Bệnh bò điên (BSE) là bệnh thần kinh gây tử vong ở bò trưởng thành, được ghi nhận đầu tiên ở Anh Quốc năm 1986. Đây là bệnh nhũn não truyền nhiễm hay bệnh do prion (dịch tạm là tiền virus). Nguyên mẫu của nhóm bệnh này là bệnh ngứa điên (scrapie) của cừu và dê (xem Chương 2.7.12 Bệnh ngứa điên).
Trang 1BỆNH NHŨN NÃO BÒ, BỆNH BÒ ĐIÊN (BOVINE SPONGIFORM ENCEPHALOPATHY)
TÓM TẮT
Bệnh bò điên (BSE) là bệnh thần kinh gây tử vong ở bò trưởng thành, được ghi nhận đầu tiên ở Anh Quốc năm 1986 Đây là bệnh nhũn não truyền nhiễm hay bệnh do prion (dịch tạm là tiền virus) Nguyên mẫu của nhóm bệnh này là bệnh ngứa điên (scrapie) của cừu và dê (xem Chương 2.7.12 Bệnh ngứa điên).
Dịch tễ học của bệnh BSE có thể giải thích bằng phơi nhiễm đường miệng đối với một tác nhân giống như tác nhân gây bệnh ngứa điên, có trong protein lấy từ loài nhai lại ở chất liệu bột thịt
và xương, bao gồm các chiết xuất cô đậm hay các chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi.
Các trường hợp đầu tiên của BSE trong một số quốc gia mà bị coi là kết quả của việc xuất khẩu
bò bệnh từ Anh Quốc hay bị vấy nhiễm với bột thịt xương, mặc dù việc xuất khẩu từ các quốc gia khác cũng có liên can đến Ở nhưng quốc gia khác, các trường hợp ban đầu rõ ràng là từ bản địa, mà không có liên quan rõ rệt với việc nhập khẩu bột thịt xương, cho thấy rằng các trường hợp mới, không phát hiện thấy có thể đã từng xuất hiện Do kết quả của các biện pháp kiểm soát, dịch tễ của bệnh trong nhiều quốc gia đã được dập tắt Các trường hợp BSE hiện nay xảy ra chủ yếu ở Châu Âu và đã phát hiện thấy ở Châu Á và Bắc Mỹ.
Khả năng truyền lây thực nghiệm của BSE trên bò đã chứng minh được sau khi gây phơi nhiễm theo đường nhu mô và đường miệng, bởi mô não của bò bị nhiễm bệnh Tác nhân gây BSE cũng được tin rằng từ nguồn thông thường, qua đường thức ăn, của các bệnh truyền nhiễm gây bệnh tích nhũn não (transmissible spongiform encephalopathies – TSEs) trong một số loài thú nhai lại và trong các loài thuộc họ mèo (felidae) Ở đây có bằng chứng về liên kết nguyên nhân giữa tác nhân gây BSE với dạng biến thể TSE ở người, là bệnh Creutzfeldt-Jakob (vCJD).
Các khuyến cáo đối với các cảnh báo an toàn trong quản lý các chất liệu bị nhiễm BSE hiện nay cho rằng BSE là bệnh từ thú vật lây cho người và được chỉ định là mầm bệnh khu trú nhóm
3 (với mức độ giảm nhẹ).
Nhận diện tác nhân gây bệnh: Trong Anh Quốc, bệnh BSE đã có tác động đỉnh điểm trên bò
ở lứa tuổi từ 4 đến 5 tuổi Tiến trình lâm sàng thì biến đổi, nhưng có thể kéo dài đến vài tháng Các dấu hiệu lâm sàng rõ rệt là đủ để phân biệt và dẫn đến nghi ngờ về bệnh này, đặc biệt khi các chẩn đoán phân biệt bị hạn chế Các dấu hiệu sớm có thể không rõ và chủ yếu về tập tính,
và có thể dẫn đến việc tiêu hủy thú vật mắc bệnh trước khi BSE khởi phát Trong các quốc gia
mà có chính sách luật phát quy định với bệnh này, các trường hợp nghi ngờ sẽ bị tiêu hủy, được kiểm tra não và tiêu hủy xác chết.
Ngày nay, trong hầu hết các quốc gia, giám sát chủ động phát hiện bò bị nhiễm trước khi, hay không có, nhận thấy các dấu hiệu lâm sàng Không có xét nghiệm chẩn đoán hiện có nào đối với tác nhân gây BSE trên thú sống Bản chất của các tác nâhn gây TSE hiện chưa rõ Một loại bệnh đặc trưng về tế bào có protein màng PrP c , nguyên gốc là PrP Sc , có phần nào đề kháng với protease, mất nếp gấp ở dạng tương đồng, là tiêu chí quan trọng trong sinh bệnh học của bệnh
và có liên quan đến giả thuyết về prion là thành phần nguyên tắc hay duy nhất của tác nhân gây nhiễm Việc chẩn đoán xác nhận, trước kia bằng kiểm tra mô bào học trên não, thì ngày nay, áp dụng các phương pháp hóa miễn dịch mô bào (immunohistochemical – IHC) và/hoặc
Nguồn: http://www.oie.int/
Người dịch: Đặng Nguyên Bình
Trang 2hóa miễn dịch (immunochemical) đối với mô não để phát hiện PrP Sc PrP Sc có thể phát hiện được trong vị trí cơ thể học thần kinh đặc trưng (specific neuroanatomical loci) trong hệ thần kinh trung ương của bò bị nhiễm bệnh, bằng các phương pháp IHC đối với chất liệu đã được cố định bằng formalin, hay bằng các phương pháp xét nghiệm thấm thấu miễn dịch (immunoblotting) và các phương pháp miễn dịch enzyme khác (enzyme immunoassay), sử dụng các chiết xuất não không cố định bằng hóa chất.
