Xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn streptococcus suis gây viêm phổi, viêm khớp ở lợn tại bắc giang và biện pháp phòng trị

Xác định một số đặc điểm dịch tễ của bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn nuôi tại Bắc Giang ..... suis đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh đối với lợn, chúng thường gây các th

––––––––––––––––––––––––

NGUYỄN THỊ HƯỜNG

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT,

HÓA HỌC CỦA CÁC CHỦNG STREPTOCOCCUS SUIS

GÂY VIÊM PHỔI, VIÊM KHỚP Ở LỢN

TẠI BẮC GIANG VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG, TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - 2017

––––––––––––––––––––––––

NGUYỄN THỊ HƯỜNG

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH VẬT,

HÓA HỌC CỦA CÁC CHỦNG STREPTOCOCCUS SUIS

GÂY VIÊM PHỔI, VIÊM KHỚP Ở LỢN TẠI BẮC GIANG VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG, TRỊ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác và chưa từng sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn chính xác và đã được chỉ rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng năm 2017

Tác giả

Nguyễn Thị Hường

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân Nhân dịp này tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc, Ban quản lý Sau đại học Đại học Thái Nguyên, Ban lãnh đạo trường Đại học Nông Lâm, phòng quản lý sau đại học và khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo thạc sĩ tại trường

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; Trung tâm Nghiên cứu và Bảo tồn giống vaccine, Công ty cổ phần MARPHAVET, Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Bắc Giang đã nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy hướng dẫn khoa học là GS.TS Nguyễn Quang Tuyên, Đại học Thái Nguyên đã trực tiếp hướng dẫn giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và các thầy cô giáo - Trung tâm nghiên cứu và bảo tồn giống vaccine, Công ty cổ phần MARPHAVET đã giúp đỡ, chia sẻ ý kiến quý báu và hướng dẫn thực hiện thí nghiệm để tôi hoàn thiện đề tài nghiên cứu Tôi xin cảm ơn lãnh đạo đơn vị Chi cục Chăn nuôi và Thú y, các anh chị đồng nghiệp đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Tôi luôn biết ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Thái Nguyên, tháng năm 2017

Tác giả

Nguyễn Thị Hường

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài 3

1.1.1 Một số hiểu biết về vi khuẩn Streptococcus suis 3

1.1.2 Bệnh do vi khuẩn S suis gây ra ở lợn 8

1.2 Nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn S suis gây bệnh trên lợn 15

1.2.1 Những nghiên cứu nước ngoài 15

1.2.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam 17

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng, phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 19

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 19

2.1.4 Nguyên, vật liệu dùng cho nghiên cứu 19

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.2.1 Xác định một số đặc điểm dịch tễ của bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn nuôi tại Bắc Giang 20

2.2.2 Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn S suis ở

lợn mắc viêm phổi, viêm khớp tại tỉnh Bắc Giang 20

2.2.3 Nghiên cứu biện pháp phòng, trị bệnh viêm phổi, viêm khớp cho lợn 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ 21

2.3.2 Phương pháp lấy mẫu 23

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S suis 23

2.3.4 Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập được 25

2.3.5 Phương pháp xác định serotype của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được bằng phản ứng PCR 27

2.3.6 Phương pháp tính LD50 của vi khuẩn S suis trên chuột bạch 28

2.3.7 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn 29

2.3.8 Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được trên động vật thí nghiệm 29

2.3.9 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được 29

2.3.10 Xây dựng phác đồ điều trị lợn mắc viêm phổi, viêm khớp 30

2.3.11 Phương pháp chế tạo Autovaccine thử nghiệm từ các chủng vi khuẩn S suis phân lập được 31

2.3.12 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch ở lợn sau tiêm Autovaccine 34

2.3.13 Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể ở lợn đã được tiêm Autovaccine bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp 34

2.3.14 Phương pháp xử lý số liệu 35

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Kết quả điều tra một số đặc điểm dịch tễ bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn tại Bắc giang 36

