LUẬN văn sư PHẠM SINH THỰC HIỆN TIÊU bản HIỂN VI cố ĐỊNH bộ NHIỄM sắc THỂ (3n) ở rễ mầm dưa hấu KHÔNG hạt

Mục tiêu của đề tài là tìm ra quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi cố định để quan sát và đếm số lượng nhiễm sắc thể ở rễ mầm dưa hấu tam bội và đồng thời nhận dạng các kỳ của quá trình

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

DƯA HẤU KHÔNG HẠT (Citrullus vulgaris Schrad.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành SƯ PHẠM SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:

Lớp: Sư phạm Sinh – K33

MSSV: 3072287

2011

LỜI CẢM TẠ

Lần đầu tiên làm đề tài nghiên cứu khoa học với kiến thức hạn hẹp và kinh nghiệm ít

ỏi, em không tránh khỏi những khó khăn và thiếu sót Tuy nhiên với sự nổ lực hết mình của bản thân cùng với sự động viên của gia đình và với sự tận tình hướng dẫn của cô Võ Thị Thanh Phương đã giúp cho em hoàn thành đề tài luận văn tốt nghiệp này

Xin kính dâng:

Cha, Mẹ và những người thân thương suốt đời tận tụy vì con

Chân thành biết ơn:

Cô Võ Thị Thanh Phương đã ủng hộ, tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ, cung cấp kiến thức và những kinh nghiệm quí báu cho em trong suốt quá thời gian thực tập tốt nghiệp

Chân thành cảm tạ:

Quý thầy cô phòng thí nghiệm Sinh lý động vật, Bộ môn Sư phạm Sinh học, Khoa Sư phạm; đặc biệt là chú Trương Văn Mục, nhân viên phòng thí nghiệm tổ Sinh lý động vật đã hết lòng giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Kính gửi đến cô cố vấn học tập Phạm Thị Bích Thủy, quý thầy cô Bộ môn Sư phạm Sinh học và quý thầy cô trường Đại học Cần Thơ đã cung cấp kiến thức cho em trong suốt khóa học

Thân gửi đến bạn Lương Thị Hoàng Dung lớp Bảo vệ thực vật K33, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng và các bạn trong nhóm làm luận văn tốt nghiệp những lời cảm

ơn chân thành và lời chúc tốt đẹp nhất

Cuối cùng em xin chúc Cha, Mẹ, quý thầy cô và các bạn dồi dào sức khỏe và thành công trong công việc

Trân trọng kính chào!

Sinh viên thực hiện Trương Thị Hồng Rô

TÓM LƯỢC

Đề tài “THỰC HIỆN TIÊU BẢN HIỂN VI CỐ ĐỊNH BỘ NHIỄM SẮC THỂ (3n) Ở

RỄ MẦM DƯA HẤU KHÔNG HẠT (Citrullus vulgaris Schrad.)” được thực hiện từ tháng

9 năm 2010 đến tháng 5 năm 2011 Mục tiêu của đề tài là tìm ra quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi cố định để quan sát và đếm số lượng nhiễm sắc thể ở rễ mầm dưa hấu tam bội và đồng thời nhận dạng các kỳ của quá trình nguyên phân ở chóp rễ non của loài này Quy trình thực hiện tiêu bản theo phương pháp ép, cố định mẫu bằng dung dịch Carnoy biến đổi và

nhuộm bằng phẩm nhuộm aceto-carmine

Trong quá trình thực hiện đề, chúng tôi đã tìm ra quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi

cố định và khảo sát được số lượng của bộ nhiễm sắc thể ở dưa hấu không hạt (Citrullus

vulgaris Schrad.) 3n = 33 vào đầu kỳ giữa (Prometaphase) và tìm được đủ các kỳ của quá

trình nguyên phân

Kết quả chúng tôi đã hoàn thành đề tài với 20 tiêu bản hiển vi cố định đạt những yêu cầu: mẫu ăn màu đẹp, độ tương phản cao, quan sát rõ các nhiễm sắc thể, tế bào không teo và

đã kiểm tra được bộ nhiễm sắc thể của dưa hấu tam bội 3n = 33

Kết quả này có thể ứng dụng trong học tập, giảng dạy và nghiên cứu ở các bậc Đại học, Cao đẳng, Trung học phổ thông (đặc biệt dùng để làm phương tiện dạy học trong bài thực hành “Quan sát hiện tượng đột biến nhiễm sắc thể” trong chương trình Sinh học 12 - Nâng cao) Ngoài ra, có thể khẳng định dưa hấu không hạt là dạng tam bội và biết được đặc điểm di truyền của nó Từ đó áp dụng vào sản xuất thực tiễn một cách có khoa học, tăng hiệu quả kinh tế

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Tên phương tiện 25

Bảng 2: Tên hóa chất 26

Bảng 3: Quy trình tổng quá 31

Bảng 4: Bảng tổng kết số lượng nhiễm sắc thể 40

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Chu kỳ sống của tế bào 05

Hình 2: Các kỳ của quá trình nguyên phân ở tế bào thực vật 10

Hình 3: Hoa quả dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.)Mats.Et) 14

