xác định phân tử của nấm phân lập, vi sinh vật và ô nhiễm kim loại nặng của sản phẩm thịt đóng hộp bán ở riyadh, ả rập saudi

Xác định phân tử của nấm phân lập, vi sinh vật và ô nhiễm kim loại nặng của sản phẩm thịt đóng hộp bán ở Riyadh, Ả Rập Saudi laila A.nasser Đại học Khoa học, Khoa Sinh học, Trường Đại h

Xác định phân tử của nấm phân lập, vi sinh vật và ô nhiễm kim loại nặng của sản phẩm thịt đóng hộp bán

ở Riyadh, Ả Rập Saudi

laila A.nasser

Đại học Khoa học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Nourah bint Abdulrahman princess, Riyadh, Saudi Arabia.

TÓM TẮT : Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các sản phẩm thịt đóng hộp có thể bị

nhiễm các yếu tố vi nấm, vi khuẩn và các kim loại nặng thậm chí có thể xảy ra trong quá trình vận chuyển, lưu trữ và xử lý Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này

để xác định các nội dung do nấm, vi sinh vật và kim loại nặng của thịt hộp ở Ả-rập Xê-út Trong số 13 mẫu thịt đóng hộp được nghiên cứu, Aspergillus và Penicillium được tìm thấy trong hơn 70% tổng số mẫu Trình tự của các loài Penicillium phân lập từ mẫu thịt tạo ra một cây phát sinh loài trong đó cho thấy rằng các chủng nghiên cứu đã tập trung tại bốn nhóm Không ô nhiễm vi khuẩn đã được ghi nhận trong tất cả các mẫu Chín trong số 13 mẫu có hàm lượng sắt cao hơn giới hạn cho phép Tất cả các mẫu có nồng độ kẽm và đồng dưới mức giới hạn tối đa cho phép Bốn mẫu có hàm lượng cadmium cao hơn mức tối đa cho phép Tất cả các mẫu có hàm lượng chì cao hơn mức tối đa cho phép Những kết quả này chỉ ra rằng yếu tố nấm và các cấp cao hơn của các kim loại nặng như chì và cadmium có thể được tìm thấy trong các sản phẩm thịt đóng hộp Điều này có thể đặt ra như một mối nguy hiểm thực sự đối với người tiêu dùng, vì sản phẩm thịt đóng hộp là dễ tiếp cận và thuận tiện ở Ả Rập Saudi

1) Giới thiệu:

Thị trường cho các loại thực phẩm đóng hộp ở Saudi Arabia đã tăng lên trong những năm qua, với các loại fi sh / hải sản đóng hộp hàng đầu thị trường thực phẩm đóng hộp tại Ả Rập Saudi (Chỉ số Báo cáo thị trường, năm 2011) Thịt, khi tiếp xúc với sinh học và ô nhiễm hóa học, có thể phục vụ như là một phương tiện truyền thông văn hóa xuất sắc cho sự phát triển của vi sinh vật, vì chúng là một nguồn tốt của các axit amin và nitrogens (BD Diagnostics tay, 2009) Khi các vi sinh vật sinh sôi trong thức ăn, chúng tạo ra các độc tố có hại và thậm chí gây chết người (Billy và Wachsmuth, 1997) Canning của thịt có thể làm trầm trọng thêm ô nhiễm bởi các vi sinh vật khi thực hành chế biến là người nghèo, đặc biệt là trong tình trạng nồng độ axit thấp và ủ ở nhiệt độ trên 37 ° C Ô nhiễm cũng có thể xảy

ra trong quá trình vận chuyển, lưu trữ và xử lý Một số loài vi khuẩn được biết đến gây ô nhiễm các loại thịt đóng hộp bao gồm Escherichia coli, Clostridium, Staphylococcus aureus, Listeria và Bacillus loài (Blake et al, 1977; Cragg và Andrews, 1973; Mitrica và Granum, 1979) Đối với một, Clostridium botulinum có thể phát triển ở pH trên 4.6 và có khả năng hình thành bào tử chịu nhiệt rất tốt và một độc tố gây chết người (Brooks, 2012) Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng mặc

dù có quy định nghiêm ngặt về chế biến và đóng hộp các sản phẩm thực phẩm, một

số lượng lớn các trường hợp ngộ độc được báo cáo chủ yếu do tiêu thụ các loại thực phẩm đóng hộp (Czerwinski et al., 2012) Trong tháng 3 năm 1995, một ổ dịch lớn của ngộ độc thực phẩm trong số 188 tù nhân trong một tổ chức diễn ra tại Singapore Vụ việc liên quan mạnh nhập khẩu thịt lợn đóng hộp, như là nguyên nhân có thể xảy ra nhất của ngộ độc thực phẩm (Ng et al., 1997) Nó đã được chứng minh rằng chất gây đột biến có thể được sản xuất ra từ nhiệt-chế biến thực phẩm đóng hộp (Krone và Iwaoka, 1984) Hơn nữa, loại thịt ướp muối đóng hộp dễ

bị hư hỏng và có khả năng nguy hiểm nếu chúng là nhiệt độ bị lạm dụng sau một thời gian lưu trữ trong tủ lạnh (Tompkin et al., 1978)

