Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn salmonella gây bệnh ở vịt nuôi tại huyện yên dũng, tỉnh bắc giang

NGUYỄN THỊ NGÂN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC CỦA VI KHUẨN SALMONELLA GÂY BỆNH Ở VỊT NUÔI TẠI HUYỆN YÊN DŨNG, TỈNH BẮC GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Thái Nguyên -2017... NGU

NGUYỄN THỊ NGÂN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC

CỦA VI KHUẨN SALMONELLA GÂY BỆNH Ở VỊT

NUÔI TẠI HUYỆN YÊN DŨNG, TỈNH BẮC GIANG

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Thái Nguyên -2017

NGUYỄN THỊ NGÂN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT HỌC

CỦA VI KHUẨN SALMONELLA GÂY BỆNH Ở VỊT

NUÔI TẠI HUYỆN YÊN DŨNG, TỈNH BẮC GIANG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, chưa hề sử dụng cho bảo vệ một học vị nào Mọi thông tin, tài liệu trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, ngày 10 tháng 9 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Ngân

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban đào tạo sau Đại học, Ban giám hiệu, Ban chủ nhiệm Khoa chăn nuôi Thú ý- Trường Đại học Nông Lâm- Đại học Thái Nguyên, Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Bắc Giang, Bộ môn Công nghệ Vi sinh, Viện Khoa học Sự sống, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Viện thú y Quốc gia, Phòng

Hệ gen học Vi sinh, Viện nghiên cứu Hệ gen-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Đặc biệt, với lòng kính trọng và biết ơn chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu

sắc tới PGS.TS Đặng Xuân Bình - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã chỉ

bảo tôi hết sức tận tình, trách nhiệm và hết lòng vì khoa học trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Hoàng Đăng Huyến, TS Lê Văn Dương - Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Bắc Giang đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn các đồng chí cán bộ trạm Chăn nuôi và Thú y huyện Yên Dũng; cảm ơn các đồng nghiệp Thú y cơ sở, các trang trại và hộ chăn nuôi thuộc 5 xã Trí Yên, Quỳnh Sơn, Lãng Sơn, Thắng Cương và Lão Hộ đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới bạn bè, đồng nghiệp và đặc biệt biết ơn gia

đình đã luôn tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Thái Nguyên, ngày 10 tháng 9 năm 2017

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Ngân

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC ẢNH, ĐỒ THỊ viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cơ sở lý luận của đề tài 3

1.1.1 Sự lưu hành của vi khuẩn Salmonella 3

1.1.2 Vi khuẩn Salmonella 5

1.1.3 Bệnh phó thương hàn vịt 15

1.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella 20

1.2.1 Nghiên cứu trên thế giới 20

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 21

Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 24

2.2 Vật liệu nghiên cứu 24

2.3 Nội dung nghiên cứu 25

2.3.1 Khảo sát tình hình chăn nuôi và tỷ lệ mắc bệnh do Salmonella gây ra cho đàn vịt tại huyện Yên Dũng- Bắc Giang 25

2.3.2 Nghiên cứu tình hình nhiễm Salmonella ở vịt 25

2.3.3 Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm Salmonella trên trứng vịt 25

2.3.4 Phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu bệnh phẩm vịt mắc bệnh PTH 25

2.3.5 Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella phân lập được 26

2.3.6 Xác định serotype của vi khuẩn Salmonella phân lập được 26

2.3.7 Xác định gene quy định yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được 26 2.3.8 Xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được 26

2.3.9 Tính kháng kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn Salmonella phân lập được 26

2.3.10 Đề xuất quy trình phòng, trị bệnh PTH cho vịt 26

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1 Phương pháp điều tra, khảo sát tình hình mắc bệnh do Salmonella gây ra ở vịt 26

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu tình hình nhiễm Salmonella ở vịt 26

2.4.3 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella spp 26

2.4.4 Phân lập vi khuẩn Salmonella 28

2.4.5 Phương pháp xác định serotype của vi khuẩn Salmonella phân lập được 29

2.4.6 Xác định gen sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR 30

2.4.7 Xác định độc lực của chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 33

2.4.8 Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập được 33

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Tình hình chăn nuôi tại huyện Yên Dũng, tỉnh Bắc Giang 36

3.1.1 Bệnh do Salmonella ở vịt theo giống 38

3.1.2 Bệnh do Salmonella ở vịt theo tuổi 40

3.2 Tình hình nhiễm Salmonella ở vịt 43

3.2.1 Nhiễm Salmonella ở vịt theo giống 43

3.2.2 Nhiễm Salmonella ở vịt theo tuổi 45

3.2.3 Nhiễm Salmonella ở vịt theo tính biệt 47

3.2.4 Nhiễm Salmonella ở vịt theo mùa 49

3.3 Tỷ lệ nhiễm Salmonella trên trứng vịt 51

3.4 Phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu bệnh phẩm vịt mắc bệnh phó thương hàn 53

3.5 Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella phân lập được 54

3.6 Xác định serotype của vi khuẩn Salmonella phân lập được 56

3.7 Xác định gene quy định yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được 58 3.8 Xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được 60

3.9 Tính kháng kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn Salmonella phân lập được 63

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65

1 Kết luận 66

2 Đề nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

% : Tỷ lệ phần trăm

cm : centimet PTH : Phó thương hàn

P : Sai số ước lượng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Primer sử dụng để xác định gene mã hóa yếu tố độc lực của vi khuẩn

Salmonella phân lập được 31

Bảng 2.2: Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh 34

Bảng 3.1 Bệnh do Samonella ở vịt theo đàn và cá thể 37

Bảng 3.2 Bệnh do Samonella ở vịt theo giống 38

Bảng 3.3 Bệnh do Samonella ở vịt theo tuổi 41

Bảng 3.4 Tình hình nhiễm Samonella ở vịt theo giống 43

Bảng 3.5 Nhiễm Samonella ở vịt theo tuổi 45

Bảng 3.6 Tình hình nhiễm Samonella ở vịt theo tính biệt 47

Bảng 3.7 Nhiễm Salmonella ở vịt theo mùa 49

Bảng 3.8 Nhiễm Salmonella trên trứng vịt 51

Bảng 3.9 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ bệnh phẩm vịt mắc bệnh phó thương hàn 53

Bảng 3.10 Đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella phân lập được 56

Bảng 3.11 Serotype vi khuẩn Salmonella phân lập được 56

Bảng 3.12 Tần xuất gene mã hóa sản sinh yếu tố gây bệnh stn, fimA, invA của vi khuẩn Salmonella phân lập được 59

Bảng 3.13 Độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được trên chuột bạch 61

Bảng 3.14 Tính kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella phân lập được 63

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Biểu đồ tỷ lệ mắc bệnh do Salmonella ở vịt theo giống 39

Hình 3.2 Biểu đồ tỷ lệ mắc bệnh phó thương hàn ở vịt theo tuổi 43

Hình 3.3 Biểu đồ tỷ lệ nhiễm Salmonella từ mẫu phân và mẫu tampon hầu họng 45 Hình 3.4 Biểu đồ tỷ lệ nhiễm Salmonella ở vịt theo lứa tuổi 46 Hình 3.5 Biểu đồ tỷ lệ nhiễm Salmonella ở vịt theo tính biệt 48 Hình 3.6 Biểu đồ tỷ lệ nhiễm Salmonella trên trứng 51 Hình 3.7 Biểu đồ tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella từ bệnh phẩm vịt mắc bệnh

phó thương hàn 53

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Vịt là loài thủy cầm có tính thích nghi cao với các điều kiện sinh thái, thích hợp chăn thả ở những nơi có nguồn nước để tìm kiếm thủy động vật và thóc lúa rơi vãi sau thu hoạch Những năm gần đây, chăn nuôi vịt phát triển mạnh trên địa bàn huyện Yên Dũng chủ yếu là các giống: vịt Bắc kinh, vịt siêu trứng CV 2000 Layer, vịt Vân Đình, vịt Xiêm (ngan nội) Tuy nhiên, điều kiện nuôi vịt cần có nước là môi trường rất thuận lợi cho việc phát triển bệnh do vi khuẩn gây ra, trong đó

Salmonella có vai trò quan trọng về dịch tễ, là một hạn chế đáng kể trong việc phát

triển mạnh giống gia cầm này Hầu hết các sản phẩm chăn nuôi vịt đều bị vấy

nhiễm Salmonella ở các mức độ khác nhau

Bệnh do Salmonella ở vịt (Salmonellosis in Duck) là bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn Salmonella gây ra, vịt ở mọi lứa tuổi đều mắc bệnh; thể bệnh cấp tính hay gặp ở

vịt con dưới 3 tuần tuổi, tỷ lệ chết cao lên đến 60%; vịt trưởng thành mắc bệnh ở thể

mãn tính, mang trùng và bài xuất mầm bệnh Vi khuẩn Salmonella xâm nhập chủ yếu

qua thức ăn, nước uống hoặc truyền từ mẹ sang con qua trứng Thiệt hại do bệnh này gây ra bao gồm vịt bị bệnh, tỷ lệ vịt con chết và loại thải cao, vịt chậm lớn, tiêu tốn thức ăn nhiều, sức đề kháng bệnh giảm, ảnh hưởng đến chất lượng con giống, tỷ lệ ấp

nở thấp Bên cạnh đó thịt, trứng là nguyên nhân nhiễm vi khuẩn Salmonella, gây tiêu

chảy và ngộ độc thực phẩm, ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng (Nguyễn Đức

Hiền và cs, 2012) [16]

Vi khuẩn Salmonella phân bố rộng rãi trong thiên nhiên Gia súc, gia cầm và con người thường bị nhiễm hoặc là vật mang vi khuẩn (Phùng Quốc Chướng, 2005) [11]

Có nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu về hiện tượng đề kháng

kháng thuốc kháng sinh của các chủng Salmonella ở đàn vật nuôi và bệnh do vi

khuẩn này gây ra ở vịt như Nguyễn Ngọc Huân và cs (2008) [17]; Frederick

Adzitey và cs (2012) [40]; Irfan Ahmad Mir và cs (2015) [42]

