LUẬN văn CÔNG NGHỆ hóa bước đầu KHẢO sát TIỀN xử lý và THỦY PHÂN vỏ CACAO để làm NGUYÊN LIỆU CHO QUÁ TRÌNH lên MEN BIOETHANOL BẰNG SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Sinh khối thực vật không phải thực phẩm là nguồn nguyên liệu thuộc “thế hệ thứ hai” được sử dụng để chuyển hóa thành bioethanol với sự kết hợp công nghệ hóa học hiện đại và công nghệ sin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA CÔNG NGHỆ

- -

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT TIỀN XỬ LÝ VÀ THỦY PHÂN VỎ CACAO ĐỂ LÀM

NGUYÊN LIỆU CHO QUÁ TRÌNH LÊN

MEN BIOETHANOL BẰNG SACCHAROMYCES CEREVISIAE

TS Lê Thị Kim Phụng Nguyễn Văn Pháp

GVC.ThS Hoàng Minh Nam MSSV: 2092149

Ngành: Công Nghệ Hóa Học-Khóa 35

Tháng 4/2013

Qua một thời gian làm luận văn tại phòng thí nghiệm Trọng điểm CNHH và Dầu Khí – Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, tôi đã được sự hướng dẫn

và giúp đỡ tận tình của quý thầy cô:

Th.s Hoàng Minh Nam, Bộ môn Quá Trình & Thiết Bị, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại học Bách Khoa, TP Hồ Chí Minh Cám ơn thầy đã tạo điều kiện cho em được làm luận văn tại trường Đại Học Bách Khoa

TS Lê Thị Kim Phụng, Bộ môn Quá Trình & Thiết Bị, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Trường Đại học Bách Khoa, TP Hồ Chí Minh Em cám ơn cô đã giúp cho em được vào thực tập tại Công Ty Cổ Phần XNK Domesco Đồng Tháp, là môi trường cho em trải nghiệm công việc thực tế Cám ơn cô đã sắp xếp công việc và động viên, chỉ bảo em để thực hiện đề tài luận văn này

ThS Trần Thị Tưởng An, Trường Đại học Bách Khoa, TP Hồ Chí Minh Cám ơn cô đã tận tình hướng dẫn chi tiết công việc, hỗ trợ kinh phí cho em và luôn động viên em trong suốt quá trình làm luận văn

Cám ơn các anh (chị) làm việc trong phòng thí nghiệm, các bạn lớp Kỹ Thuật Hóa Học – ĐHBK, với các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Bình Dương, Đại Học Kỹ Thuật TPHCM, đã giúp đỡ và chia sẻ khó khăn trong quá trình làm luận văn

Một lần nữa xin chân thành cám ơn quý thầy cô và các bạn

Sinh viên thực hiện Nguyễn Văn Pháp

Bioethanol là nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn trong tương lai thay thế cho nguồn nhiên liệu hóa thạch, bởi nó là nguồn nhiên liệu có thể tái tạo Bioethanol tồn tại ở dạng lỏng có thể được sử dụng thích nghi như nguồn nhiên liệu mới cho tương lai Tuy nhiên, những sản phẩm bioethanol có nguồn gốc từ tinh bột dễ bị biến động

do tinh bột là nguồn lương thực của con người Nếu sử dụng lương thực để sản xuất bioethanol sẽ làm cho giá của lương thực tăng cao Như vậy, sẽ làm bất bình ổn giá của lương thực, tác động xấu đến thị trường lương thực trong nước Việc sử dụng tinh bột hoặc nguyên liệu giàu đường sẽ lập tức đẩy giá của lương thực và bioethanol tăng cao hơn so với sản xuất bằng con đường hóa học Trong khi đó, giá của vật liệu phải chi trả 40 – 75% tổng chi phí của sản xuất ethanol Vì vậy, việc thay thế nguồn nguyên liệu là yêu cầu cho việc sản xuất bioethanol Như các nguồn nguyên liệu là các phụ phẩm của ngành nông nghiệp: rơm rạ, bã mía, vỏ cacao, vỏ cam chanh, …

Hiện nay, một phần vỏ cacao phế thải sau khi bóc hạt là tác nhân gây hại cho môi trường Đề tài này nhằm xác định giá trị dinh dưỡng của vỏ trái cacao để xử lí

và chuyển giao vào quá trình lên men để thu được cồn với hiệu suất cao nhất Theo nghiên cứu của các nhà khoa học nước ngoài, vỏ trái cacao chứa hàm lượng glucid cao nên việc sử dụng để chuyển hóa thành đường glucose để lên men tạo rượu ethanol là rất có hiệu quả Tuy nhiên, nếu vỏ trái cacao tươi không được sấy khô đến độ ẩm thích hợp thì đó là điều kiện cho vi sinh vật có hại phát triển Nên đề tài khảo sát nguyên liệu và lên men trên nguyên liệu có độ ẩm thích hợp, để bảo quản được lâu và sẵn sàng cung cấp nguyên liệu cho nghiên cứu Để đạt được hiệu suất lên men cao thì cần phải khảo sát các yếu tố: thời gian lên men; nhiệt độ, pH, trong dịch lên men Từ đó, chọn được điều kiện tối ưu để thu được ethanol nhiều nhất

Danh mục bảng vii

Danh mục phụ lục viii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Giới thiệu bioethanol 1

1.1.1 Khái niệm 1

1.1.2 Phương pháp sản xuất bioethanol 3

1.2 Sản xuất ethanol sinh học từ nguyên liệu lignocellulose 4

1.2.1 Các bước cơ bản trong lên men bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose 4

1.2.2 Quy trình tổng hợp ethanol từ lignocellulose 5

1.3 Tổng quan về phụ phẩm trong chế biến trái cây 8

1.4 Các phương pháp thủy phân 10

1.4.1 Phương pháp vật lý 10

1.4.2 Phương pháp hóa học 11

1.4.3 Phương pháp sinh học 12

1.5 Giới thiệu về cây cacao 15

1.5.1 Tên khoa học 15

1.5.2 Thành phần và giá trị dinh dưỡng của vỏ trái cacao 15

1.5.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cacao ở nước ta 16

1.6 Nấm men tham gia trong quá trình lên men rượu 17

1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 18

1.7.1 Thời gian 18

1.7.2 Nhiệt độ 19

1.7.3 Hàm lượng giống nấm men 19

1.7.4 Nồng độ của dịch lên men 19

1.7.5 Thành phần các chất dinh dưỡng của môi trường lên men 19

1.7.6 Nồng độ CO2 trong môi trường 20

1.7.7 pH 20

1.8.2 Tại Việt Nam 23

1.9 Các công trình nghiên cứu sản xuất bioethanol 25

1.9.1 Trên thế giới 25

1.9.2 Ở Việt Nam 26

CHƯƠNG 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 28

2.2 Đối tượng nghiên cứu 28

2.3 Vật liệu nghiên cứu 28

2.3.1 Nguyên vật liệu 28

2.3.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu 29

2.4 Bố trí thí nghiệm 29

2.4.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát giá trị dinh dưỡng nguyên liệu 29

2.4.2 Thí nghiệm 2 Tiền xử lý nguyên liệu 29

2.4.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát phương pháp thủy phân 31

2.4.4 Thí nghiệm 4 Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình lên men 33

2.5 Phương pháp phân tích 35

2.5.1 Phương pháp vi sinh: 35

2.5.2 Phương pháp hóa lý 36

2.6 Xử lý số liệu 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 Khảo sát giá trị dinh dưỡng vỏ cacao 41

3.2 Khảo sát nguyên liệu được tiền xử lý bằng dung dịch NaOH và HCl 41

3.3 Khảo sát phương pháp thủy phân 45

3.4 Khảo sát các điều kiện tối ưu của quá trình lên men 49

3.4.1 Khảo sát thời gian lên men 49

3.4.2 Khảo sát nhiệt độ lên men 54

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men 56

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

Hình 1.1 Quá trình chuyển đổi sinh khối lignocellulose thành ethanol 5

Hình 1.2 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý đến quy trình biến đổi lignocellulose thành ethanol 6

