Xác định một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa nuôi tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang (Luận văn thạc sĩ)

Xác định một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa nuôi tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang (Luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa nuôi tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang (Luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa nuôi tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang (Luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa nuôi tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang (Luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa nuôi tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang (Luận văn thạc sĩ)Xác định một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa nuôi tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang (Luận văn thạc sĩ)

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA

VI KHUẨN SALMONELLA GÂY BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN

Ở LỢN SAU CAI SỮA NUÔI TẠI HUYỆN HIỆP HÒA,

TỈNH BẮC GIANG

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ THÙY LINH

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA

VI KHUẨN SALMONELLA GÂY BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN

Ở LỢN SAU CAI SỮA NUÔI TẠI HUYỆN HIỆP HÒA,

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do các nhân tôi trực tiếp thực hiện cùng với các đồng nghiệp tại Bộ môn Vệ sinh- Viện Thú y Quốc gia Mẫu vật thu thập tại các trang trại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang; các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong Luận văn là trung thực, chính xác, chưa được công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan mọi thông tin trích dẫn trong Luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc Mọi sự giúp đỡ để hoàn thành Luận văn đều đã được cảm ơn

Thái Nguyên, ngày tháng 10 năm 2017

TÁC GIẢ

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực tập và thực hiện đề tài này, tôi đã nhận được sự quan tâm, chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè

và sự động viên khích lệ của gia đình Nhân dịp này, tôi xin được bày tỏ lòng biết

ơn sâu sắc tới:

Thầy giáo PGS TS Đặng Xuân Bình đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi hết

sức tận tình trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành Luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, Ban chủ nhiệm khoa và các thầy cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn tới các chủ trang trại trên địa bàn huyện Hiệp Hòa đã tạo điều kiện cho tôi lấy mẫu thực hiện đề tài

Xin trân trọng cảm ơn bộ môn Vệ sinh - Viện Thú y Quốc gia đã giúp đỡ tôi trong quá trình xét nghiệm mẫu và thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc về sự ủng hộ, động viên, giúp

đỡ của gia đinh, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành tốt Luận văn này

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

3.1 Ý nghĩa khoa học 3

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Cơ sở lý luận của đề tài 4

1.1.1 Vi khuẩn Salmonella 4

1.1.2 Khả năng xâm nhập của vi khuẩn Salmonella 13

1.2 Bệnh Phó thương hàn ở lợn 14

1.2.1 Đặc điểm dịch tễ 14

1.2.2 Mầm bệnh 14

1.2.3 Triệu chứng 15

1.2.4 Bệnh tích 16

1.3 Biện pháp phòng, trị bệnh do Salmonella gây ra ở lợn 17

1.3.1 Phòng bệnh 17

1.3.2 Điều trị bệnh 17

1.4 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra 18

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 18

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước 20

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng, vật liệu 23

2.1.1 Đối tượng 23

2.1.2 Vật liệu dùng trong nghiên cứu 23

2.2 Phạm vi nghiên cứu 23

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 24

2.2.2 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2016 đến tháng 7/2017 24

2.3 Nội dung nghiên cứu 24

2.3.1 Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản và lợn con 24

2.3.2 Tình hình bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 24

2.4.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong phân lợn 25

2.4.3 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella 25

2.4.4 Phương pháp giám định vi khuẩn Salmonella phân lập được 27

2.4.5 Xác định gen sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR 27

2.4.6 Xác định độc lực của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 29

2.4.7 Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập được 30

2.4.8 Phương pháp xử lý số liệu 30

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản và lợn con 31

3.1.1 Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản 31

3.1.2 Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo lứa đẻ 33

3.1.3 Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo mùa 36

3.1.4 Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn con 39

3.1.5 Biến động về số lượng vi khuẩn Salmonella thải trừ qua phân ở lợn con sau cai sữa 42

3.2 Kết quả xác định bệnh Phó thương hàn ở lợn con 44

3.2.1 Một số đặc điểm dịch tễ bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa 44

3.2.2 Phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu bệnh phẩm lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy 46

3.2.3 Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella phân lập được 48

3.2.4 Độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được 49

3.2.5 Xác định serotype của vi khuẩn Salmonella phân lập được 50

3.2.6 Xác định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được 52

3.2.7 Xác định tính kháng thuốc với một số loại kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn Salmonella phân lập được 54

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58

1 Kết luận 58

2 Đề nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA CHO ĐỀ TÀI 70

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo địa điểm và cá thể 31

Bảng 3.2 Thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo lứa đẻ 34

Bảng 3.3 Thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo mùa 37

Bảng 3.4 Thải trừ Salmonella ở lợn con trước và sau cai sữa 40

Bảng 3.5 Biến động số lượng vi khuẩn Salmonella thải trừ ở lợn con sau cai sữa 43

Bảng 3.6 Tình hình bệnh Phó thương hàn ở lợn con sau cai sữa 44

Bảng 3.7 Phân lập vi khuẩn Salmonella từ bệnh phẩm lợn con sau cai sữa bị Phó thương hàn 46

Bảng 3.8 Đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella phân lập được 48

Bảng 3.9 Độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được 49

Bảng 3.10 Serotype của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ bệnh phẩm lợn Phó thương hàn 50

Bảng 3.11 Tần xuất phát hiện gen mã hóa sản sinh yếu tố gây bệnh Stn, fimA, InvA của vi khuẩn Salmonella gây bệnh Phó thương hàn ở lợn con sau cai sữa 52

Bảng 3.12 Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập được 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1: Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella từ các mẫu

bệnh phẩm và phân 26

Hình 2.2: Chu trình phản ứng PCR đối với Salmonella để tách ADN tổng số 29

Hình 3.1: Thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo cá thể 32

Hình 3.2 Tỷ lệ thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo lứa đẻ 35

Hình 3.3 Tỷ lệ Thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo mùa 38

Hình 3.4: Tình hình bệnh Phó thương hàn ở lợn con sau cai sữa 45

Hình 3.5 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella từ bệnh phẩm lợn con sau cai sữa bị Phó thương hàn 47

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, nền kinh tế nước ta đã và đang có những bước phát triển vượt bậc về mọi mặt, đời sống kinh tế xã hội ngày càng được cải thiện Đóng góp một phần không nhỏ cho sự thành công đó phải kể đến các thành tựu của ngành nông nghiệp, trong đó có ngành chăn nuôi thú y mà đặc biệt là ngành chăn nuôi lợn Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm trong nước

và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ Theo CIRAD (2006) [40], thịt lợn chiếm 77% tổng lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam

Tuy nhiên, một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm chất lượng con giống hoặc nhiễm vào sản phẩm thịt lợn gây nguy cơ mất

an toàn vệ sinh thực phẩm Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh

tiêu chảy do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn sau cai sữa, còn gọi là bệnh Phó

thương hàn tuy không xảy ra thành dịch lớn, nhưng với đặc điểm dịch tễ hết sức phức tạp, đã và đang gây nên những thiệt hại đáng kể cho người chăn nuôi Có thể nói rằng ở bất kỳ một cơ sở chăn nuôi nào dù quy mô lớn hay nhỏ đều xuất hiện bệnh này

Khi đời sống của nhân dân ngày càng được nâng cao, vấn đề an toàn

thực phẩm trong đó có lợn và thịt lợn sạch bệnh, không bị nhiễm Salmonella là

một yêu cầu cấp thiết Có rất nhiều tác giả đã công bố rằng sự nhiễm

Salmonella vào thân thịt lợn trong quá trình giết mổ chủ yếu liên quan đến sự

nhiễm trùng Salmonella ở ruột (Arunava Das và cs, 2012 [33]; Cheng-Hsun

Chiu và cs, 2004 [37]) Do đó, việc giảm tỷ lệ các trại bị nhiễm mầm bệnh

Salmonella sẽ làm sự an toàn thịt lợn tăng lên Mục tiêu của các nhà khoa học,

nhà sản xuất là xây dựng các đàn gia súc sạch Salmonella

Nhìn chung vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra ở lợn đã được rất

nhiều các nhà vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm Ở Việt Nam đã có một số

công trình nghiên cứu về Salmonella và bệnh do chúng gây ra ở lợn như: Nguyễn

Thị Nội và cs (1989) [18]; Lê Văn Tạo và cs (1993) [23]; Trần Xuân Hạnh (1995) [14]; Cù Hữu Phú và cs (2000) [20]; Đỗ Trung Cứ (2004) [10]

Mặc dù đã được nghiên cứu từ trên 100 năm nhưng đến nay, nhiễm khuẩn

Salmonella ở động vật và người vẫn tiếp tục được nghiên cứu vì những vấn đề dịch

tễ nghiêm trọng có tính chất toàn cầu, ước tính hằng năm trên thế gới có khoảng

155.000 người chết bởi Salmonellaosis và ngộ độc thực phẩm (Patchanee P và cs,

2008 [55]; Evangelopoulou G và cs, 2015 [44])