Sự truyền lây từ mô não bị nhiễm, thường theo đường thông thường hay biến đổi gen qua chuột (transgenic mice), là phương pháp thực hành duy nhất hiện nay có được để phát hiện khả năng gây nhiễm và có vai trò quan trọng trong xác nhận hay phân loại các dòng tác nhân gây bệnh Các biến thể hay các dạng không điển hình của BSE đã được phát hiện trên các lục địa khác nhau mà đã từng gặp phải bệnh BSE cổ điển Trong khi bối cảnh chính của các kiểu hình không điển hình đã dựa vào mô hình thấm thấu dải cầu Tây (western immunoblot banding pattern), việc phân loại theo xét nghiệm sinh học đối với một số dòng phân lập cho ra bằng chứng nổi bật về khả năng biến thể của dòng đối với hiện diện bình thường của prion trong bò nhiễm bệnh.
Các xét nghiệm huyết thanh học: Các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu không phát hiện được
trong các trường hợp TSE.
Các yêu cầu đối với vaccin và các chẩn đoán sinh học: Hiện nay không có các chế phẩm
sinh học Các bộ kit chẩn đoán thương mại đối với BSE hiện có và được sử dụng để chẩn đoán BSE trong nhiều quốc gia.
A MỞ ĐẦU
BSE là bệnh gây tử vong cho bò thuần hóa, các trường hợp BSE được ghi nhận ban đầu ở Anh Quốc vào tháng Mười một 1986 (27, 37) Bệnh là một dạng bệnh tích nhũn não truyền nhiễm (transmissible spongiform encephalopathy – TSE) hay bệnh do prion (dịch tạm là dạng tiền virus), có nguồn gốc điển hình ở các loài thú vật là bệnh ngứa điên ở cừu Các bệnh do prion được định nghĩa là bệnh tích tích tụ, về nguyên tắc và bản chất, trong hệ thần kinh trung ương (central nervous system – CNS) và biến thể hơn trong hệ thống lưới lâm ba (lymphoreticular system – LRS), tích tụ này là dạng protein đồng nhất, dành riêng cho màng tế bào được mã hóa bởi ký chủ (PrPc), và được thiết kế nguyên gốc là PrPSc, protein này bị mất nếp gấp (misfolded), phần nào đề kháng với protease Chức năng của PrPc vẫn chưa được rõ PrPSc là đại phân tử đặc trưng duy nhất cho bệnh được nhận diện trong bệnh giống với bệnh ngứa điên (scrapie disease) Protein này cũng có khả năng biến đổi và được gọi là PrPres, để lưu ý đến đặc tính có đề kháng với proteinase của protein gây bệnh, PrPd đặc trưng với bệnh và PrPbse đặc biệt trong BSE
Ở đây PrPSc được áp dụng phổ biến để chỉ đến đồng dạng (isoform) bất thường PrPc Quan điểm khoa học thích hợp cho là tác nhân này bao gồm nguyên dạng đặc trưng cho bệnh của PrP và dạng này được thay thế thành dạng có khả năng khiến tạo chuyển hóa của dạng bình thường: giả thuyết về chỉ là protein hay “prion” Dữ liệu hỗ trợ cho giả thuyết thay thế này, như
vi khuẩn hay virus nguồn gốc hay sự tham gia của các đồng yếu tố như mất cân bằng khoáng chất, vẫn còn là mơ hồ Cơ sở phân tử cho biến đổi dòng vẫn còn chưa rõ, nhưng có liên quan đến giả thuyết về đặc điểm của dòng prion mà được mã hóa thành các hình thể khác nhau của protein của prion
Đặc tính ban đầu của các dòng phân lập được từ BSE ở Anh Quốc, bằng cấy truyền cho chuột bạch (mice) cho thấy, tiến trình chủ yếu của dịch tễ là do một dòng đơn độc chủ yếu của tác nhân mà đã được phân biệt với các dòng đã được phân loại của tác nhân gây bệnh ngứa điên
ở cừu (4) Tính giống nhau về sinh bệnh học ở hầu hết bò bị nhiễm cũng đã hỗ trợ khái niệm về một kiểu hình bản chất của bệnh đối với BSE (7, 30) Mô hình về bệnh tích thần kinh trong loài
Trang 3ký chủ là quan trọng trong phân loại loại hình và nhận định trường hợp đối với BSE, được áp dụng để xác nhận bệnh
Các báo cáo từ 2003 về các đặc tính biến thiên của sinh bệnh tích và/hoặc các đặc tính phân
tử trong một số quốc gia đã làm nảy sinh vấn đề về khả năng biến thiên dòng của bệnh do prion trên bò (3, 8, 21, 44) Có hay không các phát hiện này thể hiện một dòng biến thể thực sự của tác nhân gây BSE, hoặc các dạng khác nhau của bệnh nhiễm prion trên bò, vẫn còn là điều cần chứng minh Do việc phát hiện ra hầu hết các trường hợp BSE từ giám sát chủ động, nên thiếu mối liên quan về lịch sử lâm sàng, và hầu hết chỉ tập trung vào dữ liệu thấm thấu miễn dịch cầu Tây (western immunoblotting data) (3, 44) Mô tả có hiểu biết nhất, có từ hóa miễn dịch mô bào (immunohistochemical – IHC), mô bệnh học (histopathological) và phân tích thấm thấu miễn dịch cầu Tây (western immunoblotting) có liên quan đến hai con bò già ở Italy (8) Khả năng cấy truyền của một số dòng sang chuột bạch, với các đặc trưng khác với các cấy truyền BSE trước đó, đã được xác nhận (2, 5) Các nghiên cứu cấy truyền đối với các dòng khác trên bò đang được tiến hành Một đặc điểm thú vị thường gặp là hầu hết các dòng này đều có nguồn gốc từ bò già