Bên cạnh ô nhiễm vi sinh vật của thịt hộp, đó cũng là một mối quan tâm rộng rãi

về ô nhiễm kim loại nặng trong các sản phẩm thịt đóng hộp Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các sản phẩm đóng hộp có hàm lượng chì cao (Pb), nguồn gốc của nó bắt nguồn từ hàn được sử dụng trong quá trình đóng hộp (Mol, 2011) các kim loại nặng khác đặc biệt là thủy ngân và cadmium (Cd) đã được nghiên cứu rộng rãi (Storelli et al, 2010) (Shiber, 2011; Storelli et al, 2010; Gutierrez et al, 2007.)

Mức độ kim loại nặng trong hộp fi sh đã được thông báo rộng rãi (Ashraf et al, 2006; Tahvonen và Kumpulainen, 1996) Nó cũng đã được chỉ ra rằng lưu trữ thịt đóng hộp tăng dần nồng độ của sắt (Fe), đồng (Cu), chì (Pb) và kẽm (Zn) với thời gian trong một số loại thịt đóng hộp (Arvanitoyannis, 1990)

Nghiên cứu này được tiến hành để định lượng và đánh giá các nội dung vi sinh vật

và kim loại nặng của thịt hộp tại Riyadh, Saudi Arabia

2) Nguyên liệu và phương pháp

- 13 mẫu thịt hộp bao gồm mỗi nhãn hiệu 3 mẫu với hsd trên hộp 1 cách ngẫu nhiên( k loại db) thu thậa từ siêu thị và cửa hàng tiện lợi , giữa tháng 10 và 11,2012 Mẫu đc đem đến phòng thí nghiệm để phân tích Thông tin trên hộp/nhãn được ghi lại bao gồm NAFDAC, số, sx và hsd, số lô, địa chỉ nhà sx, các chất bảo quản và thành phần Hộp đc kiểm tra bằng hơi, rò rỉ và nguy cơ vật lý

- chi tiết mẫu là danh sách bảng bên dưới

- Trước khi phân tích,bề mặt hộp được làm sạch với ethanol 70% và thuốc rượu của iodine Hộp đc mở trên lửa của the Bunsen burner để tránh ô nhiễm pH của mẫu đc sd là pH meter

3 Phân tích vi khuẩn

-10g/ phần của tp đc trộn trong bình vô trùng và bơm vào 3 ống 90ml Brain Heart Infusion(BHI) broth( Oxoid) và Cooked Meat medium tấm thạch EMB đc ủ ở 37°C dến 45°C cho colifoms Kết thúc time ủ, phần thịt được đếm chỉ sử dụng trong vùng Kết quả đc tính cfu/g Đặc điểm phần thịt trên thạch là Gram stained, tinh chiết bởi sự lặp đi lặp lại và cất gĩư trên điã thạch hoặc gâm vài thạch nếu kỵ khí Nhận dạng bằng pp nhuộm Gram

+ Xác định định tính dưa vào phương pháp sau đây:

4 Phân tích vi sinh vât

- Phương pháp pha loãng được miêu tả bởi Pitt và Hocking 2009 được làm bởi mục đích Tỉ lệ pha loãng đúng là 1/2 đến 1/10(kg/v) Mỗi mẫu lặp lại 5l đã chuẩn

bị và ủ 28°C khoảng 7-10 ngày sau đó Nơi nào có vi sinh vật thì đếm Xác định

và để riêng biệt

5 Môi trường cách li

Hai loại môi trường đã được lựa chọn để phân tích về nấmcủa các mẫu thịt chế biến như được dùng bởi Taniwaki et al.(2009), vua et al (1979), Pitt và Hocking (2009) vàSamson et al (2004) Những môi trường là:

