Đánh giá khả năng sản xuất tinh dịch và khảo nghiệm quy trình đông lạnh tinh dịch bò đực giống hmông nuôi tại trung tâm giống cây trồng và gia súc phó bảng (huyện đồng văn, tỉnh hà giang)

Gần đây, tỉnh Hà Giang đã kết hợp với các nhà khoa học trong khuôn khổ của đề tài nghiên cứu khoa học cấp nhà nước "Khai thác và phát triển nguồn gen giống bò H'Mông" tuyển chọn thêm đư

PHẠM THỊ THANH HÒA

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT

VÀ KHẢO NGHIỆM QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH BÒ ĐỰC GIỐNG H'MÔNG NUÔI TẠI TRUNG TÂM GIỐNG CÂY TRỒNG VÀ GIA SÚC PHÓ BẢNG (HUYỆN ĐỒNG VĂN, TỈNH HÀ GIANG)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CHĂN NUÔI

THÁI NGUYÊN - 2017

ưĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

PHẠM THỊ THANH HÒA

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT

VÀ KHẢO NGHIỆM QUY TRÌNH ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH BÒ ĐỰC GIỐNG H'MÔNG NUÔI TẠI TRUNG TÂM GIỐNG CÂY TRỒNG VÀ GIA SÚC PHÓ BẢNG (HUYỆN ĐỒNG VĂN, TỈNH HÀ GIANG)

Chuyên ngành: Chăn nuôi

Mã số: 60 62 01 05

LUẬN VĂN THẠC SĨ CHĂN NUÔI

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Huê Viên

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng những số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin đảm bảo rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đều đã được ghi rõ

nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2017

Tác giả luận văn

Phạm Thị Thanh Hòa

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn này, lời đầu tiên cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Trần Huê Viên, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi Thú y và các thầy giáo, cô giáo của Khoa đã giảng dạy, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và triển khai thực hiện luận văn này Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, cán bộ, công nhân viên của Trung tâm giống cây trồng và gia súc Phó Bảng, huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, sự giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

Tôi vô cùng biết ơn các thành viên trong gia đình, bạn bè và đồng nghiệp

đã luôn ở bên tôi, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận văn

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2017

Tác giả luận văn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU v

DANH MỤC BẢNG, BIỂU vi

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Cơ sở khoa học 3

1.1.1 Sinh lý sinh dục bò đực 3

1.1.2 Một số chỉ tiêu đánh giá số lượng và chất lượng tinh dich bò đực 5

1.1.3 Những nhân tố ảnh hưởng đến khả năng sản xuất tinh dịch 8

1.1.4 Một số nguyên lý cơ bản về đông lạnh tinh dịch 10

1.1.5 Các nhân tố ảnh hưởng tới sức sống của tinh trùng khi đông lạnh hoạc giải đông 13

1.1.6 Môi trường pha loãng tinh dịch bò 15

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 17

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 19

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 21

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu đánh giá phẩm chất tinh dịch 21

2.3.2 Khảo nghiệm quy trình sản xuất tinh đông lạnh 24

2.3.3 Phương pháp dẫn tinh và xác định tỷ lệ thụ thai ở bò cái 27

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 28

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Khả năng sản xuất tinh dịch của bò đực giống H’Mông 29

3.1.1 Lượng tinh 29

3.1.2 Hoạt lực tinh trùng 32

3.1.3 Nồng độ tinh trung 35

3.1.4 Tổng số tinh trùng sống tiến thẳng 38

3.1.5 Màu sắc tinh dịch 40

3.1.6 Độ pH tinh dịch 42

3.1.7 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 45

3.1.8 Tỷ lệ tinh trùng sống 47

3.2 Khảo nghiệm quy trình đông lạnh tinh dịch bò đực giống H’Mông 49

3.2.1 Kết quả kiểm tra chất lượng tinh dịch bò sau khai thác 49

3.2.2 Kết quả kiểm tra chất lượng tinh dịch bò được sau pha loãng 50

3.2.3 Kết quả kiểm tra chất lượng tinh dịch bò đực sau cân bằng 52

3.2.4 Kết quả kiểm tra chất lượng tinh dịch bò đực sau giải đông 54

3.2.5 Kết quả sản xuất tinh động viên 56

3.4 Kết quả phối giống của tinh đông lạnh bò H’Mông 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

gram Holstein Friesian

Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình

Số lần kiểm tra đạt tiêu chuẩn Phát triển Nông thôn

Tiêu chuẩn ngành Tiêu chuẩn

Truyền tinh nhân tạo Lượng xuất tinh Tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần khai thác Hoạt lực tinh trùng sau giải đông

DANH MỤC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.1: Nhu cầu năng lượng và protein của bò đực giống 9

Bảng 2.1: Thành phần pha môi trường pha loãng tinh dịch 25

Bảng 3.1: Lượng tinh của bò đực giống bò H’Mông nuôi tại Trung tâm 29

Bảng 3.2: Hoạt lực tinh trùng của bò đực giống H’Mông 32

Bảng 3.3: Nồng độ tinh trùng bò đực giống H’Mông 36

Bảng 3.4: Tổng số tinh trùng tiến thẳng của bò H’Mông 38

Bảng 3.5: Màu sắn tinh dịch của bò H’Mông 41

Bảng 3.6: Độ pH tinh dịch của bò đực giống H’Mông 43

Bảng 3.7: Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K) 45

Bảng 3.8: Tỷ lệ tinh trùng sống 47

Bảng 3.9: Chất lượng tinh dịch bò đực H’Mông sau chọn lọc 49

Bảng 3.10: Chất lượng tinh dịch bò đực H’Mông sau pha loãng 51

Bảng 3.11: Hoạt lực tinh trùng sau cân bằng 53

Bảng 3.12: Hoạt lực tinh trùng sau giải đông 54

Bảng 3.13: Khả năng sản xuất tinh đông viên của bò H’Mông 57

Bảng 3.14: Tỷ lệ thụ thai của bò cái ở lần phối đầu 59

Biểu đồ 3.1: Thể tích tinh dịch của bò đực giống H’Mông 30

Biểu đồ 3.2: Hoạt lực tinh trùng của bò đực giống H’Mông 34

Biểu đồ 3.3: Nồng độ tinh trùng bò đực giống H’Mông 36

Biểu đồ 3.4: Tổng số tinh trùng tiến thẳng của bò H’Mông 39

Biểu đồ 3.5: Mầu sắc tinh dịch của bò H’Mông 42

Biểu đồ 3.6: Độ pH của tinh dịch của bò đực giống H’Mông 43

Biểu đồ 3.7: Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của bò đực giống H’Mông 46

Biểu đồ 3.8: Tỷ lệ tinh trùng sống của bò đực giống H’Mông 48

Biểu đồ 3.9: Hoạt lực tinh dịch bò H’Mông sau cân bằng 54

Biểu đồ 3.10: Hoạt lực tinh trùng sau giải đông của bò H’Mông 55

Biểu đồ 3.11: Khả năng sản xuất tinh đông viên của bò H’Mông 58

DANG MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cơ quan sinh dục bò đực 4

Hình 1.2 Cấu trúc của tinh trùng bò 5

Hình 1.3 Quá trình đông lạnh dung dịch 11

Hình 1.4 Đông lạnh nước muối sinh lý 11

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Bò H’Mông (hay còn gọi là bò Mèo) là một giống bò quý đã được Việt Nam đưa vào danh mục bảo tồn, phát triển Ở tỉnh Hà Giang bò H'Mông được nuôi nhiều tại các hộ gia đình người dân tộc H'Mông ở các huyện vùng núi cao, nơi có điều kiện môi trường ở độ cao khoảng 1000 m so với mặt nước biển Do được nuôi dưỡng bởi nguồn thức ăn chủ yếu là cây cỏ tự nhiên, nguồn nước uống là nguồn nước tinh khiết của vùng núi đá nên thịt bò H'Mông có chất lượng ngon, đảm bảo vệ sinh an toàn dịch bệnh và rất được thị trường ưa chuộng

Tuy nhiên, giống bò này hiện nay đang bị suy giảm nghiêm trọng cả về chất lượng và số lượng Công tác quản lý giống ở địa phương còn chưa chặt chẽ, các bò tốt bị khai thác xuất bán cho mổ thịt, việc giao phối tự do dẫn đến tình trạng đồng huyết, cận huyết ngày càng nhiều