Các nghiên cứu dịch tễ học ban đầu về BSE ở Anh Quốc đã được thiết lập mà sự hiện diện của bệnh đã ở dạng là nguồn bệnh dịch địa phương rộng rãi, do bệnh truyền lây qua thức ăn chăn nuôi, có chứa tác nhân gây bệnh giống với bệnh ngứa điên ở cừu, chứa trong bột thịt xương làm khẩu phần bổ sung protein (1, 39) Mặc dù dược ghi nhận ban đầu ở Anh Quốc, bệnh BSE
đã xuất hiện, ở mức độ ảnh hưởng thấp, trong bò của nhiều quốc gia có tham gia nhập khẩu và/hoặc bò bản xứ Các trường hợp này hầu hết thường là do hậu quả một cách trực tiếp hay gián tiếp từ xuất khẩu bò mắc bệnh hay bột thịt và xương bị nhiễm, từ các quốc gia có bệnh BSE, bao gồm cả Anh Quốc Rõ ràng là bệnh đã lan truyền trong các quốc gia mà trong đó các trường hợp xảy ra đã được làm rõ bằng đánh giá Nguy cơ BSE về mặt Địa lý (Geographical BSE Risk – GBR) trong nhiều quốc gia, bởi các Ủy ban Khoa học Cấp cao (Scientific Steering Committee) của Liên minh Châu Âu (European Union) (13) Thật vậy, trong một số quốc gia, các trường hợp phát hiện được phản ánh phơi nhiễm bản địa thường hiếm hơn các trường hợp có liên quan trực tiếp đến nhập khẩu thức ăn chăn nuôi bị vấy nhiễm (41) Các thống kê hiện nay về BSE xảy ra trên thế giới đã được cung cấp bởi OIE (41)
Ở đây không có bằng chứng về truyền lây ngang của BSE giữa bò với bò, và có ít dữ liệu hỗ trợ cho bằng chứng truyền lây từ mẹ (27) Các nghiên cứu dịch tễ học và truyền lây đã không phát hiện ra nguy cơ từ tinh dịch hay sữa hay qua nhau thai (27)
Do kết quả của các biện pháp kiểm soát, bệnh dịch địa phương ở Anh Quốc và nhiều quốc gia khác đã được dập tắt, hay thể hiện tác dụng của các kiểm soát dưới dạng các biến đổi về ảnh hưởng đặc trưng theo tuổi Ở một số quốc gia, các kiểm soát này đã không được đặt ra đủ lâu dài cho ra hiệu quả được công nhận Việc giải thích các tình hình về bệnh dịch địa phương đã
mở rộng bởi việc đặt ra giám sát chủ động, áp dụng các xét nghiệm chẩn đoán nhanh, mà đã phát hiện ra các con thú bị nhiễm chứa từng được phát hiện từ nghi ngờ lâm sàng Trong khi giám sát chủ động này có khả năng phát hiện một tỷ lệ các trường hợp tiền lâm sàng, điều tra hồi truy các trang trại nguồn gốc thường xác nhận được một số dấu hiệu đã từng thể hiện trước khi đem giết mổ, nhưng đã không khởi phát thành rõ rệt cho một chẩn đoán lâm sàng về BSE
Sự xuất hiện mới của các trường hợp TSE trên một số loài của họ bò và họ mèo ngoại lai bẫy bắt được và trong mèo nhà ở tiến trình dịch địa phương BSE đã ảnh hưởng đến, và với một số loài bị ảnh hưởng, cho thấy rằng chúng đã mắc bệnh bởi tác nhân gây BSE (23) Sự phơi nhiễm được giả thiết là do thức ăn
Sự nổi lên của dạng mới của rối loạn trên người do prion, bệnh Creutzfeldt-Jakob (CJD), được đặt tên là CJD biến thể (vCJD) ở Anh Quốc (40) cũng đã được phát hiện được bởi các nghiên cứu gây nhiễm và phân tử (6, 10) mà có nguyên nhân liên quan đến tác nhân gây bệnh BSE Việc phơi nhiễm với thực phẩm được coi là đường truyền lây Trước kia, không có liên hệ nào
Trang 4được thiết lập giữa các trường hợp phơi nhiễm của người đến các tác nhân gây bệnh tích nhũn não ở thú vật với sự xuất hiện TSE ở người, và do đó BSE thể hiện là một tiền lệ là một dạng TSE từ thú vật lây sang người (zoonotic TSE) Do đó ở đây khuyến cáo rằng các cảnh báo an toàn đối với quản lý tác nhân BSE là dựa vào giả thiết rằng BSE có khả năng truyền lây sang người Bệnh dịch địa phương của vCJD ở Anh Quốc trên các cá thể đồng hợp tử đối với MM ở
mã hóa (codon) 129 của gen PrP, đã có đỉnh điểm vào năm 2000; các trường hợp ít người đã xuất hiện ở một số quốc gia khác
Do kết quả của sự xuất hiện của vCJD, một tiếp cận dựa vào nguy cơ sẽ được ban bố khi xác định cấp độ khu trú sinh học cho thực hiện các khám tử trên các con thú nghi ngờ BSE hay cho quản lý các mô lấy từ các con thú này, mọi thao tác mà gây ra khí dung phải được thực hiện trong khú trú sinh học cấp độ 3 (xem Chương 1.1.2 An toàn sinh học và bảo vệ sinh học trong phòng thí nghiệm thú y và cơ sở nuôi nhốt thú vật), và phòng thí nghiệm phải tuân thủ với các quy định khu trú sinh học và an toàn sinh học của quốc gia, để bảo vệ nhân viên khỏi phơi nhiễm với mầm bệnh
Các khuyến cáo về các phương pháp tiêu độc khử trùng có thể không hoàn toàn có hiệu quả khi áp dụng với chất liệu có hiệu giá cao hay khi tác nhân gây bệnh được bảo vệ trong chất liệu hữu cơ đã khô Các khuyến cáo về làm bất hoạt bằng vật lý, là hấp tiệt trùng qua lớp xốp autoclave ở 134 – 138oC trong 18 phút ở 30 lb/inch2 Tuy nhiên, các nhiệt độ cao hơn giới hạn này có thể kém hiệu quả so với các nhiệt độ thấp hơn giới hạn này, và quá trình làm bất hoạt tổng thể có thể không đạt được dưới một số điều kiện, nhưng khi chất liệu đem xét nghiệm là trong dạng chất ngâm dầm (macerated) Việc sát trùng được thực hiện với sodium hypochloride