3.1.1 Kết quả xác định tỷ lệ lợn ốm, chết do viêm phổi, viêm khớp tại một số huyện của tỉnh Bắc Giang 36

3.1.2 Kết quả xác định tỷ lệ lợn ốm, chết do viêm phổi, viêm khớp tại Bắc Giang theo

lứa tuổi 40

3.2 Kết quả phân lập, xác định một số đặc điểm sinh vật, hóa học của vi khuẩn S suis gây bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn 45

3.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn S suis 45

3.2.2 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng S suis phân lập được 47

3.2.3 Kết quả xác định serotype của chủng S suis phân lập được 49

3.2.4 Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng S suis phân lập được 52

3.2.5 Kết quả kiểm tra độ mẫn cảm của các chủng S suis phân lập được 53

3.3 Thử nghiệm biện pháp phòng, điều trị lợn mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp ở tỉnh Bắc Giang 55

3.3.1 Chế tạo Autovaccine thử nghiệm phòng bệnh cho lợn mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp do S suis gây ra 55

3.3.2 Kết quả xác định độ dài dịch và hiệu lực của Autovaccine ở lợn nuôi tại tỉnh Bắc Giang 61

3.3.3 Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị lợn mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp do S suis gây ra 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

MỘT SỐ HÌNH ẢNH CỦA ĐỀ TÀI 80

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

BHI: Brain Heart Infusion

CPS: Capsule polysaccharide

ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbert Assay

IHA: Indirect HaemagLun Z Ration test

PBS: Phosphat buffer solution

PCR: Polymerase Chain Reaction

PYRA: Pyrrolidonyl Arylamidase

TYE Tryptone Yeast Extract Broth

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi dùng để xác định các serotype 1, 2, 7 và 9 của vi

khuẩn S suis 27

Bảng 2.2 Thành phần các chất trong phản ứng MP - PCR dùng để xác định một số gen mã hoá các yếu tố độc lực 28

Bảng 2.3 Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định một số gen mã hoá các yếu tố độc lực 28

Bảng 2.4 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo NCCLS – 2002 30

Bảng 2.5 Thí nghiệm kiểm tra an toàn của Autovaccine trên chuột bạch 32

Bảng 3.1 Tỷ lệ lợn ốm, chết do viêm phổi, viêm khớp tại một số huyện của tỉnh Bắc Giang 36

Bảng 3.2 So sánh nguy cơ lợn mắc viêm phổi giữa các huyện 38

Bảng 3.3 So sánh nguy cơ lợn mắc viêm khớp giữa các huyện 39

Bảng 3.4 Tỷ lệ lợn ốm, chết do viêm phổi, viêm khớp theo lứa tuổi 40

Bảng 3.5 So sánh nguy cơ mắc viêm phổi giữa các lứa tuổi lợn 42

Bảng 3.6 So sánh nguy cơ mắc viêm khớp giữa các lứa tuổi lợn 44

Bảng 3.7 Kết quả phân lập vi khuẩn S suis từ lợn mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp 46

Bảng 3.8 Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được 47

Bảng 3.9 Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được bằng hệ thống API 20 Strep 49

Bảng 3.10 Kết quả xác định serotype của chủng S suis phân lập được 50

Bảng 3.11 Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng S suis phân lập được 52

Bảng 3.12 Kết quả xác định mức độ mẫn cảm của các chủng S suis phân lập được với một số kháng sinh 54

Bảng 3.13 Kiểm tra đậm độ của vi khuẩn để chế tạo vaccine 56

Bảng 3.14 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu thuần khiết của canh trùng chế tạo

Autovaccine 57

Bảng 3.15 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu vô trùng 2 lô Autovaccine chế tạo 58

Bảng 3.16 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của Autovaccine 59

Bảng 3.17 Kết quả kiểm tra hiệu lực của Autovaccine trên chuột bạch 60

Bảng 3.18 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vaccine trên lợn thí nghiệm 61

Bảng 3.19 Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch của lợn sau khi tiêm Autovaccine thí nghiệm 1, 2, 3, 4 tháng 63

Bảng 3.20 Kết quả xác định tỷ lệ lợn nghi mắc viêm phổi, viêm khớp ở vùng tiêm và vùng không tiêm Autovaccine 65

Bảng 3.21 So sánh nguy cơ mắc bệnh viêm phổi do không tiêm Autovaccine 66

Bảng 3.22 Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn tại Bắc Giang 69