Hình 4: Hoa và quả dưa hấu không hạt 16

Hình 5: Hạt giống dưa hấu không hạt 26

Hình 6: Chuẩn bị mẫu 27

Hình 7: Sốc nhược trương rễ mầm bằng Citrat natri 28

Hình 8: Cố định mẫu bằngCarnoy 28

Hình 9: Mẫu ngâm trong cồn 700 29

Hình 10: Nhuộm mẫu 29

Hình 11: Thao tác thực hiện tiêu bản tạm thời 33

Hình 12: Phân hóa màu trong axit acetic 30% 34

Hình 14: Làm trong mẫu 35

Hình 15: Kỳ trung gian và Kỳ trước (X1.000) 38

Hình 16: Kỳ giữa (X1.000) 38

Hình 17: Kỳ sau (X1.000) 39

Hình 18: Kỳ cuối (X1.000) 39

Hình 19: Bộ nhiễm sắc thể của một tế bào 3n = 33 45

Hình20: Bộ nhiễm sắc thể của một tế bào dưa hấu lưỡng bội 2n = 22 51

Hình 21: Bộ nhiễm sắc thể của một tế bào dưa hấu tứ bội 4n = 44 51

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM LƯỢC ii

DANH SÁCH BẢNG iii

DANH SÁCH HÌNH iv

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU……….……… 01

1 Đặt vấn đề……… 01

2 Mục tiêu của đề tài……… 02

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU……… 03

1 Nhiễm sắc thể……… 03

1.1 Khái niệm……… 03

1.2 Đại cương về hình thái, số lượng và các loại nhiễm sắc thể……… 03

1.3 Các hình thức phân bào……… ……… 04

1.4 Chu kỳ tế bào ở Eucaryote……… ……… 05

1.4.1 Kỳ trung gian……… 06

1.4.2 Phân bào ở tế bào nhân chuẩn……… …… 06

1.5 Nguyên nhiễm……… …… 06

1.5.1 Đặc điểm……… 06

1.5.2 Các kỳ của nguyên phân……….…… 07

1.6 Đột biến nhiễm sắc thể……… 10

1.7 Các dạng đột biến số lượng nhiễm sắc thể……… 11

1.7.1 Dị bội……… ….… 11

1.7.2 Đa bội……… ……… 11

1.7.2.1 Tự đa bội (đa bội cùng nguồn……… 11

1.7.2.2 Dị đa bội (đa bội khác nguồn) 12

1.7.2.3 Đơn bội……… 12

2 Vị trí phân loại và đặc điểm cấu tạo của dưa hấu……… 13

2.1 Vị trí phân loại……… 13

2.2 Đặc điểm hình thái và cấu tạo……… 13

2.3 Cách tạo dưa hấu tam bội……… 14

3 Phương pháp nghiên cứu tế bào……….…… 16

3.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu……… 16

3.2 Chuẩn bị mẫu……… 18

3.3 Xử lý các đối tượng trước lúc cố định……… 18

3.4 Cố định mẫu……… 18

3.4.1 Tác dụng của việc cố định……… 18

3.4.2 Nguyên tắc cố định……… 19

3.4.3 Các chất cố định……… 20

3.5 Rửa vật mẫu……… 21

3.6 Làm mủn mẫu vật……… 22

3.7 Nhuộm mẫu……… 22

3.8 Dán mẫu……… 23

CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN……… 24

1 Địa điểm và thời gian thực hiện……… 24

1.1 Địa điểm……… 24

1.2 Thời gian……… 24

2 Phương tiện – hóa chất……… 24

2.1 Phương tiện……… 24

2.2 Hóa chất……… 25

3 Phương pháp nghiên cứu……… 26

3.1 Đối tượng nghiên cứu……… 26

3.2 Phương pháp thực hiện……… 26

3.2.1 Chuẩn bị mẫu……… 26

3.2.2 Xử lý mẫu bằng sốc nhược trương ……… 27

3.2.3 Cố định mẫu vật……… 28

3.2.4 Rửa và trữ mẫu trong cồn……… 29

3.2.5 Nhuộm mẫu……… 29

3.2.6 Thực hiện tiêu bản tạm thời bằng phương pháp ép… 30

3.2.7 Quy trình thực hiện tiêu bản cố định……… 30

3.2.7.1 Quy trình tổng quát……… 30

3.2.7.2 Quy trình cụ thể……… 30

3.2.8 Quan sát và chụp ảnh tiêu bản dưới kính hiển vi quang học 35

3.2.9 Đếm số lượng nhiễm sắc thể, thống kêt quả 36

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ – THẢO LUẬN……… 37

1 Kết quả……… 37

1.1 Qui trình làm tiêu bản hiển vi cố định……… 37

1.2 Số lượng tiêu bản……… 37

1.3 Chất lượng tiêu bản……… 37

1.4 Hình ảnh các kỳ của phân bào nguyên nhiễm……… 38

1.5 Khảo sát số lượng nhiễm sắc thể……… 39

1.5.1 Bảng tổng kết số lượng nhiễm sắc thể……… 40

1.5.2 Hình ảnh bộ nhiễm sắc thể của dưa hấu tam bội……… 41

2 Thảo luận……… 46

2.1 Qui trình làm tiêu bản hiển vi cố định……… 46

2.1.1 Giai đoạn thu mẫu……… 46

2.1.2 Xử lý bằng dung dịch nhược trương Citrat natri……… 46

2.1.3 Giai đoạn cố định Carnoy biến đổi……… 47

2.1.4 Giai đoạn nhuộm mẫu……… 47

2.1.5 Giai đoạn dầm mẫu trong aceto-carmine……… 48

2.1.6 Cố định tiêu bản……… 48

2.1.7 Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học 49

2.2 Khảo sát số lượng nhiễm sắc thể 49

2.2.1 Giai đoạn quan sát và chụp ảnh mẫu 49

2.2.2 Thống kê số lượng nhiễm sắc thể 50

2.2.3 Kết quả khảo sát số lượng nhiễm sắc thể 50

CHƯƠNG V KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 52

1 Kết luận 52

2 Đề nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC DUNG DỊCH CẦN PHA I PHỤ LỤC HÌNH V

- Chưa xác định được chính xác mẫu vật phục vụ giảng dạy bài thực hành

- Khó khăn về phương pháp và qui trình thực hiện

Do đó, để góp phần minh họa sinh động cho các bài giảng lý thuyết và để cho học sinh quan sát rõ bộ nhiễm sắc thể tam bội (3n) của thể đột biến trên kính hiển vi quang học trong các bài thực hành, nên chúng tôi chọn đề tài: “THỰC HIỆN TIÊU BẢN HIỂN VI CỐ

ĐỊNH BỘ NHIỄM SẮC THỂ (3n) Ở RỄ MẦM DƯA HẤU KHÔNG HẠT (Citrullus

vulgaris Schrad.)”

Mặt khác, dưa hấu không hạt là loại rau có giá trị kinh tế cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng Ở nước ta hiện nay, dưa hấu không hạt được trồng phổ biến và rộng rãi ở nhiều tỉnh trong nước với nhiều giống khác nhau Song về mặt di truyền của nó thì còn ít

được nghiên cứu Theo Kihara et al (1951), dưa hấu không hạt là kết quả lai giữa dưa hấu

lưỡng bội 2n = 22 và dưa hấu tứ bội 4n = 44 nên dưa hấu không hạt có bộ nhiễm sắc thể 3n

= 33 còn gọi là dưa hấu tam bội Nhằm mục đích kiểm chứng trên thực tế có phù hợp với lý thuyết hay không Từ đó có thể biết được đặc điểm di truyền cuả giống dưa hấu tam bội để

có thể áp dụng sản xuất thực tiễn một cách có khoa học tăng hiệu quả kinh tế nên chúng tôi chọn thực hiện đề tài trên

2 Mục tiêu của đề tài

- Tìm quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi cố định bộ nhiễm sắc thể tam bội (3n)

- Thực hiện 20 – 25 tiêu bản hiển vi cố định bộ nhiễm sắc thể tam bội (3n) ở rễ mầm

dưa hấu không hạt (Citrullus vulgaris Schrad.) với yêu cầu: mẫu ăn màu đẹp, độ tương phản

cao, quan sát rõ các nhiễm sắc thể, tế bào không teo

- Khảo sát được số lượng của bộ nhiễm sắc thể ở dưa hấu không hạt (Citrullus

vulgaris Schrad.) 3n = 33 vào đầu kỳ giữa (Prometaphase)

Nhiễm sắc thể có khả năng nhân đôi, phân li và tổ hợp ổn định qua các thế hệ Nhiễm sắc thể cũng có khả năng bị đột biến làm thay đổi số lượng và cấu trúc Kết quả tạo ra những đặc điểm di truyền mới (Phan Cự Nhân và ctv, 2004; Lê Đình Trung, 2000)

1.2 Đại cương về hình thái, số lượng và các loại nhiễm sắc thể

Ở kỳ giữa của quá trình nguyên phân, nhiễm sắc thể có thể quan sát rõ nhất Lúc này nhiễm sắc thể có hình dạng và kích thước đặc trưng, thường có dạng hình hạt hay hình que,

có kích thước vào khoảng 0,2 – 3 µm đường kính và 0,2 – 50 µm chiều dài Nhiễm sắc thể gồm hai nhiễm sắc tử chị em gắn với nhau ở tâm động (eo thứ nhất hay còn gọi là eo sơ cấp), chia nó thành hai cánh Tâm động còn là điểm đính nhiễm sắc thể vào sợi tơ vô sắc của thoi phân bào Nhờ vậy, khi sợi tơ vô sắc co rút trong quá trình phân bào thì các nhiễm sắc thể sẽ theo đó phân li về hai cực của tế bào Ở một số nhiễm sắc thể còn có eo thứ hai (eo thứ cấp)