Có thể nhận thấy, Salmonella nhiễm trên lợn nói chung có liên quan đến hai

vấn đề, thứ nhất là tác nhân gây bệnh cho lợn, và thứ hai là gây ngộ độc thực phẩm cho người (Lo Fo Wong, 2002 [53]) Ngoài ra, lợn còn được coi là yếu tố nguồn

bệnh, mang trùng và bài xuất mầm bệnh Salmonella có độc lực, tạo nguy cơ cao gây

bệnh cho gia súc, gia cầm; gây bệnh và gây ngộ độc thực phẩm cho con người (Patchanee P và cs, 2008 [55]; Steven A Carlson và cs, 2012 [61])

Đến tháng 12 năm 2016, huyện Hiệp Hòa, Bắc Giang có 97 trang trại và hơn

220 gia trại chăn nuôi gia súc, gia cầm Trong đó, có 25 trang trại nuôi lợn nái ngoại sinh sản có quy mô từ 50 con trở lên; có trên 150 gia trại nuôi lợn thịt có quy mô từ

100 con trở lên Cùng đó, trên địa bàn huyện đã xuất hiện nhiều hộ chăn nuôi gia cầm theo hướng chuyên trứng, thịt, con giống với quy mô hàng nghìn con

Việc nghiên cứu, xác định vi khuẩn Salmonella nhiễm trên lợn nái sinh

sản, lợn con sau cai sữa (Lợn khỏe và lợn bị bệnh tiêu chảy) để bổ sung tư liệu khoa học về sự lưu hành của căn bệnh (etiology), từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới về chẩn đoán đề xuất biện pháp khống chế hiệu quả tình trạng mang và thải

trừ vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho vật nuôi và gây bệnh và gây ngộ độc thực

phẩm cho người

Vì vậy mà việc phân lập vi khuẩn Salmonella, xác định serotyp và các đặc

tính gây bệnh của chúng ở lợn, nhằm mục đích phát hiện sớm và tìm ra hướng phòng và trị bệnh có hiệu quả luôn là những việc làm cấp thiết Xuất phát từ thực

tiễn nghiên cứu và yêu cầu của sản xuất, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“Xác

định một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa nuôi tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang"

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ về hiện tượng mang trùng, thải trừ mầm bệnh

và bệnh Phó thương hàn do vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn sau cai sữa nuôi tại

huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang

- Xác định yếu tố gây bệnh là độc tố do vi khuẩn Salmonella phân lập được

- Xác định đặc tính kháng thuốc của Salmonella phân lập được với một số

loại kháng sinh và hóa dược

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Bổ sung tư liệu khoa học về đặc điểm dịch tễ bệnh, tình hình mang trùng

mầm bệnh và vai trò của vi khuẩn Salmonella trong bệnh Phó thương hàn ở lợn sau

cai sữa nuôi tại huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang

- Cung cấp tư liệu khoa học về yếu tố gây bệnh là độc tố do vi khuẩn

Salmonella phân lập được sản sinh

- Bổ sung tư liệu khoa học về đặc tính kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella

phân lập được

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả của đề tài có thể được áp dụng vào thực tiễn sản xuất, đồng thời khuyến cáo người chăn nuôi xây dựng kế hoạch phòng, trị bệnh Phó thương hàn do

vi khuẩn Salmonella gây ra ở lợn sau cai sữa, hạn chế thiệt hại, góp phần nâng cao

năng suất, hiệu quả chăn nuôi

- Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn

Salmonella phân lập được giúp cho các cơ sở chăn nuôi lợn tham khảo, xây dựng

phác đồ điều trị phù hợp bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa; làm giảm tỷ lệ chết, hạn chế lợn còi cọc, giảm tiêu tốn thức ăn và chi phí thuốc thú y, góp phần nâng cao hiệu quả chăn nuôi

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở lý luận của đề tài

1.1.1 Vi khuẩn Salmonella

1.1.1.1 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Salmonella

Trực khuẩn Salmonella thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) Giống Salmonella gồm 2 loài: S enterica và S bongori đã được

phân chia thành trên 2000 serotyp theo bảng phân loại Kauffmann-White trên cơ sở cấu trúc của kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H và đôi khi các kháng nguyên

vỏ (kháng nguyên K)

Salmonella được Salmon và Smith phân lập đầu tiên vào năm 1886 (Steven A

Carlson và cs, 2012 [61]), vi khuẩn cư trú trong đường ruột của cả động vật máu

nóng và máu lạnh Với số lượng hơn 2400 serotype khác nhau, Salmonella được xác

định gây ra nhiều bệnh cho người và động vật Mặc dù đã được nghiên cứu từ trên

100 năm nhưng đến nay, nhiễm khuẩn Salmonella ở động vật và người vẫn tiếp tục

được nghiên cứu vì những vấn đề dịch tễ nghiêm trọng có tính chất toàn cầu, ước tính

hằng năm trên thế giới có khoảng 155.000 người chết bởi Salmonellosis và ngộ độc

thực phẩm (Patchanee P và cs, 2008 [55]; Evangelopoulou G và cs, 2015 [44])

Qua kiểm tra đặc tính sinh hoá của 31 chủng Salmonella đều lên men sinh

hơi các đường glucose, mantol, sorbitol, dextrose, galactose, manitol, arabinose,

nhưng không lên men đường lactose, sucrose Tất cả các chủng Salmonella phân lập

đều không sinh Indol, phản ứng oxidaza âm tính, catalaze dương tính, 100% số chủng có khả năng di động, 74,09% các chủng sinh H2S (Nguyễn Mạnh Phương và

cs, 2012 [20])

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái

Vi khuẩn Salmonella là những trực khuẩn ngắn, hình gậy ngắn, hai đầu

tròn, có kích thước 0,4-0,6 x 1,0-3,0 µm, không hình thành nha bào và giáp mô Đa

số loài Salmonella có lông (flagella) từ 7-12 chiếc xung quanh thân (trừ S

gallinarum-pullorum không có lông) Vi khuẩn dễ nhuộm với thuốc nhuộm, bắt màu

Gram âm đều toàn thân hoặc hơi đậm ở hai đầu (Nguyễn Như Thanh, 2001) [26]

Hình ảnh vi khuẩn Salmonella

Theo Lê Văn Tạo (1993) [23] thời gian gần đây nhờ kính hiển vi điện tử, bằng phương pháp nhuộm của Haschem (1972) người ta phát hiện trên bề mặt vi

khuẩn Salmonella ngoài lông còn có các cấu trúc Fimbriae Đây là một cấu trúc

ngắn hơn lông vi khuẩn, thường có kết cấu hình xoắn, được mọc lên từ một hạt gốc nằm trên thành tế bào, có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử có độ phóng đại từ 6.500 lần trở lên Trên mỗi tế bào vi khuẩn có từ 2 - 400 Fimbriae, với hai chức năng là giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột non để gây bệnh

và liên kết với nhau để trao đổi thông tin di truyền bằng hình thức tiếp hợp, di truyền ngang

1.1.1.4 Tính chất nuôi cấy

Salmonella là những vi khuẩn sống hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, phát

triển trên các môi trường thông thường Có rất nhiều loại môi trường dinh dưỡng

chọn lọc được dùng trong phân lập Salmonella, hiện nay thường dùng các loại như

môi trường bồi dưỡng (tăng sinh) Buffered Pepton Water (BPW), môi trường tăng sinh chọn lọc đặc hiệu là Tetrathionate hay còn gọi là môi trường Mueller- Kauffmann và Rappaport Vassiliadis (RV) Các loại môi trường thạch dùng để nhận

dạng các khuẩn lạc Salmonella cũng như kiểm tra một số đặc tính sinh hoá bao gồm

Brilliant Green Agar (BGA), Bismuth Sulfite Agar (BSA), Triple Sugar Ion (TSI), Xylose Lysine Deroxycholate (XLD), Xylose Lysine Tetrathionate 4 (XLT4), Modified Semisolid Rappaport Vassiliadis (MSRV), Rambach, Kligler

Trên môi trường MacConkey (MacC) vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn,

không màu Trên môi trường BSA Salmonella mọc những khuẩn lạc đặc trưng xung

quanh màu nâu sẫm, giữa màu vàng đậm, gần đen, khuẩn lạc có màu ánh kim (Timoney và cs, 1988) [64]

Trên môi trường thạch thường vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng S (Smooth) tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, rìa gọn, hơi lồi ở giữa, đường kính khoảng từ 1 - 1,5 mm, thỉnh thoảng có thể thấy khuẩn lạc dạng R (rough), nhám, mặt trong mờ Môi trường thạch máu, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, màu xám, trơn bóng, ở giữa hơi lồi lên (Nguyễn Như Thanh, 2001) [26]

Trên môi trường XLD, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc có kích thước trung bình màu đen