có chứa 2% chlorine hiện diện, hay sodium hydroxide 2 N, được áp dụng lâu hơn 1 giờ ở 20oC trên các bề mặt, và qua đêm với các thiết bị (33)
B CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN
1 Nhận diện tác nhân gây bệnh
BSE lâm sàng, như thể hiện ở trận dịch, xảy ra ở bò trưởng thành, và hầu hết các trường hợp quan sát thấy trên bò sữa ở lứa tuổi 4 – 5 năm tuổi Khi dịch đã dập tắt, tác động của các kiểm
soát có hiệu quả đã phản ánh có sự gia tăng lứa tuổi lúc phát tác bệnh lâm sàng (27) Sự xuất hiện các dấu hiệu lâm sàng không có liên quan đến mùa vụ hay giai đoạn của chu kỳ sinh sản BSE xuất hiện một cách âm ỉ và thường có tiến trình chậm chạp (24, 38) Đôi
khi, một trường hợp sẽ thể hiện với các dấu hiệu cấp tính và sau đó tắt lịm một cách nhanh chóng, tuy nhiên tần suất của quan sát là một yếu tố quan trọng trong xác định các dấu hiệu
lâm sàng sớm Các dấu hiệu thể hiện, có khác nhau, thường bao gồm các biến đổi tập tính, sợ hãi, rụt rè, và hiếu động (hyper-reactivity) Thí dụ, bò cái bị bệnh có thể miễn cưỡng đi vào phòng vắt sữa hay có thể đá lung tung trong lúc vắt sữa Ở bò cái khô sữa, đặc biệt là chân sau mất điều hòa vận động và yếu ớt, là các đặc trưng lâm sàng cần lưu
ý Các dấu hiệu thần kinh là chủ yếu trong tiến trình lâm sàng và có thể bao gồm nhiều chiều hướng về thay đổi tâm tính, các bất thường về tư thế và di chuyển, và cảm giác khác thường, nhưng các dấu hiệu thần kinh thường được báo cáo nhất là sợ hãi, mất điều hòa chân sau, và cường phản ứng đối với tiếp xúc và âm thanh Đặc điểm gia tăng tình
dục ở một số cừu khi bệnh ngứa điên thường không là chủ yếu ở bò bị BSE, do đó trong một tỷ
lệ các trường hợp, có phản ứng ngứa và gãi Bò cái bị bệnh đôi khi đứng với đầu vươn thấp xuống, cổ thẳng ra và tai hướng về phía đuôi Các bất thường của tư thế bao gồm lắc lư vùng hông và hổng chân sau; các đặc điểm này dễ nhận ra nhất khi quan sát bò lúc cho ăn Tư thế mất điều hòa vận động cũng liên quan đến hai chân trước, và trong giai đoạn nặng nề của các dấu hiệu vận động, toàn thân yếu ớt, dẫn đến ngã và nằm, có
thể chiếm chủ yếu trong bối cảnh lâm sàng Các báo cáo về giảm nhai lại, chậm nhịp tim và ngừng nhịp tim, dù là các dấu hiệu không đặc trưng, cho thấy rối loạn điều hòa là đặc trưng của BSE Các đặc điểm lâm sàng về mất cân và giảm sữa thường kèm theo các dấu hiệu thần kinh
do tiến trình của bệnh Ở đây không có biến đổi trong bối cảnh lâm sàng của BSE so với tiến
Trang 5trình của bệnh dịch địa phương tại Anh Quốc (24, 38) Các dấu hiệu lâm sàng chủ yếu giống nhau giữa các quốc gia có xảy ra BSE Tiến trình lâm sàng kéo dài, thường đến hàng tuần hay hàng tháng, sẽ dẫn đến cân nhắc cần phải giết mổ một cách nhân đạo Tuy nhiên, một chính sách luật pháp để xác định tình trạng BSE của một quốc gia cần bắt buộc khai báo và chẩn đoán điều tra các trường hợp lâm sàng nghi ngờ, giết mổ thú vật và kiểm tra não sau khi thú chết Trong tiến trình sớm của bệnh, các dấu hiệu có thể mơ hồ, biến đổi và không đặc trưng,
và do đó có thể cản trở các chẩn đoán lâm sàng trong kiểm tra ban đầu Việc quan sát liên tục các trường hợp khả nghi này, cùng với các phương pháp bệnh học lâm sàng thích hợp để giới hạn các chẩn đoán phân biệt, đăc biệt là các rối loạn dinh dưỡng, sẽ thiết lập nên được tiến
trình chủ yếu của các dấu hiệu Một số dấu hiệu lâm sàng sớm của BSE có thể thể hiện một cách tương tự như các đặc điểm về thần kinh giống như bệnh ketosis, thừa magnesium trong huyết (hypomagnesaemia), bệnh listeriosis thể thần kinh và các bệnh gây viêm não khác Các dấu hiệu lẫn lộn có thể đôi khi bị lấp đi sau khi bị stress, giống như dấu hiệu do vận chuyển Các đoạn quay phim về bò bị bệnh BSE có thể tải xuống được
từ trang web của Ủy ban Châu Âu (European Commission – EC) Hiệp hội Phòng thí nghiệm Tham chiếu TSE/Trụ sở các Phòng thí nghiệm Thú y (TSE Community Reference Laboratory/Veterinary Laboratories Agency [VLA]) (15) Các cảnh quay DVD hay băng ghi hình của các dấu hiệu lâm sàng sẵn có tại nguồn này và các nguồn khác (35)
Các chẩn đoán phòng thí nghiệm đối với BSE bao gồm nhằm gia tăng hiểu biết đối với bệnh và
các tiến bộ kỹ thuật (17) Trong khi thiếu các phương pháp ở ngoại môi trường về phân lập tác