Hình 1.3 Cơ chế quá trình nổ hơi 11

Hình 1.4 Vị trí phân cắt của cellulase 13

Hình 1.5 Cấu tạo của acid  - galacturonic và khung cấu tạo pectin 14

Hình 1.6 Cơ chế hoạt động của enzyme pectinesterase (PE) 14

Hình 1.7 Trái cacao chín 15

Hình 1.8 Thành phần cấu tạo của trái cacao 15

Hình 1.9 Sản lượng ethanol trên thế giới theo lĩnh vực qua các năm 23

Hình 1.10 Hai nhà máy công suất lớn quy mô lớn ở Việt Nam 24

Hình 2.1 Sơ đồ lên men bioethanol thử nghiệm 34

Hình 2.2 Nhân giống nấm men trong môi trường SDB 37

Hình 3.1 Vỏ cacao sau khi xử lý bằng kiềm 42

Hình 3.3 Kết quả đường khử khi thủy phân nguyên liệu bằng enzyme 47

Hình 3.4 Kết quả cellulose khi thủy phân nguyên liệu bằng enzyme 48

Hình 3.5 Bộ dụng cụ lên men 51

Hình 3.6 Sự thay đổi tổng số chất rắn hòa tan theo thời gian lên men 51

Hình 3.7 Sự thay đổi độ cồn theo thời gian lên men 52

Hình 3.8 Sự thay đổi đường khử theo thời gian lên men 53

Hình 3.9 Sự thay đổi hiệu suất chuyển hóa đường khử theo thời gian lên men 53

Hình 3.10 Kết quả lên men ảnh hưởng bởi nhiệt độ 54

Hình 3.11 Kết quả lên men ảnh hưởng bởi pH 56

Trang

Bảng 1.1 Năng lượng tạo ra khi đốt cháy 1 lít nhiên liệu 2

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số phụ phẩm trái cây 9

Bảng 1.3 Diện tích và sản lượng một số cây trồng ở nước ta năm 2011 (theo Tổng cục thống kê) 10

Bảng 1.4 Ảnh hưởng của loại nấm men đến hiệu suất tạo ethanol 18

Bảng 1.5 Tổng hợp về sản xuất ethanol trên thế giới 22

Bảng 1.6 Sản xuất Ethanol tại Mỹ từ 1981 - 2010 22

Bảng 1.7 Tổng số nhà máy ethanol và công suất tại Mỹ qua các năm 23

Bảng 1.8 Một số nhà máy sản xuất ethanol ở Việt Nam 24

Bảng 3.1 Giá trị dinh dưỡng của vỏ cacao tươi 41

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát nguyên liệu tiền xử lý với dung dịch NaOH 42

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tiền xử lý nguyên liệu với dung dịch acid 43

Bảng 3.4 Kết quả thủy phân bằng enzyme 46

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát thời gian lên men 50

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men 54

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men 56

Trang PHỤ LỤC 1: GIỚI THIỆU VỀ LIGNOCELLULOSE 65PHỤ LỤC 2: HÌNH THÁI VÀ CẤU TẠO TẾ BÀO NẤM MEN 67PHỤ LỤC 3: CÁCH XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ 69PHỤ LỤC 4: ĐƯỜNG CHUẨN ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ (DNS) 69

hô hấp kỵ khí và thải ra ethanol và khí CO2 Trong khi đó, ethanol có nguồn gốc dầu mỏ thì được tổng hợp thông qua quá trình hóa học, không có mặt tham gia của

cơ thể sống trong quá trình tạo ethanol Cả 2 quá trình tổng hợp đều tạo ra ethanol

có tính chất như sau [12]:

ETHANOL

Công thức phân tử C2H5OH Khối lượng phân tử 46.07 g/mol Trạng thái: lỏng, không màu (từ -117 oC – 78 oC)

Tỉ trọng 0.789 kg/l Điểm sôi 78.5 o

C Điểm đông đặc -1170

C Giới hạn nổ: dưới 3.5% v/v; trên 19% v/v

Áp suất hơi: 38 oC, 50mmHg

pKa = 15.9

Độ nhớt 1.200 mPa.s (20 o

C) Chỉ số octane 99

Bảng 1.1 Năng lượng tạo ra khi đốt cháy 1 lít nhiên liệu [12]

Nhiên liệu Năng lƣợng, MJ/L

Bioethanol là nguồn năng lượng tái tạo và không đóng góp vào việc làm tăng hiệu ứng nhà kính Nếu như ta đốt cháy các sinh khối sẽ sinh ra CO2 thì tác động xấu tới môi trường mà không có hiệu quả kinh tế Các nguồn sinh khối có nguồn gốc thực vật, được tổng hợp thông qua quá trình tổng hợp quang học Tổng hợp bioethanol từ nguồn sinh khối là chuyển nguồn năng lượng tổng hợp quang học thành nguồn năng lượng có giá trị và nhiều ứng trong thực tế Sinh khối thực vật không phải thực phẩm là nguồn nguyên liệu thuộc “thế hệ thứ hai” được sử dụng để chuyển hóa thành bioethanol với sự kết hợp công nghệ hóa học hiện đại và công nghệ sinh học, đó là nguồn phụ phẩm của ngành nông nghiệp như rơm rạ, vỏ cacao … Với sự phát triển của ngành sản xuất ethanol sinh học từ nguồn sinh khối thực vật sẽ thúc đẩy các hộ nông dân trồng trọt tăng diện tích cây trồng cung cấp nguồn lương thực cho con người và tận dụng sinh khối Như vậy, sẽ tạo ra diện tích cây xanh nhiều hơn giúp cân bằng hệ sinh thái, giảm hiện tượng hiệu ứng nhà kính

1.1.2 Phương pháp sản xuất bioethanol

Có nhiều phương pháp để tổng hợp ethanol, có thể chia làm hai quá trình tổng hợp: hóa học và sinh học Ethanol được tổng hợp theo phương pháp hóa học từ nguồn nguyên liệu là khí ethane hoặc ethylen bằng quá trình hydrate hóa ethylen với xúc tác là acid H2SO4 Sản xuất ethanol bằng phương pháp hóa học rất tốn nhiều chi phí cho thiết bị, nguyên liệu và năng lượng Nên để có hiệu quả kinh tế cao và đồng thời bảo vệ môi trường thì phải chọn phương pháp tổng hợp ethanol bằng con đường sinh học để thu được bioethanol Nguồn nguyên liệu sinh khối sử dụng cho lên men rất phong phú Tuy nhiên, xuất phát từ điều kiện Việt Nam là một nước nông nghiệp có sản phẩm nông nghiệp rất phong phú nên c ó t h ể sản suất ethanol từ nguồn nguyên liệu chính sau đây:

 Sản xuất ethanol từ nguyên liệu chứa tinh bột (sắn, ngô)

 Sản xuất ethanol từ nguyên liệu chứa đường(vỏ thanh long, cacao, …)

 Sản xuất ethanol từ nguyên liệu chứa cellulose (rơm rạ, mùn cưa, bã mía…) Tuy nhiên, tinh bột là nguồn lương thực quan trọng cho con người Trong thời kì khủng hoảng kinh tế thì cần phải tìm ra nguồn nguyên liệu thay thế khác, chủ yếu là các phế phẩm của ngành nông nghiệp để bảo vệ môi trường và mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nông dân Trong khi đó, nguồn nguyên liệu chứa cellulose rất phong phú ở nước ta lại chưa được sử dụng để tổng hợp bioethanol

Việc sản xuất ethanol từ các nguồn nguyên liệu chứa cellulose không còn là vấn đề mới mẻ của nhiều nước trên thế giới nhưng đối với Việt Nam thì đây là một vấn đề rất mới Hiện nay, nước ta chưa có một nhà máy nào sản xuất ethanol từ các nguồn nguyên liệu chứa cellulose như: rơm rạ, cây cỏ, mùn cưa, bã mía… Ethanol được sản xuất ở Việt Nam chỉ từ các nguồn nguyên liệu chứa tinh bột (gạo, ngô, sắn) và từ rỉ đường Việc nghiên cứu xây dựng nhà máy sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu chứa cellulose là một việc làm rất cần thiết nhằm tận dụng được các phế phẩm từ ngành nông nghiệp, tăng thu nhập cho nông dân

Vùng Đông Nam Bộ của nước ta có diện tích lớn trồng các loại cây công nghiệp như điều, cà phê Nên rất thuận lợi cho việc trồng xen cây cacao với các loại cây công nghiệp Sau đó thu hoạch và bóc vỏ tại hợp tác xã ở địa phương nên nguồn nguyên liệu vỏ trái cacao rất dồi dào cung cấp cho các nhà máy sản xuất ethanol trong tương lai tới