Nghiên cứu dịch tễ bệnh Salmonellosis ở vịt nuôi tại huyện Yên Dũng, Bắc

Giang và yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được để bổ sung tư liệu

khoa học về dịch tễ học, đặc điểm của nguồn bệnh, tính gây bệnh của mầm bệnh,

từ đó mở ra hướng nghiên cứu mới về chẩn đoán, biện pháp khống chế hiệu quả

tình trạng thải trừ vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho vật nuôi và gây ngộ độc thực

phẩm cho người

Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Salmonella gây bệnh ở vịt nuôi tại huyện Yên Dũng, tỉnh Bắc Giang”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ về tình hình mang trùng, thải trừ mầm

bệnh và bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra (Salmonellosis) trên đàn vịt nuôi tại

huyện Yên Dũng, tỉnh Bắc Giang

- Nghiên cứu một số yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được

- Xác định đặc tính kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella phân lập được

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Bổ sung tư liệu khoa học về đặc điểm dịch tễ bệnh do vi khuẩn Salmonella

gây ra (Salmonellosis) trên đàn vịt nuôi tại huyện Yên Dũng, tỉnh Bắc Giang

- Bổ sung tư liệu khoa học về một số yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella

phân lập được

- Bổ sung tư liệu khoa học về đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn

Salmonella phân lập được

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp cho công tác phòng chống quản lý dịch

bệnh đối với tình trạng mang trùng và bài xuất mầm bệnh vi khuẩn Salmonella ở

vịt; góp phần hạn chế bệnh ở vịt nói riêng và nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm ở

người do Salmonella nói chung

- Kết quả nghiên cứu về yếu tố độc lực, tính kháng kháng sinh phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo; để chế tạo Kit chẩn đoán nhanh thực phẩm nhiễm độc tố

do vi khuẩn Salmonella sản sinh; góp phần hạn chế tính kháng thuốc của

Salmonella nói riêng và vi khuẩn đường ruột nói chung

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở lý luận của đề tài

1.1.1 Sự lưu hành của vi khuẩn Salmonella

Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi khuẩn đường ruột) là một giống vi

khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ

2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi Hầu hết các loài Salmonella có thể sinh hydro sulfua Salmonella không lên men lactose (trừ S arizona) và sucrose nhưng lên

men được dulcitol, mannitol và glucose Chúng kém chịu nhiệt nhưng chịu được một

số hóa chất: brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite

Có hai loài vi khuẩn Salmonella: S bongori và S enterica S enterica được

chia thành sáu phân loài và hơn 2500 serovar (huyết thanh hình)

Salmonella được tìm thấy trên toàn thế giới trong cả động vật máu lạnh và động

vật máu nóng, và trong môi trường Các chủng vi khuẩn Salmonella gây ra các bệnh như thương hàn (do S typhimurium), phó thương hàn, nhiễm trùng máu (do S

choleraesuis) và ngộ độc thực phẩm Các triệu chứng do Salmonella gây ra chủ yếu là

tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn xuất hiện sau 12 - 36 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm

Salmonella Các triệu chứng thường kéo dài từ 2 - 7 ngày

Nghiên cứu thực hiện ở học viện Metnhicốp (1956 - 1958) đã cho thấy trong 156

mẫu Salmonella phân lập được từ gia cầm (trong đó có vịt) có 96/156 (52,9%) là do S

typhimurium (Trần Xuân Hạnh và cs, 1998) [14] Cũng theo tác giả ở Long An, Thành

phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận, cho thấy: 8,8% vịt đẻ; 24,7% vịt con; 31,7%

phôi trứng bị chết và 64,8% cứt xu đã bị nhiễm Salmonella

Theo Trần Ngọc Bích (2012) [5] cho biết: kết quả khảo sát 289 mẫu của thuỷ cầm (vịt, vịt xiêm và ngỗng) trên địa bàn 4 huyện của tỉnh Hậu Giang cho thấy tỷ lệ

nhiễm vi khuẩn Salmonella trên đàn thuỷ cầm là 19,13%; trong đó, tỷ lệ nhiểm trên

ngỗng cao nhất (25,00%) kế đến là vịt xiêm (23,44%) và thấp nhất là vịt (17,43%); tỷ

lệ nhiễm Salmonella spp của mẫu thân thịt là cao nhất (32,76%), tiếp đến là mẫu phân

(21, 01%), kế đến là vỏ trứng (13,73%) và thấp nhất là trên mẫu lòng đỏ trứng (0,13%)

Ở Indonesia, trong 2 năm 1992 - 1993, đã xác định 26 mẫu huyết thanh vịt,

trong đó S tyhimurium là 24%, S amsterdam là 10,5%, S virchov là 7,5% và S

thompson là 6,8% (Trần Thị Hạnh và cs, 2002) [15]

Kết quả phân lập trong 48 chủng Salmonella trên vịt, heo rừng và cây hương

được 4 nhóm khác nhau (nhóm B, nhóm C, nhóm D và nhóm khác) Trong đó, các

chủng Salmonella thuộc nhóm B xuất hiện nhiều nhất (25/48 chủng) và xuất hiện trong hầu hết các trang trại, chiếm tỷ lệ 52,08%, cao hơn so với Salmonella nhóm khác (13/48 chủng) chiếm 27,08%, kế đến là Salmonella nhóm D (8/48 chủng) chiếm 16,67% Loài Salmonella nhóm C hiện diện ít nhất, chỉ chiếm 2/48 chủng

phân lập được (Nguyễn Văn Minh Hoàng và cs, 2015) [20]

Nguyễn Mạnh Phương và cs (2012) [25] đã xác định: serotype của 31 chủng

vi khuẩn Salmonella phân lập từ lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy cho thấy có 16 chủng vi khuẩn Salmonella được xác định là S typhimurium (chiếm 51,67%), 6 chủng là S anatum (chiếm 19,35%), 5 chủng là S agona (chiếm 16,14%), 2 chủng

là S meleagridis (chiếm 6,45%), 2 chủng là S ruzizi (chiếm 6,45%)

Nguyễn Ngọc Hân và cs (2008) [17] tìm thấy: các serovar Salmonella trên các mẫu xét nghiệm cho thấy, tần suất phân lập S typhimurium là cao nhất (36,36%), giảm dần theo thứ tự S senftenberg (27,27%), S amsterdam (18,18%), còn lại (18,18% S.spp) không xác định serovar chính xác được

Tsai HJ và cs (2001) [58] tìm thấy 10 chủng Salmonella trên vịt là: S

potsdam (31,9%), S dusseldorf (18,7%), S indiana (14,3%), S typhirumium

(7,7%), S hadar (5,5%), S newport (4,4%), S derby (4,4%), S montevideo (2,2%),

S schwarzengrund (2,2%) và S asinnine (1,1%)

Phạm Thị Ngọc và cs (2013) [23] đã xác định: trong tổng 82 chủng Salmonella phân lập được từ các mẫu trang trại và lò giết mổ có 3 serotype phổ biến là S derby, S

typhimurium và S rissen lần lượt chiếm tỷ lệ là 25,6%; 23,3% và 13,4% các serotype

khác giao động từ 2,4% - 6,1% Các chủng chưa xác định được chiếm 12,2%

Qua kiểm tra đặc tính sinh hoá của 31 chủng Salmonella đều lên men sinh

hơi các đường glucose, mantol, sorbitol, dextrose, galactose, manitol, arabinose,

nhưng chúng không lên men đường lactose, sucrose Tất cả các chủng Salmonella

phân lập đều không sinh Indol, phản ứng oxidaza âm tính, catalaze dương tính,

100% số chủng có khả năng di động, 74,09% các chủng sinh H2S (Nguyễn Mạnh Phương và cs, 2012 [25])

Theo Lê văn Tạo và cs (1994) [29] cho biết: Salmonella ở lợn chủ yếu là S

choleraesuis Phân lập từ 75 mẫu phân ở một số vùng thuộc Ba Vì (Hà Tây cũ)

Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Hân và cs (2008) [17] cho thấy: tỷ lệ (%)

nhiễm Salmonella cao nhất là trứng sát lò ấp, giảm dần ở vịt con, phân vịt con, phân

vịt đẻ, phân vịt hậu bị tương ứng là 16,19; 12,19; 10,05; 4,65; 3,54 Tác giả cũng

cho biết tỷ lệ nhiễm Salmonella ảnh hưởng theo mùa trong năm Mùa mưa tỷ lệ nhiễm Salmonella ở vịt là 12,96% cao hơn so với mùa khô (3,95%)

Nguyễn Mạnh Phương và cs (2012) [25] kiểm tra mức độ kháng kháng sinh

của các chủng Salmonella cho kết quả: tất cả các chủng vi khuẩn Salmonella phân

lập được kháng với streptomycin, đa số các chủng kháng tetracylin, amoxicillin và ampicillin là 96,77% và sulfatrimethoprime là 93,55% Số chủng mẫn cảm với apramycin chiếm tỷ lệ cao nhất (58,06%), tiếp theo là với norfloxacin (51,61%) và colistin (48,39%)

Các phân lập Salmonella từ vịt và môi trường nuôi vịt tại Cần Thơ đề kháng

với rất nhiều loại kháng sinh khảo sát, ngoại trừ marbofloxacine, oxytetracycline, fosfomycine, amikacine và hỗn hợp doxycycline + neomycine (Nguyễn Đức Hiền

và cs, 2012) [16]

1.1.2 Vi khuẩn Salmonella

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái

Theo Nguyễn Như Thanh (2001) [31] cho biết: Salmonella là một loại vi

khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4 - 0,6 x 1 - 3 µ, không hình thành

giáp mô và nha bào, có 7 - 12 lông (trừ S Pullorum- gallinarum không có lông)

Vi khuẩn dễ nhuộm với thuốc nhuộm, bắt màu Gram âm đều toàn thân hoặc hơi đậm ở hai đầu