nhân gây bệnh, cở sở mô bào học về xác nhận đối với các chẩn đoán trong nhóm bệnh này đã chứng minh về các đặc tính hình thái của bệnh nhũn não (spongiform encephalopathy) bằng kiểm tra mô bào học Điều này cũng vẫn còn cần thiết, bởi được xác định là phương pháp duy nhất mà đặc trưng bệnh tích không bào (vacuolar pathology) có thể chẩn đoán được Các chẩn đoán nguyên thủy đối với BSE đã dựa vào các đặc trưng mô bệnh học của bệnh nhũn não giống như bệnh ngứa điên (scrap-like spongiform encephalopathy) và soi kính hiển vi điện tử dạng các sợi được gọi là các sợi có liên quan đến bệnh ngứa điên (scrapie-associated fibrils – SAF), mà cấu tạo phần lớn là PrPSc, trong các chiết xuất bằng chất tẩy của não bị nhiễm Chất liệu não được kiểm tra cho thấy đều như nhau ở các trường hợp lâm sàng nghi ngờ Ở Anh Quốc, trong giai đoạn bệnh dịch địa phương gia tăng nhanh chóng vào cuối những năm 1980, các chẩn đoán mô bệnh học dựa vào kiểm tra một lát cắt của hành tủy (medulla oblongata) lấy
ở bờ dày (obex: mỏ nhọn của não thất thứ tư, giữa hành tủy và tiểu não) đã được đánh giá tốt hơn so với kiểm tra rộng rãi hơn ở cuống não (brainstem) (34) Tiếp cận đơn giản này cho phép cải thiện việc lấy mẫu ở não tươi; thay bằng lấy đi toàn bộ não, phần cần thiết sẽ lấy từ cuống não qua lỗ chẩm (foramen magnum), sử dụng dụng cụ chuyên dùng Với ghi nhận gia tăng về tính đặc hiệu của chẩn đoán đối với PrPSc, và với sự sẵn có của các kháng thể thích hợp và gia tăng tính hiệu quả của các phương pháp phát hiện, các phương pháp hóa miễn dịch cho phát hiện PrP đặc trưng của bệnh, bao gồm các kỹ thuật IHC và thấm thấu cầu Tây/thấm thấu miễn dịch-SAF (Western blotting/SAF-immunoblotting) đã được áp dụng, hỗ trợ cho mô bệnh học, để
xác nhận các chẩn đoán Việc đưa vào các phương pháp thực hiện nhanh ở ngoại môi trường
cho phát hiện PrPSc dẫn đến áp dụng các xét nghiệm “nhanh”, nhất là xét nghiệm hấp phụ miễn dịch kết hợp enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA) cơ bản, được thực hiện trên các mẫu đã xử lý (sub-samples) của cuống não, và các xét nghiệm này đã trở nên tiếp cận chính cho các chẩn đoán giám sát chủ động Các xét nghiệm này cho ra một hiển thị ban đầu
mà các kết quả dương tình hay nghi ngờ đều được chuyển qua các kiểm tra bằng các phương pháp IHC hay thấm thấu cầu Tây để xác nhận Các chiến thuật xét nghiệm nhanh hiện nay là tiếp cận chủ yếu, trong đó các trường hợp đều phát hiện được và được áp dụng rộng rãi như là một phần của quá trình xác nhận đã được chấp thuận trên nguyên tắc (15)
Việc áp dụng một phương pháp đặc biệt sẽ tùy thuộc vào khả năng mà chẩn đoán sẽ được áp dụng trong nội dùng dịch tễ học và đánh giá phương pháp này đối với mục đích Giới hạn của các khả năng sẽ trong khoảng từ xác nhận các chẩn đoán lâm sàng trong kiểm soát bệnh dịch địa phương đến theo dõi sức khỏe cộng đồng về bằng chứng của bệnh ngấm ngầm hay tiền lâm sàng Việc xác định trường hợp bệnh đã được điều chỉnh này cũng sẽ khác với các phương pháp được áp dụng cho xác nhận một trường hợp lâm sàng hay cho theo dõi một
Trang 6quần thể Phải cẩn thận trong diễn giải dữ liệu chẩn đoán áp dụng phương pháp luận này Không có so sánh đầy đủ với tiêu chí đã được ban hành trước kia trong xác định kiểu hình BSE, và không có các nghiên cứu truyền lây, các kết quả chẩn đoán mà tuyên bố phát hiện được một dòng mới có thể là còn non nớt Việc kiểm soát chất lượng (quality control – QC) và đánh giá chất lượng (quality assessment – QA) là các bộ phận cốt yếu của các phương pháp xét nghiệm và có thể được khuyến cáo bởi các Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE (15, 42)
Dù có hay không các con thú bị nhiễm BSE sẽ được nhận diện bằng giám sát thụ động hay chủ động, ở đây có một thực hành tốt để phát hiện và xác nhận bệnh, bằng kết hợp giữa ít nhất hai phương pháp Phương pháp thứ nhất có thể là một trong các phương pháp xét nghiệm xác nhận được mô tả dưới đây hay là một xét nghiệm nhanh, nhưng quan trọng là áp dụng một xét nghiệm thứ nhì để xác nhận một kết quả dương tính hay nghi ngờ của xét nghiệm thứ nhất Khi
có mâu thuẫn giữa các kết quả xét nghiệm ban đầu và thứ nhì, các xét nghiệm thêm áp dụng hóa miễn dịch tế bào (immunohistochemistry) hay phát hiện dạng sợi có liên quan đến bệnh ngứa điên kết hợp với thấm thấu miễn dịch (SAF-immunoblot) (hay xét nghiệm khác được chấp thuận), sẽ được áp dụng, hay các mẫu sẽ được gởi đến Phòng thí nghiệm Tham chiếu của OIE
để giải quyết mâu thuẫn kết quả
a) Chuẩn bị mẫu
Tình hình BSE của một quốc gia, các chương trình giám sát thụ động và chủ động có liên quan,
và các phương pháp chẩn đoán được áp dụng, sẽ ảnh hưởng đến chiến thuật lấy mẫu
Trong tất cả các hoàn cảnnh của giám sát thụ động đối với bệnh thần kinh ở bò trưởng thành,
khi xảy ra BSE trong một quốc gia hay một bang mà không xác định được hay có tác động thấp, khuyến cáo rằng các trường hợp nghi ngờ đều phải qua một tiếp cận thần kinh