Nhằm giải quyết khắc phục những bất cập trên, tỉnh Hà Giang đã có những chính sách chú trọng đến công tác giống bò Gần đây, tỉnh Hà Giang đã kết hợp với các nhà khoa học trong khuôn khổ của đề tài nghiên cứu khoa học

cấp nhà nước "Khai thác và phát triển nguồn gen giống bò H'Mông" tuyển chọn

thêm được một số bò đực giống có chất lượng tốt về nuôi tại Trung tâm giống cây trồng và gia súc Phó Bảng (huyện Đồng Văn) để triển khai việc khai thác sản xuất tinh đông lạnh bò H'Mông phục vụ cho công tác truyền tinh nhân tạo Nhằm cung cấp thêm những thông tin khoa học về đặc điểm sản xuất và chất lượng tinh dịch của giống bò quý này, chúng tôi triển khai đề tài nghiên

cứu: “Đánh giá khả năng sản xuất tinh dịch và khảo nghiệm quy trình đông lạnh

tinh dịch bò đực giống H'Mông nuôi tại Trung tâm giống cây trồng và gia súc Phó Bảng (huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá được khả năng sản xuất, chất lượng tinh dịch của bò H’Mông nuôi tại Trung tâm giống cây trồng và gia súc Phó Bảng, tỉnh Hà Giang

- Đánh giá được chất lượng tinh đông viên của bò H’Mông sản xuất tại Trung tâm giống cây trồng và gia súc Phó Bảng, tỉnh Hà Giang

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Đề tài giúp xác định được khả năng sản xuất tinh dịch của bò đực H'Mông

và chất lượng tinh dịch đông lạnh của bò đực H'Mông sản xuất tại Trung tâm giống cây trồng và gia súc Phó Bảng; Làm cơ sở khuyến cáo áp dụng và phát

triển phương pháp truyền giống nhân tạo bò nâng cao chất lượng đàn bò

H’Mông của địa phương

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học

Người ta đã chứng minh rằng sự thành thục về tính phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhưng có liên quan đến tuổi hơn là thể trọng Mức độ dinh dưỡng điều chỉnh được tuổi thành thục của con đực Nếu nuôi dưỡng tốt, tốc độ sinh trưởng nhanh con đực sẽ đạt tuổi thành thục sớm hơn so với nuôi dưỡng kém (Kunitada, 1992) [46]

1.1.1.2 Cấu tạo bộ máy sinh dục bò đực

Cơ quan sinh dục con đực bao gồm các bộ phận quan trọng là dịch hoàn, dịch hoàn phụ, ống dẫn tinh và các tuyến sinh dục phụ (xem chi tiết ở hình 1) (Nguyễn Văn Bình, Trần Văn Tường, 2007) [3]

- Dịch hoàn (Testis): hay còn gọi là tinh hoàn có 2 chức năng: Nội tiết (tiết

ra các hornon sinh dục) và ngoại tiết (tiết ra tinh trùng) Tất cả các giai đoạn phát triển của tế bào sinh dục đực đều xảy ra ở dịch hoàn (Nguyễn Đức Hùng và

cs, 2003) [15]

- Dịch hoàn phụ: có một số chức năng chính là hấp thu, dịch chuyển, làm trưởng thành và dự trữ tinh trùng

- Ống dẫn tinh: là một ống có cơ chắc chạy từ đuôi dịch hoàn phụ ở đáy dịch hoàn ngược theo dịch hoàn đến phồng ống dẫn tinh

- Các tuyến sinh dục phụ: (tuyến tinh nang; tuyến tiền liệt và tuyến củ hành) sinh ra các chất tiết đóng góp vào thành phần của tinh thanh (Nguyễn Xuân Trạch và cs, 2006) [30]

Hình 1.1 Cơ quan sinh dục bò đực (Nguyễn Xuân Trạch và cs, 2006) [30]

1.1.1.3 Tinh dịch

Tinh dịch là dịch tiết của cơ quan sinh dục đực khi nó thực hiện có kết quả phản xạ sinh dục Tinh dịch chỉ được hình thành một cách tức thời khi con đực phóng tinh nghĩa là lúc nó hưng phấn cao nhất trong quá trình thực hiện phản xạ giao phối (Trần Tiến Dũng và cs, 2002) [10] Tinh dịch gồm 2 phần khác nhau: tinh trùng và tinh thanh Tinh trùng được sinh ra từ những ống sinh tinh ở dịch hoàn, còn tinh thanh được sinh ra từ các tuyến sinh dục phụ

Tỷ lệ giữa tinh thanh và tinh trùng cũng khác nhau tùy theo loài Ở bò tinh dịch có nồng độ tinh trùng cao do trong tinh dịch có ít chất tiết của các tuyến sinh dục phụ

a Tinh trùng

- Hình thái tinh trùng: Tinh trùng gồm các phần chính: Đầu, thân và đuôi (hình 1.2)

Hình 1.2 Cấu trúc của tinh trùng bò (Hiroshi, 1992)[44]

- Đầu là phần chính của tinh trùng Phần ngoài cùng cùng của đầu tinh trùng là màng sinh chất được cấu tạo bởi các phân tử lipoprotein Các phân tử này xếp xen kẽ nhau với khoảng cách 120A0

- Cổ - thân là vùng phức hợp do nguyên sinh chất dồn ép tạo thành Phần

cổ thân của tinh trùng chứa nhiều loại enzym oxy hóa-khử giúp cho tinh trùng trao đổi chất Các enzym này chủ yếu là: phosphatase, transferase và ATPHse Ngoài ra, phần cổ thân có chứa phospholipit có tác dụng cung cấp năng lượng cho tinh trùng hoạt động Thành phần chủ yếu của phospholipit là plasmanogen

có các chuồn như là: K+, Na+, Ca2+, Mg2+ và các anion, như :Cl- và PO43- Trong khi K+ và Mg2+ có tác dụng làm tăng sức sống của tinh trùng thì Ca2+ và kim loại nặng khác có tác dụng ngược lại

1.1.2 Một số chỉ tiêu đánh giá số lượng và chất lượng tinh dịch bò đực

1.1.2.1 Lượng tinh (ml)

Lượng tinh (hay lượng xuất tinh, ký hiệu: V) là thể tích tinh dịch của một lần khai thác tinh Lượng tinh liên quan chặt chẽ với giống, tuổi, chế độ chăm sóc, chế độ dinh dưỡng, kích thước dịch hoàn, mùa vụ, mức độ kích thích tính dục trước khi khai thác, phản xạ nhẩy giá và kỹ thuật khai thác tinh

1.1.2.2 Hoạt lực tinh trùng

Hoạt lực tinh trùng (A) là chỉ tiêu thể hiện số lượng tinh trùng hoạt động tiến thẳng trong tinh dịch Hoạt lực tinh trùng là một trong những chỉ tiêu quan trọng và là chỉ tiêu chủ yếu trong đánh giá chất lượng của tinh dịch, nếu chỉ tiêu hoạt lực tinh trùng không đạt tiêu chuẩn sẽ không thể sản xuất được tinh động lạnh có chất lượng tốt, cho dù các chỉ tiêu khác của tinh dịch vẫn đảm bảo tiêu chuẩn

1.1.2.3 Nồng độ tinh trùng

Nồng độ tinh trùng (C) là số lượng tinh trùng có trong một ml tinh dịch (tỷ/ml) Chỉ tiêu này cùng với lượng xuất tinh được dùng để xác định lượng môi trường pha loãng và số lượng tinh đông lạnh sản xuất được Ở bò, nồng độ tinh trùng biến động từ 200 triệu đến 3.200 triệu tinh trùng/ml, trung bình 1.200-1.500 triệu tinh trùng/ml

1.1.2.4 Màu sắc tinh dịch

Tinh dịch bò thường có màu trắng sữa hay trắng ngà Màu sắc tinh dịch phụ thuộc vào nồng độ tinh trùng cũng như sự hiện diện của các chất khác Tinh dịch có màu trắng sữa hoặc trắng ngà, thường có nồng độ tinh trùng cao; màu trắng trong, loãng là tinh dịch có nồng độ tinh trùng thấp Tinh dịch có màu xanh hoặc xám thường có lẫn mủ, có màu cà phê hay màu nâu, thường do lẫn máu hay sản phẩm viêm của đường sinh dục (Hà Văn Chiêu, 1999) [9]