Trên môi trường Rambach, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc trung bình, màu đỏ tím, bóng

Trên môi trường XLT4, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trung bình, màu đen, bóng, hơi lồi giống như khuẩn lạc mọc trên môi trường XLD, tuy nhiên khả năng ức chế tạp khuẩn của XLT4 tốt hơn XLD

Đào Thị Thanh Thủy (2012) [30] cho biết: Salmonella sống hiếu khí hoặc yếm

khí tuỳ tiện, dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường Nhiệt độ thích hợp

370C (sống được ở nhiệt độ từ 7 - 450C), pH = 7,2 - 7,4 (tồn tại được ở pH = 5,0)

- Môi trường thạch thường: Hình thành những khuẩn lạc dạng S, trơn, tròn

sáng, bóng, màu trắng đục

- Môi trường thạch nghiêng Triple Sugar Iron agar (TSI agar): Sinh H2S ở phần thạch nghiêng

- Môi trường MacConkey agar: Khuẩn lạc dạng S, màu trắng

- Chuyển hoá đường: Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số loại

đường và không đổi Salmonella lên men sinh hơi sản sinh axit đường glucoza, mannoza, sorbitol, mannit Tất cả các loài Salmonella đều không lên men đường

lactoza và saccaroza

1.1.1.5 Đặc tính sinh hóa

Theo Nguyễn Quang Tuyên (2008) [30] đặc tính chung của Salmonella là không lên men đường lactose Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số đường nhất định và không đổi Phần lớn các loài Salmonella lên men có sinh hơi đường glucoza, mannit, mantoza, galactoza, levuloza, arabinoza Một số loài như S

abortus equi, S abortus bovis, S abortus ovis, S typhi, S typhisuis, S cholerae suis, S gallinarum, S enteritidis cũng lên men các đường nhưng không sinh hơi

Riêng S pullorum không lên men mantoza, S cholerae suis không men arabinoza Tất cả các vi khuẩn Salmonella đều không lên men lactoza, saccaroza

Salmonella có những đặc tính sinh hóa chủ yếu mà dựa vào đó người ta có

thể định hướng phân biệt với các vi khuẩn đường ruột khác Các chủng Salmonella

sinh acid do lên men glucose, mannitol, dulcitol nhưng không lên men lactose (trừ

S arizona) và sucrose, không có khả năng tách amine từ trytophan Chúng không

sinh indol hoặc acetoin và phân giải urea Phần lớn các chủng sinh hydrogen sulfide

(H2S) và tách carboxyl (de-carboxylate) từ ornithine và lysine Chúng kém chịu nhiệt nhưng chịu được một số hóa chất như brilliant green, sodium lauryl sulfite, selenite, sodium tetrathionate Những chất này được dùng để chọn lọc chúng từ mẫu

thực phẩm và nước (Đào Thị Thanh Thủy, 2012) [28]

1.1.1.6 Sức đề kháng

Salmonella tồn tại trong đường tiêu hoá của cả động vật máu nóng và máu lạnh

(các loài cá, động vật thủy sản), trong môi trường tự nhiên, phân, đất, nước thải, đặc biệt trong thực phẩm có nguồn gốc động vật như bột thịt xương, bột trứng, bột cá… tồn

tại được 9 tháng hoặc lâu hơn Salmonella sống trong thịt ướp muối 29% được 4 - 8

tháng ở nhiệt độ 6 - 12 0C (Đào Thị Thanh Thủy, 2012) [28]

- Với nhiệt độ, vi khuẩn có sức đề kháng yếu, 500C bị diệt sau 1h, 700C trong

20 phút, sôi 1000C sau 5 phút, khử trùng bằng phương pháp Pasteur cũng diệt được

vi khuẩn (Đào Thị Xuân, 2014) [31]

- Ánh sáng mặt trời diệt khuẩn trong môi trường nước, sau 5h ở nước trong

và 9h ở nước đục

- Các chất sát trùng thông thường diệt vi khuẩn dễ dàng: Axit phenic 5%, formol 0,5% diệt khuẩn sau 15 - 20 phút (Nguyễn Quang Tuyên, 2008) [30]

1.1.1.7 Đặc điểm dịch tễ học của Salmonella

Salmonella phân tán, lây lan nhanh, rộng rãi hơn ta tưởng Chỉ cần 1 con

trong đàn bị ỉa chảy do Salmonella gây ra thì 24 giờ sau đó cả đàn đã bị lây nhiễm mầm bệnh Trong quá trình xảy ra dịch bệnh, vi khuẩn Salmonella cũng được tìm

thấy ở khắp mọi nơi như chuồng trại, rác rưởi, thức ăn, nước uống

Nguồn cảm nhiễm chính là tất cả lợn trưởng thành mang trùng Vi khuẩn

Salmonella sống hoại sinh trong cơ thể lợn khỏe từ 25 - 50% lợn khỏe mang trùng

Lợn khỏi bệnh là vật mang trùng và bài tiết vi trùng ra ngoài theo phân Cũng như

hầu hết các loài vi khuẩn khác, Salmonella không gây bệnh một cách đơn độc, mà

bệnh xảy ra thường là kết quả của sự hội tụ nhiều yếu tố (Phan Thanh Phượng, 1988) [21]

Lợn con trước cai sữa bệnh ít xảy ra, bởi chúng được bảo hộ qua sữa đầu Song nguy cơ xảy ra bệnh tăng dần theo lứa tuổi, đặc biệt là sau cai sữa, khi mà khả năng miễn dịch chủ động chưa thể bù đắp kịp thời để thay thế miễn dịch thụ động Khi xuất lợn đi có nghĩa xuất theo mầm bệnh Ở lợn mắc bệnh Phó thương hàn thể cấp tính gây

nhiễm trùng huyết, rối loạn sinh sản là do S choleraesuis var kunzendorf gây ra Thể

bệnh này có thể lưu hành ở trang trại từ đời này sang đời khác theo phương thức

“truyền dọc” từ mẹ sang con Thể bệnh viêm ruột, ỉa chảy mãn tính ở lợn chủ yếu là do

S typhimurium gây ra Song loài vi khuẩn này lại lây truyền theo phương thức “truyền

ngang” từ lợn này sang lợn khác trong đàn

Salmonella khó sinh sản trong nước thường nhưng có thể tồn tại 1 tuần;

trong nước đá có thể sống 2 - 3 tháng Trong xác động vật chết chôn ở bùn, cát có

thể sống 2 - 3 tháng Trong thịt ướp muối (nồng độ muối 29%) Salmonella có thể

sống được 4 - 8 tháng ở nhiệt độ từ 8 - 120C (Nguyễn Như Thanh, 2001) [26]

Theo các tác giả Phan Thanh Phượng (1988) [21]; Nguyễn Như Thanh

(2001) [26] khi nghiên cứu về đường nhiễm Salmonella đều cho rằng: vi khuẩn

Salmonella theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hoá và có thể do tiếp xúc Bình

thường, chúng sống trong ống tiêu hoá mà không gây bệnh Chỉ khi nào sức đề kháng của lợn giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào máu và nội tạng gây bệnh Bệnh Phó thương hàn chỉ gây thành dịch địa phương, dịch bệnh phụ thuộc vào cơ cấu đàn, tình hình vệ sinh thú y, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng và đặc điểm dịch tễ học của cơ sở đó

Cần phân biệt 4 loại kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella là:

Kháng nguyên O (O-Antigen): kháng nguyên thân

Kháng nguyên H (H-Antigen): kháng nguyên lông

Kháng nguyên K (K-Antigen): kháng nguyên vỏ

Kháng nguyên F (Fimbriae Antigen): kháng nguyên Pili

Trong đó kháng nguyên có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán là kháng nguyên thân (O - Antigen) và kháng nguyên lông (H - Antigen)

a) Kháng nguyên O

Kháng nguyên O - Lypopolysacharide (LPS) là một thành phần cơ bản tạo

nên màng ngoài của thành phần tế bào vi khuẩn LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt: vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipid A

Kháng nguyên - O là loại kháng nguyên chịu nhiệt, có thể chịu được 100oC trong nhiều giờ, chịu được cồn và HCl ở nồng độ 1N trong 20 giờ

O –Specific

(vùng ưa nước)

Core (vùng lõi)

Vùng lipit

A

Kháng nguyên - O không phải là độc tố nhưng là yếu tố gây bệnh của vi khuẩn, giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của cơ thể, chống lại hiện tượng thực bào

b) Kháng nguyên H

Kháng nguyên - H của Salmonella bản chất là một protein nằm trong phần

lông của vi khuẩn Kháng nguyên - H không chịu nhiệt, rất kém bền vững so với kháng nguyên - O; bị phá huỷ ở 600C trong 1 giờ, dễ bị phá hủy bởi cồn và axit yếu