1.2 Sản xuất ethanol sinh học từ nguyên liệu lignocellulose

1.2.1 Các bước cơ bản trong lên men bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose

Sơ đồ chuyển đổi sinh khối thành ethanol

Sinh khối lignocellulose Đường đơn

(Lignin, cellulose, hemicellulose)

Về nguyên tắc, quá trình lên men ethanol từ các nguồn nguyên liệu chứa cellulose cũng giống như từ tinh bột hay rỉ đường Bao gồm bốn bước cơ bản:

 Tiền xử lý nguyên liệu: giúp cho quá trình thủy phân cellulose thành đường có hiệu quả hơn

 Thủy phân nguyên liệu: sử dụng hệ enzyme thủy phân cellulase

 Lên men: sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae

 Tinh chế sản phẩm (chưng cất, tách nước, bốc hơi, tách lỏng rắn) tùy vào nồng độ cồn mà có phương pháp tinh chế khác nhau

Ethanol, rượu bậc cao, acid …

1 Tiền xử lý

2 Thủy phân 3 Lên men

4 Tách chiết/ tinh chế

Nhiên liệu

1.2.2 Quy trình tổng hợp ethanol từ lignocellulose

Hình 1.1 Quá trình chuyển đổi sinh khối lignocellulose thành ethanol

Quá trình tổng hợp bioethanol từ sinh khối lignocellulose bao gồm các bước chính Thủy phân và lên men có thể tiến hành độc lập (SHF, được thể hiện bằng mũi tên nét đứt), hoặc tiến hành đồng thời (SSF) Trong quá trình sinh học hợp nhất (CBP), tất cả các bước biến đổi sẽ được tích hợp vào trong một bước duy nhất bằng cách sử dụng một hoặc nhiều loại vi sinh vật Các kỹ thuật khác nhau như gây đột biến gen, đồng nuôi cấy (co-culturing) và biểu hiện gen (heterologous gene) được

sử dụng để cải thiện khả năng sử dụng đường của vi sinh vật cũng như cải thiện hoạt tính và sự ổn định của enzyme thủy phân có nguồn gốc từ nấm để nâng cao sản lượng ethanol tổng thể Để giảm chi phí cho quy trình sản xuất, việc sản xuất ethanol có thể được kết hợp với nhà máy nhiệt điện sử dụng lignin [23]

1.2.2.1 Quá trình tiền xử lý

Hình 1.2 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý đến quy trình biến đổi lignocellulose thành

ethanol [15]

Thành phần của nguyên liệu lignocellulose chứa chủ yếu là cellulose, lignin

và hemicellulose Trong đó, cellulose là thành phần quan trọng được sử dụng trong chuyển hóa sinh khối thực vật thành bioethanol Nhưng cellulose rất khó bị phân hủy vì phân tử của nó rất lớn, liên kết giữa các monomer rất bền vững, phân tử có

độ kết tinh cao và nó liên kết chặt chẽ với lignin và hemicellulose Nên cần phải có phương pháp tiền xử lý thích hợp nhất để phân hủy phân tử cellulose Mục đích của quá trình tiền xử lý là để loại bỏ lignin và hemicellulose, giảm kích thước vi sợi cellulose, và tăng độ xốp của vật liệu lignocellulose

1.2.2.2 Quá trình thủy phân

Sau quá trình tiền xử lý, cellulose và hemicellulose sẽ bị thủy phân thành các đường đơn (hexoses và pentoses) (hình 1.1) Ở đây, quan tâm nhiều đến sự thủy phân cellulose, do nó là thành phần chính trong sinh khối lignocellulose Quá trình thủy phân cellulose được thực hiện bởi acid thủy phân hoặc enzyme thủy phân Vào cuối thế kỉ 19 và đầu thế kỉ 20, quá trình thủy phân được thực hiện bởi phản ứng

giữa cellulose với acid Acid loãng được sử dụng dưới điều kiện nhiệt độ cao và áp suất cao, còn acid đậm đặc được sử dụng ở nhiệt độ thấp và áp suất khí quyển Quá trình thủy phân bằng acid loãng xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao dẫn đến

sự tạo thành các chất độc hại có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men như các acid hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất furfuran và các hợp chất vô

cơ Các mắt xích của cellulose có thể bị phân cắt thành các phân tử đường glucose riêng lẻ bằng cellulase Vì cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose Nguồn thu enzyme cellulase lớn nhất hiện nay là vi sinh vật

(nấm, vi khuẩn) Nhiều loài nấm như Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, và T emersonii có thể sản sinh ra một số lượng lớn cellulase và hemicellulase ngoại bào

Vật liệu lignocellulose bị thủy phân bằng enzyme ở điều kiện ôn hòa (50 oC và

pH ~ 5), cho phép phân cắt cellulose và hemicellulose một cách hiệu quả mà không hình thành nên các sản phẩm phụ có thể ức chế hoạt động của enzyme [23]

1.2.2.3 Quá trình lên men

Trong quá trình lên men, các sản phẩm của quá trình thủy phân bao gồm đường hexose (glucose, mannose và galactose) và pentose (xylose và arabinose) sẽ được lên men thành ethanol (hình 1.2) Trong số các sản phẩm của quá trình thủy phân, glucose là phong phú nhất, theo sau là đường xylose hoặc mannose và một ít

các đường khác S cerevisiae có ưu điểm như phổ biến, tỷ lệ lên men cao và lượng ethanol tạo thành cao Vì vậy, S cerevisiae là loại nấm men được sử dụng phổ biến cho quá trình lên men sinh khối lignocellulose thành ethanol Tuy nhiên, S cerevisiae không có khả năng lên men xylose thành ethanol được [8] Để quá trình

biến đổi sinh khối lignocellulose có khả thi về kinh tế, nó cần thiết lựa chọn những sinh vật có khả năng lên men cả glucose và xylose

Ngoài xylose, S cerevisiae không có khả năng lên men arabinose, trừ khi cải tiến chúng Do đó, S cerevisiae tái tổ hợp chứa gen có khả năng lên men xylose đã được thiết kế với gen chuyển hóa arabinose từ những vi sinh vật khác S.cerevisiae

tái tổ hợp gần đây nhất (TMB 3400) đã cho thấy lên men thành công cả ba loại đường glucose, xylose và arabinose [16]

Trong quá trình lên men sinh khối lignocellulose, hoạt tính của S cerevisiae

giảm xuống nếu có sự hiện diện của các hợp chất ức chế bao gồm các acid hữu cơ

có trọng lượng phân tử thấp, dẫn xuất fufural, phenol và các hợp chất vô cơ Các hợp chất này được sinh ra trong quá trình tiền xử lý và cũng có thể từ quá trình thủy phân lignocellulose Vì vậy, cần phải loại bỏ các hợp chất ức chế có trong môi

trường trước khi tiến hành lên men, mà điều đó sẽ làm tăng chi phí của quá trình công nghệ cũng đồng thời làm mất mát lượng đường cần thiết cho quá trình lên men

Điều thú vị, S cerevisiae là một trong những vi sinh vật ít nhạy cảm với các chất ức

chế của quá trình thủy phân lignocellulose [19]

Hai bước cuối để biến đổi sinh khối lignocellulose thành ethanol (thủy phân

và lên men) có thể được thực hiện một cách độc lập (SHF) hoặc đồng thời (SSF) (Hình 1.1) Trong phương pháp thủy phân và lên men độc lập (SHF), các sản phẩm thủy phân sẽ được lên men để sản xuất ethanol trong một quá trình riêng Ưu điểm của phương pháp này là cả hai quá trình có thể được tối ưu hóa riêng, không phụ thuộc vào nhau (ví dụ như nhiệt độ tối ưu của quá trình thủy phân là 45-50 oC, trong khi đó quá trình lên men là 30 o

C) Tuy nhiên, nhược điểm chính của nó là sự tích tụ các chất ức chế cản trở hoạt động của enzyme thủy phân cellulose và glucose Điều này làm cho quá trình biến đổi kém hiệu quả, và gây tốn kém (phải bổ sung thêm một lượng lớn enzyme) Trong phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF), thì các sản phẩm cuối của quá trình thủy phân sẽ được trực tiếp chuyển đổi thành ethanol ngay nhờ vi sinh vật Do đó, việc bổ sung một lượng lớn enzyme là không cần thiết và điều này sẽ làm giảm chi phí sản xuất ethanol Nhưng, nhược điểm của SSF là cần phải chọn được điều kiện nhiệt độ và pH gần với điều kiện tối ưu của mỗi quá trình riêng [18]