1.1.2.5 pH tinh dịch

pH tinh dịch có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định bước đầu chất lượng tinh dịch Độ pH tinh dịch có liên quan đến năng lực đệm, sức sống và

năng lực thụ tinh của tinh trùng, đồng thời phản ánh chế độ dinh dưỡng cũng như trạng thái bệnh lý của cơ quan sinh dục Tinh dịch bò có pH 6,2-6,8, các trường hợp ngoại lệ pH của tinh dịch bò 6,2-6,9là do nguyên nhân khách quan gây ra pH tinh dịch có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định bước đầu chất lượng tinh dịch Độ pH kết hợp với các đặc điểm khác sẽ gúp cho người chăn nuôi đực giống quyết định loại thải hay sử dụng tinh dịch vừa mới khai thác được

1.1.2.6 Tinh trùng kỳ hình

Trong điều kiện bình thường, tinh trùng có hình dạng đặc trưng cho mỗi loài, nếu vì một lý do nào đó trong quá trình sinh tinh, hoặc xử lý tinh dịch, tinh trùng có hình thái khác thường như giọt bào tương bám theo, biến dạng hay khuyết tật ở đầu, đuôi như: đầu méo, to, hình quả ké, hai đầu, đuôi gấp khúc, hai đuôi, đuôi xoăn, có giọt bào tương, thể đỉnh phù, tháo rời, vỡ vv Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình có liên quan đến chất lượng tinh dịch Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giống, điều kiện nuôi dưỡng, thời tiết, bệnh tật, di truyền và kỹ thuật xử lý tinh dịch vv

1.1.2.7 Tỷ lệ tinh trùng sống

Tỷ lệ tinh trùng sống liên quan chặt chẽ đến tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng Dựa vào nguyên lý màng của tinh trùng chết hoặc đang chết có khả năng cho các chất nhuộm màu thấm qua, do sự rối loạn tính thẩm thấu của màng tinh trùng Trong khi đó những tinh trùng sống màng tinh trùng không cho các chất nhuộm màu thấm qua nên không bắt màu khi nhuộm Bằng cách này người ta đã

sử dụng thuốc nhuộm màu Eosine 5% để nhuộm tinh trùng chết rồi đếm chúng trên kính hiển vi và tính tỷ lệ sống, chết

1.1.2.8 Tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần khai thác

Tổng số tinh trùng sống tiến thẳng trong tinh dịch (VAC) là chỉ tiêu tổng hợp quan trọng để đánh giá khả năng sản xuất tinh đông lạnh của từng bò đực giống VAC càng lớn phản ánh sức sản xuất của con đực càng cao, chất lượng tinh càng tốt

1.1.2.9 Hoạt lực tinh trùng sau giải đông

Hoạt lực tinh trùng sau giải đông (Asgđ %) là chỉ tiêu quan trọng nhất để đánh giá chất lượng tinh đông lạnh Hoạt lực tinh trùng sau giải đông có tầm ảnh hưởng rất lớn trong kết quả thụ thai ở bò cái: nếu hoạt lực tinh trùng sau giải đông cao thì tỷ lệ thụ thai cao và ngược lại

1.1.3 Những nhân tố ảnh hưởng đến khả năng sản xuất tinh dịch

1.1.3.1 Giống và cá thể bò đực

Tuỳ từng giống, tầm vóc to hay nhỏ, cường độ trao đổi chất mạnh hay yếu, khả năng thích nghi với thời tiết khí hậu tốt hay không mà có số lượng và chất lượng tinh dịch sản xuất khác nhau Ví dụ bò đực giống ôn đới (800 - 1.000 kg) mỗi lần lấy tinh có thể cho 8-9 ml hay thậm chí 10-15 ml, còn bò nội của ta chỉ cho được 3-5 ml Bò ôn đới nhập vào nước ta do thích nghi với khí hậu mùa

hè kém nên lượng tinh dịch giảm và tính hăng cũng kém (Nguyễn Xuân Trạch, 2003) [28]

Trong cùng một giống, cá thể đực to lớn chưa hẳn đã cho tinh nhiều hơn

cá thể nhỏ hơn Vì vậy trong thực tiễn sản xuất, việc xác định khả năng sản xuất tinh của từng cá thể là rất quan trọng (Hà Văn Chiêu, 1997) [8]

1.1.3.2 Tuổi bò đực

Số lượng và chất lượng tinh dịch của con đực trưởng thành thường nhiều

và ổn định hơn so với đực trẻ Bò đực sản xuất tinh dịch tốt một cách rất ổn định vào khoảng 3 đến 6 năm tuổi Tinh dịch được lấy từ những bò đực già hơn thể hiện những đặc trưng như giảm tỷ lệ tinh trùng sống, tăng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình và giảm khả năng có thể đông lạnh (Hiroshi, 1992) [44]

1.1.3.3 Thời tiết khí hậu

Bò đực chịu tác động trực tiếp của môi trường như các thể sống khác, chủ yếu là các yếu tố tự nhiên như nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng vv Theo quy luật giới hạn sinh thái và trong mối quan hệ giữa ngoại cảnh với sinh vật, tác động của môi trường tới sinh sản là quan trọng nhất (Hà Văn Chiêu, 1999) [9]

1.1.3.4 Chế độ dinh dưỡng

Theo Nguyễn Xuân Trạch và Mai Thị Thơm (2004) [29] thức ăn là một trong những nhân tố cơ bản có ảnh hưởng trực tiếp và gián tiếp đến số lượng và chất lượng tinh dịch

Chế độ dinh dưỡng kém, làm chậm thành thục về tính, giảm tính hăng của đực giống, giảm sự hình thành tinh trùng, tăng tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Chế độ nuôi dưỡng tốt, cân bằng dinh dưỡng có tác dụng làm cho con đực sớm thành thục về tính, khả năng sinh tinh cao Tuy nhiên, nếu chế độ dinh dưỡng quá cao

sẽ làm bò đực béo, trong thân thể và dịch hoàn tích mỡ, tuần hoàn máu kém lưu thông, làm giảm khả năng sinh tinh, tăng tỉ lệ tinh trùng chết và tỉ lệ tinh trùng

kỳ hình cao (Bùi Đức Lũng và CS, 1995) [16]

Bảng 1.1: Nhu cầu năng lượng và protein của bò đực giống

Nghỉ phối Trung bình Phối nhiều

5,2 – 5,8 6,0 – 6,6 6,7 – 7,5 7,3 – 8,2 7,8 – 8,9 8,6 – 9,5 9,1 – 10,0

5,6 – 6,1 6,4 – 7,0 7,2 – 8,0 7,9 – 8,7 8,5 – 9,5 9,2 – 10,2 9,8 – 10,8

Nhu cầu protein tiêu hóa (g/ĐVTA)

Theo (Nguyễn Xuân Trạch và cs, 2006) [30]

Khẩu phần ăn cân đối, giàu đạm, giàu vitamin sẽ làm tăng số lượng tinh dịch và tinh trùng Thức ăn thiếu vitamin A hoặc ít caroten, quá trình sinh tinh

bị giảm đi rõ rệt, khẩu phần thức ăn giàu chất xanh sẽ khắc phục được nhược điểm trên

1.1.3.5 Khoảng cách lấy tinh

Khoảng cách lấy tinh ảnh hưởng đến lượng xuất tinh, chất lượng, nồng độ

và hoạt lực của tinh trùng Đối với bò đực giống thường khoảng cách 3-5 ngày

lấy tinh một lần là tốt nhất, nếu khoảng cách lấy tinh ngắn có thể mỗi lần lấy tinh được ít, nhưng số lần lấy tinh thì nhiều (Hà Văn Chiêu, 1997) [8]