Kháng nguyên - H không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, nhưng có ý nghĩa trong việc phân loại, định danh vi khuẩn Không quyết định yếu

tố độc lực, không có vai trò bám dính, nhưng có tác dụng bảo vệ vi khuẩn đường ruột tránh sự tiêu diệt của đại thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong tế bào gan, thận và ngay cả trong đại thực bào

d) Kháng nguyên pili (KN - Pili) - Fimbriae antigen

Kháng nguyên Pili của vi khuẩn Salmonella nằm trong cấu trúc Fimbriae

nên còn gọi là kháng nguyên - F Nó có chức năng giúp vi khuẩn bám dính vào tế

bào nhung mao ruột Theo Lê Văn Tạo (1993) [23] kháng nguyên Fimbriae của

Salmonella thuộc type I (CFA/I) có khả năng ngưng kết hồng cầu gà, chuột lang

Kháng nguyên - Pili bản chất là protein, thành phần và trật tự các amino axit của mỗi kháng nguyên đều có những điểm khác biệt Đến nay, một số nhóm kháng

nguyên pili của Salmonella đã phát hiện gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật là

Colonization Factor Antigen (CFA) I và II (Trần Quang Diên, 2002 [12])

1.1.1.9 Các yếu tố gây bệnh của Salmonella

a) Các yếu tố không phải là độc tố

Kháng nguyên K: tạo hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào (Nguyễn Như Thanh, 2001) [26]

+ Yếu tố bám dính:

Khả năng bám dính của vi khuẩn là yếu tố gây bệnh quan trọng, là bước đầu tiên của quá trình gây bệnh của vi khuẩn đường ruột, đó là quá trình liên kết vững chắc giữa bề mặt của vi khuẩn với bề mặt của tế bào vật chủ: Trước hết, vi khuẩn liên kết với từng phần của bề mặt tế bào; tiếp theo là quá trình hấp phụ và cuối cùng

là quá trình tương tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn (đó là phân tử Fimbriae

type I) với điểm tiếp nhận trên bề mặt của tế bào (Nguyễn Như Thanh, 2001 [286)

+ Khả năng xâm nhập:

Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác động làm tăng hàm

lượng Ca++ nội bào, hoạt hóa actin depolimeriring enzymes, làm thay đổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến đổi màng tế bào, dẫn đến hình thành giả túc bao vây tế

bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn Sau đó, Salmonella được

xâm nhập vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục phát triển nhân lên với số lượng lớn và phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh enterotoxin, làm xuất hiện quá trình tiêu chảy của vật chủ Các hạch viêm tích nước, biểu hiện viêm hạch có thể là hệ quả của đáp ứng

xâm nhiễm của Salmonella

+ Khả năng kháng kháng sinh:

Việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc kháng sinh để phòng, trị bệnh, kích thích tăng trưởng gia súc, gia cầm, xử lý môi trường… đã tạo ra nhiều giống vi khuẩn

có khả năng kháng thuốc, giúp vi khuẩn tồn tại rất lâu trong cơ thể người, vật nuôi và môi trường

Khả năng kháng kháng sinh của Salmonella có thể thay đổi, phụ thuộc vào

địa phương và thời điểm làm kháng sinh đồ, loại vật nuôi

b) Các yếu tố là độc tố của vi khuẩn Salmonella

Salmonella gây bệnh cho người và vật nuôi (gia súc, gia cầm và loài chim)

Bình thường vi khuẩn có thể được phát hiện trong đường ruột của người và gia súc khoẻ mạnh (lợn nái…) Khi sức đề kháng của vật chủ giảm sút sẽ tạo điều kiện

thuận lợi cho Salmonella tác động gây bệnh

Ngoài yếu tố gây bệnh giúp vi khuẩn Salmonella bám dính, xâm nhập tế bào Đối với vi khuẩn Salmonella chúng sản sinh ra ít nhất 3 loại độc tố chính đó là độc tố đường ruột (Enterotoxin), nội độc tố (Endotoxin) và độc tố tế bào (Cytotoxin) Trong

đó độc tố đường ruột (Enterotoxin) có vai trò trong ngộ độc thực phẩm (Đào Thị

Thanh Thủy, 2012) [28]

* Độc tố đường ruột (enterotoxin)

Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai yếu tố chính là yếu tố thẩm

xuất nhanh (Rapit Permeability Factor - RPF) và yếu tố thẩm xuất chậm (Delayed Permeability Factor - DPF)

- Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của

ruột, thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1-2 giờ, kéo dài 48 giờ và làm trương tế bào CHO (Chinese Hansten Ovary Cell) Yếu tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc, thành phần

giống độc tố chịu nhiệt của E coli được gọi là độc tố chịu nhiệt của Salmonella (Heat

Stable Toxin - ST), chịu được ở nhiệt độ 1000C trong 4 giờ, nhưng bị phá huỷ nhanh khi hấp cao áp và bền vững ở nhiệt độ thấp Độc tố này làm tăng tính thấm thành mạnh, phá hủy các mạch máu cục bộ (Clarke và cs (1988) [41)

- Yếu tố thẩm xuất chậm có thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của E

coli, nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt Salmonella (Heat Lable Toxin - LT)

Độc tố này bị phá hủy ở 700C trong 3 phút và 560C trong 4 giờ Độc tố không chịu

nhiệt của Salmonella làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải của cơ

thể dẫn đến rút nước vào lòng ruột và gây tiêu chảy

* Nội độc tố (endotoxin):

Nội độc tố nằm ở lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn và được cấu tạo bởi thành phần cơ bản là Lipo polysaccharide (LPS) được phóng ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải Các cơ quan trong cơ thể vật chủ chịu sự tác động của nội độc tố với các biểu hiện bệnh lý tắc mạch máu, giảm trương lực cơ, thiếu ôxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hóa

LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biết với các đặc tính và chức năng riêng biệt: Vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipit A

Vùng ưa nước bao gồm một chuỗi Polysacchariade chứa các đơn vị cấu trúc kháng nguyên O Vùng lõi có bản chất là axit heterooligosaccharide, ở trung tâm, nối kháng nguyên O với vùng lipit A Vùng lipit A đảm nhận chức năng nội độc tố của vi khuẩn Cấu trúc nội độc tố gần giống với cấu trúc của kháng nguyên O Cấu

trúc nội độc tố biến đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của Salmonella Các biến đổi gen ở vung lõi, vùng ưa nước làm cho Salmonella không còn độc lực (Trần Quang

Diên, 2002) [12]

Nội độc tố là LPS được tiết ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải Trước khi thể hiện độc tính, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm ba cầu B, lâm ba cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan lách

Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể vật chủ chịu sự tác động của nội độc tố LPS như: gan, thận, cơ, hệ tim mạch, giảm trương lực cơ, thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hóa, mất tính thèm ăn

1.1.2 Khả năng xâm nhập của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella muốn có khả năng gây bệnh cho động vật hay con

người, thì điều quan trọng đầu tiên là chúng có khả năng xâm nhập Để xâm nhập

và tránh khỏi yếu tố thực bào của hệ thống phòng vệ cơ thể, vi khuẩn Salmonella

sinh ra một loại độc tố nào đó để chống lại quá trình thực bào, chính vậy mà vi khuẩn sống và tồn tại trong tế bào vật chủ

Sự xâm nhập của Salmonella vào tế bào phụ thuộc vào các gen kề nhau trong

nhiễm sắc thể và mỗi đoạn gen mã hóa cho một loại protein phân tiết đã biết, kí

hiệu là Sip A, B, C, D (Samonella ivasion protein) cần thiết cho khả năng xâm nhập

vào bên trong tế bào

1.2 Bệnh Phó thương hàn ở lợn

1.2.1 Đặc điểm dịch tễ

Theo Quinn và cs (2002) [58], có thể nhận thấy, Salmonella nhiễm trên lợn nói

chung có liên quan đến hai vấn đề, thứ nhất là tác nhân gây bệnh cho lợn, và thứ hai là gây ngộ độc thực phẩm cho người Trong đó, loài lợn được coi là yếu tố nguồn bệnh,

mang trùng và bài xuất mầm bệnh Salmonella có độc lực, tạo nguy cơ cao gây bệnh

cho gia súc, gia cầm; gây bệnh và gây ngộ độc thực phẩm cho con người

Lợn ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh, phổ biến là lợn con từ cai sữa đến 4 tháng tuổi, ít khi xảy ra ở lợn đến 6 tháng tuổi (chỉ thấy mắc bệnh ở thể mãn tính)

Bệnh Phó thương hàn ở lợn là bệnh truyền nhiễm đường tiêu hóa phổ biến ở lợn con nước ta, thường ghép với bệnh dịch tả

Bệnh này cũng có nhiều nước thuộc châu Âu, châu Mỹ, giết hại nhiều lợn con Ruột bị xuất huyết