Các môi trường chứa: peptone 5 g, đường 10 g, KH2PO4

1 g, MgSO.7H2O 0,5 g, dichloran (2,6-dichloro-4-nitroaniline)

dung dịch 1 ml, Rose Bengal 0,025 g,

chloramphenicol 0,1 g, thạch 15 g, và nước cất 1000 ml

pH cuối cùng nên là 5.6 Các thành phần được trộn lẫn, đun nóng để hòa tan agar

và tiệt trùng bằng nồi hấp ở 121 ° C trong 15 phút

Các môi trường được làm mát đến 45 ± 1 ° C trong một cốc nước

trước khi đổthí nghiệm DRBC thạch đặc biệt hữu ích cho việc phân tích mẫu có chứa '' khuẩn lạc lan rộng '' khuôn mẫu (ví dụ Mucor, Rhizopus, vv), kể từ khi dichloran thêm và tăng hiệu quả bengal giảm tốc độ sự phát triển của nấm mọc nhanh, do đó dễ dàng cho phép phát hiện của nấm men và nấm mốc mầm khác, mà

***

Nó bao gồm (g / l): peptone 5 g, đường 10 g, KH2PO4 1 g,

MgSO4 Æ7H2O 0,5 g, dichloran (0,2% trong ethanol) 1 ml, glycerol

220 g, chloramphenicol 0,1 g, thạch 15 g, và nước cất

1000 ml Những môi trường đã được hấp ở 120 ° C trong 20 phút

Trộn các mục và hơi nước để hòa tan thạch trên, sau đó mang lại

khối lượng đến 1000 ml bằng nước cất Thêm 220 g glycerol

và khử trùng bằng nồi hấp ở 121 ° C trong 15 phút PH cuối

nên là 5,6 và hoạt độ nước 0,955 Môi trường này được sử dụng như một

mục đích chung vừa khuôn liệt kê và được ưa thích

khi mật độ nước của thực phẩm đã phân tích là 0,95 hoặc thấp hơn Các hoạt động của nước thấp của môi trường này làm giảm sự can thiệp của vi khuẩn và phát triển

* nhận dạng nuôi cấy nấm

đặc tính hình thái vĩ mô và vi được sử dụng đểxác định các chủng nấm khác nhau gây ô nhiễm các mẫu thịt chế biến Các tài liệu tham khảo sau đây được tham vấnđể kiểm tra xác định chính xác: de Hoog et al (2002),Samson et al (2004) và

6 Đánh giá ô nhiễm kim loại nặng độc hại;

Tất cả 13 mẫu được phân tích ô nhiễm kim loại nặng độc hại Máy hỗ trợ phân hủy axit được sử dụng tất cả các mẫu,các nguyên tố chứa bên trong và cho vào của họ

đã được xác địnhbằng AAS và ICP-AES.phương pháp phân hủy axit được áp dụng trong điều kiện tối ưu bới sự hòa tan của cây thảo dược

Trong 400 ml xi lanh, 300 ml HCl đậm đặc và 100 ml tập trung HNO3 đã được thêm vào Hỗn hợp được chuyển một bình thể tích 1000 ml và khối lượng được tạo thành với nước Hỗn hợp được trộn và để đứng

Mẫu được sấy khô ở 70 ° C trong 24 h sau khi họ được nghiền mịn trong máy nghiền SPEX.Nồi nấu kim loại và nắp đã được chuẩn bị bằng cách rửa trong 10% HNO3 và bị đậy kín ở 75 ° C trong 2 giờ.0.5g của mẫu đất được đặt vào từng nồi nấu sử dụng Mettlerquân bình và xếptrong lò ủ đưa xuống nhiệt độ tro (45 ° C) chậm trong 90 phút và đốt trong 4 h

Nồi nấu kim loại được làm mát.phạm vi tuyến tính với nồng độ được xác định cho các bước sóng được dùng và một công thức mẫu pha loãng thích hợp được đưa ra.chiết xuất pha loãng được đo bằng hàm lượng kim loại bởi một quang phổ hấp thụ nguyên tử

trong phân tích ô nhiễm kim loại nặng, nồng độ cho phép được quy định như sautối

đa là 0,15 mg / kg cho niken (Ni), tối đa là 0,2 mg / kg đối với chì (Pb), tối đa là 0,5 mg / kg cho cadmium (Cd), tối đa là 10 mg / kg cho đồng (Cu), tối đa 50 mg /

kg đối với kẽm (Zn) và tối đa 20 mg / kg đối với sắt (Fe) (Salama và Radwan,

2005; Mariam et al, 2004; CAC, 2003; Demirezen và Uruc, 2006).