Khoảng cách lấy tinh dài, thể tích tinh dịch lấy được nhiều nhưng tỷ lệ tinh trùng chết cao, hoạt lực tinh trùng yếu Việc xác định khoảng cách lấy tinh phải căn cứ vào thể tích và chất lượng tinh lấy được lần trước của từng con đực để xác định lần lấy tinh tiếp theo Để duy trì khả năng sinh sản lâu dài của bò đực thì khoảng cách lấy tinh thích hợp cho bò là 3-4 ngày/lần (Cheng, 1992) [40]

1.1.3.6 Chăm sóc

Chăm sóc là công việc tác động trực tiếp lên cơ thể bò đực gồm: cách cho

ăn, tắm trải vận động Chuồng trại sạch sẽ, thoáng mát về mùa hè, ấm áp về mùa đông, bò được tắm, chải, vận động thoải mái hàng ngày giúp bò đực khỏe mạnh

1.1.3.7 Tay nghề của kỹ thuật viên khai thác tinh dịch

Các thao tác chuẩn bị của kỹ thuật viên cần đảm bảo đúng theo các bước quy định, điều này sẽ làm cho bò đực giống cảm nhận được sự hưng phấn gần như nhảy trực tiếp giúp làm tăng số lượng và chất lượng tinh dịch (Hà Văn Chiêu, 1999) [9]

1.1.4 Một số nguyên lý cơ bản về đông lạnh tinh dịch

Trong quá trình đông lạnh tinh dịch, ngoài việc dựa vào nguyên lý, lý học, hóa học còn phải dựa vào nguyên lý sinh học và mối tương tác của chúng sao cho tinh trùng khi đông băng vẫn giữ nguyên hình thái, trao đổi chất tạm ngừng

và sau khi giải đông tinh trùng vẫn hoạt động bình thường (Ditto, 1992) [41]

1.1.4.1 Hiện tượng đông băng chất lỏng

Diễn biến quá trình đông băng chất lỏng gồm các giai đoạn: Tiền đông băng (Supercooling), tạo nhân (nucleation), giãn nở của tinh thể băng (growth of ice crystals) và kết tinh hoàn thiện tại một nhiệt độ nhất định (Eutectic Point)

Tiền đông băng: Quá trình làm lạnh một chất lỏng nếu tốc độ làm lạnh chậm, nhiệt độ của chất lỏng hạ xuống điểm đông băng Trạng thái của chất lỏng lúc này là không ổn định, chỉ cần một tác động nhẹ là xảy ra hiện tượng tạo nhân

hoặc phá vỡ hiện tượng tạo nhân tinh thể thay vào đó là hiện tượng kết hạt (Supercooling) (Ditto, 1992) [41]

Tạo nhân tinh thể: chất lỏng đông băng phải có một hạt nhỏ làm “nhân” cho các phân tử nước lần lượt bám vào để hình thành tinh thể (Barios, 1995 trích

từ Hà Văn Chiêu, 1999) [9] Hiện tượng tạo nhân tinh thể có hai hình thái Đối với nước nguyên chất, việc tạo nhân từ hạt tinh thể nước; đối với dung dịch, các hạt chất tan làm nhân cho các phân tử nước bao quanh tạo tinh thể

- Sự giãn nở của tinh thể băng: Khi đông băng các tinh thể hình thành, thể tích của chúng sẽ tăng lên, sự giãn nở thể tích này giải phóng năng lượng tiềm

ẩn sẵn trong các phân tử nước Tốc độ đông băng nhanh thì giai đoạn trên sẽ ngắn và sự giãn nở của tinh thể băng sẽ bị loại trừ và thay vào đó là hiện tượng tinh thể hoá (Ditto, 1992) [41]

Hình 1.3 Quá trình đông lạnh dung dịch (Hiroshi, 1992) [44]

Hình 1.4 Đông lạnh nước muối sinh lý (Hiroshi, 1992) [44]

- Kết tinh hoàn thiện tại một nhiệt độ nhất định: Khi hiện tượng làm lạnh tiếp tục, lượng tinh thể nước tăng lên và pha loãng giảm dần, nồng độ dung dịch tăng Dung dịch sẽ tách làm hai phần: Pha tinh thể nước và pha lỏng Nếu hiện tượng làm lạnh tiếp tục thì pha lỏng sẽ bị biến mất tại một nhiệt độ nhất định Điểm đó gọi là điểm đông băng hoàn chỉnh của một dung dịch (Rodriguez và Duverger, 1997 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999) [9]

1.1.4.2 Ảnh hưởng của đông băng lên tế bào tinh

Tinh trùng rất mẫn cảm và luôn tồn tại trong tinh thanh, khi đông lạnh, tinh trùng chịu sự tác động của các hiện tượng sau (Ditto, 1992) [41]:

- Hiện tượng đông băng nội bào: Nếu tinh trùng bị chết, hoặc mất năng lực hoạt động, khi cấu tạo nội bào bị phá vỡ do việc hình thành tinh thể nuớc nội bào Nếu tinh trùng nằm trong dung dịch nuớc muối sinh lý có thể loại trừ đuợc hiện tuợng này, vì được các phân tử nuớc dạng lỏng bao quanh, mặc dù dung dịch ngoại bào bắt đầu đóng băng ở nhiệt độ -2oC hoặc -5oC Nhưng quá trình đông băng sẽ không làm hại tới tế bào tinh trùng cho đến khi nước nội bào đông lạnh mặc dù dung dịch môi trường bao quanh đã đông lạnh (Mazur, 1989) [48]

- Sự mất nước của tế bào tinh trùng: Nếu nước nội bào thoát ra ngoài, tinh trùng sẽ bị teo lại, nhưng vẫn có tinh trùng sống được ở nhiệt độ thấp hoặc siêu thấp -1960C Quá trình làm lạnh tinh dịch, nước ngoại bào đông băng làm áp suất thẩm thấu chênh lệch, nước nội bào thoát ra khỏi ngoài tinh trùng và tiếp tục đông băng phần ngoại bào

- Hiện tượng đông băng ngoại bào: trong quá trình đông lạnh, hiện tượng đóng băng nước ngoại bào sẽ xảy ra làm nồng độ dung dịch tăng lên và ASTT ngoại bào cao hơn ASTT nội bào dẫn đến sự thoát nước nội bào ra môi trường,

pH cũng thay đổi

- Chuyển động của nước và sự giãn nở của tinh thể nước gây ra huỷ hoại cơ học đối với tinh trùng: Hiện tượng giải đông giống như đông lạnh cũng làm huỷ hoại tinh trùng do chênh lệch áp suất thẩm thấu, sự di chuyển của nước qua màng tế bào tinh trùng và sự giãn nở của các tinh thể nước đá trong quá trình

đông lạnh hoặc tan băng có thể gây tổn thương tế bào tinh trùng Các bọt khí tồn tại trong tinh thể băng cũng có thể gây tổn hại tinh trùng trong quá trình này (Maria, 1995 trích từ Hà Văn Chiêu, 1999) [9]

1.1.5 Các nhân tố ảnh hưởng tới sức sống của tinh trùng khi đông lạnh hoặc giải đông

Khi đông lạnh hoặc giải đông các hiện tượng đông băng sẽ ảnh hưởng

sự sống của tình trùng Các nhân tố giúp tinh trùng tồn tại khi đông lạnh hoặc giải đông:

- Sức đề kháng của tinh trùng đối với đông lạnh: sức kháng đông của tinh trùng là khả năng chịu được đông lạnh của tinh trùng và thường được đo bằng tỷ

lệ hồi phục lại của tinh trùng sau khi đông lạnh và giải đông Ở bò đực, sức kháng đông của tinh trùng là khác nhau, tùy theo từng cá thể bò đực, điều kiện lúc lấy tinh và tuổi của bò đực

+ Giống, cá thể và tuổi: sức kháng đông của tinh trùng thể hiện rõ giữa các

cá thể bò đực, nhưng không rõ ràng giữa các giống khác nhau Bò đực có tuổi 1,5 năm tuổi, tinh trùng có sức kháng đông thấp, từ 2 năm tuổi trở lên có sức kháng đông cao Nhưng từ 6 năm tuổi trở lên tinh trùng của chúng có sức kháng đông giảm xuống (Phạm Văn Tiền, 2014) [26]

1-+ Mùa vụ: mùa hè nhiệt độ không khí cao nên sức kháng đông của tinh trùng vào mùa này thường thấp