1.1.2.2 Tính chất nuôi cấy

Salmonella là những vi khuẩn sống hiếu khí và yếm khí tùy tiện, phát triển

trên các môi trường thông thường Có rất nhiều loại môi trường dinh dưỡng chọn

lọc được dùng trong phân lập Salmonella, hiện nay thường dùng các loại như môi

trường bồi dưỡng (tăng sinh) Buffered Pepton Water (BPW), môi trường tăng sinh chọn lọc đặc hiệu là Tetrathionate hay còn gọi là môi trường Mueller- Kauffmann

và Rappaport Vassiliadis (RV) Các loại môi trường thạch dùng để nhận dạng các

khuẩn lạc Salmonella cũng như kiểm tra một số đặc tính sinh hoá bao gồm Brilliant

Green Agar (BGA), Bismuth Sulfite Agar (BSA), Triple Sugar Ion (TSI), Xylose Lysine Deroxycholate (XLD), Xylose Lysine Tetrathionate 4 (XLT4), Modified Semisolid Rappaport Vassiliadis (MSRV), Rambach, Kligler

Trên môi trường BSA: sau 48 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn Salmonella mọc

lên những khuẩn lạc đặc trưng, xung quanh khuẩn lạc màu nâu thẫm, giữa khuẩn lạc màu nâu chuyển dần sang màu đen, khuẩn lạc có màu ánh kim

Trên môi trường MacConkey agar vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn,

không màu Trên môi trường BSA Salmonella mọc những khuẩn lạc đặc trưng xung

quanh màu nâu sẫm, giữa màu vàng đậm, gần đen, khuẩn lạc có màu ánh kim (Timoney và cs, 1988) [55 ]

Trên môi trường thạch thường vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng S (Smooth) tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, rìa gọn, hơi lồi ở giữa, đường kính khoảng từ 1-1,5 mm, thỉnh thoảng có thể thấy khuẩn lạc dạng R (rough), nhám, mặt trong mờ Môi trường thạch máu, vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, màu xám, trơn bóng, ở giữa hơi lồi lên (Nguyễn Như Thanh, 2001) [31]

Vi khuẩn Salmonella thể hiện tính kiềm hình thành khuẩn lạc màu đỏ trên

môi trường BGA Trong môi trường TSI hình thành khuẩn lạc nhạt màu, mặt nghiêng môi trường có màu đỏ, màu hồng ở đáy cùng sản sinh H2S làm cho môi trường chuyển màu đen (Quinn và cs, 1994) [51]

Trên môi trường XLD, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc có kích thước trung bình màu đen

Trên môi trường Rambach, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc trung bình, màu đỏ tím, bóng

Trên môi trường XLT4, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trung bình, màu đen, bóng, hơi lồi giống như khuẩn lạc mọc trên môi trường XLD, tuy nhiên khả năng ức chế tạp khuẩn của XLT4 tốt hơn XLD

Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn là 37oC Tuy nhiên,

Salmonella cũng mọc tốt ở nhiệt độ 42oC Đặc tính này ứng dụng trong phân lập

Salmonella nhằm ức chế vi khuẩn khác trong bệnh phẩm bị ô nhiễm Môi trường có

pH 6,5 - 7,5 là thích hợp nhất cho sự phát triển của vi khuẩn Tuy vậy, Salmonella

có thể phát triển được ở pH từ 4,5 - 9,0 Nồng độ muối NaCl 3 - 4% trong môi

trường có thể ức chế sự phát triển của Salmonella (Nguyễn Như Thanh, 2001) [31]

1.1.2.3 Đặc tính sinh hóa

Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số đường nhất định và không đổi Phần lớn các loài Salmonella lên men có sinh hơi đường glucoza, mannit, mantoza, galactoza, levuloza, arabinoza Một số loài như S abortus equi, S

abortus bovis, S abortus ovis, S typhisuis, S typhi, S choleraesuis, S gallinarum,

S enteritidis cũng lên men các đường nhưng không sinh hơi Riêng S pullorum

không lên men mantoza, S choleraesuis không lên men arabinoza

Tất cả các vi khuẩn Salmonella đều không lên men lactoza, saccaroza

Trên môi trường có kalixyanua, tất cả các Samonella đều không mọc Khoảng 96% Salmonella tiết ra enzym khử cacboxyn đối với lyzin, ocnitin và arginin Đa số Salmonella khômg làm tan chảy gelatin, không phân giải urê, không sản sinh Indol Phản ứng MR, catalaza dương tính (trừ S cholerae suis, S gallinarum -

pullorum có MR âm tính) Phản ứng H2S dương tính (trừ S paratyphi A, S

abortusequi, S typhisuis) (Nguyễn Như Thanh, 2001) [31]

Sức đề kháng của vi khuẩn Salmonella:

S typhimurium có thể tồn tại hơn 7 tháng trong đất, nước, phân súc vật và

trên đồng cỏ (Nguyễn Như Thanh, 2001) [31]

Vi khuẩn Salmonella bị tiêu diệt ở nhiệt độ 600C trong một giờ, ở 750C trong

5 phút Ánh sáng mặt trời chiếu thẳng diệt vi khuẩn trong nước sau 5 giờ, trong

nước đục 9 giờ Salmonella tồn tại trong xác chết 100 ngày, trong thịt ướp muối ở

60C - 120C từ 4 đến 8 tháng Salmonella có khả năng tồn tại nhiều tháng trong phân,

đất, nước và trong chuồng nuôi động vật Vi khuẩn có sức đề kháng cao đối với các loại hóa chất, phải dùng NaOH nóng 3 - 4%, Formalin 2 - 5% thì mới tiêu diệt được chúng (Shivaprasad, 2013) [53]

1.1.2.4 Đặc điểm dịch tễ của Salmonella

Phạm Hồng Sơn (2002) [27] cho biết: Salmonella phân tán, lây lan nhanh, rộng rãi hơn ta tưởng Chỉ cần 1 con trong đàn bị ỉa chảy do Salmonella gây ra thì

24 giờ sau đó cả đàn đã bị lây nhiễm mầm bệnh Trong quá trình nổ ra dịch bệnh, vi

khuẩn Salmonella cũng được tìm thấy ở khắp mọi nơi như chuồng trại, rác rưởi,

thức ăn, nước uống

Nguồn bệnh là lợn trưởng thành mang trùng (mang và bài xuất vi khuẩn

Salmonella) Vi khuẩn Salmonella sống hoại sinh trong cơ thể lợn khỏe từ 25 - 50%

lợn khỏe mang trùng Lợn khỏi bệnh là vật mang trùng và bài tiết mầm bệnh

Salmonella ra ngoài theo phân (Phan Thanh Phượng, 1988) [26]

Lợn con trước cai sữa bệnh ít nổ ra, bởi chúng được bảo hộ qua sữa đầu Song nguy cơ nổ ra bệnh tăng dần theo lứa tuổi, đặc biệt là sau cai sữa Ở lợn bệnh

Phó thương hàn thể cấp tính gây nhiễm trùng huyết, rối loạn sinh sản là do S

choleraesuis và S kunzendorf gây ra Thể bệnh này gây bệnh theo phương thức

“truyền dọc” từ mẹ sang con Thể bệnh viêm ruột, ỉa chảy mãn tính ở lợn chủ yếu là

do S typhimurium gây ra Song loài vi khuẩn này lại lây truyền theo phương thức

“truyền ngang” từ lợn này sang lợn khác trong đàn (Laval A, 2000) [21]

Salmonella khó sinh sản trong nước thường nhưng có thể tồn tại 1 tuần; trong

nước đá có thể sống 2 - 3 tháng Trong xác động vật chết chôn ở bùn, cát có thể sống

2 - 3 tháng Trong thịt ướp muối (nồng độ muối 29%) Salmonella có thể sống được

4 - 8 tháng ở nhiệt độ từ 8 - 120C Vi khuẩn gây ra bệnh PTH cho lợn con từ 2 -

4 tháng tuổi với tỷ lệ tử vong khoảng 25%, có khi lên đến 95%; bệnh có thể ở lợn lớn với thể mãn tính và ít gây chết (Nguyễn Như Thanh, 2001) [31]

Theo các tác giả Phan Thanh Phượng (1988) [26]; Laval A (2000) [21]; Nguyễn

Như Thanh (2001) [31] khi nghiên cứu về đường nhiễm Salmonella đều cho rằng: vi khuẩn Salmonella theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hoá và có thể do tiếp xúc

Bình thường, chúng sống trong ống tiêu hoá mà không gây bệnh Chỉ khi nào sức đề kháng của lợn giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào máu và nội tạng gây bệnh

1.1.2.5 Cấu trúc kháng nguyên

Cấu trúc kháng nguyên của Salmonella hết sức phức tạp, gồm rất nhiều loại Theo Phạm Hồng Sơn (2002) [27] cho biết: Salmonella có hơn 67 loại kháng

nguyên O (có nhiều tài liệu công bố hơn 80 loại), 94 loại kháng nguyên H pha 1, hơn 11 kháng nguyên H pha 2, kháng nguyên K là kháng nguyên Vi Những năm

gần đây, người ta phát hiện thêm kháng nguyên Pili của Salmonella, yếu tố giúp vi

khuẩn bám dính vào tế bào biếu mô

Cần phân biệt 4 loại kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella là:

Kháng nguyên O (O-Antigen): kháng nguyên thân

Kháng nguyên H (H-Antigen): kháng nguyên lông

Kháng nguyên K (K-Antigen): kháng nguyên vỏ

Kháng nguyên F (Fimbriae Antigen): kháng nguyên Pili

Trong đó kháng nguyên có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán là kháng nguyên thân (O - Antigen) và kháng nguyên lông (H - Antigen)

* Kháng nguyên O

Kháng nguyên O - Lypopolysacharide (LPS) là một thành phần cơ bản tạo nên màng ngoài của thành phần tế bào vi khuẩn LPS có cấu tạo phân tử lớn, gồm 3 vùng riêng biệt: vùng ưa nước, vùng lõi và vùng lipid A

