nó ph i c cho i ngang qua c t b o

v , công d&ng là l c b nh ng t p ch t b0n còn sót l i

– C t b o v không )t ti n nên c n c thay m i th ng xuyên

d B ph n tiêm m u vào máy

– Cho m u vào m t pha ng v trí trên u c t là m t v n k thu t c a máy HPLC vì lúc ó h th ng ang áp su t cao, h n n a, pha ng l ng có th làm h h i nút ng n làm b-ng cao su

– Máy HPLC có h th ng tiêm m u *c bi t 1ng ch a m u là van có 2 c,ng, giúp

nh h ng dòng ch y c a pha ng ch# có th i trên m t trong hai con ng khác

nhau Khi máy ang ho t ng u, pha l ng i xuyên ngang qua c t s)c ký nh m t máy

b m t o áp su t cao

– M u kh o sát ( ang bên ngoài, áp su t th ng) c tiêm vào máy nh m t kim tiêm G t van theo chi u quy nh, ng ch a m u c n i thông vào bên trong máy, pha ng l ng th,i ngang qua o n ng ch a m u, cu n h t các ch t m u n-m trong ng

i vào trong máy Trong khi ng (A) ho t ng thì ng (B) thông ra không khí bên ngoài máy, c khí th,i s ch s2n sàng ch a m t m u m i cho l n phân tích sau

Hình 5 1ng ch a m u trong HPLC

e $ u dò

Ho t ng c a u dò là theo dõi dòng ch y c a dung môi r%a gi i c t bi t khi nào thì các h p ch t i ra kh i c t M i lo i u dò có m t nguyên t)c ho t ng khác nhau, nh ng u ph i t n m&c ích cu i cùng b-ng m t tín hi u i n t% và tín hi u này ph i t5 l v i m t s tính ch t c a ch t phân tích, thí d& nh m c h p thu UV, ch# s khúc x ,… M c áp ng c a u dò ph i t5 l v i s l ng c a m i ch t phân tích

ch t trong cu n a vào máy

Kim tiêm

b m m u vào

M t lo i u dò HPLC lý t ng t m t s tiêu chu0n sau:

– $ n gi n, d s% d&ng, có b n cao và không làm h h i m u phân tích

– Có nh y cao và cho k t qu có tính l*p l i

– Cho áp ng t ng +ng i v i nh ng ch t phân tích có c u trúc t ng +ng – Không thay ,i khi có s thay ,i nhi t ho*c áp su t

– Có th i gian áp ng ng)n, c l p v i v n t c dòng ch y c a dung môi r%a gi i Trong th c nghi m, không có m t lo i u dò nào th a mãn h t các yêu c u trên Ch# có u dò kh i ph, và u dò i n hóa là t ng i áp ng c các yêu c u trên Các nghiên c u v n còn ang ti p t&c tìm ra c lo i u dò m i

Các lo i u dò HPLC có th s)p x p thành m t s lo i nh sau:

– $ u dò theo dõi m t tính ch t hóa h c *c tr ng c a các ch t phân tích mà dung môi r%a gi i không có tính ch t này, nh v y có th phát hi n s hi n di n c a ch t tan khi nó hi n di n trong dòng ch y c a dung môi r%a gi i Các tính ch t ó là: s h p thu

UV, hi n t ng hu'nh quang

– $ u dò theo dõi s hi n di n m t kh i v t ch t trong dung môi r%a gi i, kh i v t

ch t ó chính là ch t phân tích: ch# s khúc x , h-ng s i n môi Thí d&: do s hi n di n

c a h p ch t trong dung môi mà dòng dung môi t i v trí lúc u dò phát hi n s( có giá tr ch# s khúc x khác v i giá tr ch# s khúc x c a dung môi r%a gi i lúc không có m u

l ng m u (g/ml)

Nh y c m

v i t c dòng ch y

Nh y c m

v i nhi t

Lo i m u phân tích phù h p

IR 10-6 Không Th p H p ch t carbonyl,

hydrocarbon Ch# s khúc x 5.10-7 Không ± 10 − 4 o C T t c các lo i h p ch t

c t pha t o n i, c t pha o, c t trao ,i ion, c t s)c ký gel,…

Các lo i nguyên li u dùng nh+i c t HPLC là nh ng h t có l r ng siêu nh v i nhi u d ng, kích th c và r ng khác nhau Ph n l n các nguyên li u là silica, là nh ng

Có tr ng l ng phân t% nh (< 2000 vC), không có mang

i n tích, có th phân c c ho*c không phân c c, có th hòa tan trong dung môi h u c ho*c n c