Căn cứ vào vị trí tâm động, nhìn rõ ở kỳ giữa và kỳ sau của nguyên phân, người ta phân biệt ba kiểu hình thái:

- Nhiễm sắc thể tâm cân, hình chữ V, có hai cánh bằng nhau

- Nhiễm sắc thể tâm lệch, một cánh ngắn, một cánh dài

- Nhiễm sắc thể tâm mút, một cánh hết sức ngắn

Mỗi loài có số lượng nhiễm sắc thể là ổn định và đặc trưng cho loài đó Ví dụ: ở

người (Homo sapiens) 2n = 46, ruồi giấm (Drosophila melanogaster) 2n = 8, đậu hà lan (Pisum sativum) 2n = 14, (Phan Cự Nhân và ctv, 2004) Ở các tế bào sinh dưỡng, bộ nhiễm

sắc thể tồn tại thành từng cặp tương đồng (trong đó một chiếc có nguồn gốc từ bố và một chiếc có nguồn gốc từ mẹ) Tập hợp tất cả các nhiễm sắc thể trong tế bào sinh dưỡng của loài được gọi là bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n) Trong các tế bào và cơ thể đơn bội ví dụ

như các tế bào giao tử thì bộ nhiễm sắc thể có số lượng chỉ còn một nửa số nhiễm sắc thể trong tế bào lưỡng bội của loài, được gọi là bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n) Ngoài ra còn có bộ nhiễm sắc thể đa bội đặc trưng cho cơ thể đa bội, số nhiễm sắc thể tăng lên theo bội số n và

bộ nhiễm sắc thể lệch bội do đột biến lệch gây ra làm thay đổi số lượng nhiễm sắc thể ở một hay một số cặp nhiễm sắc thể tương đồng (Vũ Văn Vụ và ctv, 2007)

và co ngắn lại tạo thành các thể có hình dạng nhất định được gọi là nhiễm sắc thể (chromosome) Mỗi nhiễm sắc thể chứa một phân tử ADN xoắn kép dạng thẳng Qua pha S của kỳ trung gian, ADN được tái bản và nhiễm sắc thể được nhân đôi tạo thành 2 nhiễm sắc

tử đính với nhau ở tâm động (được gọi là nhiễm sắc tử chị em - sister chromatides) Vì nhiễm sắc thể có cấu trúc phức tạp, nằm trong nhân có màng nhân, nên đối với tế bào nhân chuẩn, phương thức phân bào diễn ra phức tạp và đòi hỏi phải có bộ máy phân bào (thoi phân bào) Người ta phân biệt hai phương thức phân bào là nguyên phân (mitosis) và giảm

phân (meiosis)

Ngoài ra người ta còn quan sát thấy dạng phân bào được gọi là trực phân (amitosis)

và nội phân (endomitosis) là các biến thể của nguyên phân Trực phân là hình thức phân bào xảy ra ở các tế bào đã biệt hóa cao, các tế bào bệnh lý, các tế bào bị tác hại đang đi vào quá trình thoái hóa Trong trực phân, nhân được phân đôi một cách đơn giản, không xuất hiện nhiễm sắc thể và thoi phân bào (vì vậy còn được gọi là phân bào không tơ) Nhiều khi nhân phân thành hai nửa không đều nhau hoặc phân thành nhiều mảnh, mọc chồi (trực phân bệnh

lý hoặc bị tác hại) Tế bào chất có thể được phân đôi cùng với nhân hoặc không phân chia tạo thành tế bào hai nhân hoặc đa nhân Ví dụ như tế bào gan (Nguyễn Như Hiền và Trịnh Xuân Hậu, 2000)

Nội phân (endomitosis) là một dạng biến đổi của nguyên phân, trong đó ADN và nhiễm sắc thể được nhân đôi nhưng không phân chia về các tế bào con Kết quả tạo thành tế bào đa bội (polyploide) có số nhiễm sắc thể tăng cao nhiều lần Trong trường hợp các sợi nhiễm sắc được nhân đôi nhiều lần (do nhân đôi của ADN) nhưng số lượng nhiễm sắc thể không đổi sẽ dẫn đến hiện tượng đa sợi (polytenisation) và tạo nên nhiễm sắc thể đa sợi (polyten chromosome) quan sát thấy ở nhiều bọn sâu bọ như ở ruồi giấm (Nguyễn Như Hiền

và Trịnh Xuân Hậu, 2000)

1.4 Chu kỳ tế bào ở Eucaryote

Hình 1: Chu kỳ sống của tế bào

(Nguồn: http://www.kentsimmons.uwinnipeg.ca/cm1504/lifecyclecells.htm)

Chu kỳ sống của tế bào là thời gian diễn ra kể từ thời điểm tế bào được hình thành nhờ phân bào của tế bào mẹ và kết thúc bởi sự phân bào để hình thành tế bào mới (Nguyễn Như Hiền, 2005; Phạm Thành Hổ, 1998)

Người ta chia chu kỳ tế bào ra hai thời kỳ chính:

- Thời kỳ giữa hai lần phân chia được gọi là kỳ trung gian (interphase) ký hiệu là I, là thời gian tế bào trao đổi chất, sinh trưởng và chuẩn bị cho phân bào

- Thời gian tiếp theo là kỳ phân bào (mitosis) được ký hiệu là M, là thời kỳ tế bào mẹ phân đôi cho ra hai tế bào con

1.4.1 Kỳ trung gian

Trong kỳ trung gian tế bào thực hiện các chức năng trao đổi chất, các hoạt động sống

khác nhau, tổng hợp ARN, ADN, các protein, các enzym v.v Và chuẩn bị cho phân bào

Tùy theo đặc điểm chức năng người ta chia kỳ trung gian ra ba giai đoạn hay là pha liên tiếp nhau: giai đoạn G1 (Gap1), giai đoạn S (Synthesis) và giai đoạn G2 (Gap2) Thời gian kéo dài của kỳ trung gian tùy thuộc vào G1 vì ở các loại tế bào khác nhau thì thời gian

G1 là rất khác nhau, còn giai đoạn S và G2 tương đối ổn định

1.4.2 Kỳ phân bào

Tiếp theo pha G2 là thời kỳ tế bào mẹ phân chia thành hai tế bào con Sự phân bào là phương thức sinh sản của tế bào, đồng thời là phương thức tế bào mẹ truyền thông tin di truyền chứa trong ADN (đã được nhân đôi qua pha S) cho hai tế bào con

Sự phân bào cùng với sự tổng hợp các chất nội bào và gian bào là cơ sở của sự tăng trưởng của các mô, các cơ quan và cơ thể đa bào

1.5 Nguyên phân

1.5.1 Đặc điểm

Hình thức nguyên phân có những đặc điểm sau đây:

- Là dạng phân bào phổ biến ở Eucaryote

- Kết quả của phân bào hình thành 2 tế bào con có chứa số lượng nhiễm sắc thể giữ nguyên như tế bào mẹ (cho nên có tên là phân bào nguyên nhiễm)

- Xuất hiện nhiễm sắc thể và phân chia nhiễm sắc thể về 2 tế bào con

- Xuất hiện trong tế bào chất bộ máy phân bào, tức là thoi phân bào, có vai trò hướng dẫn các nhiễm sắc thể con di chuyển về 2 cực tế bào

- Trong tiến trình phân bào, màng nhân và hạch nhân biến mất và được tái tạo ở hai tế bào con (Nguyễn Như Hiền và Trịnh Xuân Hậu, 2000)