Chất chứa vi khuẩn: Tất cả phủ tạng, chất bài tiết và máu đều chứa vi khuẩn Đường xâm nhập: Vi khuẩn theo đương tiêu hóa, qua thức ăn, nước uống vào

cơ thể Nó cũng có thể từ lợn mẹ truyền sang bào thai qua nhau

Vi khuẩn gây bệnh có khả năng tồn tại ngoài môi trường, nếu lợn gặp phải điều kiện bất lợi gây stress như thời tiết thay đổi lúc giao mùa, lúc cai sữa cho lợn con, vận chuyển lợn đi xa, nhập đàn, thay đổi thức ăn một cách đột ngột, thức ăn bị nấm mốc, do ký sinh trùng… lúc này vi khuẩn sẽ xâm nhập vào cơ thể lợn lây qua đường tiêu hóa (gây bệnh cấp tính trên lợn con) Ngoài ra lợn nái mang thai có thể truyền bệnh cho bào thai

1.2.2 Mầm bệnh

Bệnh gây ra chủ yếu do hai loài vi khuẩn là Salmonella choleraesuis chủng

Kunzendor (thể cấp tính) và Salmonella typhi suis chủng Voldagsen (gây thể mãn tính)

+) Salmonella choleraeasuis (gây thể cấp tính) vào cơ thể đường tiêu hóa

vào hầu và ruột, dạ dày gây xuất huyết, viêm ruột viêm dạ dày

+) Salmonella typhisuis (gây thể mãn tính): qua đường tiêu hóa vào hạch lâm ba

ruột già sinh sản ở đó, gây hoại tử tổ chức vùng xung quanh tạo ra những mụn loét

Salmonella là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, di động, gây gram (-)

tác động chủ yếu đến toàn bộ niêm mạc bộ máy tiêu hóa, gây viêm dạ dày và ruột

có mụn loét

Theo Quinn và cs (2002) [58], Salmonella cần xâm nhập vào ruột non và kết

tràng để gây bệnh đường ruột Tuy nhiên, những axit hữu cơ bay hơi được sản sinh bởi hệ vi sinh vật yếm khí bình thường trong đường ruột có khả năng ức chế sự phát

triển của Salmonella Hệ vi sinh vật hiếu khí bình thường cũng có thể ngăn cản việc tiếp xúc với các vị trí bám gắn cần cho loài Salmonella Sự rối loạn của hệ vi sinh

vật do các yếu tố như: Dùng kháng sinh, khẩu phần ăn, mất nước làm tăng khả năng mẫn cảm của vật chủ với sự nhiễm trùng Nhu động ruột giảm, stress do vận chuyển

và chật chội cũng tạo điều kiện cho sự xâm nhập đường ruột của Salmonella

Mầm bệnh sau khi nhiễm vào đường tiêu hoá, nhanh chóng đi vào hệ lâm ba của ruột gây viêm sưng hạch, từ đó vào hệ tuần hoàn, gây bại huyết, làm cho lá lách sưng to, lúc đầu do tụ máu, về sau do tăng sinh, sản sinh nội độc tố, gây viêm hoại

tử gan và hạch

1.2.3 Triệu chứng

1.2.3.1 Thể cấp tính

Thời kỳ nung bệnh từ 3 - 4 ngày

Bệnh bắt đầu bằng một cơn sốt nặng, thân nhiệt lên đến 41,5oC - 42oC, con vật kém ăn, hoặc không ăn, không bú, con vật đi táo, bí đại tiện, nôn mửa Tiếp đến

là ỉa chảy, phân lỏng thối màu vàng, có nước và máu, có khi lòi dom, con vật kêu la đau đớn do viêm dạ dày, viêm ruột nặng

Con vật thở khó, thở gấp, ho, tim đập yếu, suy nhược

Cuối thời kỳ bệnh, da tụ máu thành từng nốt, đỏ ửng rồi chuyển thành màu tím xanh ở tai, bụng, mặt trong đùi ngực

Bệnh tiến triển 2 - 4 ngày Con vật gầy còm, còi cọc, ỉa chảy nhiều rồi chết

Tỷ lệ chết từ 25% có thể lên đến 95% Có khi bệnh chuyển sang thể mạn tính

1.2.3.2 Thể mãn tính

Bệnh phát ra lúc đầu không rõ triệu chứng Con vật gầy yếu dần, ăn uống giảm sút, chậm lớn, thiếu máu, da xanh, có khi trên da có những mảng đỏ hoặc xám tím bầm

Con vật ỉa chảy, phân lỏng, vàng rất thối, triệu chứng đi tháo kéo dài Con vật thở khó, ho, đặc biệt sau khi vận động con vật thường mệt nhọc, đi lại khó khăn, khệnh khạng Bệnh tiến triển vài tuần lễ Tỷ lệ chết từ 25% - 75% Một số có thể khỏi bệnh nhưng chậm lớn, tiêu hóa thức ăn kém, chậm lớn

Lợn lớn mắc bệnh thì uể oải, kém ăn, sốt 40,8oC duy trì trong 3 - 4 ngày, có khi lợn nái sẩy thai ở các thời kỳ chửa khác nhau Một số lợn con sơ sinh chết những ngày đầu sau khi đẻ Những con sống thì cằn cỗi, còi cọc, thiếu máu, gầy còm, lưng cong, da bong vẩy, sức đề kháng kém Hiện tượng sảy thai tiếp tục trong đàn lợn trong mấy năm liền, đồng thời có triệu chứng viêm ruột cấp tính, bào thai xuất huyết ở gan và thận

Gan tụ máu có nốt hoại tử bằng hạt kê

Niêm mạc dạ dày và ruột viêm đỏ, nhăn nheo, có điểm xuất huyết, có khi có nốt loét nhỏ bằng hạt đậu Viêm phúc mạc có bài xuất huyết tương và fibrin

Phổi tụ máu, có các ổ viêm mới

1.2.4.2 Thể mãn tính

Bệnh tích chủ yếu ở dạ dày và ruột Niêm mạc dạ dày viêm đỏ từng đám

Ở ruột già, có khi ở ruột non, hồi manh tràng có viêm sưng nang lâm ba và mụn loét Các tổ chức lâm ba, các nang lâm ba, các tấm pêie bắt đầu viêm, sưng lên,

tụ máu rồi bị hoại tử, casein hóa thành những mụn, những cục hoặc khối mềm hình hạt,

hơi cộm trên mặt niêm mạc, khi bóp thì lòi ra cục casein (bã đậu) Mụn loét có viêm trơn, bờ nông (mụn loét mới) phủ một lớp fibrin (do sợi huyết bài tiết ra và đông lại) chung quanh mụn và tổ chức hoại tử có màu vàng xanh hay xám

Lách không sưng Đôi khi chứa những nốt hoại tử to bằng quả mận Hạch lâm ba màng ruột sưng to, có khi chứa những nốt bã đậu cứng, cắt ra có màu tro xám, có nước, có khi có điểm xuất huyết Gan có khi có nốt viêm hoại tử to bằng hạt kê hay hạt đỗ Hà Lan, màu xám

Phổi viêm sưng có vùng nát lầy nhầy màu hồng xám hoặc ổ bã đậu, cắt ngang có những hạt nhỏ màu vàng xám Trong xương có thể tìm thấy những nốt hoại tử

1.3 Biện pháp phòng, trị bệnh do Salmonella gây ra ở lợn

1.3.1 Phòng bệnh

Phòng bệnh Phó thương hàn cho lợn, nhất là ở những nơi chăn nuôi lợn tập trung quy mô lớn và chăn nuôi lợn nái có nhiều lợn con là một việc quan trọng,

vì đặc điểm dịch tễ của căn bệnh là vi khuẩn Samonella không dễ dàng khống

chế và yêu cầu của quá trình phòng bệnh là phải thực hiện được triệt để các nội dung như tiêm phòng vacxin, vệ sinh khử trùng tiêu độc, quản lý chăn nuôi, sử dụng chế phẩm sinh hoá học…

1.3.2 Điều trị bệnh

Hiệu quả chữa bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các biện pháp phòng bệnh tổng hợp như vệ sinh thú y, chăm sóc, nuôi dưỡng, đồng thời phải chẩn đoán bệnh kịp thời thì mới nâng cao hiệu quả chữa bệnh

- Sử dụng kháng huyết thanh Phó thương hàn

Kháng huyết thanh Phó thương hàn được chế bằng cách: Gây tối miễn dịch

cho bò đực thiến bằng canh trùng vi khuẩn S choleraesuis chứa độc tố được vô hoạt

bằng formol Tiêm bắp 30 - 60ml cho lợn dưới 45 ngày tuổi; 50 - 80ml cho lợn 45 ngày tuổi trở lên