bệnh học (neuropathological approach), trong đó các vùng đại diện của toàn bộ não đều được kiểm tra Hơn nữa, cần cẩn thận bảo quản các mẫu đã được cố định thích hợp cho xét nghiệm miễn dịch hóa mô bào và hóa miễn dịch đối với PrPSc Khởi đầu của tiếp cận này có thể giải quyết việc phân loại một cách thích hợp đối với trường hợp bệnh, để xác nhận có hay không đây là điển hình của BSE
Bò nghi ngờ mắc bệnh sẽ bị tiêu diệt bằng tiêm vào mạch máu dung dịch barbiturate đậm đặc,
mà trước đó đã được tạo an thần, nếu cần Não sẽ được lấy ra càng sớm càng tốt sau khi chết, bằng các phương pháp chuẩn
Các kiểm tra mô bào học và IHC được thực hiện ban đầu trên một khối mô của mỏ nhọn dưới của hành não (0,5 – 1,0 cm rộng) (Hình 1a, chiều A – A thể hiện trung tâm của khối mô được kiểm tra), mà sẽ được chọn để cố định trong ít nhất 5 ngày bằng dung dịch formaldehyde 4% (tức là 10% dung dịch muối formol [formal saline] hay 10% formalin đệm trung tính [normal buffered formalin – NBF]) và sau đó xử lý mô học bằng các phương pháp thấm sáp faraffin bình thường đối với mô thần kinh
Chất liệu tươi dùng trong xác nhận thấm thấu miễn dịch (immunoblotting) để phát hiện PrP đặc trưng của bệnh sẽ được lấy từ đầu, là một khối toàn bộ phần trên của tủy sống (2 – 4 g), giữa vùng mỏm (rostral), hay vùng chóp (caudal) đến dưới khối mỏ nhọn (obex), để cố định Cách khác, hành tủy nơi mỏ nhọn tiểu não sẽ được cắt đôi, như mô tả trong giám sát chủ động (xem dưới đây) Tất cả các vùng não khác sẽ được cắt song song với đường mạch máu (cách động mạch giữa dây thần kinh 0,5 cm) Phần nhỏ hơn này sẽ được dùng để phát hiện PrPSc bằng các phương pháp hóa miễn dịch (như SAF-thấm thấu miễn dịch) và được bảo quản đông lạnh trước khi xét nghiệm (nếu xét nghiệm được thực hiện ngay sau khi lấy mẫu)
Sau khi lấy mẫu ở vùng mỏ nhọn hành não để cố định và lấy mẫu mô tươi, phần còn lại của mô não được đặt nguyên vẹn vào khoảng 4 – 6 lít formalin, sẽ được thay hai lần hàng tuần Sau khi cố định trong 2 tuần, não được cắt thành các lát ngang Thời gian cố định có thể rút ngắn
Trang 7bằng cắt cuống não (đã tách khỏi phần còn lại của não) thành các lát nhỏ hơn, tương tự đối với lấy ra vùng mỏ nhọn hành tủy, nhưng để nguyên các vùng đã cắt qua quan trọng cho chẩn đoán ở cuống tiểu não (cerebellar peduncle) và rostral colliculi (Hình 1a và b, mặt cắt B – B và
C – C) Tùy theo một số yếu tố khác (nhiệt độ, sự lay động, độ dày của khối mô, sử dụng siêu âm), thời gian cố định đối với các lắt cắt nhỏ của cuống não này có thể giảm xuống còn 2 – 5 ngày Tuy nhiên, đánh giá về các tác động này đối với xử lý trên các giao thức IHC tiếp theo cần có các tiêu chuẩn xét nghiệm thành thạo Các phần đã được cố định bằng formol khác của não có thể được sử dụng cho các chẩn đoán phân biệt sau khi hoàn tất tiêu chuẩn cố định hai tuần
Hình 1 Cuống não (brainstem) sau khi tách khỏi tiểu não (cerebellum) a) mặt lưng, và b) mặt
bụng Các phần cắt ngang được khuyến cáo là: A–A = hành tủy (medulla), ở nơi mỏ nhọn (obex); B–B = hành tủy (medulla) qua mỏm cuống tiểu não (caudal cerebellar peduncles); C–C
= não giữa (midbrain) qua mỏ quạ (rostral colliculi).
Khi BSE xảy ra trong một quốc gia riêng biệt trong quần thể bò bản xứ, và có bằng chứng
về phân bố các bệnh tích và các kiểu hình xác định khác thấy trong não giống như ở bò bệnh dịch địa phương của Anh Quốc, mặc dù không tuyệt đối, thì để theo dõi sẽ chỉ lấy mẫu hành não
Điều này có thể thực hiện được bằng lấy hành não qua lỗ chẩm (foramen magnum), mà không cần phải mở hộp sọ (calvarium) (Hình 2) Điều này sẽ làm giảm lượng formol dùng cố định, giảm thời gian và dụng cụ cần thiết, làm giảm chi phí và cải thiện an toàn Các vùng mục tiêu chính cho kiểm tra mô bào học có thể vẫn được lấy mẫu Phương pháp này cho phép thu thập
và kiểm tra số lượng lớn các mẫu cho giám sát thụ động hay cho chương trình giám sát chủ động ở lò mổ Hành não được cắt ra qua lỗ chẩm mà không cần mở hộp sọ bằng dụng cụ chuyên dùng hình thìa với các cạnh bén quanh lòng thìa sâu (Hình 2) Dụng cụ này sẵn có trong thương mại, làm bằng plastic hay kim loại Ở đây có khả năng biến thể trong kỹ thuật, bao gồm chiều hướng, mà cần thiết cho các dạng khác nhau của dụng cụ, do đó cần nhấn mạnh sự cần thiết về huấn luyện người thực hiện lấy mẫu khi sử dụng dụng cụ Trong các điều kiện lò
mổ mà có khả năng ép nguyên hành não ra từ lỗ chẩm, với điều kiện là chất liệu này vẫn giữ được tình trạng tổ chức mô, bằng sử dụng áp suất dịch lỏng (không khí hay nước) (20) thông vào hộp sọ qua lỗ thủng của búa hơi gây bất tỉnh Tính khả thi và hiệu quả của phương cách này sẽ tùy theo phương pháp giết mổ và trước khi áp dụng làm thủ tục, thì cần phải qua đánh giá nguy cơ