1.2.2.4 Quá trình chưng cất và tinh chế

Chưng cất là phương pháp tách ethanol ra khỏi hỗn hợp cấu tử trong dịch sau lên men Do ethanol tạo hỗn hợp đẳng phí với nước nên sản phẩm thu được hỗn hợp gồm cồn và nước Để thu cồn tuyệt đối người ta có thể dùng các phương pháp sau:

 Bốc hơi thẩm thấu và rây phân tử

 Chưng cất và thẩm thấu qua màng

1.3 Tổng quan về phụ phẩm trong chế biến trái cây

Ngành công nghệ chế biến các loại rau quả đáp ứng thị trường trong nước và xuất khẩu rất phát triển ở nước ta Nên các phế phẩm được dùng trong sản xuất ethanol có thể là vỏ của các loại quả (như vỏ cam chanh, vỏ chuối, vỏ dứa, vỏ thanh long, vỏ quả cacao), hoặc bã ép nếu còn nhiều đường (như bã ép táo, nho…)

Trong chế biến cam, quýt, chanh, bưởi thì vỏ ngoài, cùi trắng, bã loại ra khi

ép và khi chà là phế liệu Vỏ ngoài và cùi trắng chiếm 10-35% khối lượng quả Vỏ được sử dùng để trích ly tinh dầu ứng dụng trong thực phẩm và dược phẩm Hàm lượng pectin hơn 6-7 lần, chất khoáng hơn 1.5-2 lần và vitamine C hơn 3-4 lần so với múi Từ vỏ cam, quýt thu hồi được tinh dầu, pectin, chế phẩm vitamine P, chất màu và làm được mứt Tuy nhiên, hiệu suất trích ly rất thấp do đó cần phải có biện pháp sử dụng có hiệu quả hơn vỏ quả cam chanh Đó là sử dụng vỏ cam chanh để lên men tạo ethanol

Vỏ chuối chiếm 30% khối lượng quả, được sử dụng để chế biến chuối nước đường Phần bã còn lại được sử dụng để sản xuất ethanol

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số phụ phẩm trái cây [21]

Chỉ tiêu Vỏ quýt Vỏ cam Vỏ bưởi Vỏ thanh

Ghi chú: “-“: không có số liệu

Từ số liệu bảng 1.2, hàm lượng đường của các phụ phẩm trái cây rất thích hợp để chuyển hóa thành ethanol bằng con đường lên men Đối với các nguyên liệu

có hàm lượng cellulose cao thì cần phải tiền xử lý và thủy phân cellulose để tạo ra hàm lượng đường cao hơn giúp quá trình lên men tạo ra cồn nhiều hơn

Bảng 1.3 Diện tích và sản lượng một số cây trồng ở nước ta năm 2011 (theo

Tổng cục thống kê)

Cây trồng Diện tích

(nghìn ha)

Sản lượng (nghìn tấn)

1.4 Các phương pháp thủy phân

Về nguyên tắc, cellulose và pectin là đại phân tử gồm nhiều đơn vị liên kết với nhau thành chuỗi phân tử có khối lượng phân tử lớn Do đó, cần phải thực hiện quá trình thủy phân cellulose thành các đơn vị monomer để nấm men dễ dàng sử dụng để thực hiện quá trình lên men Trên nguyên tắc đó, có các phương pháp thủy phân bằng vật lý và hóa học [14]

 Bức xạ: sử dụng tia lửa điện kết hợp với vi sóng để sinh ra nhiệt nội

và bẻ gãy các liên kết phân tử phân cực cellulose thành các monomer

 Nổ hơi nước: Quá trình nổ hơi nước là một quá trình cơ – hóa – nhiệt Đó là phá v ỡ cấu trúc các h ợp phần với sự giúp đỡ của nhiệt ở dạng hơi (nhiệt), lực cắt do s ự giãn nở của ẩm (cơ), và th ủy phân các liên k ết glycoside (hóa)

Hình 1.3 Cơ chế quá trình nổ hơi Trong thiết bị phản ứng, nước dưới áp suất cao thâm nh ập vào cấu trúc lignocellulose bởi quá trình khu ếch tán và làm ẩm nguyên liệu Ẩm trong biomass

sẽ hóa hơi đột ngột ra khi áp suất trong thi ết bị phản ứng được giải phóng và hạ đột ngột từ rất cao khoảng vài chục atm xuống còn áp suất khí quyển Nguyên liệu được tống mạnh khỏi thiết bị qua một lỗ nh ỏ bởi lực ép Nhiệt độ càng cao thì áp suất càng cao, do đó càng làm gia tăng s ự khác nhau giữa áp suất trong thiết bị phản ứng

so với áp suất khí quyển Sự chênh lệch về áp suất t ỷ lệ với lực cắt của ẩm hóa hơi Phương pháp này tăng đ ộ xốp c ủa nguyên liệu, phá h ủy phần lớn cấu trúc hemicellulose và lignin Tuy nhiên, tiêu tốn nhiều năng l ượng và hình thành các chất gây kiềm hãm là những hạn chế lớn của phương pháp này

1.4.2 Phương pháp hóa học

Xử lý bằng acid: là phương pháp được xem là một công nghệ quan trọng và cho năng suất tạo đường cao nhất từ lignocellulose Mục đích ch ủ yếu của các phương pháp tiền x ử lý bằng acid là để hòa tan ph ần lớn hemicellulose c ủa sinh khối và để làm cho ph ần cellulose có nhiều kh ả năng tiếp xúc với enzyme hơn Sử dụng acid với nồng độ thấp 0.2 % và 0.25 % w/w và nhiệt độ 130 oC và 210 oC để

xử lý nguyên liệu Acid sulfuric được sử dụng rộng rãi trong các loại acid dùng để

xử lý như HCl, HNO3 Các loại acid này có thể phá hủy cấu trúc của các polysaccharides, hemicellulose dễ dàng được thủy phân thành glucose Tuy nhiên, phương pháp xử lý bằng acid sẽ tạo ra những sản phẩm phụ như acetic acid, furfural, đây là các tác nhân chống lại hoạt động của nấm men Hơn nữa, vấn đề ăn mòn thi ết bị và thu hồi acid là những nhược điểm quan tr ọng khi sử dụng các phương pháp tiền xử lý bằng acid đặc Chi phí vận hành và bảo dưỡng cao làm giảm

sự quan tâm đến việc áp dụng phương pháp tiền x ử lý bằng acid đặc ở quy mô thương mại [28]

Xử lý bằng kiềm: các loại kiềm sử dụng như NaOH, KOH, NH4OH Với phương pháp này, các nguyên liệu được xử lý ở nhiệt độ và áp suất thấp hơn Điều kiện để xử lý nguyên liệu là dung dịch NaOH nồng độ 1.5 % trong 144 giờ, ở nhiệt

độ 20 o

C Mục đích c ủa phương pháp là lo ại bỏ và thay đ ổi cấu trúc thành ph ần

lignin dẫn đến tăng khả năng tiếp cận của các tác nhân th ủy phân cellulose và gi ảm

độ hấp phụ của enzyme lên thành ph ần lignin Phương pháp này có thể th ực hiện ở nhiệt độ phòng trong 1-2 ngày hoặc ở nhiệt độ cao trong thời gian ngắn NaOH có thể làm ph ồng nở cấu trúc cellulose , tăng diện tích ti ếp xúc của cellulose và làm giảm độ trùng hợp cũng như độ kết tinh của cellulose NaOH đã được chứng minh tăng hiệu suất thủy phân gỗ cứng từ 14% lên 55% bằng cách giảm hàm lượng lignin

từ 24-55% xuống còn 20% [23] Ngoài ra Ca (OH)2 cũng đang được nghiên cứu rộng rãi vì nó có giá thành r ẻ, không tốn kém thi ết bị yêu cầu độ an toàn cao và có thể tái phục hồi bằng phản ứng với CO2

Các phương pháp khác: Cũng có thể s ử dụng những phương pháp khác nh ư

xử lý v ới dung môi hữu cơ: dùng dung môi như ethanol, methanol, acetone để hòa tan lignin ; hay sử dụng các lo ại hóa chất khá c: ozone, ure, KMnO4 , dioxane, EDTA …