1.5.2 Các kỳ của nguyên phân

Quá trình nguyên phân gồm có kỳ trung gian và kỳ phân bào Người ta có thể phân chia thành giai đoạn phân nhân (karyokinesis) và phân chia tế bào chất (cytokinesis) Giai đoạn phân chia nhân là tiến trình phân đôi của nhân bao gồm 4 kỳ là: kỳ đầu, kỳ giữa, kỳ sau

và kỳ cuối Còn sự phân tế bào chất là tiến trình phân đôi tế bào chất tiếp theo sự phân nhân

để chia thành hai tế bào con

Trên thực tế, trong tế bào sống rất khó phân biệt giới hạn chuyển tiếp giữa các kỳ Mỗi kỳ được đặc trưng bởi cấu trúc, tập tính của nhiễm sắc thể, bộ máy phân bào, màng nhân, v.v (Nguyễn Như Hiền và Trịnh Xuân Hậu, 2000)

và hạch nhân có nhiều thay đổi Hạch nhân giảm thể tích, phân rã và biến mất Tấm lamila của màng nhân bị phân giải, màng nhân đứt ra nhiều đoạn và biến thành các bóng không bào

bé phân tán trong tế bào chất, tạo điều kiện cho nhiễm sắc thể di chuyển ra bên ngoài tế bào

- Hình thành bộ máy phân bào: Đa số tế bào động vật có trung thể gồm hai trung tử (centriole) và vùng quanh trung tử (pericentriole) gọi là trung cầu Qua pha S, trung tử được nhân đôi tạo thành hai đôi trung tử con Mỗi đôi trung tử con trở thành trung thể mới Do sự hoạt hóa của chất quanh trung tử, các đơn hợp tubulin trong tế bào chất trùng hợp hóa thành các vi ống tubulin Các vi ống xếp phóng xạ quanh trung tử mới, tạo thành sao phân bào (aster) Hai sao di chuyển về hai cực tế bào Giữa hai sao, các vi ống phát triển sắp xếp thành

hệ thống sợi có dạng hình thoi được gọi là thoi phân bào Cấu tạo nên thoi có hai dạng sợi (vi ống) chạy từ sao của cực này đến cực kia Các vi ống cực (hay sợi cực) chạy liên tục từ cực này đến cực kia, còn các vi ống tâm động (hay sợi tâm động) là các sợi nối với tâm động của nhiễm sắc thể kép Đến cuối kỳ trước, khi màng nhân biến mất thì bộ máy thoi vô sắc có hai sao phân bào đã được hình thành

Ở tế bào thực vật không quan sát thấy trung tử, nhưng ở vùng cạnh nhân vẫn có vùng đậm đặc tương tự vùng quanh trung tử và vai trò của chúng là hoạt hóa sự trùng hợp tubulin

để tạo thành thoi phân bào ở tế bào thực vật Vì vậy được gọi là phân bào không sao (Nguyễn Như Hiền và Trịnh Xuân Hậu, 2000)

b) Kỳ giữa (Metaphase)

Kỳ giữa được bắt đầu khi màng nhân tiêu biến thành các bóng nhỏ phân tán trong tế bào chất quanh thoi phân bào Thoi phân bào được hình thành lúc đầu ở vùng cạnh màng nhân, khi màng nhân biến mất thì nó di chuyển chiếm ngay vị trí trung tâm Các nhiễm sắc thể kép mang trung tiết (centromere) là nơi đính hai nhiễm sắc tử Trung tiết phân hóa thành tâm động (kinetochore) có cấu tạo gồm trung tiết ở giữa và hai tấm protein hai bên kẹp lấy trung tiết (có kích thước khoảng 1 picromet) và đính với các sợi tâm động của thoi Qua tâm động, nhiễm sắc thể kép đính với các sợi tâm động của thoi Các nhiễm sắc thể kép xếp trên mặt phẳng xích đạo nằm thẳng góc với trục của thoi tạo nên cái gọi là tấm trung kỳ Mặt phẳng xích đạo cắt giữa hai nhiễm sắc tử chị em của nhiễm sắc thể kép (Nguyễn Như Hiền

và Trịnh Xuân Hậu, 2000)

c) Kỳ sau (Anaphase)

Đặc điểm của kỳ sau là sự tách đôi của hai nhiễm sắc tử chị em khỏi nhau và trở thành nhiễm sắc thể con độc lập, sự tách của hai nhiễm sắc tử chị em là do sự tách rời của hai trung tiết Mỗi nhiễm sắc tử mang một trung tiết riêng và hai trung tiết đính với nhau nhờ protein cohesin Bước vào kỳ sau, cohesin bị phân giải và hai trung tiết tách khỏi nhau, mỗi nhiễm sắc tử có một tâm động riêng đính với sợi tâm động Tất cả các nhiễm sắc tử chị em cùng tách khỏi nhau trở thành nhiễm sắc thể con và cùng thời gian di chuyển về hai cực nhờ

sự co ngắn của sợi tâm động (do sự giải trùng hợp của vi ống tubulin) phối hợp với sự kéo dài của các sợi cực và hẹp lại của thoi Người ta đã tính được tốc độ di chuyển về cực của nhiễm sắc thể con (khoảng 1picromet trong 1 phút) (Nguyễn Như Hiền và Trịnh Xuân Hậu, 2000)

d) Kỳ cuối (Telophase)

Trong kỳ này các nhiễm sắc thể con đã di chuyển tới hai cực, giãn xoắn, dài ra và biến dạng trở thành chất nhiễm sắc Thoi phân bào biến mất, đồng thời hình thành màng nhân bao quanh chất nhiễm sắc Hạch nhân được tái tạo và hai nhân con được hình thành trong khối tế bào chất chung (Nguyễn Như Hiền và Trịnh Xuân Hậu, 2000)

e) Phân tế bào chất (Cytokinesis)

Sự phân tế bào chất được bắt đầu từ cuối kỳ sau hoặc đầu kỳ cuối và diễn ra suốt kỳ cuối Ở tế bào động vật, sự phân tế bào chất được bắt đầu bởi sự hình thành một eo thắt (ở vùng xích đạo ở vùng giữa tế bào) Sự hình thành eo thắt và lõm sâu của eo tiến tới cắt đôi tế bào chất là do sự hình thành một vòng co rút ở vùng xích đạo được cấu tạo bởi vi sợi actin Khi vòng sợi actin co rút kéo theo phần màng sinh chất lõm thắt vào trung tâm và khi màng nối với nhau sẽ phân tách tế bào chất thành hai nửa, mỗi nửa chứa một nhân con Mặt phẳng phân cắt tế bào chất thẳng góc với trục của thoi phân bào

Đối với tế bào thực vật được bao bởi thành vỏ xenlulozo làm cho tế bào không vận động được nên sự phân tế bào chất xảy ra khác với tế bào động vật Sự phân tế bào chất ở tế bào thực vật được bắt đầu bằng sự xuất hiện vách ngang ở vùng trung tâm xích đạo, vách ngang phát triển dần ra ngoại vi cho đến khi liên kết với vách bao tế bào và như vậy phân tách tế bào chất thành hai nửa chứa nhân con Trên vách ngang phân tách hai tế bào con phát triển hệ thống cầu nối tế bào chất tạo thành cấu trúc plasmodesma đặc trưng cho tế bào thực vật Tham gia vào sự tạo thành vách ngang có phức hệ Golgi, mạng lưới nội chất và vi ống cực của thoi còn tồn dư lại ở vùng xích đạo