Trang 8Khi trường hợp đã định được phát hiện thấy qua giám sát chủ động, các vùng não cần
thiết cho phân biệt đầy đủ kiểu hình thì không sẵn có Trong hầu hết các quốc gia, chỉ hành não được thu thập, kể cả trước khi thực hiện xác nhận ban đầu về BSE Một cách lý tưởng, sẽ dự tính giữ lại những cái đầu mà đã lấy mẫu trong quá trình giám sát chủ động cho đến khi có được kết quả xét nghiệm ban đầu Điều này sẽ giúp thuận tiện hơn cho lấy mẫu não ở các con thú dương tính và giúp thực hiện các khuyến cáo tiếp cận về phân biệt các trường hợp Điều này đặc biệt quan trọng nếu áp dụng các xét nghiệm chưa được đánh giá, và ở đây, trong sự vắng mặt của so sánh trực tiếp với các phương pháp được mô tả ở đây, tuyên bố được đưa ra
về các kiểu hình mới đã được nhận diện Khi các xét nghiệm miễn dịch nhanh (rapid immunoassay) được áp dụng làm công cụ giám sát ban đầu, trong khi không có các chẩn đoán BSE nào được thực hiện trong một quốc gia, thì cần phải dự trù đối với chất liệu cho kiểm tra thêm về hình thái và IHC mà sẽ cho phép nhận diện kiểu hình của bệnh
Hình 2 Sau khi đầu đã được lấy ra khỏi cơ thể, bằng cắt lìa giữa đốt sống atlas và đốt sống
occipital condyles của hộp sọ, đầu được đặt trên một giá đỡ, mặt dưới ngửa lên (A), với đầu chót của cuống não (medulla oblongata) nhìn thấy được qua lỗ chẩm (foramen magnum) (xem
B, nhô ra từ hộp sọ) Dụng cụ (C) được chèn vào qua lỗ chẩm giữa màng cứng (dura mater) và hướng bụng/lưng (tùy theo tiếp cận chuyên môn) của hành tủy và mỏm trước, giữ cho phía lồi của dụng cụ sát vào xương sọ và di chuyển với xoay tròn hai bên Chuyển động này sẽ cắt rời thần kinh gốc sọ mà không làm hư hại mô não Dụng cụ được đưa vào sâu khoảng 7 cm theo chuyển động này và sau đó cắt chéo (tức là hướng đến phía bụng/lưng của cuống não, theo hướng đưa vào) để cắt và tách rời cuống não (với một số phần của tiểu não) khỏi phần còn lại của não Dụng cụ này, được giữ ở góc hướng cũ, sau đó được kéo ra khỏi hộp sọ để dứt mô ra khỏi lỗ chẩm.
o Lấy mẫu cuống não trong giám sát chủ động để sử dụng cho các xét nghiệm nhanh
Việc lấy mẫu và xử lý mô não để dùng cho xét nghiệm nhanh sẽ được thực hiện một cách chính xác theo hướng dẫn của nhà cung cấp hay nhà sản xuất ra bộ kit hay trang bị xét nghiệm Các chi tiết về phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu khác nhau giữa các phương pháp xét nghiệm, và phải không được thay đổi mà không có thông tin hỗ trợ của nhà sản xuất đối với phương pháp cải biến Mẫu thích hợp cho xét nghiệm miễn dịch sẽ là nơi cách mấu hay cạnh
mỏ quạ khoảng 1,0 cm đến sát với vị trí chính (Hình 3) để chứng minh các tích tụ PrPSc và cho đánh giá mẫu dùng cho các xét nghiệm nhanh Việc chọn vị trí chính cần tính đến phương pháp xác nhận về sau Ít nhất một lát cắt đôi của hành tủy, ở gần mỏm mỏ quạ sẽ được cố định cho kiểm tra hóa miễn dịch mô bào/mô bào (immunohistochemistry/histology) Việc cắt mẫu từ gốc hay mỏm hành tủy đến mấu mỏ quạ cho xét nghiệm nhanh không làm cản trở kiểm tra theo các
Trang 9phương cách mô bào hay IHC Tuy nhiên, để thu được các mẫu tương đương cho xét nghiệm nhanh và xét nghiệm xác nhận, việc cắt mẫu bằng chia đôi hành tủy đến gần mấu mỏ quạ là thích hợp Trong khi việc này dẫn đến mất khả năng đánh giá tính đối xứng của các biến đổi hình thành lỗ xốp, tiếp cận này ít cản trở đối với kiểm tra IHC mà quan trọng hơn Tuy nhiên, nếu cắt đôi mẫu được áp dụng, cốt yếu là phải đảm bảo các vị trí mục tiêu là không bị hư hại trong cả hai phần
Thí dụ, các phần hạch nhân của đường ẩn khuất (solitary tract) và các phần hạch nhân của sợi vận động của thần kinh giao cảm (vagus nerve) (các vùng mục tiêu cho các bệnh tích trên bò bị BSE) đều là nhỏ, và nằm tương đối gần với đường giữa (Hình 3) Nếu mô được lấy mẫu đã tự phân đến mức mà không thể định hướng cơ thể học được, có thể lấy dịch chất còn lại để xét nghiệm Một kết quả dươgn tính trong các trường hợp này vẫn còn có giá trị, nhưng các kết quả âm tính không thể cho là con thú âm tính, và sẽ được diễn giải với cảnh giác và được báo cáo với chất lượng thích hợp
Hình 3 Lát cắt ngang cuống não của bò ở mấu mỏ quạ (obex) tương ứng với các vị trí chính
cho các chẩn đoán bằng mô bệnh học (histopathology) và hóa miễn dịch mô bào (immunohistochemistry) trong BSE Các vị trí này chủ yếu là các hạch nhân của kênh tủy sống (spinal tract) của thần kinh sinh ba (trigeminal nerve) [2]; nhưng cũng là vị trí của hạch nhân vận động của thần kinh giao cảm (vagus nerve) [3] Cho thấy rằng chất liệu lấy cho thực hiện xét nghiệm nhanh cũng phải bao gồm đại diện của các vùng này.