1.4.3 Phương pháp sinh học

Là phương pháp sử dụng enzyme làm tác nhân thủy phân cellulose, pectin thành đường glucose sau quá trình tiền xử lí để loại bỏ các thành phần lignin, hemicellulose làm cản trở quá trình tấn công vào mạch để phân cắt mạch dưới tác dụng của enzyme Tùy vào nguyên liệu có chứa hàm lượng thành phần nào nhiều thì sử dụng enzyme để thủy phân thành đường glucose Vỏ Cacao có chứa nhiều cellulose, pectin nên sử dụng hệ cellulase và pectinase làm tác nhân thủy phân

 Hệ cellulase: là một phức hệ enzyme có tác dụng thủy phân lần lượt cellulose thông qua việc thủy phân liên kết – 1,4 – glucosid trong cellulose thành sản phẩm cuối cùng là đường glucose Người ta có thể thu nhận enzyme từ vi khuẩn

như: Bacillus, Clostridium, Cellulomonas, … hay từ nấm như: Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, Penicillium pinophilentum, Talaromyces emersonii, Pleurotus sp, … trong đó, người ta chú ý nhiều đến các chủng Trichoderma vì

chúng có khả năng sinh enzyme cellulase với số lượng lớn và hoạt tính cao Cellulose là polysaccharide phong phú nhất trong tự nhiên nên làm nguồn cơ chất cho cellulase Đồng thời việc thủy phân cellulose của vi sinh vật là một bước quan trọng của chu trình carbon trên trái đất Có 3 loại cellulase:

 Endo - β - glucanase hay còn gọi là 1,4 - β - D-glucan glucanohydrolase, CMCase, Cx: Enzyme này tham gia phân giải liên kết β - 1,4 - glucosid trong mạng cellulose, trong lichenin và β - D - glucan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose

và glucose Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose dạng vô định hình, tác động yếu đến cellulose dạng kết tinh

 Exo - β - glucanase hay còn gọi là 1,4 - β - D - glucan

cellobiohydrolase, Avicelase, C1: Enzyme cắt đặc hiệu liên kết β - 1,4

glucosid ở đầu tự do của cellulose để tạo thành cellobiose Không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng

 β - glucosidase hay còn gọi là cellobiase (EC.3.2.1.21): enzyme này tham gia thủy phân cellobiose, tạo thành glucose

Cellulase là một protein có tính acid Cellulase có thể hoạt động ở dãy pH từ

3 – 7 , nhưng pH tối ưu là 4 – 5 và nhiệt độ tối ưu là 40 - 50 °C Cellulase bị ức chế bởi các sản phẩm như glucose và cellobiose được tạo ra trong phản ứng thủy phân Glucose ức chế β-glucosidase và cellobiose ức chế Endo-ß-glucanase và Exo-ß-glucanase Trong tự nhiên, thủy phân cellulose cần có sự tham gia của tất cả 3 loại

enzyme endoglucanase, exolglucanase và β- glucosidase Mỗi loại enzyme chỉ tham

gia thủy phân một phần trong cellulose Các loại enzyme này lần lượt thủy phân cellulose để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose

Hình 1.4 Vị trí phân cắt của cellulase [30]

 Hệ pectinase: là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid galacturonic, galactose, methanol Đây là nhóm enzyme thứ

ba được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật sau amylase và protease Pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật Ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều

trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá Nhiệt độ tối ưu của enzyme trong khoảng 45 – 55 oC Pectin là cơ chất của enzyme pectinase Pectin là polysaccharide dị thể mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết - 1,4 – glucosid Các mạch bên của phân tử pectin gồm có rhamnose, arabinose, galactose và xylose Các nhóm carboxyl của acid galacturonic có thể ester hóa một phần bằng các nhóm methyl và được trung hòa một phần hay hoàn toàn bằng các ion Na+, K+, NH4

+

hay bị decarboxyl hóa … Công thức cấu tạo của acid  - galacturonic và khung cấu tạo phân tử pectin được giới thiệu ở hình 1.5

Hình 1.5 Cấu tạo của acid  - galacturonic và khung cấu tạo pectin

Dựa vào thành phần khác nhau của khung sườn chính mà pectin được phân loại thành protopectin, acid pectic, acid pectinic và pectin [11]

Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, pectinase được chia thành

ba nhóm chính gồm: pectinesterase, các enzyme khử mạch polymer, protopectinase

Pectinase còn được gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử ester hóa nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic Enzyme này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyl ester của acid galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không

bị ester hóa

Hình 1.6 Cơ chế hoạt động của enzyme pectinesterase (PE) [11]

Các enzyme khử mạch polymer chia thành hai tiểu nhóm: enzyme thủy phân liên kết glycosid và enzyme cắt

Polymethylgalacturonase (PMG) có tác dụng xúc tác thủy phân liên kết

 - 1,4 – glycosid, đặc hiệu với pectin có mức độ ester hóa cao PMG gồm 2 loại:

phân cắt ngẫu nhiên liên kết  – 1,4 – glycosid và phân cắt ngẫu nhiên từ đầu không khử của mạch pectin

1.5 Giới thiệu về cây cacao

1.5.1 Tên khoa học [1]

Tên khoa học của cacao như sau: Theobroma cacao L

Thuộc họ Trôm Sterculiaceae

Hình 1.7 Trái cacao chín [36]

1.5.2 Thành phần và giá trị dinh dƣỡng của vỏ trái cacao

Những nghiên cứu khoa học đã và đang được thực hiện đều hướng đến sự phát triển bền vững của xã hội Trong đó, việc sử dụng có hiệu quả các phế phẩm của ngành nông nghiệp để sản xuất nhiên liệu ethanol thân thiện với môi trường Một trong những sự phát triển bền vững đó là sử dụng nguồn cung cấp đường từ vỏ cacao để chuyển hóa vi sinh để tạo ra ethanol sinh học Điều đó sẽ giải quyết các vấn đề về ô nhiễm môi trường và chất thải nông nghiệp [11]

Hình 1.8 Thành phần cấu tạo của trái cacao [35]

1.5.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cacao ở nước ta

Theo ban điều phối phát triển Cacao (VCC), Việt Nam có hơn 20500 ha cacao, trong đó gần 7000 ha thu hoạch, sản lượng trên 4800 tấn/năm Có 15 tỉnh trồng Cacao, chủ yếu là vùng đồng bằng sông Cửu Long (Bến Tre, Tiền Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Cần Thơ), Đông Nam Bộ (Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình phước, Bình Thuận), Tây Nguyên ( Đắc Lắc, Đắc Nông, Lâm Đồng, Gia Lai) và một số tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ Trong đó, Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích cây Cacao lớn nhất (khoảng 12.100 ha), Tây Nguyên (4.500ha), Đông Nam bộ (3.400 ha) Ca cao Việt Nam cho năng suất hơn

7 tạ hạt/ha, mỗi vụ cho sản lượng khoảng 4.900 tấn/ha Gần đây, đầu ra của hạt Cacao Việt Nam rất thuận lợi, có hàng chục doanh nghiệp trong và ngoài nước chuyên thu mua với giá trên 50 nghìn đồng/kg Đặc biệt, cả nước có hơn 600 hộ dân trồng 541 ha cây ca cao đạt tiêu chuẩn UTZ (tiêu chuẩn Quốc tế chứng nhận sản xuất tốt) Trong năm 2011, cả nước đã xuất khẩu được 240 tấn hạt Cacao, đạt kim ngạch xuất khẩu 520 nghìn USD So với nhiều loại cây ăn quả khác, Cacao dễ trồng, thích nghi với nhiều loại đất khác nhau, thường thì sau 18 tháng trồng cây Cacao bắt đầu cho trái [31]

Tiền Giang có 5 huyện là: Chợ Gạo, Gò Công Tây, Tân Phú Đông, Châu Thành và thành phố Mỹ Tho đã trồng loại cây này và đang phát huy hiệu quả Giữa tháng 11/2011, 147 ha cây cacao của các nhà vườn tại huyện Chợ Gạo được tổ chức HELVETAS (Thụy sĩ) cấp giấy chứng nhận UTZ [32]