Ở kỳ sau, các bào quan như ty thể, lục lạp, mạng lưới nội chất v.v được phân về hai

tế bào con Nói chung trong thời kỳ phân bào, các hoạt động tổng hợp chất, hoạt động sinh

lý của tế bào bị đình chỉ hoặc giảm bớt nhằm phục vụ cho sự phân bào (Nguyễn Như Hiền

và Trịnh Xuân Hậu, 2000)

Ý nghĩa của quá trình nguyên phân:

* Nguyên phân có ý nghĩa đặc biệt quan trọng đối với di truyền, nó đảm bảo cho sự

ổn định về số lượng cũng như hình thái nhiễm sắc thể trong các tế bào của cơ thể Qua quá trình nguyên phân các tế bào con hình thành đều có bộ nhiễm sắc thể 2n giống như tế bào

Trao đổi chéo ở nguyên phân khá hiếm, nhưng nó quan trọng đối với một số cơ thể

Ví dụ: một số loại nấm không có chu trình sinh sản hữu tính sử dụng trao đổi chéo ở nguyên phân như một nguồn biến dị

Hình 2: Các kỳ của quá trình nguyên phân ở tế bào thực vật

1) Kỳ trước; 2) Đầu kỳ giữa; 3) Kỳ giữa; 4) Kỳ sau; 5) Kỳ cuối

(Nguồn: http://www.biology.arizona.edu.cell – bio/tutorials/cell – cycle/cells3.htm)

1.6 Đột biến nhiễm sắc thể

Đột biến nhiễm sắc thể bao gồm đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể và đột biến số lượng nhiễm sắc thể Đột biến số lượng nhiễm sắc thể là các đột biến làm thay đổi số lượng ở một hay một số cặp nhiễm sắc thể hoặc toàn bộ nhiễm sắc thể Sự thay đổi số nhiễm sắc thể có hai dạng là: lệch bội và đa bội (Vũ Văn Vụ và ctv, 2007)

Trong thực tế, người ta có thể gây đa bội bằng cách chiếu xạ hoặc sử dụng hóa chất Điển hình như sử dụng chất colchicine các nhà tạo giống đã tạo nên các dòng thực vật đa bội như dâu tằm, mía, dưa hấu không hạt (Phan Cự Nhân, 2004)

1.7 Các dạng đột biến số lượng nhiễm sắc thể

1.7.1 Dị bội

Đột biến dị bội là những thay đổi về số lượng nhiễm sắc thể xảy ra ở một hay một số cặp nhiễm sắc thể tương đồng Ở sinh vật lưỡng bội thường gặp những dạng như: thể không (2n – 2), thể một (2n – 1), thể ba (2n + 1), thể bốn (2n + 2) Hiện tượng này thường xảy ra

do sự sai lệch trong phân li của các cặp nhiễm sắc thể trong giảm phân hoặc nguyên phân (Phan Cự Nhân, 2004)

Đột biến lệch bội thường gặp ở thực vật, ít gặp ở động vật Nếu hiện tượng lệch bội xảy ra trong giai đoạn sớm của hợp tử thì một phần cơ thể mang đột biến lệch bội sẽ phát triển thành thể khảm (Vũ Văn Vụ và ctv, 2007)

Trong tự nhiên, hiện tượng đa bội thường thấy ở cây trồng cũng như các loại cây hoang dại Ví dụ: trong các họ Polygonaceae, Rosaceae, Crassulaceae, Araliaceae, Graminceae, các loại hình đa bội thể chiếm vị trí trọng yếu

1.7.2 Đa bội

Đột biến đa bội là dạng đột biến số lượng nhiễm sắc thể, trong đó các tế bào đột biến chứa nhiều hơn n lần số nhiễm sắc thể đơn bội (n) của cùng một loài và lớn hơn 2n (3n, 4n, 5n, 6n, 7n,…) Các cơ thể mang tế bào có bộ nhiễm sắc thể 3n, 4n, 5n, 6n, 7n,… là các thể

đa bội (Vũ Văn Vụ và ctv, 2007)

1.7.2.1 Tự đa bội (đa bội cùng nguồn)

Tự đa bội là sự tăng một số nguyên lần số nhiễm sắc thể đơn bội của cùng một loài và lớn hơn 2n, trong đó 3n, 5n, 7n gọi là đa bội lẻ; 4n, 6n gọi là đa bội chẵn (Vũ Văn Vụ và ctv, 2007)

Thể đa bội cùng nguồn được mô tả đầu tiên là Oenothera lamarchiana Thể đột biến

này có 28 nhiễm sắc thể thay vì cho 14 nhiễm sắc thể Trường hợp tương tự thấy ở cà độc

dược (Datur sramonium) có 48 nhiễm sắc thể thay vì cho 24 Thoạt đầu hai thể nói trên

được coi là thể đột biến và tách thành hai loài độc lập dựa trên tính trạng hình thái và không

có khả năng tạp giao với dạng gốc

Thể tứ bội cùng nguồn chứa 4 bộ gene giống nhau, tồn tại trong tế bào soma 4 nhiễm sắc thể tương đồng của mỗi kiểu nhiễm sắc thể Thể tam bội cùng nguồn chứa 3 bộ gene giống nhau, tồn tại trong tế bào soma 3 nhiễm sắc thể tương đồng của mỗi kiểu nhiễm sắc thể Sự tăng số lượng nhiễm sắc thể dẫn đến sự tăng mỗi alen của locus làm cho diễn biến của mỗi nhiễm sắc thể trong giảm phân bị thay đổi Sự phân li về kiểu gene và kiểu hình trong đời sau của các tổ hợp lai trở nên phức tạp hơn so với trường hợp lưỡng bội (Phan Cự Nhân, 2004)

1.7.2.2 Dị đa bội (đa bội khác nguồn)

Dị đa bội là hiện tuợng khi cả hai bộ nhiễm sắc thể của hai loài khác nhau cùng tồn tại trong một tế bào Thể dị đa bội được hình thành do lai xa kết hợp với đa bội hóa (Vũ Văn

Vụ và ctv, 2007)

Khi cho lai hai loài lưỡng bội có số nhiễm sắc thể giống nhau thì sẽ được con lai lưỡng bội Con lai mang bộ nhiễm sắc thể thường bất thụ do các nhiễm sắc thể thuộc bộ gene A hoàn toàn không tương đồng hoặc chỉ tương đồng một phần với nhiễm sắc thể của

bộ gene B Sự tiếp hợp của các nhiễm sắc thể ở kỳ trước I của giảm phân không có hoặc khó thực hiện được dẫn đến hình thành giao tử có bộ gene không cân bằng Các giao tử này thường là bất thụ

Nếu nhân đôi số lượng nhiễm sắc thể ở cá thể con lai AB thì sẽ được thể tứ bội khác nguồn hữu thụ do mỗi nhiễm sắc thể đều có nhiễm sắc thể tương đồng với nó, sự tiếp hợp thực hiện bình thường hình thành giao tử có hệ gene cân bằng (Phan Cự Nhân, 2004)

1.7.2.3 Đơn bội

Trong chu kỳ sống của thực vật có hoa, giai đoạn lưỡng bội chiếm ưu thế, còn giai đoạn đơn bội chỉ hạn chế ở hạt phấn và túi phôi Trong một số trường hợp hiếm hoi có thể phát sinh những cây hoàn toàn đơn bội Những cây này chỉ mang một bộ gene như giao tử của các cây lưỡng bội nhưng vẫn phát triển thành cây bình thường Về cơ bản cây này có hình dạng giống với cây lưỡng bội tương ứng