Kháng nguyên O là loại kháng nguyên chịu nhiệt, có thể chịu được 100oC trong nhiều giờ, chịu được cồn và HCl ở nồng độ 1N trong 20 giờ, là đơn vị cơ sở của kháng nguyên O thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm Kháng nguyên O không phải

là độc tố nhưng là yếu tố gây bệnh của vi khuẩn, giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của cơ thể, chống lại hiện tượng thực bào (Morris và cs, 1976) [47]

Kháng nguyên O của Salmonella rất phức tạp, theo Nguyễn Như Thanh (2001)

[31] người ta đã tìm thấy 65 yếu tố khác nhau, ký hiệu bằng số La mã hay Ả rập

* Kháng nguyên H

Kháng nguyên H của Salmonella bản chất là một protein nằm trong phần

lông của vi khuẩn Kháng nguyên H không chịu nhiệt, rất kém bền vững so với kháng nguyên O; bị phá huỷ ở 600C trong 1 giờ, dễ bị phá hủy bởi cồn và axit yếu

Kháng nguyên H không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, nhưng có ý nghĩa trong việc phân loại, định danh vi khuẩn

Kháng nguyên H không quyết định yếu tố độc lực, không có vai trò bám dính, nhưng có tác dụng bảo vệ vi khuẩn đường ruột tránh sự tiêu diệt của đại thực bào, giúp vi khuẩn sống và nhân lên trong tế bào gan, thận và ngay cả trong đại thực bào (Quinn P J và cs, 2002) [51]

Kháng nguyên H chia làm 2 pha:

Pha 1 có tính chất đặc hiệu, gồm có 28 kháng nguyên lông, được biểu thị bằng chữ la tinh thường: a, b, c, d, f, g nếu hết cả 28 chữ thì người ta sử dụng chữ

f và số đứng bên phải chữ f Ví dụ f5, f27

Pha 2 không có tính chất đặc hiệu, gồm có 6 loại, được biểu thị bằng chữ số

Ả rập: 1, 2, 3, 4, 5, 6

Pha 1 và pha 2 được biểu thị bởi H1 và H2 được kiểm tra bởi một phát động H2

(Promoter H2), nhờ sự phát động này mà có thể chuyển ngược lại một mặt thúc đẩy

H2 và ức chế H1 hoặc H2 bị ức chế còn H1 lại hoạt động (Carter G R, 1995) [36]

Kháng nguyên 5 dễ bị axit HCl phá hủy và tính chất ngưng kết của kháng nguyên 5 hoàn toàn bị phá hủy ở nhiệt độ 120o C, nhưng không bị phá hủy bởi cồn

Kháng nguyên Vi có sức đề kháng cao với cồn và axit HCl Kháng nguyên Vi không liên quan gì đến độc lực của vi khuẩn, nhưng đóng vai trò chính trong việc tạo miễn dịch chủ động và thụ động ở động vật và người (Morris và cs, 1976) [47]

Kháng nguyên M kháng nguyên của dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng nhầy Kháng nguyên Vi là một loại kháng nguyên có khả năng ngưng kết kháng thể O khi nó phát triển nhiều

* Kháng nguyên màng ngoài vỏ bọc (Outer Membrame Protein)

Lớp màng ngoài của Salmonella chứa protein có đặc tính đã được

hydrô hóa, thành phần này chiếm tới 5% toàn bộ kháng nguyên màng ngoài vỏ

bọc Kháng nguyên màng ngoài vỏ bọc của S typhymurium có 4 loại protein phân

chia theo trọng lượng phân tử, trong đó có 3 loại tạo kênh vận chuyển của màng tế bào Chức năng của kháng nguyên màng ngoài vỏ bọc chưa được xác định rõ, nhưng khi kháng nguyên màng ngoài vỏ bọc thay đổi cấu trúc thì ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của vi khuẩn

* Kháng nguyên pili - Fimbriae antigen

Kháng nguyên pili bản chất là protein, thành phần và trật tự các amino axit của mỗi kháng nguyên đều có những điểm khác biệt Đến nay, một số nhóm kháng

nguyên pili của Salmonella đã phát hiện gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật là

Colonization Factor Antigen (CFA) I và II (Trần Quang Diên, 2002) [11]

1.1.2.6 Các yếu tố gây bệnh của Salmonella

* Các yếu tố không phải là độc tố

+ Kháng nguyên O, K, H:

Kháng nguyên O là yếu tố giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của vật chủ, phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của đại thực bào (Morris và cs, 1976) [47]

Cũng theo Morris và cs (1976) [47] cho biết: khi thay đổi số lượng và chất lượng các hợp chất của kháng nguyên O sẽ dẫn đến sự thay đổi tính chất gây bệnh

của vi khuẩn Thành phần 9, 12 ở kháng nguyên O của vi khuẩn S enteritidis được

thay bằng thành phần 1, 4, 12 sẽ làm cho vi khuẩn không còn độc nữa, nhưng nếu trả lại thành phần cũ vi khuẩn lại có độc lực Thí nghiệm tương tự cũng được làm

với S cholerae suis và S typhimurium

Kháng nguyên H: không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, không quyết định yếu tố độc lực, nhưng kháng nguyên H có ý nghĩa bảo vệ vi khuẩn không bị tiêu diệt trong quá trình thực bào Chúng giúp vi khuẩn nhân lên trong tế bào gan, thận và cả tế bào đại thực bào (Carter G R, 1995) [36]

Kháng nguyên K: tạo hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào (Nguyễn Như Thanh, 2001) [31]

+ Yếu tố bám dính:

Theo Lê Văn Tạo (1994) [29]: trên mỗi tế bào vi khuẩn Salmonella có từ 2 đến 400 Fimbriae, với chức năng là giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao

ruột non để gây bệnh

Khả năng bám dính của vi khuẩn là yếu tố gây bệnh quan trọng, là bước đầu tiên của quá trình gây bệnh của vi khuẩn đường ruột, đó là quá trình liên kết vững chắc giữa bề mặt của vi khuẩn với bề mặt của tế bào vật chủ Quá trình bám dính: trước hết, vi khuẩn liên kết với từng phần của bề mặt tế bào; tiếp theo là quá trình hấp phụ và cuối cùng là quá trình tương tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn (đó

là phân tử Fimbriae type I) với điểm tiếp nhận trên bề mặt của tế bào (Nguyễn Như

Thanh, 2001) [31]

Đỗ Trung Cứ và cs (2003) [9] cho biết: 100% các chủng S typhimurium

phân lập từ lợn bị Phó thương hàn đều có khả năng bám dính trên bề mặt tế bào Vero với tỷ lệ cao (từ 70,76% - 93,48%), tương đương với khả năng bám dính của

chủng S typhimurium chuẩn

+ Khả năng xâm nhập:

Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác động làm tăng hàm

lượng Ca++ nội bào, hoạt hóa actin depolimeriring enzymes, làm thay đổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến đổi màng tế bào, dẫn đến hình thành giả túc bao vây tế

bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn Sau đó, Salmonella được

xâm nhập vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục phát triển nhân lên với số lượng lớn và phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh enterotoxin, làm xuất hiện quá trình tiêu chảy của vật chủ Các hạch viêm tích nước, biểu hiện viêm hạch có thể là hệ quả của đáp ứng

xâm nhiễm của Salmonella (Lê Văn Tạo, 1994) [29]

Gene plasmid không những tham gia trong quá trình xâm nhập, mà chúng còn có ý nghĩa quan trọng đối với sự sống sót và tồn tại của vi khuẩn bên trong tế bào vật chủ (Đỗ Trung Cứ và cs, 2003) [9]

+ Khả năng tổng hợp sắt của Salmonella:

Đây là khả năng quan trọng của Salmonella, là yếu tố làm suy yếu khả năng

chống đỡ của vật chủ do thiếu sắt và đồng thời giúp vi khuẩn tăng nhanh về số lượng

Vi khuẩn Salmonella có phản ứng với sự thay đổi cơ chế chu chuyển sắt; khi quá trình

tổng hợp sắt bị ức chế, chúng sẽ chuyển toàn bộ protein mang, điều phối sắt lên bề mặt của vi khuẩn làm cho khả năng hấp thụ sắt tăng cường một cách tích cực

+ Khả năng kháng kháng sinh:

Việc sử dụng rộng rãi các loại thuốc kháng sinh để phòng, trị bệnh, kích thích tăng trưởng cho gia súc, gia cầm, xử lý môi trường… đã tạo ra nhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc, giúp vi khuẩn tồn tại rất lâu trong cơ thể người, vật nuôi và môi trường

Theo kết quả nghiên cứu của Tô Liên Thu (2004) [32] cho biết: các chủng

Salmonella phân lập từ thịt gà kháng lại các loại kháng sinh thông thường như

streptomycin, ampicillin, tetracyclin với tỷ lệ cao Nhiều chủng Salmonella có đặc

tính đa kháng, có những chủng kháng lại 8 loại kháng sinh Cũng theo tác giả, khả

năng kháng kháng sinh của Salmonella có thể thay đổi, phụ thuộc vào địa phương

và thời điểm làm kháng sinh đồ, loại vật nuôi

Nghiên cứu của Phùng Quốc Chướng (2005) [11] cho biết: tại Đăk Lăk, khi

làm kháng sinh đồ với Salmonella phân lập từ gia súc, giai đoạn 1993 - 1995, mức

độ kháng thuốc của Salmonella còn ít; giai đoạn 1996 - 1998 tỷ lệ các chủng

Salmonella kháng thuốc có chiều hướng tăng, cao nhất là đối với penicillin

(56,66%), streptomycin (53,33%), sulfaguanidin (36,66%), ampicillin (26,66%);

giai đoạn 1999 - 2003, Salmonella có tỷ lệ kháng với ampicillin lên tới 93,75%…

* Các yếu tố là độc tố của vi khuẩn Salmonella

- Độc tố đường ruột (enterotoxin)

Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai yếu tố chính là yếu tố thẩm

xuất nhanh (Rapit Permeability Factor - RPF) và yếu tố thẩm xuất chậm (Delayed Permeability Factor - DPF)

+ Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô,

làm trương tế bào CHO (Chinese Hansten Ovary Cell) Yếu tố thẩm xuất nhanh có

cấu trúc, thành phần giống độc tố chịu nhiệt của E coli được gọi là độc tố chịu nhiệt

của Salmonella (Heat Stable Toxin-ST), cấu trúc phân tử gồm những chuỗi

polysaccarit và một số chuỗi poly-peptit phân tử lượng lớn hơn 90.000 dalton, chịu được ở nhiệt độ 1000C trong 4 giờ, nhưng bị phá huỷ nhanh khi hấp cao áp và bền vững ở nhiệt độ thấp Độc tố này làm tăng tính thấm thành mạnh, phá hủy các mạch máu cục bộ

Đỗ Trung Cứ và cs (2001) [8] cho biết: 72,7% các chủng Salmonella phân

lập được từ lợn sau cai sữa bị ốm, chết nghi PTH sản sinh ST

+ Yếu tố thẩm xuất chậm có thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của

E.coli, nên được gọi là độc tố không chịu nhiệt Salmonella (Heat Lable Toxin - LT),

cấu trúc phân tử gồm 3 chuỗi polypeptit và một số hợp chất khác, phân tử lượng 40.000 - 50.000 dalton Độc tố này bị phá hủy ở 700C trong 3 phút và 560C trong 4

giờ Độc tố không chịu nhiệt của Salmonella làm thay đổi quá trình trao đổi nước và

chất điện giải của cơ thể dẫn đến rút nước vào lòng ruột và gây tiêu chảy

Theo Đỗ Trung Cứ và cs (2003) 9 cho biết: khoảng 81,81% chủng S

typhimurium phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy sản sinh độc tố không chịu nhiệt

(LT) có khả năng gây tích nước trong ruột non của lợn thử nghiệm

- Nội độc tố (endotoxin):

Nội độc tố thường là Lipo polysaccharide (LPS) được phóng ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải Các cơ quan trong cơ thể vật chủ chịu sự tác động của nội độc tố với các biểu hiện bệnh lý tắc mạch máu, giảm trương lực cơ, thiếu oxy mô bào, toan huyết, rối loạn tiêu hóa

Nhiễm độc huyết trong bệnh Salmonellosis xuất hiện có liên quan đến sự giải

phóng nội độc tố từ tế bào vi khuẩn (Taylor, 1995) [56] Ở gan nội độc tố tác động làm cạn kiệt nguồn dự trữ cacbonhydrate, ức chế hoạt động enzym, ức chế chuyển hóa đường glucoza, tăng đường huyết tạm thời, sau đó làm giảm lượng đường huyết nghiêm trọng Làm tổn thương gan, nội độc tố làm tăng cường hoạt động của men tranaminaza huyết thanh, đồng thời làm giảm hoạt lực oxygenaza

Nội độc tố tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ, kích thích hình thành kháng thể, tăng tiết histamine, serotonia; ngưng kết tiểu cầu và gây tắc mạnh quản

LPS tác động lên quá trình biệt hóa các tế bào lympho B, tăng cường tổng hợp globulin miễn dịch (IgM và IgG); tăng cường chức năng của lâm ba cầu T và các tế bào miễn dịch trung gian

Sau khi bám lên “điểm tiếp nhận”, LPS được hấp thu, vận chuyển vào trong nguyên sinh chất tế bào Tại đây, chúng kết hợp với lysosomes hình thành dạng lysosomes thứ cấp, giải phóng các enzym, đẩy mạnh quá trình phân bào, đồng thời tăng cường tổng hợp mARN, phá hủy mitochodria và các bào quan khác (Shivaprasad và cs, 2013) [53]

1.1.3 Bệnh phó thương hàn vịt

1.1.3.1 Căn bệnh

Bệnh Phó thương hàn (Salmonellosis) ở thuỷ cầm là một bệnh truyền nhiễm

cấp hoặc mãn tính, bệnh gây ra bởi một hoặc nhiều giống vi khuẩn Sallmonella Vi khuẩn Salmonella phân bố rộng rãi trong tự nhiên Gia súc, gia cầm và người

thường bị nhiễm hoặc là nguồn mang vi khuẩn Bệnh Phó thương hàn ngan, vịt phân bố khắp nơi trên thế giới

Các chủng vi khuẩn Salmonella khu trú thường xuyên trong ruột và manh tràng của vịt, ngan Vịt, ngan ở mọi lứa tuổi đều mẫn cảm và có thể bị nhiễm Salmonella

Salmonella là vi khuẩn Gram âm, di động, không tạo nha bào, mọc tốt trong

môi trường nuôi cấy bình thường, Salmonella rất mẫn cảm với nhiệt độ và với hầu

hết các loại thuốc tẩy trùng Ở nhiệt độ bình thường, vi khuẩn tương đối bền vững Mầm bệnh xâm nhập chủ yếu qua thức ăn, nước uống, qua lòng đỏ trứng vịt, qua

vỏ trứng Từ phân, Salmonella thường gây ô nhiễm vỏ trứng trong quá trình đẻ hoặc

từ ổ đẻ (Nguyễn Như Thanh, 2001) [31]

1.1.3.2 Yếu tố truyền bệnh

Dụng cụ chăn nuôi, thức ăn, nước uống, các loài gặm nhấm và chim là các yếu tố truyền bệnh Vi khuẩn xâm nhập vào vật chủ chủ yếu qua đường tiêu hoá, mặt khác có thể qua đường hô hấp và trứng (Dương Thị Toan và cs, 2010) [33]

1.1.3.3 Đặc điểm dịch tễ học

Đường truyền lây bệnh do Salmonella gây nên trên vịt chủ yếu qua đường tiêu

hoá Thức ăn bị ô nhiễm, đặc biệt là thức ăn có nguồn gốc động vật như bột xương, bột

cá, bột thịt là các nguyên nhân lây lan dịch bệnh Kết quả điều tra của Phạm Hồng

Sơn (2002) [27] cho thấy: tỷ lệ nhiễm Salmonella từ các nguyên liệu thức ăn là khá

cao và là nguyên nhân gây nên một ổ dịch, phương thức truyền lây quan trọng nhất của

bệnh PTH vịt là truyền dọc - truyền trực tiếp qua trứng Vi khuẩn Salmonella từ vịt mẹ,

ổ đẻ, máy ấp, phân xâm nhập vào trứng rồi nhân lên trong phôi

Theo tác giả Bela Toth (1985) [4] cho biết: vịt ở mọi lứa tuổi đều mẫn cảm với bệnh, song bệnh có biểu hiện lâm sàng thường gặp ở vịt con, vịt trưởng thành ít biểu hiện triệu chứng lâm sàng, vịt mang trùng và bài xuất vi khuẩn ra ngoài theo phân

Vệ sinh môi trường kém, nước và thức ăn bị ô nhiễm, mật độ nuôi quá dày, stress do vận chuyển, thời tiết thay đổi đột ngột, vịt bị nhiễm ký sinh trùng hoặc bị

các bệnh do virus gây ra đều là các yếu tố làm cho vi khuẩn Salmonella có cơ hội

xâm nhập và gây bệnh (Nguyễn Thị Ngọc Liên, 1997) [22]

1.1.3.4 Quá trình gây bệnh

* Giai đoạn 1: Xâm nhập vào đường tiêu hoá

Vi khuẩn Salmonella có khả năng xâm nhập vào cơ thể qua đường hô hấp, tổ

chức liên kết nhưng con đường chính là qua đường miệng và tập trung ở ruột Quá trình này có sự tham gia tích cực của các thành phần trên bề mặt tế bào vi khuẩn đặc biệt là pili (Fimbriae) Fimbriae giúp tế bào vi khuẩn gắn vào điểm tiếp nhận trên tế bào biểu mô nhung mao ruột gây lên quá trình bệnh lý Các yếu tố đề kháng không đặc hiệu như: dịch vị dạ dày, khả năng nhu động của ruột non, màng nhầy, men Lysosyme và hệ

vi khuẩn đường ruột có tác dụng ngăn cản quá trình bám dính của tế bào vi khuẩn lên

tế bào biểu mô nhung mao ruột bằng cách che phủ các điểm tiếp nhận đặc hiệu đối với các yếu tố bám dính của vi khuẩn (Bela Toth, 1985) [4]

* Giai đoạn 2: Tấn công các tế bào biểu mô ruột

Timoney và cs (1988) [55] cho biết: sau khi bám vào điểm tiếp nhận đặc

hiệu, vi khuẩn Salmonella gây lên các biến đổi màng tế bào biểu mô nhung mao

ruột đặc biệt vùng hồi tràng và kết tràng rồi xâm nhập vào bên trong tế bào biểu mô Khả năng vi khuẩn sống sót và nhân lên bên trong tế bào thực bào là yếu tố quyết

định hậu quả của quá trình bệnh Cư trú bên trong tế bào, vi khuẩn có thể tránh được các tác động của kháng sinh, kháng thể và bổ thể Để tồn tại vi khuẩn cần chống lại các yếu tố bất lợi bên trong tế bào đại thực bào như: các chất hoá học trung gian (O2 hoạt động, H2O2), pH thấp, lượng Fe2+ hạn chế trong tế bào Quá trình viêm ruột dẫn đến phá huỷ thành mạch, biến đổi các tế bào biểu mô nhung mao ruột, thoái hoá hoại tử tế bào ruột, phá huỷ tế bào biểu mô gây lắng đọng fibrin dẫn đến phá huỷ thành ruột

* Giai đoạn 3: Kích thích bài xuất dịch thể

Phản ứng viêm do quá trình xâm nhập tế bào ruột của vi khuẩn là một yếu tố quan trọng kích thích bài xuất dịch thể Prostaglandins được giải phóng trong quá trình viêm đã hoạt hoá Adenylate cyclase - một enzyme có mặt trong màng tế bào biểu mô nhung mao ruột, chính enzyme này xúc tác chuyển hoá ATP thành AMPc AMPc nội bào tăng lên dẫn đến quá trình bài xuất Na+, Cl-, H2O ra khỏi tế bào vào xoang ruột Song song với các quá trình trên các chất hoạt động thành mạch quản do phản ứng viêm tạo ra đã làm tăng tính thấm thành mạch dẫn đến bài xuất dịch thể (Nguyễn Như Thanh và cs, 2001) [31]