C t trao ,i ion Có tr ng l ng phân t% nh (< 2000 vC), phân t% có

mang i n tích, lo i h p ch t hòa tan trong n c

C t s)c ký gel Có tr ng l ng phân t% nh ho*c l n, không có mang i n

tích, có th hòa tan trong dung môi h u c ho*c n c

Hình 6 S + h ng d n ch n lo i c t HPLC phân tích h p ch t tan c trong n c

SEC, Silica l r ng nh ho*c gel h u c a n c, dung môi n c

1/ Pha th ng (amino, diol), dung môi h u c / n c 2/ Silica, dung môi h u c

H p ch t ion

Tính acid

IEC, dung môi n c

Nh a trao ,i cation, dung môi n c

Nh a trao ,i anion, dung môi n c

* Pha t o n i

Pha t/nh t o n i b-ng hóa h c c t o b i các h t silica có ng kính 3.5 và

108m Giá mang silica có nhi u l r ng, có h t hình c u ho*c có hình d ng b ngoài không u

+ 9u i m:

– Các lo i phân t% phân c c, không phân c c, lo i ion, lo i có kh n ng ion hóa,…

u có th tách ch# b i m t c t s)c ký và v i pha ng phù h p

– Có th ch t o nhi u lo i pha t/nh v i phân c c khác nhau

– Có th l a ch n nhi u lo i dung môi r%a gi i

– Dung môi r%a gi i ch l c là n c k t h p v i dung môi h u c nh methanol, acetonitrile là nh ng lo i dung môi thông d&ng, giá thành t ng i

– Có th áp d&ng k thu t r%a gi i v i dung môi có phân c c t ng d n mà không làm h h i pha t/nh (l p dung môi b c bên ngoài trôi tu t kh i giá mang)

– H th ng t s cân b-ng nhanh và không l i các h qu x u

+ Nh c i m:

– Dung môi ch# nên kho ng pH t" 2.0–8.5, n u v t quá kho ng này, pha t/nh s(

b t n i ho*c b th y gi i Không th s% d&ng các dung môi có tính oxid hóa

– $i u ch pha t o n i b-ng cách bi n ,i các nhóm silanol b m*t thành các nhóm d n xu t

+ Có các lo i pha t o n i nh sau:

– Các nhóm alkyl nh octadecyl (–C18H37), ngoài ra còn m t s nhóm khác v i dây carbon ng)n h n nh C1, C2, C8 và aryl

– Các nhóm phân c c nh amino, cyanopropyl, ether, diol

– Các nhóm trao ,i ion nh acid sulfonic, amino, ammonium t c p

+ Nguyên li u t,ng h p pha n i

– Các pha t/nh t o n i th ng m i có 40–60% các nhóm silanol c bi n ,i thành các d n xu t Các pha t/nh này ch u c áp su t dòng ch y c a pha ng 41.4MPa trong kho ng pH 2.0–8.5

– S + các lo i ph n ng i u ch các lo i pha t/nh t o n i khác nhau:

– Trong ph n ng i u ch ra các lo i pha t/nh t o n i, giai o n thông d&ng nh t

là s% d&ng thionyl chloride bi n nhóm silanol thành chlorosilane Ti p ó, có th g)n các nhóm ch c h u c vào silica b-ng các d n xu t Grignard ho*c organolithium, ho*c cho nhóm chlorosilane tác d&ng v i alkylamine t o nên alkylaminosilane

(11) Nh a trao ,i anion (12) Nh a trao ,i cation

Si O Si

CH3

CH3(CH2)3 NH2

Si O Si

Cl

Cl Ph

– Nguyên li u c a pha t o n i c s% d&ng nhi u nh t là nh ng nguyên li u c

t o thành b-ng cách cho nhóm silanol b m*t tác d&ng v i organochlorosilane giúp n i pha t/nh vào ch t mang, ngang qua n i siloxane (Si–O–Si) Thí d&, v i pha t o n i ODS (C18H37Si–), tác ch t s% d&ng là chlorodimethyl(octadecyl)silane

– N u silane ch# n i v i duy nh t 1 nhóm chlor, ph n ng s( t o ra m t pha t/nh mang nh ng nhóm dimethylsilane m t cách +ng u và pha t/nh nh th s( b che ph

l p m*t b i kho ng 8–12% carbon

Ph n ng c a silica v i chlorodimethyl(octadecyl)silane

– Tuy v y, trên b m*t silica, v n còn l i kho ng vài m i ph n tr m các nhóm silanol t do, các nhóm này t o ra hi n t ng m!i tín hi u b kéo uôi trên s)c ký + $ kh)c ph&c hi n t ng này, cho tác d&ng v i chlorotrimethylsilane, (CH3)3SiCl, các nhóm silanol t do còn sót l i s( b khóa ch t, còn g i là c “che ph u” V i m t pha t/nh

có s “che ph u”, thì l ng che ph b m*t t ng thêm 1–2% carbon

– N u s% d&ng dichlorosilane ho*c trichlorosilane, ngh/a là Si n i v i 2 ho*c 3 nhóm chlor, s( có ph n ng t o n i ngang l p nên m t pha t/nh có m c t o n i không

th ng pha l ng–l ng và c!ng có th hi u là có m t s tranh giành gi a dung môi r%a gi i

và các phân t% ch t tan chi m l y m t “v trí” trên pha t/nh

– Các nhóm silanol còn sót l i trên b m*t c a h t silica có th gây hi u ng h p thu, khi n cho có hi n t ng tín hi u m!i trên s)c ký + kéo uôi, t o v t dài Vì lý do