Đắc Lắc là tỉnh đầu tiên trồng cây cacao của cả nước nhưng đến nay chỉ có hơn 2.100 ha và chưa xây dựng được nhà máy chế biến cacao Bộ Nông nghiệp – PTNT cho biết: toàn quốc hiện nay chỉ có 2 nhà máy chế biến hạt cacao tại tỉnh Quảng Ngãi và Bình Dương Riêng dự án Nhà máy chế biến hạt cacao có kế họach xây dựng tại xã An Khánh, huyện Châu Thành (tỉnh Bến Tre) nhưng đến nay vẫn chưa khởi động Mặt khác công tác sản xuất, quản lý giống cây cacao; kỹ thuật trồng, thu hoạch, chế biến hạt cacao còn nhiều bất cập Ở một số địa phương, nhà vườn chưa thật sự tin tưởng vào loại trái cây này

Cùng với nhu cầu sử dụng cacao trong nước và thế giới đang tăng cao, đây là

cơ hội cho Việt Nam phát triển diện tích và sản lượng cacao Đó là kỳ vọng của các nhà chế biến cacao tại châu Âu về sản xuất cacao của Việt Nam Tuy diện tích trồng cacao còn thấp so với thế giới nhưng chất lượng hạt cacao tại các nhà máy chế biến vào loại hàng đầu Để phát triển năng suất trồng cây cacao lên cao thì cần sự hỗ trợ của một số ngân hàng các nước như ngân hàng Rubank của Hà Lan Đây là một

trong những ngân hàng lớn nhất thế giới tài trợ những dự án về nông nghiệp cho nhiều quốc gia ở các nước đang phát triển Ngân hàng này đang quan tâm đến sản xuất nông nghiệp, nhất là cây cacao ở Việt Nam

Cacao là một trong những cây trồng chủ lực của tỉnh Bình Phước, có lợi thế cạnh tranh cao Trong những năm qua, tỉnh đã tập trung phát triển trồng cây cacao, đặc biệt xây dựng mô hình trồng cây ca cao dưới tán điều Từ năm 2005 – 2007, Dự

án phát triển cacao cho các nông hộ nhỏ ở Việt Nam cho chính phủ Hoa Kỳ tài trợ

đã triển khai chuyển giao giống và hướng dẫn kỹ thuật trồng cây cacao cho nông dân Năm 2010, dự án phát triển nông nghiệp bền vững do tổ chức ROP (Roots of Peace) tiếp tục hỗ trợ đầu tư phát triển cacao tại địa phương này

Do vậy, ngành trồng và chế biến từ vỏ cacao rất có tiềm năng phát triển ở nước ta, đặc biệt là các tỉnh miền Đông Nam Bộ Với sự đầu tư về vốn, kỹ thuật trồng cây và chế biến hạt cacao của các đối tác nước ngoài thì ngành chế biến hạt cacao sẽ thải ra một lượng lớn vỏ quả cacao Nên cần phải nghiên cứu các ứng dụng

để sử dụng có hiệu quả phụ phẩm này Trong đó, sử dụng vỏ cacao để chuyển hóa thành rượu ethanol sử dụng làm nhiên liệu sinh học là tiềm năng tương lai cho ngành năng lượng xanh ở nước ta khi bước tới trở thành một nước phát triển

1.6 Nấm men tham gia trong quá trình lên men rƣợu

Nấm men là thành phần chủ đạo trong lên men rượu nói chung Tế bào nấm men có dạng hình ovan, sinh sản bằng cách nảy chồi hay tạo bào tử, sống kỵ khí không bắt buộc, có khả năng lên men các loại đường khác nhau Trong điều kiện hiếu khí, nấm men oxy hóa hoàn toàn đường thành CO2 và H2O, gia tăng sinh khối, ngược lại trong điều kiện kỵ khí, nấm men sẽ không tăng sinh khối vì không tổng hợp được sterol cần cho cấu trúc tế bào, nấm men tiến hành lên men đường để thu năng lượng

Trong công nghệ sản xuất cồn, hay các loại đồ uống có cồn người ta thường

sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae là loại vi sinh vật được sử dụng phổ

biến trong lên men để tạo ethanol

Saccharomyces cerevisiae thuộc loại nấm men chìm có đặc điểm:

 Nấm men chìm chỉ phát triển trong môi trường lên men, chúng không tạo thành bọt dày trên bề mặt, lắng nhanh khi lên men kết thúc và tạo thành lớp men xít bám chắc ở đáy thùng

 Đặc điểm nổi bậc của nấm men chìm là một số chủng có chứa enzyme

α - galactosidase nên lên men hoàn toàn đường rafinose, còn đối với nấm men nổi

thì một số ít chủng có khả năng chuyển hóa đường rafinose thành CO2 và H2O và chỉ 1/3 đường rafinose

Trong quá trình thủy phân cellulose có tạo ra đường 5 carbon_xylose thì

chủng men Saccharomyces cerevisiae không thể sử dụng để lên men tạo ethanol

nên hiệu suất tạo ethanol không cao Vì vậy, cần phải sử dụng các loại nấm men có

thể sử dụng glucose và xylose để chuyển hóa thành ethanol như: P stipitis BCC15191, P stipitis NRRL Y-712

Bảng 1.4 Ảnh hưởng của loại nấm men đến hiệu suất tạo ethanol [14]

Nguyên liệu Loại nấm men Hiệu suất tạo ethanol Đặc điểm lên men

Rơm rạ

Saccharomyces cerevisiae Pichia stipitis NRRL

Y – 7124

4 g/l

6 g/l

Chỉ lên men glucose

Lên men glucose rồi tới xylose

Candida shehatae 0.45g/g và 0.5g/g

đường sử dụng từ quá trình thủy phân, cố định trong 48 h

Đồng lên men glucose và xylose

1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

1.7.1 Thời gian

Thời gian cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men…Thời gian lên men được tính bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào môi trường lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng môi trường lên men cụ thể và tùy thuộc vào mục đích lên men mà ta dừng quá trình lên men

Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho dịch đường tiếp xúc với oxy Lúc này nấm men cần oxy để tích lũy một lượng sinh khối cần thiết cho quá trình lên men Tiếp theo, để chuyển hóa đường thành ethanol, nấm men phải được phát triển trong điều kiện yếm khí hoàn toàn Vì trong môi trường này, sự hô hấp của nấm men bị ức chế và bắt đầu phải tìm năng lượng cần thiết bằng con đường lên men Để đáp ứng năng lượng cần thiết thì nấm men cần phân hủy một lượng đường lớn và đường sẽ chuyển hóa thành ethanol và CO2 Đó là nguyên nhân muốn có

ethanol nhiều thì không được thoáng khí môi trường Nếu có oxy thì trong giai đoạn này rượu sẽ tiếp tục chuyển hóa thành acid acetic làm sản phẩm bị chua [4]

Việc bổ sung tỷ lệ giống lên men cũng phải được lựa chọn Thông thường lượng men giống cấy vào 15 triệu tế bào/ml dịch lên men [4]

1.7.4 Nồng độ của dịch lên men

Nếu nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Kết quả là ethanol nhiều sẽ ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn hao nguồn nguyên liệu và phải kéo dài thời gian lên men Mặt khác nếu nồng độ đường của dịch lên men thấp thì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và làm cho nấm men không đủ chất dinh dưỡng để phát triển Thông thường nồng độ dịch đường được giới hạn ở 22 % khối lượng hoặc ít hơn (nếu cao hơn thành tế bào có thể bị vỡ) [3]

1.7.5 Thành phần các chất dinh dưỡng của môi trường lên men

Môi trường nuôi cấy cần phải có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng chủ yếu

là glucide ở dạng monosaccharide và disaccharide, nitơ ở dạng acid amin, các muối

vô cơ, trừ dạng muối nitrit, nitrat, các vitamin và muối khoáng [4]

Ngoài ra, để tránh các vi khuẩn tạp nhiễm sử dụng nguồn dinh dưỡng trong môi trường lên men, có thể sử dụng các chất chống oxi hóa, tiêu diệt hoặc kìm hãm phát triển của vi khuẩn có hại Trên thế giới, người ta thường sử dụng Na2SO3 ở nồng độ thấp để ức chế các loại vi khuẩn có hại, đương nhiên chất này không có hại

cho sự phát triển của nấm men lên men rượu và cung cấp nguồn vi lượng cho nấm men từ chất này

1.7.6 Nồng độ CO 2 trong môi trường

CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường Một phần sẽ tồn tại trong môi trường; một phần tách lên trên bề mặt môi trường; phần còn lại tích tụ lại thành một lớp ngăn cách giữa không khí và môi trường CO2 tích tụ lại trong môi trường chỉ làm giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng không thể làm cho khả năng lên men của nấm men yếu đi