+ Số lần lấy tinh liên tiếp: khi khai thác tinh liên tiếp thì tinh trùng thu được từ lượt phóng tinh thứ hai cho thấy sức kháng đông tốt hơn so với tinh trùng thu được từ lượt phóng tinh đầu

- Thành phần của môi trường pha loãng: môi trường pha loãng tinh dịch có thành phần cơ bản là đường saccharid, chất đệm và lòng đỏ trứng gà Nồng độ tối ưu của lòng đỏ trứng là 15-20 %, nếu nồng độ này quá thấp hoặc quá cao thì không tốt cho tinh trùng Chức năng này chủ yếu do tác động của lipoprotein và lecithin trong lòng đỏ Đường saccharide đóng vai trò quan trọng trong môi

trường, do tác động đến áp suất thẩm thấu, nó có tác dụng bảo vệ tinh trùng khi

ở nhiệt độ thấp và là nguồn năng lượng cho tinh trùng

Chất đệm có vai trò quan trọng trong duy trì màng sinh chất của tinh trùng khi đông lạnh và khi giải đông, trong kích thích trao đổi chất diễn ra bình thường ở tinh trùng sau giải đông đồng thời duy trì sức sống của chúng Chất

đệm phải phù hợp như là môi trường khi đông lạnh và phải có đặc tính sau:

+ Duy trì mức thấp nhất về sự tổn hại cho tinh trùng do các muối gây ra + Phải tan trong nước với hằng số phân ly điện tích là 6-8

+ Khả năng thấm qua màng sinh chất phải thấp và có sức đề kháng mạnh với các enzyme

- Bảo quản tinh đã pha loãng ở 50C trước khi đông lạnh: bảo quản tinh đã pha loãng ở 50C trước khi đông lạnh sẽ tăng cường sức kháng đông cho tinh trùng bò đực Tinh bò đực sau khi khai thác và đủ tiêu chuẩn pha chế thì tiến

hành xử lý gồm:

+ Pha loãng lần đầu tinh dịch ở 350C

+ Làm lạnh dần xuống 50C và bảo quản trong thời gian 1,5 – 2 giờ

+ Pha loãng lần hai với môi trường có chứa glycerol

+ Cân bằng trong 4 giờ

+ Đông lạnh tinh trùng

+ Bảo quản tinh trùng đã làm lạnh ở 50C trước khi pha loãng lần hai

- Nồng độ của glycerol: nồng độ glycerol trong môi trường pha loãng cuối cùng để làm đông lạnh tinh trùng bò vào khoảng 7 %, nhưng tỷ lệ này có hơi khác nhau tùy theo các thành phần của môi trường pha loãng Nồng độ glycerol trong môi trường pha loãng có mối tương quan đáng tin cậy với tốc độ giải đông, đó là nồng độ glycerol cao trong môi trường pha loãng là cần thiết cho tốc

độ giải đông nhanh (Hiroshi, 1992) [44]

- Tốc độ làm lạnh: tốc độ làm lạnh quá cao sẽ gây tổn hại tới tinh trùng vì

nó gây ra siêu lạnh, thể vẩn và nước lưu giữ trong tế bào Điều đó gây ra đông lạnh ngoại bào và sau đó đông lạnh nội bào Tốc độ làm lạnh chậm sẽ gây ra tập

trung nồng độ cho cả dung dịch ngoại bào và dung dịch nội bào và sẽ làm rối

loạn tế bào, đây được coi là ảnh hưởng của dung dịch

- Tốc độ giải đông: tốc độ giải đông có ảnh hưởng lớn đến sức sống, hoạt lực, tỷ lệ acrosome bình thường và quá trình trao đổi chất bình thường của tinh trùng Giải đông tinh cọng rạ bằng nước 350C sức sống tinh trùng cao hơn so với nước 40C hoặc 200C Giải đông ở nước 35-750C, cũng cho tỷ lệ acrosome bình thường cao hơn so với nước 40C hoặc 200C Nếu tinh được bảo quản ở nhiệt độ

370C sau khi giải đông, tinh đông viên nào được giải đông nhanh ở nhiệt độ cao hơn thì sẽ duy trì được sức sống tinh trùng cao hơn (Trịnh Văn Bình, 2013) [4]

- Thời gian bảo quản: tinh trùng đông lạnh phải luôn luôn được bảo quản ngập chìm trong nitơ lỏng (-1960C), nếu bảo quản tốt sau vài chục năm, tỷ lệ sống và hoạt lực tinh trùng của tinh trùng vẫn không thay đổi, khả năng thụ tinh vẫn không bị giảm (Hà Văn Chiêu, 1997) [8]

1.1.6 Nguyên tắc môi trường pha loãng tinh dịch bò

Môi trường pha loãng tinh dịch là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tồn tại của tinh trùng trong quá trình đông lạnh Theo Ivanop (1890) được (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [15] trích dẫn, môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch

là một môi trường lý, hóa học, đáp ứng đầy đủ các điều kiện sống và trao đổi chất của tinh trùng và sau khi bảo tồn có khả năng hồi phục chức năng hoạt động

và thụ tinh Vì vậy, môi trường phải đảm bảo các nguyên tắc cơ bản sau:

- Áp lực thẩm thấu

Áp lực thẩm thấu của môi trường phải tương đương áp lực thẩm thấu của tinh dịch Áp lực thẩm thấu là áp suất cần thiết trong dung dịch tác động lên màng tế bào làm ngừng hiện tượng thẩm thấu Đây là nguyên tắc cơ bản cao nhất, chỉ trong điều kiện cân bằng về áp lực thẩm thấu tinh trùng mới giữ nguyên được hình thái và quá trình trao đổi chất Môi trường ưu trương hay nhược trương đều có thể giết chết tinh trùng, bởi vậy trong các môi trường này tinh trùng sẽ bị teo đi hay trương phồng lên dẫn tới cấu trúc bị thay đổi tinh trùng bị chết một cách nhanh chóng (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [15]

- Độ pH:

Môi trường phải có độ pH tương đương độ pH của tinh dịch hoặc hơn toan một chút Nồng độ H+ càng tăng thì môi trường càng toan tính và ngược lại Môi trường pha loãng tinh dịch phải có pH 6,2 - 6,8 (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997) [1]

- Năng lực đệm của môi trường:

Bảo tồn tinh dịch là giữ cho tinh trùng sống Sự sống luôn được gắn liền với quá trình trao đổi chất mà bản chất quá trình trao đổi chất của tinh trùng trong thời gian bảo tồn là quá trình đường phân yếm khí Quá trình này luôn thải

ra môi trường axit lactic, làm cho nồng độ H+ trong môi trường luôn có xu hướng tăng lên Sự tăng lên của H+ có nguy cơ gây đầu độc tinh trùng Do đó phải bổ sung thêm chất đệm vào môi trường, thường là đệm một chiều, như muối kim loại kiềm của các axit hữu cơ yếu như: Natri xitrat, Kali tartrat, Natri bicarbonat… (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [15]

- Tỷ lệ giữa chất điện giải và chất không điện giải:

Môi trường phải đảm bảo có tỷ lệ giữa chất điện giải và không điện giải thích hợp

Chất không điện giải thường là các đường (glucose, fructose ) Ngoài việc cung cấp năng lượng cho tinh trùng trong quá trình trao đổi chất, đường có vai trò rất quan trọng trong việc bảo vệ tinh trùng tránh cho tinh trinh trùng không bị mất điện tích bề mặt một nguyên nhân gây ra hiện tượng kết dính tinh trùng thành từng đám (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [15]

Tinh trùng rất mẫn cảm với dung dịch muối, như NaCl, BaCl2… , nhưng trong quá trình pha chế, người ta vẫn phải đưa vào môi trường một lượng nhất định muối không độc và có chứa các anion có hóa trị cao

- Môi trường phải có đặc điểm vật lý phù hợp với tinh trùng: Tỷ trọng của

môi trường phải tương đương tỷ trọng của tinh dịch Nguyên tắc này đảm bảo cho môi trường và tinh dịch hòa tan vào nhau, tinh trùng tránh được lực đẩy Acsimet