7 xác định kiểu gen của các chủng nấm

Nucleotide trình tự của các gen rRNA của một số loài Penicillium đã được thực hiện với sự giúp đỡ của Công ty SolGent, Daejeon,

Hàn quốc Chất mồi sử dụng để khuếch đại gen có các thành phần sau đây: ITS1 (5 0-TCC GTA GGT GAA CCTGCG G-3 0), và ITS4 (5 0-TCC TCC GCT TAT TGA TATGC-3 0) Sau đó, việc khuếch đại được thực hiện trong một chu trình nhiệt trong các điều kiện sau đây: một đợt biến tính ở 95 ° C trong 15 s tiếp theo là

30 chu kỳ của sự biến tính

ở 95 ° C trong 20 s, ủ ở 50 ° C trong 40 s và kéo dài ở 72 ° C trong 1 phút Phần cuối cùng kéo dài ở 72 ° C trong 5phut Các sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch với the SolGent

PCR Purification Kit-Ultra trước khi săp xếp theo trình tự.sản phẩm PCR tinh sạch được xác nhận lại (bằng kích thước marker) bằng điện di trên gel agarose 1% Sau

đó những dãi băng được tách rữa và sắp xếp theo trình tự với sự kết hợp của dideoxynucleotidestrong hỗn hợp phản ứng Sau đó các mẫu được sắp xếp theo hướng dẫn ITS1 and ITS4 primers (White et al., 1990) Tiếp tục phân tích trên website Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học(NCBI) Và sự giúp

đỡ của phần mền MegAlign phiên bản 5.05

8 Kết quả

Các phân tích về nấm trong số 13 mẫu thịt đóng hộp tiết lộ sự cô lập của 13 loài nấm thuộc đến năm chi (bảng 1,2,3) Tổng dân số nấm trên DRBC là tương đối cao hơn so với trên DG18 (1912 so với 1288 col ??? onies / g thịt tươi) Aspergillus và Penicillium là nhiều nhất (Bảng 1-3)

Trên DRBC, Penicillium là nấm chính ô nhiễm tất cả các mẫu ghi tổng số cao nhất trong số tất cả các loại nấm, chiếm tới 77,8% tổng dân số (Bảng 3).Penicillium đã được đại diện bởi bốn loài mà Peni ??? cillium chrysogenum là phổ biến nhất (69,23% của mẫu phù hợp với 63,6% tổng số nấm) Phần còn lại loài Penicillium (Penicillium citrinum

Bảng 1 Đếm (thuộc địa / g thịt tươi) của nấm và loài phân lập từ mẫu thịt đóng hộp trên Dichloran Rosebengal thạch Cloramphenicol (DRBC) ở 28 C

Bảng 2 Counts (thuộc địa / g thịt tươi) của nấm và loài phân lập từ mẫu thịt đóng hộp trên Dichloran 18% Glycerol (DG18) agar ở 28 C

xảy ra ở mức thấp tỷ lệ mắc trong các mẫu thịt Aspergillus xuất hiện ở 10 trong số

13 mẫu (77,0%) phù hợp với 20,81% tổng số nấm Trong số bốn loài Aspergillus, Aspergillus flavus là sự phổ biến nhất (46.15% mẫu) tiếp theo là Aspergillus niger

và Aspergillus ochraceus (23,08%cho mỗi mẫu)

Các nấm và loài còn lại ít thường xuyên gặp phải từ thịt đóng hộp và được đại diện bởi Clad ??? sphaerospermum osporium và brevicaulis Scopulariopsis

Sử dụng G18 vừa tiết lộ sự cô lập của 11 loài nấm thuộc bốn chi trong đó Cladosporium variabile, Eurotium amstelodami (30,77% mẫu cho mỗi), Penicillium oxalicum và các loài nấm men không xác định (7,69% cho mỗi mẫu ) chỉ gặp trên môi trường này và không cô lập trên DRBC các loại nấm khác như P aurantiogriseum và S.brevicaulis mà xảy ra ở tỷ lệ thấp trên DRBC không bị cô lập trên DG18 Tỷ lệ các chi Aspergillus và Penicillium là hơi thấp hơn trên DG18 (53.85% và 84.62% các mẫu tương ứng) so với trên DRBC (84,63% và 100% các mẫu tương ứng)

Ứng dụng của DRBC vừa cho thấy rằng hầu hết con ??? taminated mẫu là số 9 mà

là thịt bò corned nhập khẩu đến từ Braxin Nó mang lại 770 thuộc địa mỗi gram trọng lượng tươi