Trong môi trường có hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thoát ra ngoài, dẫn đến ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men có hiệu suất thấp CO2 nằm trong khoảng không giữa bề mặt môi trường và không khí có tác dụng kiềm chế sự phát triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại Do vậy, các thùng lên men phải có nút đặc biệt chỉ cho phép CO2 bay ra mà không cho không khí vào [4]

1.7.7 pH

Nồng độ ion H+ trong canh trường ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Mỗi vi sinh vật chỉ có thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định, trạng thái này phụ thuộc vào pH của canh trường

Trong điều kiện lên men ethanol, pH tối ưu để tạo ethanol là 4.5- 5.0 Nếu

pH thấp khoảng 3.0 - 4.0 nấm men còn hoạt động được và vi khuẩn bị ức chế pH hơi cao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm có độ chua thấp, sản phẩm dễ bị nhiễm khuẩn và các sản phẩm phụ trong quá trình lên men sẽ tạo nhiều hơn, lên men có hiệu suất

Đến sau 1930 thì Mỹ, Braxin, Anh, Pháp, Đức, Ý, Thuỵ Điển… đã bắt đầu

sử dụng Bio-Ethanol thay thế xăng Nhưng trào lưu này thực sự bùng nổ vào những năm 1970 khi nguồn nhiên liệu chính là dầu mỏ bị khủng hoảng nguồn cung

Cũng theo báo cáo trên thì 47 % bioethanol nhiên liệu trên thế giới được sản xuất từ mía đường, 53% là từ cây có chứa tinh bột (bắp, sắn lát và lúa mì) Sản lượng bioethanol sản xuất năm 2008 khoảng 65.7 tỷ lít Nhu cầu Bio-Ethanol nhiên liệu trên toàn thế giới vào năm 2015 sẽ cao gấp hơn 2 lần sản lượng năm 2006 (100

tỷ lít)

Trước đó, Braxin là quốc gia đứng đầu về sản xuất và tiêu thụ bioethanol Đến năm 2006, Mỹ vượt qua Braxin và trở thành nước sản xuất bioethanol nhiên liệu lớn nhất thế giới Các quốc gia sản xuất bioethanol lớn như Braxin, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ và Pháp chiếm 84% sản lượng bioethanol nhiên liệu của toàn thế giới trong năm 2005

Braxin: là nước đi đầu trên thế giới trong việc sản xuất bioethanol nhiên liệu

từ mật rỉ đường trong năm 2004 và đến năm 2008, Braxin đã sản xuất được 30 tỷ lít, chiếm 34 % sản lượng bioethanol toàn thế giới Trong giai đoạn 2012 – 2013, Braxin sẽ đạt được 37 tỷ lít/năm từ 728 tỷ rỉ đường Ở Braxin, tỉ lệ bioethanol pha trộn với xăng hóa thạch là 20% và 25% tương ứng với loại xăng E20 và E25 Nhóm các nước nhập khẩu bioethanol nhiên liệu từ Braxin là Mỹ, Ấn Độ, Hàn Quốc, Nhật Bản, Thụy Điển và Hà Lan [12]

Năm 2007, Mỹ đã vượt qua Braxin trở thành quốc gia lớn nhất thế giới về sản xuất bioethanol nhiên liệu từ nguồn nguyên liệu là ngô, chiếm 44 % sản lượng toàn thế giới Theo chương trình phát triển năng lượng quốc gia, Mỹ sẽ sản xuất 150

tỷ lít bioethanol vào năm 2030

Năm 2010, sản lượng bioethanol của EU là 341.250.000 lít chiếm 8% sản lượng thế giới Trong đó, Pháp là quốc gia sản xuất bioethanol nhiên liệu lớn nhất châu Âu (114 triệu lít, chiếm 33 %), Tây Ban Nha 47.8 triệu lít ( chiếm 14 %) và Đức 44.4 triệu lít ( chiếm 13 %)

Trung Quốc: là nước sản xuất bioethanol lớn nhất khu vực Châu Á, đứng thứ

ba trên thế giới, sản xuất ethanol từ ngô Năm 2005, tổng sản lượng bioethanol của quốc gia này xấp xỉ 3.8 tỷ lít (trong đó 1.3 tỷ lít là bioethanol nhiên liệu), chiếm gần

8 % sản lượng toàn thế giới

Các quốc gia khác đã có những thành tựu đáng kể trong việc sản xuất bioethanol đó là Ấn Độ, Thái Lan và một số quốc gia khác:

Ấn Độ: đây là quốc gia đứng thứ 2 ở châu Á về sản xuất bioethanol sau Trung Quốc, chiếm 4% sản lượng ethanol toàn cầu Năm 2005 sản lượng bioethanol của Ấn Độ là 1.7 tỷ lít, trong đó 200 triệu lít là bioethanol nhiên liệu

Thái Lan: là quốc gia Đông Nam Á đi tiên phong trong việc sản xuất bioethanol nhiên liệu Năm 2007, Thái Lan có 9 nhà máy sản xuất bioethanol nhiên liệu với tổng công suất gần 400 triệu lít/năm, trong khi đó chỉ có duy nhất nhà máy Thai Nguan sản xuất bioethanol từ sắn lát Dự kiến đến năm 2011, Thái Lan sẽ sản xuất khoảng 1 tỷ lít bioethanol nhiên liệu

Bảng 1.5 Tổng hợp về sản xuất ethanol trên thế giới [33]

Bảng 1.6 Sản xuất Ethanol tại Mỹ từ 1981 - 2010 [33]

Bảng 1.7 Tổng số nhà máy ethanol và công suất tại Mỹ qua các năm [33]

Hình 1.9 Sản lượng ethanol trên thế giới theo lĩnh vực qua các năm [33]

1.8.2 Tại Việt Nam

Ở Việt Nam bioethanol được sử dụng một phần trong công nghiệp, thực phẩm, thức uống và phần lớn được dùng làm nhiên liệu sinh học Tính đến tháng 4/2012, có 13 dự án sản xuất ethanol nhiên liệu, 5 nhà máy đã đi vào hoạt động với công suất thiết kế 490 triệu lít/năm Hiện nay một phần xăng được sử dụng ở các

thành phố lớn ở nước ta đều được pha bioethanol để được sản phẩm xăng sinh học E5 Đây là cơ hội tốt cho Việt Nam góp phần vào nỗ lực cải thiện đời sống nông thôn, xóa đói giảm nghèo và thu hẹp khoảng cách đời sống giữa nông thôn và thành thị Cho nên cần có một chính sách và quy hoạch quốc gia nhằm vừa hỗ trợ phát triển ngành sản xuất các loại nhiên liệu sinh học vừa tạo thêm việc làm ở nông thôn, tăng gia lợi tức nông dân và bảo đảm an ninh năng lượng trong nước Thế nhưng việc đưa xăng E5 ra thị trường còn nhiều trở ngại, lượng tiêu thụ trong thời gian qua

ở mức rất thấp Để có thể duy trì hoạt động, các doanh nghiệp sản xuất ethanol Việt Nam đang phải tìm đường xuất khẩu

Hình 1.10 Hai nhà máy công suất lớn quy mô lớn ở Việt Nam [34]

Bảng 1.8 Một số nhà máy sản xuất ethanol ở Việt Nam [34]

Tên nhà máy Công suất – Nguyên liệu

Nhà máy Ethanol Đại Lộc

– Quảng Nam

100 triệu lít/năm – Sắn Công ty Đồng Xanh

Nhà máy Ethanol Cư Dút

– Đắc Nông

50 triệu lít/năm –Rỉ đường

Công ty Đại Việt

Nhà máy Ethanol Tam

Nông – Phú Thọ

100 triệu lít/năm – Sắn, mía

Công ty PVB thuộc PV OIL

Nhà máy Ethanol Dung 100 triệu lít/năm – Sắn Nhà máy liên doanh Bình

Quất Sơn thuộc Petrovietnam

Năm 2008, B.C Akin-Osanaiye, H.C Nzelibe và A.S Agbaji, đã báo cáo đề tài “Sản xuất ethanol từ phụ phẩm của trái đu đủ” Sau quá trình trích ly enzyme papain để sản xuất các loại thuốc hỗ trợ tiêu hóa thức ăn giàu protein ở người thì

những phần còn lại sẽ được lên men bằng Saccharomyces cerevisiae trong thời gian

72 giờ, nhiệt độ 300C Kết quả đạt độ cồn từ 2.82 – 6.60% theo thể tích [9]