Độ nhớt của môi trường cũng phải tương đương với độ nhớt của tinh dịch Bởi vì, sự vận động của tinh trùng trong môi trường hình thành một lực ma sát nội phân tử tác động lên bề mặt màng tế bào, gây nên sức căng trên bề mặt và có thể làm thay đổi hình thái, cấu trúc của tinh trùng

Chất keo nhớt thường dùng trong môi trường là glyxeryl, lòng đỏ trứng

gà, lipoprtein hoặc leucitin

- Môi trường cần thỏa mãn tính kinh tế và tính thực tế và thực tiễn: Môi

trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch thỏa mãn các yêu cầu: Nguyên liệu dễ tìm,

rẻ tiền; kỹ thuật pha chế đơn giải; môi trường có khả năng kéo dài thời gian sống của tinh trùng, nhưng vẫn đảm bảo tỷ lệ thụ thai cao sau khi phối giống

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 1960 TTNT trên bò lần đầu tiên được thực hiện, sau nhiều năm nhưng công tác phát triển đàn bò thịt ở Việt Nam chưa được quan tâm đúng mức, tình trạng thiếu bò đực giống ở nhiều nơi, hiện tượng giao phối cận huyết khá phổ biến dẫn đến nguồn gen của các giống bò quý đang bị suy giảm cả về số lượng, tầm vóc và khối lượng Việc tuyển chọn những bò đực giống có chất lượng tốt phát triển đàn bò tại địa phương và các tỉnh lân cận để phát triển kinh

tế trong chăn nuôi, công tác TTNT đóng vai trò rất quan trọng

Ở nước ta hiện nay những nghiên cứu về số lượng, chất lượng tinh dịch,

kỹ thuật đông lạnh tinh và TTNT chủ yếu thực hiện trên bò sữa và đã mang lại những kết quả to lớn trong công tác phải triển chăn nuôi bò sữa Tuy nhiên, kỹ thuật TTNT cho bò thịt chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều, chỉ có một số ít công trình nghiên cứu về sinh sản của bò thịt và TTNT, lai tạo bò, đông lạnh và ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng sản xuất tinh

Hà Văn Chiêu (1999) [9] đã nghiên cứu một số đặc điểm sinh học tinh dịch bò HF, Zêbu và khả năng sản xuất tinh đông lạnh của chúng tại Việt Nam cho biết, bò Zêbu có thể tích tinh dịch đạt 4,25ml/lần; nồng độ tinh trùng là 0,94

tỷ/ml; hoạt lực tinh trùng là 58,76 %; pH là 6,6; tỷ lệ tinh trùng kỳ hình là 18,45

% và tỷ lệ tinh trùng sống là 79,1 %

Lê Bá Quế và CS (2001) [18] khi nghiên cứu trên bò Zêbu (Bos Indicus) cho thấy rằng, ảnh hưởng của chế độ dinh dưỡng đến từng đặc điểm sinh học của tinh dịch là không đáng kể nhưng sự ảnh hưởng tổng hợp của chúng đến khả năng sản xuất tinh đông lạnh là rất lớn và cho kết quả: nồng độ tinh trùng là 0,91 tỷ/ml; pH là 6,4-6,8; tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 18 % và khả năng sản xuất tinh viên trung bình 3.414 viên/con/năm (cao nhất đạt 6.439 viên/con/năm)

Phạm Văn Tiềm (2009) [25] cho biết khả năng sản xuất tinh đông lạnh của bò đực giống Brahman, trung bình 18.586 liều/con/năm; trong đó nhóm bò Brahman Cuba trung bình 21.253 liều/con/năm cao hơn nhóm bò Brahman Australia trung bình (16.808 liều/con/năm)

Gần đây nhất trong nghiên cứu bò H’Mông khả năng sản xuất tinh dịch và ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến chất lượng tinh của Trịnh Văn Bình (2013) [4] đã khẳng định: Hoạt lực tinh trùng bị giảm trong thời gian bảo quản nhưng tốc độ giảm chậm từ 41,46 xuống 41,09 % với tốc độ này tinh đông viên bảo quản được 2 – 3 năm vẫn có hoạt lực ≥ 40 %, nghĩa là vẫn có thể sử dụng phối giống cho tỷ lệ đậu thai Phẩm chất tinh dịch bò H’Mông khá tốt; các chỉ tiêu chủ yếu có giá trị trung bình là lượng xuất tinh 4,43 ml/lần khai thác; hoạt lực tinh trùng 68,96 %; nồng độ tinh trùng 0,85 tỷ/ml; tổng số tinh trùng sống tiến thẳng 2,59 tỷ; tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 16,49 % và tỷ lệ tinh trùng sống 83,47

%; các chỉ tiêu sinh học khác đều đạt tiêu chuẩn tốt

Các nghiên cứu về sản xuất tinh bò thịt nói chung và tinh đông viên ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở bước đầu xác định khả năng sản xuất, ảnh hưởng của mùa vụ đến thể tích tinh dịch ở một số ít bò đực giống thí nghiệm, tinh đông lạnh chỉ được sử dụng trong phạm vi hẹp Như vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng tinh đông lạnh để TTNT cho bò thịt ở Việt Nam còn hạn chế

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1900, TTNT lần đầu tiên được thực hiện trên bò ở Nga bởi nhà khoa học Ivanov nhưng chưa phổ biến do gặp khó khăn trong việc khai thác tinh trùng của bò đực Năm 1914 từ phát minh âm đạo giả của Joseppe Amantea (nhà bác học người Italia) lần lượt các âm đạo giả để khai thác tinh trùng của các loài gia súc khác được ra đời

Bajwa (1986) [35] nghiên cứu trên bò Zêbu cho biết nồng độ tinh trùng trung bình dao động 0,8 tỷ/ml đến 1,2 tỷ/ml; hoạt lực tinh trùng dao động 67 % đến 70 %

Leon và cs (1991) [47] nghiên cứu trên 30 bò đực nâu Thụy Sỹ và 30 bò đực Zêbu cho biết kết quả trên bò Zêbu: thể tích tinh dịch trung bình là 6,4 ml;

pH = 6,96 và nồng độ tinh trùng là 1,05 tỷ/ml

Risco và cs (1993) [51] nghiên cứu trên bò Brahman ở Floria Mỹ cho biết hoạt lực tinh trùng trung bình của bò Brahman là 66,0 % và tỷ lệ tinh trùng sống

là 83,01 %

Brito và cs (2002a) [37] nghiên cứu trên 68 bò Bos indicus cho biết nồng

độ tinh trùng 1,5 tỷ/ml và hoạt lực tinh trùng 59,3 %;

Brito và cs (2002b) [38] nghiên cứu ở 7 bò đực giống Bos indicus tại Brazil cho biết ở bò Bos indicus: thể tích tinh dịch đạt 6,6ml và hoạt lực tinh trùng đạt 59 %

Brito và cs (2004) [39] nghiên cứu trên bò Bos indicus cho biết kỳ hình trung bình là 15,9 %

Tatman và cs (2004) [53] nghiên cứu trên bò đực Brahman ở Mỹ cho biết hoạt lực tinh trùng trung bình là 60,0 %

Anwar và cs (2008) [32] nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ giải đông đến hoạt lực tinh trùng sau giải đông trên bò Zêbu cho biết: giải đông ở nhiệt độ

370C cho kết quả hoạt lực sau giải đông đạt cao nhất, trung bình là 46,7 %

Herliantien (2009) [43] cho biết, thể tích tinh dịch bò đực từ 2-14 ml; pH tinh dịch từ 6,2-6,8 và khả năng sản xuất tinh bò đông lạnh của bò Brahman tại

Trung tâm thụ tinh nhân tạo Singosari ở Indonesia trung bình đạt 14.350 cọng rạ/con/năm

Abd Al Karim Khalifa Maok Zamuna, Trinil Susilawati, Gatot Ciptadi (2016) [34] đánh giá các giống khác nhau về khả năng sản xuất tinh đông lạnh cho biết lượng tinh dịch của bò Limousin là 72 ±1,3 ml, bò Simental là 6,9 ±1,6

ml, bò PO là 6,1 ± 1,2 ml, bò Brahman là 4,2 ±1,8 ml

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Khả năng sản xuất tinh dịch của 5 bò đực, giống bò H'Mông gồm:

- Bò số 01 ở độ tuổi 45 tháng, có khối lượng cơ thể 590 kg

- Bò số 02 ở độ tuổi 50 tháng, có khối lượng cơ thể 580 kg

- Bò số 03 ở độ tuổi 55 tháng, có khối lượng cơ thể 555 kg

- Bò số 04 ở độ tuổi 60 tháng, có khối lượng cơ thể 535 kg

- Bò số 05 ở độ tuổi 65 tháng, có khối lượng cơ thể 500 kg

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Địa điểm: Trung tâm giống cây trồng và gia súc Phó Bảng (huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang)

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 7 năm 2016 đến tháng 8 năm 2017

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá khả năng sản xuất tinh dịch bò đực giống H'Mông

- Khảo nghiệm quy trình đông lạnh tinh dịch bò đực giống H'Mông

- Sử dụng tinh đông viên để phối giống cho bò cái

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu đánh giá phẩm chất tinh dịch

2.3.1.1 Lượng tinh V (ml)

- Tinh bò được khai thác bằng âm đạo giả sau khai thác được kiểm tra bằng cách nhìn vào ống nghiệm đựng tinh để xác định số ml tinh dịch (V) của mỗi lần khai thác

+ Màu sắc: các chỉ tiêu này được xác định bằng phương pháp cảm quan các

cơ quan thị giác (nhìn)

2.3.1.2 Hoạt lực của tinh trùng A (%)

Chỉ tiêu này được xác định bằng phương pháp quan sát qua kính hiển vi với độ phóng đại 200 lần, cụ thể:

Dùng micropipét hút 0,1 ml tinh dịch + 0,09 ml dung dịch nước muối sinh

lý nhỏ phiến kính khô, sạch, ấm (350C - 370C) Dùng lamen đậy lên tinh dịch quét đều bốn cạnh của lamen Tiến hành soi trên kính hiển vi với độ phóng đại

200 lần, quan sát trên toàn vi trường xác định tỷ lệ tinh trùng tiến thẳng Tiến hành ước lượng tỷ lệ phần trăm số tinh trùng tiến thẳng so với tổng số tinh trùng

có trong vi trường mà ta quan sát được Việc đánh giá cho điểm được tiến hành theo thang điểm 10 của Milovanov

2.3.1.3 pH tinh dịch

Đo pH tinh dịch bằng giấy đo pH (1-14) của hãng Merck-Đức: Dùng đũa thủy tinh lấy 1 giọt dinh dịch nhỏ lên giấy pH và sau 3 giây thì so sánh màu của giấy với bảng màu chuẩn

2.3.1.4 Tỷ lệ tinh trùng sống

Theo phương pháp của Milovanov như sau: Nhỏ 1 giọt tinh dịch lên lam kính + 2 giọt Eosin 5%, đảo nhẹ rồi sau đó nhỏ 4 giọt Nogrosin 10% Đảo nhẹ nhàng, để ấm 370C trong 30 giây Lấy 1 giọt phết kính dàn mỏng đều đưa lên kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần đếm tổng số 500 tinh trùng rồi tính tỷ lệ

%, bằng phép số học thông thường Tinh trùng chết là những tinh trùng bắt màu

đỏ Eosin

2.3.1.5 Nồng độ tinh trùng trong tinh dịch (C – tỷ/ml)

Sử dụng phương pháp xác định nồng độ tinh trùng bằng buồng đếm Newbouer: Dùng ống pha loãng bạch cầu để hút tinh dịch đến vạch 0,5, hút tiếp dung dịch NaCl 0,3% đến vạch 11 Bịt 2 đầu ống pha loãng bằng ngón tay trái

và ngón tay giữa lắc nhẹ 5 - 6 lượt cho tinh dịch trộn đều với dung dịch NaCl mức độ pha loãng 200 lần Sau đó bỏ đi 5 - 6 giọt ban đầu, nhỏ hỗn hợp này vào trong buồng đếm sau đó đưa lên kính hiểm vi có độ phóng đại 200 lần để đếm tinh trùng

Cách đếm: Xác định ô đếm: 5 ô lớn, 4 ô ở 4 góc và 1 ô ở giữa đếm ở từng ô một

và ghi cụ thể, dựa vào đầu tinh trùng để đếm, cách đếm trong một ô có 16 ô con, đếm theo hình zíc zắc

Xác định số tinh trùng trong 5 ô lớn bằng 5 x 16 = 80 ô con là n và xác định nồng

triệu tinh trùng có trong tinh dịch)

2.3.1.6 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K)

Sử dụng phương pháp Chemineau (1991) Lấy một giọt tinh dịch nhỏ phiến kính Đặt chiều rộng lam kính trùng khít với cạnh ngang tinh dịch và nghiêng phiến kính A một góc 450, kéo xuống nhẹ một lần sao cho tinh dịch dàn đều trên phiến kính A Để phiến kính có tinh dịch dàn đều tự khô trong không khí hoặc

hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để tinh trùng dính chặt trên lam kính, cố định 2 – 3 phút sau đó cho vòi nước chảy nhẹ vào lam kính (tránh tinh trùng bị trôi mất), vẩy khô Dùng Methylen 5% hoặc đá Fucxin 5% hoặc Rosa bengad 5% nhỏ lên phiến kính để trong 5 phút Đặt phiến kính lên kính hiểm vi với độ phóng đại

400 lần, đếm số tinh trùng kỳ hình và tổng số tinh trùng có trong vi trường (Đếm hết tinh trùng trong vi trường này xong mới chuyển sang vi trường khác cho đủ tổng số tinh trùng trong khoảng 300 – 500)

K(%)= Số tinh trùng kỳ hình

X 100 Tổng số tinh trùng đếm được

2.3.1.8 Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong tinh dịch (VAC)

Xác định bằng cách nhân tích số của V, A và C

2.3.1.9 Tỷ lệ các lần lấy tinh đạt tiêu chuẩn (%)

Ghi chép tất cả các lần lấy tinh và tính toán bằng phương pháp số học thông thường:

Tỷ lệ các lần lấy tinh

đạt tiêu chuẩn (%) =

Số lần lấy tinh đạt tiêu chuẩn

x 100 Tổng số lần khai thác

2.3.2 Khảo nghiệm quy trình sản xuất tinh đông lạnh

2.3.2.1 Quy trình khai thác và sản xuất tinh bò đông lạnh dạng viên

Các bước của quy trình khai thác tinh:

Thời gian khai thác tinh từ 7 giời đến 8 giờ.

Tần suất khai thác tinh dịch: 2 lần/tuần

- Chuẩn bị âm đạo giả: Các bộ phận của âm đạo giả được khử trùng rồi lắp ráp vào bảo quản trong tủ ấm 420C trước khi lấy tinh

- Chuẩn bị bò đực lấy tinh: Những bò đực giống đến ngày lấy tinh vào buổi sáng sớm được vệ sinh sạch sẽ và thụt rửa bao dương vật trước khi lấy tinh 30 phút bằng nước muối sinh lý 0,9%

- Lấy tinh: Kích thích cho bò đực hưng phấn, rồi cho nhảy giá và lấy tinh bằng âm đạo giả (Mẫu tinh dịch khi khai thác được đưa ngay vào phòng thí nghiệm và đặt trong bể nước ấm 350C để kiểm tra các chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch)

- Chuẩn bị môi trường pha loãng tinh dịch, môi trường có nhiệt độ 350C để cân bằng nhiệt độ với nhiệt độ tinh dịch

- Pha loãng tinh dịch: nếu tinh dịch đạt tiêu chuẩn theo quy định tiêu chuẩn của Bộ Nông nghiệp và PTNT (2015) [6], thì pha vào môi trường Cân bằng nhiệt ở nhiệt độ 50C trong khoảng 4 giờ

- Đông lạnh tinh: Đông lạnh tinh ở nhiệt độ hơi nitơ -950C và đông lạnh sâu trong môi trường nitơ lỏng -1960C

- Kiểm tra hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh: Sau khi đông lạnh 48 giờ, tinh trùng được lấy mẫu điểm theo từng con đực giống, giải đông và kiểm tra