Trong đa số trường hợp thể đơn bội hoàn toàn bất thụ Nhiều trường hợp cây đơn bội cho giao tử đơn bội, các giao tử này phối hợp với nhau tạo nên cây lưỡng bội Thể đơn bội trong tự nhiên rất hiếm (Phan Cự Nhân, 2004)

2 Vị trí phân loại và đặc điểm cấu tạo của dưa hấu

Chi: Citrullus Schrad

Loài: Citrullus lanatus (Thunb.)Mats Et

(Hoàng Thị Sản, 2007)

2.2 Đặc điểm hình thái và cấu tạo

Dưa hấu là cây thân cỏ, bò, có nhiều lông đứng màu trắng, tua cuốn thường chẽ ba

Lá xanh tươi có chia ba thùy lớn rồi những thùy này lại chia thành nhiều thùy nhỏ hơn, cuống lá và gân lá ở mặt dưới đều có lông Hoa đơn tính cùng gốc, to, màu vàng, đài hình chuông có năm lá đài, vành hình chuông rộng, ba tiểu nhị, bao phấn hình chữ S Quả to, hình cầu hay hình bầu dục, vỏ ngoài màu lục sẫm đen, đôi khi có vân sọc màu lục lợt, thịt quả màu đỏ đôi khi vàng, nhiều nước ăn ngọt và mát, có nguồn gốc ở Nam Phi (Phạm Thành Hộ, 2003) (hình 3)

Hình 3: Hoa quả dưa hấu (Citrullus lanatus (Thunb.)Mats Et)

(Nguồn: http://tudo.9.forumer.com; http://enthralltech.com;

http://www.ent.uga.edu.bees/news/etter/aug2005.htm)

2.3 Cách tạo dưa hấu tam bội

Theo Kihara Yamashita et al (1951) và sau đó là Kiss Arpad (Hungari) đã tạo ra

dạng dưa hấu tam bội mà hiện nay được bán phổ biến trên nhiều thị trường thế giới Loại dưa hấu này quả to, hương vị ngon, thịt quả dày, hàm lượng đường cao và không hạt Dưa hấu tam bội này được tạo ra từ quá trình lai giữa dưa hấu tứ bội (dạng mẹ) và lưỡng bội

(dạng cha) Vì dưa hấu tam bội không cho hạt nên phải có một hệ thống sản xuất hạt tam bộ riêng Để có dạng tam bội có sản lượng cao phải chọn mhững dạng lưỡng bội từ các thứ khác nhau, có khả năng kết hợp cao Khi gieo hạt tam bội phải gieo thêm một số hàng hạt lưỡng bội, vì hạt phấn cây tam bội thường kém sức sống Để phân biệt được các quả tam bội,

tứ bội và lưỡng bội người ta có thể sử dụng những đặc điểm về mặt hình thái được kiểm soát một cách di truyền Nếu như lai dạng tứ bội có vỏ quả màu sáng (gSgSgSgS) với dạng cây lưỡng bội thuộc thứ có vỏ quả màu xanh (GG) thì cây tam bội sinh ra sẽ cho quả có vỏ sọc xanh (GgSgS)

Theo Lâm Ngọc Phương và Nguyễn Kim Hằng (2010), trong tự nhiên cây dưa hấu tứ bội không hiện diện Thông thường cây tứ bội được phát triển bởi xử lý đột biến cây con nhị bội trong điều kiện vườn ươm và nuôi cấy mô Nghiên cứu được thực hiện nhằm phát triển những dòng dưa tứ bội để tạo giống dưa hấu tam bội Kết quả cho thấy xử lý colchicine 0,025% trong thời gian 6 ngày cho tỉ lệ cây tứ bội cao nhất là 10% Mức bội thể của các cây này được phân tích bằng máy tế bào “Flowcytometry”.Sau đó chúng được chuyển ra trồng ở vườn ươm và đồng ruộng

Tóm lại các bước thực hiện trong việc tạo giống dưa hấu tam bội gồm có 4 bước sau :

- Bước 1: Chọn dòng dưa hấu nhị bội

- Bước 2: Sản xuất dưa hấu tứ bội

- Bước 3: Phát triển dòng tứ bội

Bước 4: Sản xuất dưa tam bội

Ở dưa hấu tam bội (3n = 33) sẽ hình thành nên những giao tử có số nhiễm sắc thể từ 0 đến 33 Trong số ấy chỉ những giao tử có số nhiễm sắc thể là 11 và 22 mới có khả năng hữu thụ Vì thế, sẽ có khoảng 95% số giao tử được sinh ra là bất thụ

Cây dưa hấu tam bội được Kihara thu nhận tương đối dễ dàng từ việc lai giữa cây dưa hấu lưỡng bội có số lượng nhiễm sắc thể 2n = 22 (làm bố) với cây dưa hấu tứ bội thu được bằng thực nghiệm có số lượng nhiễm sắc thể là 44 (làm mẹ) Tuy nhiên hạt của nó có nội nhủ phát triển yếu và vỏ hạt rất cứng, cản trở việc nảy mầm Muốn bảo đảm hạt tam bội nảy mầm cần tách cẩn thận vỏ hạt, sẽ làm tăng đáng kể độ nảy mầm Ở cây tam bội vào thời

điểm phân chia giảm nhiễm thường tạo thành 10 – 11 thể tam trị, việc phân ly thể tam trị dẫn đến xuất hiện nhân bộ đôi thường có 15 – 18 chiếc nhiễm sắc thể Sau phân chia giảm nhiễm lần hai đáng lẽ là 4 tế bào bộ 4 hoàn toàn như nhau thì lại tạo ra những tế bào dị hình không

có sức sống hoặc là hạt phấn khổng lồ không giảm nhiễm Sự hình thành đại bào tử ở dạng tam bội cũng như hình thành tiểu bào tử có lẽ là diễn ra không bình thường và tạo thành tế bào trứng lệch bội, đa số trường hợp không có khả năng sống Vì vậy mà dạng tam bội có tính bất thụ cao, ở chúng khả năng sống của hạt (kể cả khi thụ phấn bằng hạt phấn của cây lưỡng bội) chỉ được hình thành trong trường hợp rất hiếm Thường cây tam bội đáng lẽ có hạt thật thì lại tạo ra hạt rất bé và lép, tuy nhiên vẫn ăn được như hạt dưa chưa chín Quả của cây dưa hấu tam bội không có hạt và là đơn tính sinh (Đ.Ph.Pêtrop,1976) (hình 4)

Hình 4: Hoa và quả dưa hấu không hạt

(Nguồn: http://www.growingproduce.com;

http://www.flickr.com/photos/megz/2680302050)

Hình 20: Bộ nhiễm sắc thể của một tế bào dưa hấu lưỡng bội 2n = 22(Idehen et al 2006)

Hình 21: Bộ nhiễm sắc thể của một tế bào dưa hấu tứ bội 4n = 44 (Idehen et al 2006)

Theo James M Stephens ở University of Florida (UF), dưa hấu tam bội có bộ nhiễm sắc thể 3n = 33 (http://edis.ifas.ufl.edu/mv152) Theo Idehen et al (2006), một nhóm các

nhà Sinh học ở Đại học Nông nghiệp Nigeria, đã đếm được số lượng nhiễm sắc thể của dưa hấu lưỡng bội 2n = 22 (hình 20) và dưa hấu tứ bội 4n = 44 (hình 21) Kết quả nghiên cứu của họ là dưa hấu tam bội có bộ nhiễm sắc thể gồm 33 chiếc