- Điều trị bằng kháng sinh

Cho đến nay, việc dùng kháng sinh chữa bệnh Phó thương hàn cần chú ý loại trừ các loại kháng sinh đã bị vi khuẩn kháng được nhiều tác giả thông báo như

streptomycin, ampicillin,… Cũng phải loại trừ các kháng sinh vi khuẩn mẫn cảm nhưng đã bị cấm sử dụng như chloramphenicol, furazolidon,… Có nhiều loại kháng sinh mà các công ty, xí nghiệp thuốc thú y trong và ngoài nước sản xuất dùng cho điều trị bệnh Phó thương hàn Khi sử dụng theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất

Tốt nhất là làm kháng sinh đồ trên môi trường thạch đĩa để đánh giá và chọn loại kháng sinh điều trị có hiệu quả nhất

1.4 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra

Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh cho người và súc vật

truyền từ thực phẩm, chủ yếu do thịt (thịt lợn, bò, gia cầm, ) và các sản phẩm của thịt, trứng, và các sản phẩm của trứng

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1880, Eberth lần đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn Salmonella dưới kính

hiển vi Bốn năm sau (1984), Gaffky đã nuôi cấy thành công vi khuẩn này Loài vi

khuẩn Salmonella typhi thời gian đầu được gọi với các tên như: Bacillus typhous,

Bacterium typhi và Eberthella typhi hay Eberthella typhi tiphosa, còn tên giống Salmonella được Lignires sử dụng đặt tên cho trực khuẩn gây bệnh dịch tả “Hog-

cholera bacillus” vào năm 1900 (Selbizt và cs, 1995 [59])

Năm 1885, tên gọi S choleraesuis lần đầu tiên xuất hiện trong báo cáo năm của

phòng chăn nuôi công nghiệp Mỹ Thời gian này, Salmon, D.E là trưởng phòng nghiên cứu, vì vậy mà tên ông được lấy đặt cho vi khuẩn mới này Song Smith, người

cộng sự của Salmon mới thật sự là người phát hiện ra vi khuẩn Salmonella Một vài năm sau đó, lần lượt các loài Salmonella khác đã được phát hiện và những loài vi

khuẩn đó vẫn có ý nghĩa trong y học cho tới ngày nay (Plonait và Birkhardt, 1997 [57])

Năm 1891, Jensen đã phân lập được S dublin từ bệnh phẩm của bê bị tiêu chảy Cũng vào năm đó, S typhimurium được phát hiện ở vùng Greiswald và

Breslau Hai năm sau đó (1893), tại Breslau đã xảy ra một vụ ngộ độc thịt do ăn phải thịt bò ốm, kết quả là bệnh đã xảy ra ở người Kaensche là người tìm thấy vi khuẩn,

vì vậy vi khuẩn được đặt tên là trực khuẩn Kaensche (Selbizt và cs, 1995 [59])

Năm 1926, với những công trình nghiên cứu của White về cấu trúc kháng

nguyên của Salmonella đã bắt đầu một thời kỳ khoa học mới về giống vi khuẩn này

Sau đó Kauffmann cũng rất thành công trong lĩnh vực nghiên cứu về vi khuẩn

Salmonella (Selbizt và cs, 1995) [59]

Năm 1934, Kauffmann và White đã thiết lập được bảng cấu trúc kháng nguyên đầu tiên và đặt tên là bảng phân loại Kauffmann-White Từ đó đến nay, bảng

cấu trúc kháng nguyên của Salmonella luôn luôn được bổ sung Năm 1993 đã có

2375 serovar Salmonella được định danh (Selbizt và cs, 1995) [59] Năm 1997, số serovar đã lên đến 3000 (Plonait và Birkhardt, 1997) [57] Như vậy, giống Salmonella

luôn luôn thu hút sự chú ý của các nhà chuyên môn trong lĩnh vực vi sinh vật

Trước năm 1983, sự tồn tại của nhiều loài Salmonella được chấp nhận trong

phân loại Từ đó vì kết quả của những thí nghiệm cho thấy mức tương đồng ADN

cao, tất cả các chủng Salmonella được xếp thành một loài duy nhất là S choleraesuis (Salmonella choleraesuis) (Crosa và cs, 1973 [42]; Farmer và cs, 1995 [45])

Vi khuẩn Salmonella được phân lập từ thịt lợn chết bởi bệnh Phó thương hàn thường gặp ở miền Tây của nước Mỹ là S bongori, S choleraesuis var kunzendorf,

S typhimurium và S typhisuis (Barners và Sorensen, 1975) [35] Trong một vài

trường hợp, ở lợn còn tìm thấy S dublin và S enteritidis Hai serotyp S dublin và S

enteritidis cũng gặp ở lợn con đang theo mẹ Những báo cáo gần đây cho thấy: Ở

một số nước như Mỹ, Canada, Anh và Bắc Đài Loan đã phân lập được S

choleraesuis từ người bị bệnh (Khakhria và Johnson, 1995 [50]; Chiu và cs, 1996 [39];

Su và cs, 2001 [62])

Tại Nhật Bản 2002, Asai và cs (2002) [34] tỷ lệ nhiễm Salmonella ở lợn sau

cai sữa bị tiêu chảy là 12,4%; lợn vỗ béo là 17,3%; lợn con theo mẹ 4,5% Tác giả

cũng cho biết S typhimurium được phân lập thấy nhiều nhất ở lợn sau cai sữa là

72,6%; lợn gần xuất chuồng là 73,8%

Theo Barners và Sorensen (1975) [35]; Wilcock (1995) [70]: Ở lợn, cần

phân biệt 2 dạng bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra, đó là bệnh Phó thương hàn cấp tính ở lợn con do S choleraesuis var kunzendorf và bệnh viêm ruột mãn tính do

S typhimurium Ở trâu bò, bệnh chủ yếu do các loài S dublin và S entertidis gây

ra Ở cừu, do S abortus ovis, S montevideo, S dublin, S anatum gây ra Ở ngựa do

S abortus equi gây ra, còn ở gia cầm và chim do S pullorum, S gallinarum, S typhimurium và S enteritidis gây ra

Hiện nay, có rất nhiều loại thuốc kháng sinh có thể được sử dụng để điều trị bệnh, nhất là với lợn con trước và sau cai sữa Tuy nhiên, do việc sử dụng rộng rãi kháng sinh để phòng và điều trị bệnh nên đã xuất hiện các chủng vi khuẩn

Salmonella kháng thuốc (Kishima và cs, 2008) [51]

Gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào nghiên cứu gen kháng kháng sinh

DT104 ở vi khuẩn Salmonella Chủng đa kháng thuốc S typhimurium DT104 được phát hiện lần đầu tiên ở người mắc Salmonellaosis tại Anh vào năm 1980 Sau đó

được quan sát thấy cả ở người cũng như vật nuôi trên khắp thế giới vào những năm

90 và hiện đang là mối quan ngại hàng đầu đối với sức khỏe cộng đồng Gen này

thường xuất hiện ở các serotyp S typhimurium và ít thấy ở các serotyp khác

Selbitz (1995) [59] còn cho biết: “genom” của Salmonella được nghiên cứu

tương đối kỹ Cho đến nay ít nhất đã chứng minh được 750 gen, trong đó có 680 gen đã có trong bản đồ gen

Như vậy, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra được rất nhiều các

nhà vi sinh vật trên toàn thế giới quan tâm Mục đích của các nghiên cứu này nhằm tìm ra các biện pháp có hiệu quả để góp phần ngăn chặn và đẩy lùi bệnh do

Salmonella gây ra ở động vật và ở người

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Ở Việt Nam, vi khuẩn Salmonella và bệnh do chúng gây ra cho người và gia

súc cũng đã được bắt đầu nghiên cứu từ những năm 50 Viện Pasteur Sài Gòn trong

những năm (1951-1953) đã phân lập được 6 chủng Salmonella ở người (4 chủng từ

máu, 2 chủng từ nước tiểu) Cũng ở Sài Gòn, trong thời gian này đã phân lập được 35

chủng từ 360 lợn, trong đó có 23 mẫu là S cholereasuis (Đỗ Đức Diên, 1999) [11]

Võ Thị Trà An và cs (2006) [1] cho biết, tại các tỉnh phía Nam: phân lợn

nhiễm Salmonella chiếm tỷ lệ 49,3 %, tỷ lệ mẫu phân mang Salmonella thu thập từ

cơ sở giết mổ luôn cao hơn mẫu phân thu thập từ cơ sở chăn nuôi, mẫu vải gạc lau

thân thịt lợn nhiễm Salmonella với tỷ lệ 55,9 %

Lại Thị Lan Hương, Vũ Đức Hạnh (2017) [16] nghiêm cứu tỷ lệ nhiễm

Salmonella trên thịt tại một số cơ sở giết mổ lợn trên địa bàn tỉnh Thanh Hóa cho

thấy, tỷ lệ nhiễm Salmonella ở 4 cơ sở là 8/67 mẫu (chiếm 11,94%) Nghiên cứu của Dương Thị Toan (2010) [29] tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt lợn tại cơ sở giết

mổ tại tại Bắc Giang là 12,5%; theo Ngô Văn Bắc (2007) [3] tại Hải Phòng tỷ lệ

nhiễm 13,89%; Võ Thị Trà An (2006) [1] tỷ lệ nhiễm Salmonella tại một số tỉnh

phía Nam dao động từ 20,00% - 90,00%

Phạm Thị Ngọc và cs (2013) [17] đã phân lập được 82 chủng Salmonella từ

các loại mẫu lau hậu môn, lau nền chuồng, thức ăn, nước uống, nước thải tại trại chăn nuôi lợn, các mẫu lau thân thịt, lau sàn giết mổ và bể nước giết mổ tại lò mổ