Việc chia đôi không chính xác sẽ dễ dàng dẫn đến mất đi hoàn toàn vùng mục tiêu cho xét nghiệm xác nhận, và làm giảm rõ rệt hiệu quả của chương trình giám sát Thất bại trong lấy mẫu chính xác các vùng mục tiêu cũng có thể do sử dụng không chính xác các dụng cụ lấy mẫu Do đó các tiếp cận này cần được áp dụng với chính sách rõ ràng và chương trình theo dõi để huấn luyện và đảm bảo chất lượng các phương pháp lấy mẫu Do sự phân bố đến mục tiêu một cách đặc trưng của PrPSc, kích thước mẫu và vị trí sẽ như được mô tả trong bộ kit chẩn đoán, hoặc nếu không được chỉ định, thì ít nhất 0,5 g lấy từ các vùng mục tiêu cho mọi xét nghiệm xác nhận như chi tiết ở Hình 3 Các đặc điểm thi hành của một số xét nghiệm này có thể bị cản trở bởi quá trình tự phân, đặc biệt là do mất khả năng đảm bảo đủ các vùng mục tiêu trong mẫu lấy từ các vùng mục tiêu cho chẩn đoán như minh họa ở Hình 3
b) Chẩn đoán kiểm tra (diagnostic examination)
i) Kiểm tra mô bào học (histological examination)
Trang 10Mô bào học không còn là phương pháp chẩn đoán tốt nhất cho điều tra các con thú có nghi ngờ, hay theo dõi sức khỏe cộng đồng Tuy nhiên, một cảnh báo về các biến đổi mô bệnh học
là quan trọng, để dễ dàng phát hiện các trường hợp khi thực hiện các thủ tục kiểm tra chẩn đoán mô bào đối với não bò Để chẩn đoán phân biệt, các lát cắt hành tủy-mấu mỏ quạ được cắt lát dày 5 µm và được nhuộm màu với haematoxylin và eosin (H&E) Nếu mô có chất lượng, việc kiểm tra mô bệnh học đối với các lắt cắt nhuộm H&E cho phép xác nhận các đặc điểm biến đổi bệnh tích thần kinh của BSE (30, 36) mà từ đó bệnh được phát hiện trước tiên là bệnh tích nhũn não (spongiform encephalopathy) Các biến đổi này bao gồm chủ yếu là biến đổi dạng nhũn xốp (spongiform) và hình thành không bào trong sợi thần kinh (neuronal vacuolation) và giống với bệnh tích ở tất cả các thú vật khác bị TSE, nhưng ở BSE, tần suất cao xuất hiện không bào trong nhu mô não (neuroparenchymal vacuolation) trong một số hạch nhân của hành tủy ở gần mấu mỏ quạ, cho ra một phương cách thích hợp để thiết lập một chẩn đoán mô bệnh học trên một lát cắt đơn của hành tủy (34) trong các trường hợp nghi ngờ lâm sàng Như
ở các loài khác, các biến đổi không bào trong não bò, đặc biệt là các không bào bên trong sợi thần kinh có nhân ngoài rìa (neuronal perikarya) của hạch nhân đỏ (red nuclei) và thần kinh thị giác (oculomotor nuclei) của não giữa cũng thấy bị ảnh hưởng (18) Do đó, các chẩn đoán mô bệnh học đối với BSE không chỉ dựa vào sự hiện diện của không bào thần kinh, đặc biệt là ở các vị trí cơ thể học này
Các chẩn đoán này có thể được xác nhận nếu các biến đổi hình thái học hoàn toàn điển hình, thể hiện ở hành tủy nơi mấu mỏ quạ, nhưng bất kể các chẩn đoán mô bệnh học, hóa miễn dịch
mô bào (immunohistochemistry) vẫn được áp dụng làm thủ tục thêm vào, do các bằng chứng không công bố cho thấy có đến 5% các trường hợp nghi ngờ lâm sàng (mà âm tính trên kiểm tra lát cắt nhuộm H&E tìm các biến đổi không bào ở mấu mỏ quạ) có thể chẩn đoán được bằng kiểm tra IHC Rõ ràng là giao thức này giới hạn trong kiểm tra vùng hành tủy-mấu mỏ quạ không cho phép thiết lập kiểm tra đầy đủ bệnh tích thần kinh cho các chẩn đoán phân biệt lẫn cho phép hiểu biết về đặc điểm hình thái của mọi TSE Với lý do này, khuyên rằng nên lấy mẫu
là toàn bộ não, từ tất cả các trường hợp nghi ngờ lâm sàng
ii) Phát hiện các dạng PrP đặc hiệu của bệnh
Việc áp dụng phổ biến các phương pháp phát hiện PrP hiện nay cho ra các phương cách đặc biệt cho chẩn đoán độc lập đối với các biến đổi hình thái nhất định bằng tiếp cận mô bệnh học
Do đó nhiều phòng thí nghiệm hiện nay được cung cấp hay thay thế kiểm tra mô bệnh học bằng các phương pháp IHC hay các phương pháp phát hiện PrP khác Việc phát hiện các tích
tụ PrPSc là tiếp cận tốt nhất cho các chương trình giám sát và các chẩn đoán xác nhận Nếu có thể thì thực hiện hóa miễn dịch mô bào cho PrP trên chất liệu đã đông lạnh trước khi cố định (12) Việc đông lạnh trước khi cố định sẽ không cản trở phản ứng miễn dịch của mẫu, nhưng có thể cản trở việc nhận diện các vị trí mục tiêu mà cần phải kiểm tra trước khi ghi nhận kết quả là
âm tính
o Các phương pháp hóa miễn dịch mô bào (immunohistochemical – IHC)
Việc kiểm tra IHC để phát hiện tích tụ PrPSc được áp dụng cho các lát cắt từ cùng chất liệu đã được cố định bằng formalin và thấm paraffin của hành tủy nơi mấu mỏ quạ như đã sử dụng cho các chẩn đoán mô bệnh học (36) Một số giao thức đã được áp dụng thành công đối với IHC để phát hiện PrPSc cho các chẩn đoán BSE và mặc dù cần phải hài hòa theo hướng là thủ tục được đánh giá đầy đủ cho chẩn đoán IHC, nhưng kinh nghiệm đã cho thấy, quan trọng là có được các phương pháp mạnh mẽ mà đạt được một kết quả chuẩn mực, do được theo dõi bởi tham gia áp dụng thành thạo xét nghiệm, và bằng so sánh với các kết quả của một phương pháp hiện đại đã được chuẩn hóa trong một Phòng thí nghiệm Tham chiếu Kỹ thuật này không cần đến cố định mô lâu dài, mặc dù đối với tính chính xác như được hướng dẫn đối với mô bào học vẫn còn được áp dụng, và với điều kiện là mô có thể xử lý mô bào học được một cách hoàn chỉnh, kỹ thuật này hoạt động tốt với mô đã bị tự phân mà việc đánh giá hình thái đã không còn thực hiện được (11, 25) Tuy nhiên, ở đây vẫn còn cần thiết về khả năng ghi nhận cơ