Năm 2009, Simone Brethauer, Charles E Wyman*

đã báo cáo nghiên cứu

“Tổng quan: Phương pháp thủy phân và lên men liên tục cho sản xuất ethanol từ nguyên liệu cellulose” [27]

Năm 2011, Hossain, A B M S.1, Ahmed, S A, Ahmed M Alshammari, Faris M A Adnan, Annuar, Hadeel Mustafa1 và Norah Hammad, đã báo cáo nghiên cứu “ Sản xuất nhiên liệu bioethanol từ phụ phẩm vỏ chuối để quản lý chất thải và phát triển nguồn năng lượng bền vững” Đề tài đã tiến hành thủy phân nguyên liệu bằng sự kết hợp giữa cellulase và pectinase Kết quả lên men bằng

Saccharomyces cerevisiae cho độ cồn từ 4.1 tới 7.1% bioethanol [13]

Năm 2011, Othman Abd Samah, Salihan Sias, Yeap Geok Hua & Nurul Nadiah Hussin, đã báo cáo đề tài “Sản xuất ethanol từ sản phẩm thủy phân vỏ cacao” Theo báo cáo, hiệu suất tạo ethanol đạt 17.3% v/v trong 26 giờ lên men Với phần trăm cồn đạt cao như vậy, nghiên cứu sẽ trở thành thiết thực trong việc sản xuất ethanol từ vỏ cacao – là phụ phẩm của ngành chế biến bột cacao, góp phần

xử lý phụ phẩm để bảo vệ môi trường [22]

Năm 2011, Kulanthaivel Senthilguru, Tanya Susan George, Narasinganallur Sankaranarayanan Vasanthi và Kilavan Packiam Kannan, đã báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài “ Sản xuất bioethanol từ nguồn lignocellulose phụ phẩm” Đề tài tiến

hành tiền xử lý nguyên liệu để tăng hiệu quả thủy phân của enzyme trong giai đoạn thủy phân cellulose tạo ra đường Đồng thời kết hợp với sử dụng loài nấm Phoma

Sp Kết quả thu được 2.4% (v/w) cho 100 gram nguyên liệu lignocellulose [17]

Năm 2011, Razif Harun, Michael K Danquah đã báo cáo nghiên cứu “Ảnh hưởng của acid trong giai đoạn tiền xử lý sinh khối từ vi tảo cho sản xuất ethanol sinh học” Kết quả cho thấy nồng độ ethanol sinh học thu được cao nhất là 7.2 g/L khi bước tiền xử lý được thực hiện với 15 g/L vi tảo ở 140 o

C sử dụng 1 % (v/v) acid sulfuric trong 30 phút Về sản lượng ethanol, tối đa khoảng 52% khối lượng (g ethanol/ g tảo) thu được bằng cách sử dụng 10 g/L vi tảo và 3 % (v/v) acid sulfuric

ở 160 o

C trong 15 phút Phân tích thống kê cho thấy trong số các thông số khảo sát thì nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất trong quá trình sử dụng acid trong tiền xử lý vi tảo để sản xuất ethanol sinh học [24]

Năm 2012, Aloia Romaní, Gil Garrote, Juan Carlos Parajó đã báo cáo nghiên

cứu “Sản xuất ethanol sinh học từ gỗ bạch đàn globulus tự phân bằng phương pháp

đường hóa và lên men đồng thời” Kết quả tạo ra được 291 L ethanol/1000 kg gỗ khô từ cellulose trong đó chủ yếu chứa phần lớn là lignin [7]

Năm 2012, María Boluda-Aguilar, Antonio López-Gómez, đã báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài “Quá trình sản xuất bioethanol từ quá trình lên men vỏ cam chanh được tiền xử lý bằng phương pháp nổ hơi nước” Trong vỏ cam chanh có chứa nhiều D – limonene (0.8 – 1.6%) là chất ức chế hoạt động của nấm men Nên

đề tài áp dụng phương pháp nổ hơi nước vỏ cam chanh để giảm hàm lượng D – limonene xuống còn 0.05% Sau quá trình lên men, lượng cồn thu được 60 lít/1000

kg vỏ cam chanh tươi [20]

Tại Rio de Janeriro (Brazil), Elba P.S Bon và Maria Antoniete Ferrara đã tiến hành nghiên cứu quá trình sản xuất bioethanol từ sinh khối bằng cách thủy phân bởi enzyme [10] Đặc biệt gần đây tại Sao Paulo ( Brazil), nhóm nghiên cứu gồm Marcia A Ribeiro, Vanessa M Cardoso, Manoel N Mori, Jaime Finguerut, Celia

M A Galvao và Celina L Duarte đã tiến hành nghiên cứu tận dụng nguồn bã mía

để sản xuất bioethanol dùng phương pháp tiền xử lí bằng chiếu xạ điện tử [25]

1.9.2 Ở Việt Nam

Năm 2008, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ” của tác giả Trần Diệu Lý [2] bằng cách sử dụng rơm rạ cắt nhỏ và được tiền xử lý bằng phương pháp nổ hơi để phá vỡ cấu trúc Sau đó được tiến hành thủy phân bằng enzyme cellulase hoặc thủy phân và lên men đồng thời bằng enzyme cellulase và

nấm men Saccharomyces cerevisiae chủng turbo yeast extra Kết quả cho thấy rằng,

quá trình thủy phân diễn ra tốt nhất trong điều kiện: 11 % bã rắn, 5 % enzyme,

50 0C và pH 4.8, tương ứng nồng độ glucose thu được là 55.08 g/l và hiệu suất đạt

81 % Quá trình thủy phân và lên men đồng thời đạt được kết quả tốt ở 11 % bã rắn,

5 % enzyme, 23.6 triệu tế bào nấm men/ml, 500C và pH 4.8 Quá trình này thu được 30.86 g/l ethanol tương ứng hiệu suất là 86.61 % Kết quả này cho thấy quá trình thủy phân và lên men đồng thời rất thích hợp cho việc sản xuất ethanol từ rơm rạ

Năm 2011, Võ Thành Trung, Lê Như Hậu, Nguyễn Thanh Hằng, đã báo cáo

kết quả đề tài “ Nghiên cứu điều kiện thủy phân rong lông cứng (Cladophora Socialis Kutzing) ứng dụng trong sản xuất cồn” Với hàm lượng carbohydrate cao

nên rất thuận lợi để thủy phân tạo ra một lượng đường lớn cung cấp cho nấm men sinh ra lượng cồn cao Khi lên men 200 ml dịch đường sau quá trình thủy bằng

Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện 300C trong 72 giờ, thu được 50 ml dịch

bay hơi đầu tiên từ quá trình chưng cất đạt độ cồn 5% Cladophora Socialis Kutzing

dễ dàng bị thủy phân và lên men tạo ethanol hứa hẹn là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất bioethanol [5]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài: từ 18/02 - 18/04/2013

Địa điểm: PTN trọng điểm CNHH và Dầu khí - trường ĐH Bách Khoa TPHCM

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành trên vỏ trái Cacao được trồng ở Tiền Giang

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Nguyên vật liệu

Vỏ cacao: Hợp tác xã cacao Tiền Giang cung cấp

Enzyme: enzyme được sử dụng là cellulase – pectinase

Hóa chất: các loại hóa chất thí nghiệm có nguồn gốc từ Trung Quốc

Danh mục các hóa chất được sử dụng:

2.3.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

Thiết bị dùng trong nghiên cứu:

- Nồi hấp tiệt trùng Autoclave

2.4.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát giá trị dinh dƣỡng nguyên liệu vỏ Cacao

Nội dung 1: Độ ẩm được xác định bằng phương pháp trọng tài

Nội dung 2: Độ tro toàn phần được xác định bằng cách nung ở nhiệt độ cao

Nội dung 3: Độ acid toàn phần được xác định bằng cách chuẩn độ với dung dịch kiềm với thuốc thử phenolphtalein

Nội dung 4: Đường khử được xác định theo phương pháp dinitrosalisylic DNS Nội dung 5: Định lượng hàm lượng cellulose

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo

2.4.2 Thí nghiệm 2 Tiền xử lý nguyên liệu

Việc tiền xử lý nguyên liệu có ý nghĩa rất quan trọng Điều này ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình lên men

Nội dung 1 Tiền xử lý bằng dung dịch NaOH