1.1.3.5 Triệu chứng

Ở vịt con: bệnh thường ở thể cấp tính, cánh sã, lông xù, bỏ ăn, khát nước, ỉa chảy, phân màu trắng nhầy mùi thối khắm, lông vùng lỗ huyệt nhớp dính phân bết vào nhau, bụng sưng to do cục lòng đỏ chưa tiêu hết, ruột viêm làm cho vịt đau bụng kêu nhiều Vịt dồn lại gần nguồn nhiệt, một số vịt biểu hiện triệu chứng viêm khớp, què chân.Tỷ lệ chết phôi cao, vịt chết ngay trong lò ấp hoặc chết ngay trong

những ngày đầu mới nở Ở đàn vịt con bị bệnh Salmonellosis có hai cao điểm chết:

+ Tập trung vào tuần tuổi đầu: là những con nhiễm trùng từ mẹ, nhiễm trùng trong máy ấp nở

+ Khoảng 18-20 ngày tuổi: là những con nhiễm trùng sau khi nở

Theo Timoney và cs (1988) [55] cho biết: ở những đàn nuôi tập trung, mật độ nuôi quá dày, thức ăn mất cân đối về tỷ lệ các thành phần dinh dưỡng nhất là khẩu phần thiếu vitamin A, các yếu tố stress… càng làm cho bệnh phát triển mạnh Triệu chứng bệnh thể hiện rõ và điển hình nhất là ở vịt con trong 2 tuần tuổi đầu tiên

Ở vịt lớn: bỏ ăn, ủ rũ, xù lông, sã cánh, liệt chân và ỉa chảy nặng, phân loãng nhiều nước bọt vàng Con vật viêm buồng trứng, viêm ruột , bụng sưng to và có dáng đứng của chim cánh cụt Vịt bệnh thiếu máu, gầy sút nhanh, tỷ lệ đẻ giảm hoặc ngừng hẳn, trứng biến dạng méo mó, đầu to đầu nhỏ, vỏ xù xì có vệt máu hoặc không có vỏ

đá vôi, lòng đỏ lẫn máu (Bela Toth, 1985 [4])

1.1.3.6 Bệnh tích

Ở vịt con: xuất huyết tổ chức liên kết dưới da, các vùng hoại tử nhỏ lan tràn ở gan, tim, lách sưng to màu tím sẫm, ở manh tràng với những ổ hoại tử và vết loét lan tràn, trực tràng điểm xuất huyết to bằng đầu mũi kim hoặc đầu đinh ghim, khi viêm màng ngoài tim, viêm túi khí, khớp đầu gối và khớp cánh viêm làm con vật què, liệt chân, sã cánh

Ở vịt lớn: xuất huyết lớp mỡ vành tim, gan, ruột non, manh tràng, ruột già, hậu môn… lách sưng to màu tím sẫm như quả mận chín, tim, gan có những ổ hoại

tử lan tràn

Trong trường hợp bệnh ở thể mãn tính: xác chết gầy, xoang bụng chứa nhiều dịch rỉ viêm Buồng trứng viêm thoái hoá, trứng biến dạng, vỡ lòng đỏ gây viêm dính và hoại tử các cơ quan phủ tạng

1.1.3.7 Chẩn đoán

Theo Timoney và cs (1988) [55] để chẩn đoán chính xác bệnh do

Salmonella gây ra trên vịt gồm những phương pháp sau:

* Chẩn đoán dịch tễ học

Bệnh thường xảy ra quanh năm và hay gặp ở vịt con từ những ngày đầu sau khi nở Tỷ lệ chết phôi cao, tỷ lệ nuôi sống thấp là dấu hiệu đầu tiên nghi ngờ bệnh

do Salmonella gây ra

Căn cứ vào tính chất lưu hành bệnh quanh năm cũng như công tác điều tra, chăm sóc, quản lý, ô nhiễm môi trường, thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi…

có thể giúp cho công tác chẩn đoán được tốt hơn

* Chẩn đoán lâm sàng

Dựa vào các triệu chứng, bệnh tích và biến đổi giải phẫu bệnh lý tổ chức đại thể để kết luận chẩn đoán sơ bộ ban đầu

* Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

- Chẩn đoán vi khuẩn học:

+ Phân lập vi khuẩn Salmonella trực tiếp từ phân, lách, chất chứa trong manh

tràng… Phết kính nhuộm Gram rồi xem dưới kính hiển vi quan sát hình thái, tính chất bắt màu và các cấu trúc đặc biệt (lông, nha bào, giáp mô…) của vi khuẩn nếu có

+ Nuôi cấy vi khuẩn trên các môi trường thích hợp sau đó đọc kết quả

+ Tiêm động vật thí nghiệm: vi khuẩn sau khi đã phân lập từ các môi trường nuôi cấy, tiến hành gây bệnh cho chuột bạch hoặc vịt con, quan sát biểu hiện triệu chứng lâm sang của động vật gây bệnh và bệnh tích rồi tiến hành so sánh với triệu chứng, bệnh tích của vịt mắc bệnh trong tự nhiên

- Chẩn đoán huyết thanh học:

Phương pháp này được sử dụng trong chẩn đoán phát hiện sự có mặt của

kháng thể kháng Salmonella trong máu của gia cầm mắc bệnh Phương pháp này

đang được sử dụng rộng rãi ở các nước có ngành chăn nuôi gia cầm phát triển Một

số phương pháp chẩn đoán huyết thanh học được áp dụng trong chẩn đoán bệnh PTH vịt là phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính (Slide Agglutination Test), phản ứng kết hợp bổ thể (Complement Fixation Test), ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

1.1.3.8 Phòng bệnh

Chưa có vacxin hữu hiệu để phòng bệnh Phó thương hàn cho vịt Chủ động dùng kháng sinh với liều phòng cho vịt con ăn thường xuyên từ lúc bóc trứng đến khoảng 2 tuần tuổi thì ngăn chặn được bệnh, giảm tỷ lệ vịt con chết

Phòng bệnh rất có ý nghĩa và liên quan đến chế độ chăm sóc, vệ sinh và nuôi dưỡng vịt ở những tuần tuổi đầu Có chế độ nuôi vịt giống, xử lý và vệ sinh trứng, lò ấp trước khi đưa trứng vào ấp Diệt nấm, khử trùng máy ấp bằng Formol sẽ có tác dụng tốt

chống nhiễm Salmonella xâm nhiễm qua vỏ trứng Vệ sinh thú y: sát trùng chuồng trại,

bãi thả sau mỗi đợt xuất bán, thường xuyên tẩy uế máng ăn, máng uống

1.1.3.9 Điều trị

* Điều trị bằng thuốc

Hiện nay, vi khuẩn Salmonella có khả năng kháng lại rất nhiều loại thuốc

kháng sinh Do vậy, việc điều trị bệnh PTH vịt bằng kháng sinh phải dựa trên kết quả thử phản ứng kháng sinh đồ mới mang lại hiệu quả điều trị

Dung dịch nước sinh lý, chất điện giải có ý nghĩa rất lớn trong quá trình điều trị giúp cho cơ thể con vật đang điều trị bệnh duy trì cân bằng muối và nước, đặc biệt là những con bệnh trong tình trạng ỉa chảy, mất nước, thiếu máu nặng

* Điều trị bằng kháng huyết thanh

Điều trị bằng kháng huyết thanh là một trong những phương pháp điều trị nhanh nhất, có hiệu quả nhất, đặc hiệu nhất và cũng đắt tiền nhất Hiện nay, việc sử dụng kháng huyết thanh để phòng và chữa bệnh PTH vịt chưa được ứng dụng rộng rãi trong chăn nuôi

1.2 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn Salmonella

1.2.1 Nghiên cứu trên thế giới

Vào năm 1888 một vụ dịch xảy ra ở Anh tại một cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp đã gây chết 400 con Lúc bấy giờ người ta nghi đây là bệnh dịch tả gà, ngay

sau đó Klein phân lập được căn bệnh và đặt tên là Bacillus gallinarum Một vài năm

sau Lucet ở Pháp, Pfeiler và Rhese ở Đức cũng mô tả căn bệnh tương tự Hầu hết

các loài gia cầm như gà, gà tây, vịt, ngan, ngỗng và bồ câu đều bị nhiễm Salmonella

ở mọi lứa tuổi (Selbitz H.J và cs, 1995) [52]

Năm 1972, tại nước Anh đã tìm thấy vi khuẩn Salmonella có trong phân lợn

là 9,9% số mẫu kiểm tra; năm 1973, tiếp tục phát hiện Salmonella trong hạch ruột lợn ốm là 7,3% Tại Mỹ, năm 1984 đã xét nghiệm thấy Salmonella trong máu lợn chết là 4,3% Năm 1989, Hungari công bố tỷ lệ mẫu phân lợn có Salmonella tới

48% (Wilcock và cs, 1992) [59]

Tại các nước Đông Nam Á, đã có những nghiên cứu về các chủng

Salmonella gây bệnh trên vịt, một số tác giả đã phân lập được S typhimurium

từ một số ổ dịch tự nhiên xảy ra trên vịt con và vịt đẻ Tuy nhiên, các tác giả cũng

nhận thấy rằng vịt có sức đề kháng với Salmonella cao hơn so với gà S

typhimurium và S enteritidis được coi là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh cho vịt

Tại Thái Lan, đã phân lập được S typhimurium từ các ổ dịch tự nhiên xảy ra trên vịt

S.typhimurium và S.enteritidis là những tác nhân gây bệnh cho người phổ biến và nguy

hiểm có nguồn gốc từ gia cầm và sản phẩm của chúng (Selbitz H.J và cs, 1995) [52]

Ở Hà Lan, người ta phát hiện thấy 25% lợn khỏe có Salmonella Ở Anh, S

typhimurium nhiễm ở trâu, bò, đặc biệt là trâu, bò thương phẩm với tỷ lệ đến 30%

Trong các trại chăn nuôi trâu, bò ở Mỹ, sự có mặt của Salmonella là 16% Ở Otario

có 22% số trại chăn nuôi có Salmonella lưu hành (Wilcock P.B, 1995) [59]