(Bảng 1) với phần lớn được xác định là P chrysogenum và

A niger (600 và 168 thuộc địa, tương ứng) Mặt khác

tay, mẫu số 1 ( thịt bò muối từ Brazil) cũng cho thấy sự cao số các thuộc địa khi DG18 vừa được sử dụng (412khuẩn lạc/ g mẫu) Mẫu số 6 (corned thịt bò từ Brazil cũng giàu nấm (256khuẩn lạc/ g) với P chrysogenum và A ochraceus là loài phổ biến nhất.Số lượng thấp nhất của các thuộc địa nấm (4 / g trên DG18 hoặc 6 / g

trên DRBC) đã được phát hiện trong mẫu số 4 mà là một con gà thịt ăn trưa được sản xuất bởi Siniora Food Industries, Jordan Một số xuống thấp của các thuộc địa (4-28khuẩn lạc/g) cũng được lấy từ mẫu số 11 (gà giò từ Hoa Kỳ) và số 12 (ăn trưa thịt bò từ Jordan) như chỉ ra trong Bảng 1 và 2

Nucleotide trình tự của các gen rRNA của một số các loài Penicillium đã được thực hiện.hình 1 cho thấy sơ đồ nhánh được tạo ra dựa trên các giá trị giống nhau của ba chủng cũngnhư chủng tham khảo lấy từ GenBank Bảng 6 thể hiện chặt chẽ nấm phân lập từ thịt so nấm liên quan thu được từ GenBank.phát sinh loài nghiên cứu cho thấy sự phân lập ở 4 nhóm như chủng tham khảo lấy từ GenBank Bảng 6 quà

nấm phân lập từ thịt so với chặt chẽ

nấm liên quan thu được từ GenBank Các phát sinh loài tạo

dendrogram (Hình 1) cho thấy các chủng phân lập được nghiên cứu

được nhóm trong bốn nhóm

Bảng 4 trình bày đếm khuẩn lạc ở các thuộc địa mỗi gram

mẫu và loài vi khuẩn không có

phát hiện các khuẩn lạc trong hầu hết các mẫu trừ

sự hiện diện của nấm men trong mẫu số 3 (42 · 103 thuộc địa / g),

mẫu số 5 (15 · 103 thuộc địa / g), và Bacillus spp trong mẫu

Số 3 (1 · 10 thuộc địa / g), mẫu số 5 (2 · 10 thuộc địa / g),

mẫu số 8, 11 và 13 (tất cả đều có 1 · 10 thuộc địa / g)

Đáng chú ý là tất cả các mẫu đều âm tính đối với thịt lợn

DNA Tất cả các mẫu đều dương ADN của một thịt động vật nhai lại

Mẫu 2, 3, 9, 13 dương tính với DNA của cá trong khi phần còn lại

của các mẫu âm tính với DNA như vậy

Bảng 5 trình bày các hàm lượng sắt (Fe), kẽm (Zn),

đồng (Cu), cadmium (Cd), chì (Pb) và nickel (Ni) được tìm thấy trong

13 nhãn hiệu của các sản phẩm thịt đóng hộp Nồng độ của

Fe trong các thương hiệu khác nhau dao động 11,8-39,1 mg / kg Các nồng độ cao nhất của Fe là trong mẫu số 13 Chín

13 mẫu có hàm lượng Fe trên những gì được phép

giới hạn Nồng độ Zn dao động từ 3,6 đến

28,0 mg / kg, mức cao nhất thể hiện trong mẫu số 1 Tất cả

mẫu có nồng độ Zn dưới giới hạn tối đa cho phép

Nồng độ của Cu dao động 0,01-0,59 mg / kg

Nồng độ cao nhất của Cù đã được nhìn thấy trong mẫu số 1 tại

0,59 mg / kg Tất cả các mẫu có nồng độ Cu dưới

mức tối đa cho phép Ba mẫu (số 3, 5 và 11)

cho thấy mức độ không thể phát hiện Cừ Nồng độ của Cd

dao động 0,16-0,62 mg / kg Mức cao nhất của nồng độ Cd

đã được nhìn thấy trong mẫu số 5 (0,62 mg / kg) Bốn mẫu

(Số 1, 5, 7, 9) có lượng Cd cao hơn tối đa

mức cho phép Mẫu số 3 có mức độ không bị phát hiện ở Cd

Nồng độ Pb dao động 0,27-1,1 mg / kg,

nồng độ cao nhất được tìm thấy trong mẫu số 2 (1,1 mg / kg) Mẫu vật

Số 4 có mức độ không thể phát hiện của Pb Tất cả các mẫu có nồng độ Pb