Si O

Si

C18H37Cl

Si OSi(CH 3 ) 3

Si O O

Si O

Si

C18H37OSi(CH 3 ) 3

này, nên s% d&ng lo i pha t/nh có hàm l ng pha t/nh che ph cao, ho*c lo i có nhóm silanol t do ã c che ph u

– L ng carbon che ph không có ý ngh/a nhi u b-ng ph n tr m b m*t silica

Th tích

l (ml/g)

Di n tích

b m*t (m2/g)

L ng carbon (%)

Pha t/nh che ph (8mol/m 2)

– V vi c l a ch n dây alkyl dài ho*c ng)n thì có m t nguyên t)c t,ng quát là các

h p ch t tan có tính phân c c c tách t t h n nh vào pha t/nh có dây alkyl ng)n và

ch t tan có tính kém phân c c c tách t t h n nh vào pha t/nh có dây alkyl dài

– Pha t/nh nitrile th ng tách các porphyrin Các pha t/nh aminoalkyl th ng

c s% d&ng tách các lo i ng và peptide Tuy nhiên, không nên s% d&ng pha này tách các h p ch t carbonyl vì các h p ch t này s( t o thành base Schiff v i pha t/nh

Aminopropyl h p ch t carbonyl base Schiff

1.2.2 u dò kh i ph

– M*c dù các ph ng pháp phân tích s)c ký th ng c t u hóa cho t"ng lo i

ch t ho*c m t nhóm ch t có liên h g n g!i v i nhau v c u trúc, ví d& nh nhóm .–agonists, ng i ta luôn mong mu n có c các ph ng pháp phân tích c a ch t T"

ó, s)c ký l ng ghép 2 l n kh i ph, ã ti n tri n r t nhanh trong vi c cùng m t lúc xác

nh t i hàng lo t các ch t (nh ã xác nh c 40 lo i c t n m m c khác nhau thu c nhóm trichothecene B) Thi t b LC/MS/MS hi n i không òi h i m u ph i c làm s ch, *c bi t ngay c khi trong máy có s% d&ng các m u chu0n có g)n +ng v

+ Máy s)c ký l ng hi u n ng cao ho t ng trong i u ki n áp su t cao, nhi t

t ng i th p, m u ch t trong dòng ch y c a pha ng v i l ng l n th tích, ch t

kh o sát th l ng, v n t c dòng ch y l n (kho ng vài ml/phút)

– Khi n i u ra c a máy HPLC vào m t máy kh i ph, có ngh/a là m u ch t ang trong dung d ch (trong dung môi r%a gi i) ph i ch u s chuy n ,i v i s khác bi t r t

l n $ kh)c ph&c nh ng khó kh n nêu trong vi c ghép 2 lo i máy v i nhau thì c n ph i

có m t trung gian là giao di n

Hình 7 S + t,ng quát máy s)c ký l ng ghép kh i ph, (LC/MS) – Có nhi u lo i giao di n khác nhau dùng cho LC/MS nh tia nhi t, ion hóa hóa

h c áp su t khí quy n, chùm tia h t, phun ion,… Tùy thu c vào kh i l ng phân t% và

*c tính (phân c c hay không phân c c) c a h p ch t kh o sát mà ta s% d&ng máy LC/MS v i các k thu t giao di n khác nhau

Hình 8 Ph m vi thích h p áp d&ng LC/MS v i các giao di n khác nhau,

tùy thu c vào kh i l ng phân t% và tính phân c c c a các h p ch t c n kh o sát Giao di n ion hóa áp su t khí quy n:

– Giao di n này giúp ch u c dòng ch y c a pha ng lên n 2ml/phút, vì th

nó phù h p làm vi c v i nhi u lo i h p ch t có tính bay h i và không bay h i

– Pha ng l ng sau khi ra kh i c t s)c ký HPLC c cho i ngang qua giao di n

và t i ây nó c chuy n thành sol khí b i m t máy phun s ng b-ng khí nit v i v n

t c cao Khí nit này s( lôi cu n m u ch t vào bu+ng nung nóng, trong bu+ng nung nóng,

t i kho ng không gian gi a i n c c kh% gi i ion và i di n c c thì s ion hóa x y ra

Máy kh i ph,

$ n b ph n phát hi n c a máy kh i ph,

H p ch t ion

KLPT có th ghi nh n

H p ch t phân c c

H p ch t không

phân c c