Vi khuẩn Salmonella được tìm thấy ở tất cả các nước trên khắp thế giới ở

trong động vật khoẻ cũng như động vật ốm

Theo Laval A (2000) [21] cho biết: bệnh Phó thương hàn cấp tính ở lợn con

do S cholerae suis và S kunzendorf gây ra; bệnh viêm ruột mãn tính do S typhimurium Gây bệnh chủ yếu ở trâu, bò là S dublin, S enteritidis Các loài S abortus ovis, S

montevideo, S dublin, S anatum gây bệnh ở cừu S abortus equi là tác nhân chính

gây bệnh cho ngựa Còn ở gia cầm và chim chủ yếu do S pullorum-gallinarum, S

typhimurium, S enteritidis gây ra

Nghiên cứu của Angkititrakul (2005) [35] cho biết: Salmonella có tỷ lệ nhiễm

cao được phát hiện ở rất nhiều loài như lợn, trâu bò, gia cầm và con người

Theo Tsai HJ và cs (2005) [58] đã kiểm tra trên vịt và trang trại nuôi vịt tại

Đài Loan cho thấy 4,6% số vịt kiểm tra và 20% số trại bị nhiễm Salmonella

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ngay từ những năm 1951 - 1953, viện Pasteur Sài Gòn đã phân lập được

6 type Salmonella ở người và 35 type Salmonella ở lợn tại lò sát sinh Năm 1963,

Viện vệ sinh dịch tễ Hà Nội kiểm tra và phát hiện 6,3% mẫu phân của công nhân

giết mổ và 22% mẫu thịt lợn nhiễm Salmonella, với phần lớn là các type thuộc

nhóm E (Nguyễn Quang Tuyên, 1996 [34])

Nghiên cứu của Phùng Quốc Chướng (1995) [10] cho biết: trong thời gian 5 năm (1989-1994) xét nghiệm một lượng lớn mẫu phân lợn lấy từ các địa phương, xác định tỷ lệ lợn ở 4 tỉnh Tây Nguyên (Đắk Lắk, Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng)

nhiễm vi khuẩn Salmonella ở các vùng khác nhau, lợn các lứa tuổi và theo các mùa

trong năm Kết quả nghiên cứu cho thấy lợn nuôi tại Tây Nguyên có tỷ lệ nhiễm

Salmonella 24,83%; 15% số mẫu thức ăn thừa trong máng ăn, 30% số mẫu nước

rửa chuồng tại trại nhiễm Salmonella Tác giả đã theo dõi biến động số lợn nhiễm

Salmonella ở lợn khoẻ và ở lợn bị tiêu chảy

Nguyễn Thị Ngọc Liên (1997) [22], nghiên cứu bệnh Phó thương hàn vịt ở Hà

Tây cũ đã phát hiện vịt các lứa tuổi đều nhiễm Salmonella; vịt con (1 - 56 ngày tuổi)

nhiễm cao nhất (20,97% - 25,42%); vịt đẻ nhiễm thấp hơn (8,78% - 14,4%)

Nguyễn Văn Quang (1998) [28] đã có công trình nghiên cứu mang tính bao

quát về một số vi khuẩn hiếu khí thường gặp và vai trò của Salmonella trong hội

chứng tiêu chảy của bò, bê ở một số tỉnh Nam Trung Bộ

Cù Hữu Phú và cs (2000) [24] có công trình nghiên cứu Salmonella trong

bệnh tiêu chảy ở lợn 35 ngày đến 4 tháng tuổi nuôi xung quanh Hà Nội cho biết:

80% mẫu phân lợn tiêu chảy có nhiễm Salmonella Xác định đặc tính sinh học, khả năng sản sinh độc tố đường ruột của các chủng Salmonella phân lập được; các tác

giả đã chế thử nghiệm autovacxin phòng bệnh tiêu chảy cho lợn, kết quả đạt 89,22% lợn được phòng bệnh sau 4 tháng tiêm phòng Cũng theo tác giả, nghiên

cứu sự phân bố của Salmonella trong cơ thể lợn bị bệnh Phó thương hàn; đã tiến

hành gây viêm ruột cho 12 lợn sau cai sữa bằng cách cho uống nước muối và sau 10

giờ cho uống thêm 5 ml canh trùng Salmonella Sau 4 - 7 ngày lợn sốt (40 - 410C),

ỉa chảy phân khắm; chứng tỏ viêm ruột ở giai đoạn nhiễm trùng Và tiến hành xét nghiệm vi khuẩn 12 lợn trên, 100% bệnh phẩm lấy ở ruột; 85,71% đến 100% bệnh

phẩm là hạch lâm ba, gan, lách có Salmonella cả thể cấp tính và mãn tính

Nghiên cứu tình trạng nhiễm Salmonella của Trần Thị Hạnh và cs (2002)

[15], tại các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp, đã xác định vi khuẩn ở thức ăn hỗn hợp, nước uống, nước thải, chất độn chuồng, vỏ trứng và lòng đỏ trứng Kết quả cho

thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella cao nhất ở chất độn chuồng (80,00%); thấp nhất là vỏ

trứng và lòng đỏ trứng (18,29%)

Theo Võ Thị Trà An (2006) [1] đã nghiên cứu tỷ lệ nhiễm Salmonella trong

phân và thân thịt (bò, heo) tại một số tỉnh phía Nam dao động từ 20,00% - 90,00%

Nguyễn Ngọc Huân và cs (2008) [17] đã tiến hành nghiên cứu sự lưu hành

Salmonella trên vịt tại trại vịt giống Vigova, đã nghiên cứu trên các mẫu phân vịt,

trứng chết phôi ở lò ấp và mẫu nước môi trường Kết quả cho thấy, tỷ lệ nhiễm

Salmonella không cao (8,83%) và tỷ lệ nhiễm cao nhất là ở mẫu xét nghiệm trứng

chết phôi ở lò ấp (16,19%), thấp nhất là ở mẫu nước (0%)

Theo Đặng Xuân Bình và cs (2010) [6] đã nghiên cứu Salmonella trên thịt

lợn tươi được thu thập tại các chợ khu vực trung tâm thành phố Thái Nguyên từ

5/2009 đến 4/2010 chiếm từ 10% đến 19,5% mẫu thịt nhiễm Salmonella không đạt

tiêu chuẩn kỹ thuật

Nghiên cứu của Dương Thị Toan và cs (2010) [33] cho biết: tỷ lệ nhiễm

Salmonella trong thịt lợn tại cơ sở giết mổ ở tỉnh Bắc Giang là 12,5%

Trịnh Tuấn Anh và cs (2010) [2] nghiên cứu Salmonella trong bệnh tiêu chảy

ở lợn 1 ngày đến 90 ngày tuổi nuôi tại Thái Nguyên cho biết: Qua xét nghiệm 516

mẫu phân và bệnh phẩm lợn bệnh có 83 mấu nhiễm Salmonella spp (chiếm tỷ lệ

16,08%)

Theo Nguyễn Thị Chinh và cs (2010) [7] đã nghiên cứu Salmonella trên đàn

vịt tại hai tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang có tỷ lệ nhiễm 19,02% Tỷ lệ nhiễm cao nhất

là trứng chết phôi

Nghiên cứu của Lại Thị Lan Hương và cs (2017) [19], về tỷ lệ nhiễm

Salmonella trên thịt tại một số cơ sở giết mổ lợn trên địa bàn tỉnh Thanh Hóa cho

thấy: tỷ lệ nhiễm Salmonella ở 4 cơ sở là 8/67 mẫu (chiếm 11,94%)

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vật nuôi khảo sát dịch tễ học và bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra là các

giống vịt cỏ Vân Đình, vịt Bắc Kinh, vịt Siêu trứng CV 2000 Layer (vịt siêu đẻ) và ngan nội (vịt Xiêm)

- Vi khuẩn Salmonella phân lập được

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ 7/2016 đến 7/2017

- Địa điểm nghiên cứu: xã Trí Yên, xã Quỳnh Sơn, xã Lãng Sơn, xã Thắng Cương, xã Lão Hộ huyện Yên Dũng, tỉnh Bắc Giang

- Địa điểm xét nghiệm mẫu: được thực hiện tại Viện Khoa học sự sống-Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; Bộ môn Vệ sinh gia súc - Viện thú y Quốc gia; Phòng

Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu Hệ gen; Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Mẫu khảo sát tình hình nhiễm Salmonella ở vịt, ngan nội không có biểu hiện

lâm sàng: mẫu tampon hầu họng, mẫu tampon lau trứng, mẫu phân thải trừ của vịt

- Mẫu phân lập vi khuẩn Salmonella từ vịt mắc bệnh: Mẫu bệnh phẩm gan,

thận, lách, dịch ruột non (Intestinal contents), dịch ruột già (Ileum contents);

- Môi trường tăng sinh không chọn lọc: dung dịch đệm BPW

- Môi trường tăng sinh chọn lọc: Mueller Kauffumann

- Môi trường kiểm tra đặc tính di động của vi khuẩn Salmonella: MSRV

- Môi trường phân lập: XLT4, Rambach

- Các thuốc nhuộm và thuốc thử phản ứng sinh hóa

- Các loại đường để phản ứng lên men

- Kháng huyết thanh để định type vi khuẩn Salmonella

- Động vật thí nghiệm: chuột nhắt trắng 20 - 25g/con

- Dụng cụ, trang thiết bị máy móc phòng thí nghiệm vi sinh vật:

+ Thiết bị: tủ ấm, tủ lạnh, tủ mát, tủ hấp sấy, cân, buồng cấy vô trùng

+ Dụng cụ: pipet, ống nghiệm, chai lọ các loại,… và hóa chất cần thiết trong phòng thí nghiệm

+ Máy dập mẫu Stomacher; thiết bị PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac 300 (Bio-Rad, Mỹ), máy soi DNA Mini transilluminator (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy hút chân không Speed - Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Pulser, cùng với các trang thiết bị cần thiết khác