3 Phương pháp nghiên cứu tế bào

3.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của hệ thống học tế bào thực vật là bộ nhiễm sắc thể của toàn

bộ các taxôn thực vật bậc thấp cũng như bậc cao Để nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể phục vụ cho hệ thống học thực vật người ta thường tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của phân bào nguyên nhiễm, cụ thể người ta thường sử dụng mầm non của lá, đỉnh sinh trưởng của thân, đỉnh rễ non của cây hoặc đỉnh rễ chính của hạt vừa nẩy mầm vì đó là vùng

có phân chia mạnh nhất Bên cạnh người ta còn tiến hành nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của quá trình phân bào giảm nhiễm, cụ thể người ta dùng bông non đối với họ Lúa (Poaceae) ngay sau khi mới nhú bông hoặc nụ hoa đối với các loài khác lúc chưa có màu đặc trưng hoặc từ hạt phấn cho nẩy mầm trong ống nghiệm (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2008)

Phương pháp thông thường tiện lợi và dễ chủ động nhất là gieo hạt trong đĩa petri ở nhiệt 23 -250C cho hạt nẩy mầm Thời gian nẩy mầm tùy theo từng loại 1 – 2 ngày đến vài tuần lễ Độ dài của rễ từ 0,8 – 2 cm là dùng được Người ta tiến hành dùng pencer hay dùng kim mũi giáo ngắt một đoạn cách đỉnh rễ khoảng 2 mm và nhúng vào dung dịch cố định Bên cạnh gieo hạt trong đĩa petri người ta còn có thể tiến hành trồng cây trong chậu với đất

ẩm và tơi xốp Đối với các loài cây gỗ có hạt to và có vỏ cứng tốt nhất lấy trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng của thân hay lá non hoặc có thể trồng thành cây con và sau đó lấy trực tiếp từ đỉnh rễ non Trước khi lấy 1 – 2 giờ hoặc từ đêm hôm trước cần tưới nước cho đất đủ ẩm để kích thích rễ phát triển Thời gian lấy rễ tốt nhất từ 8 – 10 giờ sang tùy mùa, đối với các loài sinh trưởng bằng căn hành, thân củ hoặc bằng hom v.v… thì phải đặt hom, củ hay căn hành trong cát ướt hoặc trong lọ đựng nước có hỗn hợp chất dinh dưỡng nhân tạo (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2008)

3.2 Chuẩn bị mẫu

Muốn cố định mẫu vật trước hết phải quan tâm đến việc chuẩn bị mẫu vật, nghĩa là phải tạo cho sinh vật những điều kiện sống tối thích tương ứng với yêu cầu nghiên cứu cụ thể Ví dụ: Để nghiên cứu phân chia nguyên nhiễm của tế bào chóp rễ cần phải đảm bảo cho

rễ phát triển trong điều kiện đủ ẩm, nhiệt độ thích hợp (20 – 250C), đủ dinh dưỡng và ánh sáng Ngoài ra còn cần quan tâm thời gian xuất hiện nguyên phân đầu tiên (nếu lấy rễ mọc từ hạt) vì trong cùng trong một điều kiện sống, các loài thực vật có thời gian xuất hiện phân bào nguyên nhiễm ở rễ mầm khác nhau (ví dụ cây họ đậu nguyên phân đầu tiên xuất hiện

khi rễ mầm có độ dài 12- 17 mm, còn ở cây lúa mì (Triticum aestivum) khi rễ mầm có độ dài

8 – 10 mm) (Trần Tú Ngà, 1982)

3.3 Xử lý các đối tượng trước lúc cố định

Theo Nguyễn nghĩa Thìn (2008), trong một số trường hợp khó đếm số lượng nhiễm sắc thể hoặc nhiễm sắc thể quá dài thì trước khi cố định phải xử lý rễ hay lá mầm, đỉnh sinh trưởng của thân qua một số thuốc như 8 – oxyquinolin, chloranhydrat, consixin, paradichlorobenzen hoặc làm lạnh Muốn xem nhiễm sắc thể dễ dàng và chính xác thì trước khi xử lý đối tượng cần làm lạnh ở 00C trong 24 giờ vì lúc đó nhiễm sắc thể co ngắn đáng

kể Kagava đã ngâm trong dung dịch chloranhydrat 0,3 – 1% để làm ngắn nhiễm sắc thể sau

đó cho vào nước cất để rửa trong 1 giờ và tiếp tục cho vào buồng ấm 2 – 4 giờ rồi mới cho vào dung dịch cố định Những năm gần đây người ta sử dụng dung dịch colchicine 0,01 – 0,05% để xử lý trong thời gian 2 giờ trước khi cố định Để phân tích kiểu nhân thường ta thường sử dụng dung dịch colchicine kết hợp với hỗn hợp dung dịch paradichlorobenzen đậm đặc và 8 – oxyquinolin 0,002 M theo tỉ lệ 1: 1 trong thời gian 2 giờ Hai dung dịch này pha trong tủ ấm ở 600C

3.4 Cố định mẫu

3.4.1 Tác dụng của việc cố định

Cố định là nhằm giữ nguyên cấu trúc của mô cũng như cấu tạo tế bào bằng cách làm chết tế bào thật nhanh trong dung dịch cố định, một loại hóa chất độc đối với tế bào Chất cố định khi ngâm vào tế bào sẽ làm đình chỉ mọi quá trình sống xảy ra trong tế bào và không

gây ra quá trình thuận nghịch (Trần Tú ngà, 1982)

Ngoài ra việc cố định còn nhằm mục đích sau:

- Ngăn chặn quá trình phá hủy do men, hay phá hủy trong các mô

- Làm cho các mô cứng dễ cắt và dễ nhuộm hơn (Trần Công Khánh, 1980)

Trong thành phần thuốc cố định nhân có thể có: axit acetic, axit cromic, fomalin, cồn, chloroform… và tác dụng của chúng khi cố định như sau:

+ Axit acetic ngấm rất nhanh vào mẫu vật, có thể làm cho mẫu vật bị trương lên, gây kết tủa đối với acid nucleic rất tốt

+ Cồn etylic thường được dùng trong các mục đích sau:

* Dùng các độ cồn khác nhau để loại nước trong quá trình làm tiêu bản cố định hoặc quá trình chuẩn bị để cắt lát mỏng bằng máy cắt

* Để cố định đồng thời ngâm giữ nguyên liệu thực vật trong thời gian dài, người ta thường dung cồn 700 – 900 Những nguyên liệu đã ngâm trong cồn thì không thể dùng để quan sát thành phần của tế bào chất nhưng để nghiên cứu về cấu tạo giải phẫu thì tốt hơn nhiều so với nguyên liệu tươi (dễ cắt, dễ nhuộm hơn, trong các khoảng gian bào không còn bọt khí)

* Ngoài ra cồn còn dung để pha dung dịch làm mềm, các dung dịch cố định, hoặc dùng để rửa vi mẫu sau khi nhuộm màu…

+ Đối với các nghiên cứu về nhiễm sắc thể, người ta thường dùng các chất cố định nhân như Navashin hay Carnoy Trong đề tài này chúng tôi chọn Carnoy biến đổi Thành phần của thuốc cố định Carnoy biến đổi (3: 1) là cồn và axit acetic Đây là chất cố định thường dùng trong nghiên cứu tế bào và phôi, đặc biệt là khi cần làm tiêu bản tạm thời Thời gian cố định từ 2 đến 12 giờ, ở nhiệt độ 00 – 30C vật có thể giữ lâu trong chất cố định này (Trần Tú Ngà, 1982)