- Bảo quản: Tinh đông lạnh dạng viên đạt tiêu chuẩn thì được đóng vào ống đựng tinh (có ghi rõ ngày sản xuất và tên số hiệu của từng đực giống), bảo quản trong bình chuyên dụng chứa đầy nitơ lỏng (-1960C)

2.3.2.2 Thực hiện quy trình đông lạnh tinh dịch bò

a Môi trường pha loãng tinh dịch

Tiến hành pha chế môi trường, thành phần môi trường pha loãng tinh dịch

bò (theo tiêu chuẩn Việt Nam) do Viện chăn nuôi quốc gia cung cấp

Bảng 2.1: Thành phần pha môi trường loãng tinh dịch (*)

(*: Công thức do Viện chăn nuôi chuyển giao cho Trung tâm theo dự án)

b Cách pha chế môi trường pha loãng tinh dịch

Chuẩn bị 1 lọ đựng sạch, vô khuẩn: ghi nhãn hiệu bên ngoài môi trường (ngày/tháng/ năm)

đó 7ml glycerine và 1 lọ gentamycine 80mg sau đó khuấy thật đều

+ Đổ trứng gà cùng hỗn hợp trên vào lọ đã sạch và vô khuẩn sau đó khuấy thật nhẹ nhàng bằng đũa thuỷ tinh

+ Để môi trường trong khoảng 45 - 60 phút sao cho đảm bảo sự cân bằng

về áp suất thẩm thấu, pH

Chuẩn bị dụng cụ hoá chất: Nước cất 2 lần, trứng gà mới sạch và vô khuẩn, glyxerin và một số dụng cụ khác cần để pha chế như: lọ, bình đựng, ống hút, pipét…Tiến hành pha môi trường trước khi khai thác tinh khoảng 30 - 40 phút đảm bảo cân bằng về áp suất thẩm thấu, pH, tỷ trọng

c Chuẩn bị tinh dịch bò

- Tinh dịch bò sau khi khai thác được kiểm tra phẩm chất tinh dịch thật nhanh các chỉ tiêu: A, C, V, K, pH, màu sắc chính xác đảm bảo yêu cầu kỹ thuật được đưa vào pha loãng

d Pha loãng tinh dịch bò

Tỷ lệ pha loãng biến động tuỳ theo chất lượng tinh nguyên của bò đực Khi pha tinh dịch cần tính toán để khi đưa vào đông lạnh mỗi viên tinh sản xuất

có chứa từ 40 - 50 triệu tinh trùng (xấp xỉ 12 - 18 triệu tinh trùng tiến thẳng) Sau khi tinh dịch và môi trường đã được hoà trộn vào với nhau cần kiểm tra lại các chỉ tiêu như: V, A, C, pH

Sau khi kiểm tra xong các chỉ tiêu để ống nghiệm vừa pha loãng vào cốc có nhiệt độ 370C sao cho nước trong cốc ngập lượng tinh trong ống nghiệm, sau đó lấy parafin bịt miệng của ống nghiệm lại

e Cân bằng tinh dịch

Đánh dấu vào lọ đựng tinh đem cân bằng bảo quản trong tủ lạnh 50C (4h)

g Kiểm tra chất lượng tinh dịch sau cân bằng

Trước khi đông lạnh (sau cân bằng) tinh dịch được mang kiểm tra xác định hoạt lực của tinh trùng (A%) qua kính hiển vi với độ phóng đại 200 lần Quan sát toàn vi trường và đánh giá hoạt lực của tinh trùng; kiểm tra thật nhanh và đưa vào sản xuất tinh đông viên

h Thao tác làm tinh đông viên ở bò

- Chuẩn bị: Một hộp xốp có kích thước 36 x 36 x 15(cm) trong đó có 2 thanh làm giá đỡ cho tấm mêca, cách mặt trên của hộp xốp khoảng 7cm, tấm mêca mỏng mặt trên nhẵn, đổ dung dịch Nitơ lỏng vào hộp xốp sao cho dung dịch ngập tấm mêca đặt trên giá đỡ

- Nhúng tấm mêca mỏng (0,6mm) ngập trong hộp đựng dung dịch nitơ lỏng (- 1960C) trong vòng 5 - 10 phút khi nào tấm mêca hết sủi bọt là đạt

- Nhấc tấm mêca lên giá đỡ trong hộp, sao cho 1/3 tấm mêca có mặt dưới giáp mặt dung dịch nitơ lỏng đồng thời phải để bề mặt trên tấm mêca phủ một

lớp tuyết màu trắng là được, sau đó dùng Pipet nhỏ hút nhẹ nhàng tinh dịch pha loãng (đã cân bằng), nhỏ lên bề mặt tấm mêca từng giọt nhỏ, hình cầu, thể tích một viên tinh đạt 0,1 - 0,2ml đảm bảo cho một viên tinh cách nhau 1 - 2cm là được Để 1 – 2 phút, viên tinh có màu trắng hơi vàng, đảm bảo đông lạnh nông (-860C - 1000C âm ) trong nitơ lỏng Sau đó tiến hành đếm và ghi kết quả

- Nhúng tấm mêca đã có viên tinh ngập vào dung dịch nitơ lỏng trong 5 phút Sau đó nhấc tấm mêca lên gạt hết viên tinh trên mặt vào trong ống đựng tinh (để ngập trong dung dịch nitơ lỏng)

i Kiểm tra chất lượng tinh sau giải đông 24h

Kiểm tra chỉ tiêu A% sau giải đông: Lấy ngẫu nhiên 1-2 viên tinh giải đông ở nước ấm nhiệt độ 2 mức (250C – 300C) và (350C - 370C), thời gian 30 giây theo từng ngày sản xuất của từng bò đực để đánh giá hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh của lô sản xuất đó bằng kính hiển vi với (A ≥ 35%) đạt tiêu chuẩn

- Chia theo lô bảo quản trong bình chuyên dụng chứa đầy nitơ lỏng (-1960C)

2.3.3 Phương pháp dẫn tinh và xác định tỷ lệ thụ thai ở bò cái

a Phương pháp dẫn tinh (quy trình thụ tinh nhân tạo bằng tinh viên)

- Dùng panh kẹp dài gắp một viên tinh cho vào nước muối sinh lý dùng cho tinh viên có dung tích là 1-2ml

- Chuẩn bị nước giải đông ở trong cốc có nhiệt độ 370C

- Sử dụng ống hút để tinh dịch được hút vào đầu dẫn tinh quản

- Sử dụng súng dẫn tinh chuyên dụng cho bò cái để dẫn tinh

b Theo dõi bò cái động dục và xác định thời điểm phối giống

- Theo dõi bò động dục bằng các biện pháp thông thường, quan sát niêm dịch và niêm mạc âm đạo và ban đêm, buổi sáng và những biểu hiện nhảy, niêm dịch tiết nhiều, niêm mạc âm đạo xung huyết

- Xác định thời điểm phối giống: được thực hiện bằng phương pháp lâm sáng kết hợp với khám buồng trứng qua trực tràng

- Bò cái được tiến hành kiểm tra hoạt động của buồng trứng bằng phương pháp khám qua trực tràng

- Bò cái đã được phối giống được quản lý và giữ tại nhà đến hết thời gian động dục mới cho đi chăn thả

- Xác định bò có chửa và tỷ lệ thụ thai sử dụng khám thai qua trực tràng sau khi phối 3 tháng để xác định bò có chửa

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu trong quá trình nghiên cứu được ghi chép, tổng hợp và xử lý theo phương pháp thống kê sinh vật học của Nguyễn Văn Thiện và Cs (2002) [27] qua phần mềm Excel với sự hỗ trợ của máy vi tính và máy tính cá nhân

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khả năng sản xuất tinh dịch của bò đực giống H'Mông

Chất lượng tinh của bò đực giống phản ánh một cách đầy đủ năng lực sản xuất tinh, sức khỏe, sự thích nghi với môi trường sống… Nếu tinh dịch có số lượng chất lượng tốt thì sản xuất được tinh động lạnh có chất lượng tốt, khả năng thụ thai cao và ngược lại Đồng thời nó phản ánh một cách trung thực việc

áp dụng các quy trình kỹ thuật chăn nuôi, dinh dưỡng, thức ăn…vv và kỹ thuật khai thác tinh