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát tình hình chăn nuôi và tỷ lệ mắc bệnh do Salmonella gây ra cho đàn vịt tại huyện Yên Dũng, tỉnh Bắc Giang

- Bệnh do Salmonella ở vịt theo giống

- Bệnh do Salmonella ở vịt theo tuổi

2.3.2 Nghiên cứu tình hình nhiễm Salmonella ở vịt

- Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở vịt theo giống

- Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở vịt theo tuổi

- Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở vịt theo tính biệt

- Tỷ lệ nhiễm Salmonella ở vịt theo mùa

2.3.3 Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm Salmonella trên trứng vịt

2.3.4 Phân lập vi khuẩn Salmonella từ mẫu bệnh phẩm vịt mắc bệnh PTH

2.3.5 Giám định đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn Salmonella phân lập được

2.3.6 Xác định serotype của vi khuẩn Salmonella phân lập được

2.3.7 Xác định gene quy định yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được 2.3.8 Xác định độc lực của vi khuẩn Salmonella phân lập được

2.3.9 Tính kháng kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn Salmonella phân lập được

2.3.10 Đề xuất quy trình phòng, trị bệnh PTH cho vịt

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp điều tra, khảo sát tình hình mắc bệnh do Salmonella gây

ra ở vịt

Điều tra trực tiếp điều kiện, phương thức chăn nuôi, thức ăn, nguồn nước, công tác phòng bệnh cho vịt tại một số hộ chăn nuôi

- Trực tiếp quan sát

- Phát phiếu điều tra kết hợp phỏng vấn

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu tình hình nhiễm Salmonella ở vịt

Để nghiên cứu tình hình nhiễm Salmonella ở vịt chúng tôi sử dụng phương

pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả và dịch tễ học phân tích (theo tài liệu của Nguyễn Như Thanh và cs, 2011)

Việc thu thập mẫu được tiến hành ngẫu nhiên tại các trang trại nuôi vịt Số mẫu phân được lấy ở 5 xã thuộc huyện Yên Dũng

Mẫu phân vịt mới thải ra được thu thập ngẫu nhiên vào các buổi sáng, để trong

lọ nhựa có nắp hoặc túi nilon buộc kín, có nhãn ghi các thông tin: giống vịt, tuổi, tính biệt và các biểu hiện lâm sàng của vịt (nếu có), thời gian và địa chỉ

Các loại mẫu được xét nghiệm ngay trong ngày hoặc xét nghiệm sau khi bảo quản theo quy trình bảo quản mẫu trong nghiên cứu vi sinh vật học

2.4.3 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella spp

Mẫu sau khi được thu thập và vận chuyển về phòng thí nghiệm, được áp dụng phương pháp nghiên cứu theo Tiêu chuẩn ISO

Sơ đồ phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella từ các mẫu bệnh phẩm và phân

(Nguồn: Viện thú y Quốc gia)

Bệnh phẩm (Phân,máu tim, gan, lách, thận, dịch ruột)

BPW(370C/18- 24 h)

LIM

(370C/ 20- 24 h) (370Malonate C/ 18- 24 h)

TSI (370C/ 18- 24 h)

Xác định

serotyp

Giữ giống

RV (420C/ 18- 24 h)

DHL

TM Salmonella(370C/ 20- 24 h)

Phản ứng lên men đường

Kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm

Xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh

Xác định các yếu tố độc lực

2.4.4 Phân lập vi khuẩn Salmonella

Bước 1: Tăng sinh không chọn lọc

Mẫu bệnh phẩm, phân, gan, thận, lách: lấy mẫu cho vào túi dập mẫu vô trùng rồi cân, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10 Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút Để tủ ấm

37oC trong vòng 16 - 18 h

Mẫu bệnh phẩm dịch ruột non, dịch ruột già: vô trùng bên ngoài rồi dùng kéo

và panh tuốt phân trong ruột cho vào túi dập mẫu vô trùng rồi cân, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10 Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút Sau đó để tủ ấm 37oC trong vòng 16 - 18 h

Mẫu tampon lau trứng: 6 mẫu tampon lau trứng làm thành 1 mẫu gộp vào túi dập mẫu vô trùng, cho dung dịch đệm BPW vào theo tỉ lệ 1/10 Đồng nhất mẫu với môi trường bằng máy dập mẫu (Stomacher) trong 1 phút với tốc độ 230 vòng/ phút

Để tủ ấm 37oC trong vòng 16 - 18h

Bước 2: Tăng sinh chọn lọc

Dùng pipet vô trùng hút 1 - 1,2ml dung dịch tăng sinh không chọn lọc, nhỏ 3

giọt vào thạch bán cố thể MSRV (để kiểm tra sự di động của vi khuẩn Salmonella),

để vào tủ ấm 41,50C/24-48h Còn lại cho vào ống nghiệm có chứa 10 ml môi trường Muller Kauffmann, dùng máy (vortex) lắc đều, để vào tủ ấm 370C/18 - 24h

Đọc kết quả: trên môi trường MSRV vi khuẩn mọc lan ra xung quanh giọt canh khuẩn Ở môi trường Muller Kauffmann hỗn dịch có thể biến đổi màu sắc

Bước 3: Phân lập trên các môi trường chọn lọc

Dùng que cấy có đường kính 1μm lấy 1 vòng canh trùng từ môi trường MSRV (lấy ở vị trí vi khuẩn lan xa nhất) ria cấy sang đĩa thạch Rambach, để tủ ấm 370C/18 -

24h Khuẩn lạc Salmonella tròn trơn, nhẵn bóng, có màu đỏ hoặc hồng cánh sen

Dùng que cấy có đường kính 10 μm lấy 1 vòng canh trùng từ ống tăng sinh Muller Kauffmann (trước khi lấy phải dùng máy lắc đều hỗn dịch trong ống) ria cấy sang đĩa thạch XLT4 Cấy làm 3 đường cấy và thưa dần để tách khuẩn lạc riêng rẽ

Để tủ ấm 370C/18 - 24h Khuẩn lạc Salmonella tròn, bóng lồi lên trên bề mặt thạch,

có màu đen

Bước 4: Kiểm tra tính chất sinh hoá

Từ môi trường XLT4 và môi trường Rambach chọn ra khuẩn lạc điển hình kiểm tra đặc tính sinh hoá trên môi trường Kligler, ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng và cấy chích sâu ở phần thạch đứng xuống tận đáy ống nghiệm, để tủ ấm

37oC/18 - 24 h, sau đó đọc kết quả:

+ Nếu phần thạch nghiêng có màu hồng: lactose âm tính

+ Nếu phần thạch đứng có màu vàng: glucose dương tính

+ Nếu có bọt khí: sinh hơi dương tính

+ Nếu dọc đường cấy trích sâu có màu đen: H2S dương tính

Những mẫu có phản ứng đặc trưng của vi khuẩn Salmonella trên môi trường

Kligler (Lên men đường glucose, không lên men đường lactose, sinh hơi, H2S dương tính) được cấy kiểm tra vào: urease, LDC (nuôi cấy yếm khí) và Simmons citrate, để tủ ấm 37oC/18 - 24h đọc kết quả:

+ LDC: dung dịch từ màu tím chuyển sang màu vàng, lysine âm tính

+ Simoncitrate: phần thạch nghiêng chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển

+ Ure: dung dịch có màu đỏ nhạt chuyển sang mầu hồng rất đậm, ure dương tính

Tiến hành định type theo bảng cấu trúc kháng nguyên của Kauffmann-White 2.4.5 Phương pháp xác định serotype của vi khuẩn Salmonella phân lập được

Trong đề tài này chúng tôi sử dụng kháng huyết thanh đơn giá O, H của hãng SIFIN (Đức) và Bio RAD (Pháp)

Sử dụng khay thuỷ tinh trong đó có các giếng nhỏ Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh vào giếng, dùng que cấy vô trùng lấy 1 phần khuẩn lạc cần định type từ thạch nuôi cấy, trộn đều khuẩn lạc và kháng huyết thanh, lắc nhẹ và quan sát:

+ Phản ứng dương tính: có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti

+ Phản ứng âm tính: huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đồng nhất không có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi đục

Đối với các chủng sau khi định được kháng nguyên O, H1 mà chưa định được type thì phải xác định pha 2 của kháng nguyên H Sau khi xác định kháng nguyên H pha 1 theo sơ đồ trên, tiến hành xác định pha 2 như sau:

- Chuẩn bị thạch Sven Gard: đây là môi trường bán cố thể, có bán sẵn trên thị trường, chỉ cần pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất Dùng đĩa có đường kính 6cm trước khi đổ thạch nhỏ 1 giọt nhỏ Anti Sven Gard Serum với mục đích ức chế pha 1.Tuỳ theo pha 1 mà có loại Anti Sven Gard Serum khác nhau ví dụ SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6

- Sau khi đã có thạch Sven Gard, dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn đã xác định được kháng nguyên H pha 1, chấm nhẹ lên bề mặt thạch ở giữa đĩa thạch Nuôi ở 37oC/24h Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính tương tự như đối với pha 1

2.4.6 Xác định gen sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp PCR

+ Thêm 540 μl extraction buffer vào mỗi mẫu, đảo trộn kỹ bằng máy vontex

để hòa tan tế bào

+ Bổ sung 5 μl protease K (20 mg/ml), đem ủ lắc ở 37oC trong 90 phút + Thêm 60 μl SDS 20 %, ủ ở 65oC trong 120 phút, có đảo trộn

+ Bổ sung 600 μl CI (Chloroform isoamylalcohol), vontex nhẹ, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC, sau đó thu pha trên ra ống eppendorf 1,5 ml mới

+ Thêm 600 μl CI (Chloroform isoamylalcohol), vontex nhẹ, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC, sau đó thu pha trên ra ống eppendorf 1,5 ml mới

+ Kết tủa ADN bằng 350 μl Isopropanol ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ + Ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC rồi thu tủa

+ Rửa tủa bằng 500 μl Ethanol 70 %, ly tâm 12000 v/p trong 15 phút ở 4oC, thu cặn