- Thể tích của dung dịch chất cố định phải lớn gấp nhiều lần so với dung lượng mẫu vật cần cố định (thường từ 50 đến 100 lần)

- Chuẩn bị cho mẫu vật cần cố định có đủ điều kiện tốt nhất để phát triển theo yêu cầu thí nghiệm

- Vật cố định phải còn tươi nguyên Để đảm bảo yêu cầu này thông thường người ta

cố định mẫu ngay nơi gieo trồng

- Những mẫu vật có kích thước lớn trước khi cố định phải cắt thành những mẫu vật nhỏ, cắt bỏ những bộ phận không cần thiết để chất cố định ngấm nhanh vào mẫu vật Độ lớn của miếng cắt phụ thuộc vào loại chất cố định, thể chất của mẫu vật cố định và mục đích nghiên cứu

- Thời điểm cố định trong ngày được ấn định tùy theo từng trường hợp cụ thể: nụ hoa,

rễ non thường cố định vào khoảng 8 – 9 giờ sáng,… (Trần Tú Ngà, 1982)

- Thông thường thì chất cố định để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm Riêng đối với những mẫu vật dùng để nghiên cứu nhiễm sắc thể nên giữ ở nhiệt độ +40C (để ở ngăn mát của tủ lạnh)

- Thời gian cố định phụ thuộc vào thể chất, vào độ lớn của mẫu vật cố định cũng như vào loại dung dịch cố định Đối với chất cố định là Carnoy thì thời gian cố định là từ 2 đến

12 giờ Đối với những nguyên liệu cứng rắn thì thời gian cố định có thể kéo dài lâu hơn khoảng 24 giờ (Trần Tú Ngà, 1982)

- Sau khi cố định cần rửa sạch mẫu vật đã cố định bằng chất lỏng thích hợp Nếu dung dịch cố định pha trong nước thì dùng nước rửa, nếu dung dịch cố định pha trong cồn thì dùng cồn rửa (Trần Công Khánh, 1980)

Ghi nhãn với nội dung gồm có: số thứ tự mẫu cố định, ngày giờ cố định, tên mẫu vật

cố định, tên chất cố định…

- Trong thời gian cố định phải thay đổi chất cố định mới Chẳng hạn sử dụng chất cố định Carnoy nếu trong thời gian cố định thấy dung dịch Carnoy chuyển màu thì thay bằng dung dịch mới (Khoa nông nghiệp, 2001)

- Ghi vào sổ theo dõi thí nghiệm những gì đã ghi trên nhãn và ghi thêm mục đích nghiên cứu

b Chất cố định Carnoy biến đổi (cồn – acetic acid tỉ lệ 3:1): thường dùng trong

nghiên cứu tế bào và phôi, đặc biệt khi cần làm tiêu bản tạm thời Thời gian cố định từ 2 đến

12 giờ Ở nhiệt độ 00 – 30C vật có thể giữ lâu trong chất cố định này

Chú ý: Chất cố định này rất chống hỏng do đó chỉ nên điều chế trước khi dùng Đây

là chất cố định nước nên tác dụng rất từ tốn mềm mại, bảo quản tốt cấu trúc của nhiễm sắc thể

Do thành phần chất cố định có formalin và axit cromic vật không nhuộm được bằng

đỏ carmine

3.5 Rửa vật mẫu

Sau khi cố định xong vật mẫu cần được rửa sạch thuốc cố định Đối với thuốc pha trong nước người ta cho vật mẫu vào trong cốc thủy tinh chứa nước và phía trên được đặt một vòi nước chảy liên tục Thời gian rửa 1 – 2 giờ trong mùa hè, 2 – 3 giờ trong mùa đông Sau khi rửa, phải làm mất nước bằng cách cho vào dung dịch cồn etylic theo từng mức độ 20%, 40%, 60%, 80% Mỗi lần ngâm trong thời gian 30 phút, mục đích là để không cho vật mẫu quăn lại trong khi làm mất nước Sau khi làm mất nước người ta có thể giữ vật mẫu lâu dài trong cồn 80%

Đối với thuốc cố định pha cồn thì vật mẫu sau khi cố định xong được rửa sạch trong cồn 80% mỗi lần 1 – 2 giờ cho đến khi hết mùi axit acetic Vật mẫu được rửa sạch có thể giữ lâu trong cồn 80%

nhau nhằm làm nổi rõ một số thành phần cấu tạo của từng tế bào hoặc từng mô trong cơ thể thực vật

Phương pháp nhuộm vật mẫu để nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể có nhiều cách Các phương pháp chính dễ sử dụng và cho kết quả tốt là nhuộm trong aceto-carmine, aceto-orcein hoặc hematocylin

Carmine là một dạng nước chiết sắc tố từ những thể lipit trong con cái của một loài

côn trùng gọi là Coccuscacbi Carmine nhuộm nhân tế bào và nhiễm sắc thể rất tốt, là một

loại thuốc nhuộm không thể thiếu trong nghiên cứu nhân tế bào và phôi Thông thường người ta sử dụng carmine trong dung dịch axit acetic 45% Khi sử dụng thuốc nhuộm aceto-carmine cần chú ý một số điểm sau:

- Có thể cho thêm một ít muối sắt (thường là sắt (III) clorua – FeCl3) làm cho nhiễm sắc thể bắt màu rõ hơn (Trần Công Khánh, 1980)

- Cũng có thể lúc đầu chỉ nhuộm với thuốc nhuộm aceto-carmine bình thường, sau đó mới chuyển vào thuốc nhuộm có thêm muối sắt

- Trong một số trường hợp nguyên liệu không cần cố định trước mà cho ngay vào thuốc nhuộm aceto-carmine Dung dịch này sẽ đồng thời cố định mẫu và nhuộm luôn mẫu vật

- Thuốc nhuộm aceto-carmine dùng để nghiên cứu nguyên phân, với thuốc nhuộm này thì nhiễm sắc thể có màu đỏ, các phần khác của tế bào có màu hồng nhạt

3 8 Dán mẫu

Có thể dán cố định bằng: Baume canada, Glycerin – gelatin

- Baume canada: là chất lỏng, trong, màu hơi vàng, mùi thơm dễ chịu, tan trong xylen, dùng để gắn những tiêu bản cố định Khi dùng phải pha loãng trong xylen

- Glycerin: là chất lỏng sánh, không màu, không mùi, vị nóng và ngọt, trộn lẫn trong nước và cồn, có tác dụng làm mềm mẫu, chống lại những hiện tượng co rúm Nhưng khi dãn mẫu bằng glycerin thì lammelle dễ bị xê dịch, khó làm sạch tiêu bản, glycerin có ảnh hưởng không tốt đến màu sắc của các mẫu nhuộm

- Glycerin – gelatin: dùng làm chất gắn tiêu bản đối với một số loại tiêu bản cố định như tiêu bản phấn hoa… (Trần Tú Ngà, 1982)

CHƯƠNG III

PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN

1 Địa điểm và thời gian thực hiện

1.1 Địa điểm

Phòng thí nghiệm Sinh lý động vật, Bộ môn Sư phạm Sinh học, Khoa Sư phạm,

Trường Đại học Cần Thơ

1.2 Thời gian

Đề tài được thực hiện vào tháng 09 năm 2010 đến tháng 05 năm 2011

2 Phương tiện – hóa chất

2.1 Phương tiện

Bảng 1: Tên dụng cụ

STT TÊN HÓA CHẤT SỐ LƯỢNG