Tất cả các chủng được định type kháng huyết thanh tìm ra 3 serovar chủ yếu là S

derby (25,6%), S typhimurium (23,2%) và S rissen (13,4%), các serovar khác bao

gồm S anatum, S braenderup, S chartres và S meleagridis có tỷ lệ dao động từ

2,4% đến 6,1%

Cù Hữu Phú và cs (2000) [19] nghiên cứu Salmonella trong bệnh tiêu chảy ở

lợn 35 ngày đến 4 tháng tuổi nuôi xung quanh Hà Nội cho biết 80% mẫu phân lợn

tiêu chảy có nhiễm Salmonella Xác định đặc tính sinh học, khả năng sản sinh độc

tố đường ruột của các chủng Salmonella phân lập được; các tác giả đã chế thử

nghiệm autovacxin phòng bệnh tiêu chảy cho lợn, kết quả đạt 89,22% lợn được phòng bệnh sau 4 tháng tiêm phòng

Theo Đặng Xuân Bình, Dương Thùy Dung (2010) [4] nghiên cứu Salmonella

trên thịt lợn tươi được thu thập tại các chợ khu vực trung tâm thành phố Thái

Nguyên từ 5/2009 đến 4/2010 chiếm từ 10% đến 19,5% Mẫu thịt nhiễm Salmonella

không đạt tiêu chuẩn kỹ thuật

Trương Hà Thái và cs (2012) [25] khi nghiên cứu các mẫu thịt tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam thấy 39,60% mẫu thịt lợn và 42,90% mẫu thịt gà phân lập được

vi khuẩn Salmonella

Theo Nguyễn Thị Chinh và cs (2010) [6] nghiên cứu Salmonella trên đàn vịt

tại hai tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang có tỷ lệ nhiễm 19,02% Tỷ lệ nhiễm cao nhất là trứng chết phôi

Nguyễn Thị Nội và cs (1989) [18] đã tiến hành điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột tại một số cơ sở chăn nuôi lợn ở miền Bắc đã tìm thấy 37,5% lợn

nhiễm Salmonella

Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy tại 4 cơ sở

chăn nuôi lợn thuộc miền Bắc nước ta của Cù Hữu Phú và cs (2000) [19] cho biết:

Tỷ lệ tìm thấy Salmonella trung bình ở lợn tiêu chảy nuôi tại 4 cơ sở trên là 80%

Đây là điều đáng lo ngại đối với ngành chăn nuôi lợn ở nước ta

Trần Thị Hạnh và cs (2009) [13] đã công bố tỷ lệ nhiễm Salmonella tại các

cơ sở giết mổ lợn công nghiệp và cho kết quả: Chất chứa manh tràng của lợn là 59,18%, ở mẫu lau thân thịt là 70%, mẫu lau sàn giết mổ là 28%, còn các mẫu nước

kiểm tra không phát hiện Salmonella Tại các cơ sở giết mổ lợn theo phương thức thủ công cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella ở chất chứa manh tràng của lợn chờ giết

mổ là 87,5%, ở mẫu lau thân thịt là 75%, mẫu lau hậu môn là 55%, mẫu lau nền chuồng nhốt lợn chờ giết mổ là 70%, mẫu lau sàn giết mổ là 80%, mẫu nước là 50%

Như vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn Salmonella một cách toàn diện để từ đó

đề ra biện pháp phòng chống bệnh hiệu quả, giữ gìn vệ sinh an toàn thực phẩm, bảo

vệ sức khỏe con người là một yêu cầu rất cần thiết

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, vật liệu

2.1.1 Đối tượng

Lợn nái sinh sản, lợn sau cai sữa bình thường và lợn nghi mắc bệnh Phó thương hàn

Vi khuẩn Salmonella phân lập được

2.1.2 Vật liệu dùng trong nghiên cứu

2.1.2.1 Mẫu bệnh phẩm: Phân tiêu chảy, dịch ruột già, dịch ruột non, gan, thận,

máu trong tim, hạch ruột của lợn sau cai sữa mắc bệnh Phó thương hàn

2.1.2.2 Vật liệu khác

- Các loại môi trường, hoá chất cần thiết cho nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

Salmonella

+ Môi trường tăng sinh không chọn lọc: dung dịch đệm BPW

+ Môi trường tăng sinh chọn lọc: Mueller Kauffmann

+ Môi trường kiểm tra đặc tính di động của vi khuẩn Salmonella: MSRV

+ Môi trường phân lập: XLT4, Rambach

- Các loại thuốc nhuộm và thuốc thử phản ứng sinh hoá

- Các loại đường để thử phản ứng lên men

- Kháng huyết thanh chuẩn để định type vi khuẩn Salmonella: Kit kháng

huyết thanh chuẩn O, H (H anstigens phase 1, H anstigens phase 2) của Bio-Rad Laboratories, Inc

- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng dòng Swiss 18- 22g/con

- Dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm vi sinh vật

+ Thiết bị: tủ ấm, tủ lạnh, tủ mát, tủ hấp sấy, cân, buồng cấy vô trùng

+ Dụng cụ: pipet, ống nghiệm, chai lọ các loại,… và hoá chất cần thiết trong phòng thí nghiệm

2.2 Phạm vi nghiên cứu

- Điều tra tình hình nhiễm Salmonella tại 8 xã trên địa bàn huyện Hiệp Hòa,

tỉnh Bắc Giang

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Lấy mẫu tại các trang trịa, hộ chăn nuôi lợn trên địa bàn huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang

- Phân lập, giám định đặc tính sinh vật học, xác định gen mã hóa sản sinh

đọc tố của vi khuẩn Salmonella được thực hiện tại Bộ môn Vệ sinh gia súc - Viện

nghiên cứu Hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam

2.2.2 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2016 đến tháng 7/2017

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản và lợn con

2.3.1.1 Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản

2.3.1.2 Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo lứa đẻ

2.3.1.3 Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn nái sinh sản theo mùa

2.3.1.4 Tình hình thải trừ Salmonella ở lợn con

2.3.1.5 Biến động về số lượng vi khuẩn Salmonella thải trừ qua phân lợn con sau cai sữa

2.3.2 Tình hình bệnh Phó thương hàn ở lợn sau cai sữa

2.3.2.1 Một số đặc điểm dịch tễ bệnh Phó thương hàn ở lợn con sau cai sữa

2.3.2.2 Phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu bệnh phẩm lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy 2.3.2.3 Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella phân lập được 2.3.2.4 Độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được

2.3.2.5 Xác định serotype của vi khuẩn Salmonella phân lập được

2.3.2.6 Xác định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được 2.3.2.7 Xác định tính kháng thuốc với một số loại kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn Salmonella phân lập được

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu

- Đối với mẫu phân: Lấy phân từ lợn mới thải hoặc dùng tăm bông vô trùng ngoáy vào trực tràng của lợn rồi cho vào các typ vô trùng, bảo quản lạnh 4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm

- Đối với những lợn sau cai sữa bị ốm hoặc chết có các triệu chứng: ỉa chảy phân có mùi thối đặc biệt, vùng da bụng, quanh tai và bẹn có những đốm đỏ hoặc tím bầm, tiến hành mổ khám tại chỗ, rồi lấy các bệnh phầm như: gan, thận, hạch ruột non, dịch ruột non, dịch ruột già vào các túi nilon riêng rẽ, bảo quản ở 4oC và vận chuyển về phòng thí nghiệm

2.4.2 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong phân lợn

Xác định chỉ tiêu tổng số VKHK trong phân lợn áp dụng theo TCVN 5667:1992

- Nguyên lý: Trên môi trường thạch thường, ở điều kiện hiếu khí, ở 37°C, trong 24 giờ, mỗi khuẩn lạc phát triển riêng rẽ là một điểm xuất phát của vi khuẩn Đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch chính là số vi khuẩn chứa trong mẫu phân tích

- Chuẩn bị mẫu: 1g phân lợn cho vào túi P.E chuyên dụng vô trùng, bổ sung thêm 225 ml dung dịch đệm Peptone Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 1 phút Hỗn dịch thu được có tỷ lệ mẫu pha loãng 10-1, từ mỗi dịch này có thể pha loãng 10-2, 10-3… Tuỳ theo mức độ đánh giá ô nhiễm để xác định mức pha loãng

- Phương pháp nuôi cấy: Với 1 mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm

độ, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch riêng Lấy 1 ml dung dịch đồng nhất mẫu pha loãng ở những đậm độ khác nhau để chuyển vào đĩa Petri Đổ vào mỗi đĩa 12 - 15

ml môi trường thạch PCA (Plate Count Agar) hoà tan (đã được hấp vô khuẩn, để nguội 45°C), trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa 1 - 2 vòng theo chiều kim đồng hồ và ngược lại Để đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng nằm ngang, sau đó lật ngược đĩa chuyển vào tủ ấm 37°C, trong 24 giờ đọc kết quả

- Tính kết quả: Đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch Để tránh nhầm lẫn cần đưa đĩa thạch lên giá kính chia ô để đếm Nếu vượt quá 300 khuẩn lạc/đĩa Petri thì loại bỏ và mẫu cần được pha loãng tiếp

Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g thịt được tính theo công thức sau:

N =

d W W

C

) 1 0

Trong đó:

N: Số khuẩn lạc trong 1 gram mẫu kiểm tra, N biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 - 9,0 nhân với 10w (W là chữ số mũ thích hợp của 10)

C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

W1, W2: Số đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ 2

d: Hệ số của đậm độ pha loãng đã chọn thứ nhất

2.4.3 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella

- Thu thập mẫu phân để xác định số lượng vi khuẩn; lấy mẫu bệnh phẩm để phân lập; giám định đặc tính sinh vật, hóa học; xác định độc lực, thử tính mẫn cảm

với kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn Salmonella theo Quinn và cs (2002) [58];

Wallace H Andrews và cs (2016) [67]

- Giám định serotype Salmonella phân lập được theo bộ Kit O antigens, H

(antigens phase 1, antigens phase 2) của hãng Bio-Rad (Bacterial serotyping guide

for Salmonella); Oxoid Salmonella Test Kit

- Ứng dụng kỹ thuật PCR theo Chaudhary J H và cs (2015) [36] để xác định

gene mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được

- Xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm SAS (SAS 9.3.1 statistical software)

Sơ đồ 3.1 trình bày tóm tắt quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella

từ các mẫu bệnh phẩm (Nguồn tham khảo: Bộ môn Vệ sinh Thú y,Viện Thú y Quốc gia)

Hình 2.1: Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella

từ các mẫu bệnh phẩm và phân

Bệnh phẩm (Phân, gan, thận, hạch ruột, dịch ruột)

BPW(370C/ 18- 24 h)

LIM

(370C/ 20- 24 h)

Malonate (370C/ 18- 24 h)

TSI (370C/ 18- 24 h)

Xác định serotyp

Giữ giống

RV (420C/ 18- 24 h)

DHL (370C/ 20- 24 h)

CHROMTM Salmonell

(370C/ 20- 24 h)

Phản ứng lên men đường

Kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm

Xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh

Xác định các yếu tố độc lực

2.4.4 Phương pháp giám định vi khuẩn Salmonella phân lập được

Bao gồm các phương pháp sau:

- Kiểm tra hình thái học

- Kiểm tra khả năng di động

- Phản ứng Indol

- Phản ứng lên men đường

2.4.5 Xác định gen sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR

2.4.5.1 Phương pháp tách ADN tổng số

Để thu nhận ADN tinh sạch cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein Sự tách chiết ADN dựa theo nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước) Mục đích là thu được các phân tử nucleic acid ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học

Các bước tiến hành như sau:

+ Nuôi cấy lắc khuẩn lạc vi khuẩn trong môi trường LB lỏng ở 37oC, tốc độ máy lắc 220 v/p qua đêm

+ Bơm 1400 μl mỗi mẫu vào 2 ống eppendorf rồi ly tâm dịch khuẩn nuôi qua đêm với tốc độ 8000 v/p trong 7 phút ở 20oC, sau đó thu tế bào

+ Thêm 540 μl extraction buffer vào mỗi mẫu, đảo trộn kỹ bằng máy vontex

để hào tan tế bào

+ Bổ sung 5 μl protease K (20 mg/ml), đem ủ lắc ở 37oC trong 90 phút

+ Thêm 60 μl SDS 20 %, ủ ở 65oC trong 120 phút, có đảo trộn

+ Bổ sung 600 μl CI (Chloroform isoamylalcohol), vontex nhẹ, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC, sau đó thu pha trên ra ống eppendorf 1,5 ml mới

+ Thêm 600 μl CI (Chloroform isoamylalcohol), vontex nhẹ, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC, sau đó thu pha trên ra ống eppendorf 1,5 ml mới

+ Kết tủa ADN bằng 350 μl Isopropanol ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ + Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC rồi thu tủa

+ Rửa tủa bằng 500 μl Ethanol 70 %, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC, thu cặn

+ Làm khô ADN bằng máy hút chân không Mi-vac 110 V, sau đó thêm 25 µl nước khử deion để ở nhiệt độ phòng cho tan hoàn toàn

+ Điện di kiểm tra 4 µl mẫu trên agarose 1 %

+ Bảo quản mẫu ở -20oC để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

2.4.5.2 Phương pháp PCR (Điện di sản phẩm tách ADN tổng số)

Kỹ thuật tổng hợp ADN nhân tạo cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của sao chép ADN trong tế bào vi sinh vật như: Đoạn ADN cần được mở xoắn thành 2 mạch đơn, cần có các cặp mồi xuôi, ngược, cần nguyên liệu và điều kiện môi trường thích hợp và enzym ADN polymerase Tuy nhiên, kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (95oC) để biến tính chuỗi ADN sợi kép, kết hợp với enzym Taq

ADN polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều khiển nhiệt thích hợp cho từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động Kỹ thuật PCR nhân bản lượng lớn ADN chỉ với một lượng nhỏ ADN ban đầu

+ Đặt các ống vào máy PCR, khởi động, cài đặt chu kì và cho máy chạy

* Phản ứng PCR để tách ADN tổng số của Salmonella gồm các thành phần sau

+ 5 µl PCR buffer 5 x [(750mM Tris - HCl (pH 8.8), 200mM (NH4)2SO4, 0,1 % Tween 20) (ABgene), 2 mM MgCl2,200 µM của mỗi loại dNTP]

+ 1 µl mỗi loại primer (3,2 µM/µl)

+ 0,05 µl Taq ADN Polymerase (5 units/µl) (Abgene)

+ 2 µl ADN khuôn

+ Nước khử ion vô trùng vừa đủ 25 µl cho một phản ứng

Hình 2.2: Chu trình phản ứng PCR đối với Salmonella

để tách ADN tổng số

- Máy móc, dụng cụ phòng thí nghiệm; thiết bị PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac 300 (Bio - Rad, Mỹ), máy soi ADN (Mini - transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy hút chân không Speed - Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Pulser, cùng với các trang thiết bị khác

Cặp mồi sử dụng nghiên cứu đối với Salmonella spp

phẩm PCR (bp)

Stn- F 5’- CTTTGGTCGTAAATAAGGCG- 3’

259 Stn- R 5’- TGCCCAAAGCAGAGAGATTC- 3’

(Nguồn: Viện nghiên cứu Hệ gene, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam)

2.4.6 Xác định độc lực của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được

* Phương pháp thử độc lực trên chuột bạch

Sau khi nuôi cấy và tiến hành tinh khiết vi khuẩn qua các môi trường cấy chuyển, ta lấy một vài khuẩn lạc cấy tiếp lên môi trường BHI bồi dưỡng trong tủ ấm 37°C trong 24h tạo điều kiện cho vi khuẩn sản sinh độc tố rồi tiến hành thử độc lực trên chuột thí nghiệm

Chuẩn bị chuột thí nghiệm: Chuột bạch dòng Swiss nuôi cấy bệnh tại Viện Thú y, khối lượng chuột khoảng 18 - 22 g/con Đánh dấu thứ tự tương ứng với canh khuẩn đem tiêm Mỗi chủng dùng 2 chuột, mỗi chuột tiêm 0,2ml canh khuẩn nguyên (đã bồi dưỡng ở 370C trong 24h), tiêm vào xoang phúc mạc Theo dõi số chuột chết và thời gian chết của chuột sau khi tiêm canh khuẩn (trong 24 - 72h) Chuột chết được mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy bệnh phẩm ở gan, thận, hạch ruột, dịch ruột non, dịch ruột già để phân lập lại

2.4.7 Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập được

Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn Salmonella

phân lập được theo Quinn và cs (2002) [58]

* Nguyên lý chung

Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ có độ mẫn cảm khác nhau đối với kháng sinh trị liệu, biểu hiện ở sự khác nhau về đường kính (ф) vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh trên môi trường nuôi cấy

* Mục đích

Tìm hiểu tính mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh sẽ giúp ích rất nhiều cho phương hướng điều trị, lựa chọn kháng sinh đặc hiệu, góp phần đánh giá thực trạng tính kháng thuốc của vi khuẩn