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn S suis (Viện Thú y Quốc gia) 24 Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình chế tạo Autovaccine (Viện Thú y quốc gia) 33 Hình 3.1 Biểu đồ tỷ lệ lợn mắc, chết do bệnh viêm phổi, viêm khớp tại một số

huyện của tỉnh Bắc Giang 37 Hình 3.2 Biểu đồ tỷ lệ lợn mắc, chết do bệnh viêm phổi, viêm khớp theo lứa tuổi 41 Hình 3.3 Kết quả phản ứng PCR xác định serotype của vi khuẩn S suis 51 Hình 3.4 Biểu đồ tính mẫn cảm mạnh và khả năng kháng thuốc của các chủng

vi khuẩn S suis phân lập được 55

Hình 3.5 Biểu đồ hiệu giá kháng thể của lợn sau tiêm Autovaccine thử nghiệm

1 tháng, 2 tháng, 3 tháng và 4 tháng 64

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Bắc Giang là tỉnh có nghề chăn nuôi lợn phát triển đem lại nguồn thu nhập cao cho nhiều hộ gia đình, theo thống kê chăn nuôi (1/10/2016) tổng đàn lợn của tỉnh đạt 1.305.942 con (trong đó 202.065 lợn nái, 1.102.500 lợn thịt), tổng sản lượng thịt hơi là 172.512 tấn [3], đây không chỉ là nguồn cung cấp thực phẩm trong tỉnh mà còn xuất đi nhiều tỉnh thành trong cả nước Vì vậy, chăn nuôi lợn thực sự chiếm vị thế quan trọng trong ngành chăn nuôi nói riêng, cũng như phát triển kinh

tế của tỉnh Bắc Giang nói chung Tuy nhiên, tình hình dịch bệnh trên đàn lợn trong thời gian gần đây có nhiều diễn biến phức tạp, gây nhiều thiệt hại cho sản xuất chăn nuôi, theo báo cáo tổng kết công tác thú y năm 2016 [2] của Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Bắc Giang, năm 2016 dịch bệnh đã làm cho 102.220 con lợn bị ốm, 5.145 con bị chết

Vi khuẩn Streptococcus suis (S suis) đóng vai trò quan trọng trong quá trình

sinh bệnh đối với lợn, chúng thường gây các thể bệnh ở đường sinh sản, hô hấp, viêm não, viêm khớp Chúng thường khu trú ở họng, amidan, xoang mũi của lợn (đường hô hấp trên của lợn khỏe) khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ xâm nhập vào các

cơ quan, phủ tạng và gây bệnh cho lợn, đồng thời đây cũng là nguồn lây bệnh cho những con lợn khác khi nhốt chung đàn hay truyền nhiễm từ lợn mẹ sang lợn con Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên (1993) [14] đã điều tra hệ vi khuẩn đường hô

hấp của 162 lợn bị bệnh ho thở truyền nhiễm nhận thấy vi khuẩn S suis chiếm tỷ lệ

74%; hay nghiên cứu của Harry H và cs (1992) [40] về các vi khuẩn gắn liền với

lợn viêm khớp, trong 153 mẫu khớp của lợn đem phân lập cho kết quả vi khuẩn S

suis chiếm 16%, đứng thứ 2 sau E rhusiopathiae là 45% Theo nghiên cứu của Cù

Hữu Phú (1998) [15] đã phân lập được vi khuẩn S suis từ bệnh phẩm của lợn ốm, chết nghi do vi khuẩn S suis gây nên là rất cao: Khu vực chăn nuôi tập trung chiếm

tỷ lệ 93,9% và khu vực chăn nuôi phân tán (gia đình) là 95,3%

Không chỉ gây thiệt hại trên đàn lợn S suis còn gây bệnh nguy hiểm cho con

người, dịch bệnh liên cầu lợn đã xảy ra ở Trung Quốc từ 22/7/2005 đến ngày 5/8/2005 có 215 ca ở người mắc, trong đó có 39 ca tử vong (chiếm tỷ lệ 18,1%)

(Lun Z.R và cs., 2007) [49] Trong nhiều năm trở lại đây, Việt Nam cũng đã ghi nhận nhiều ca mắc và tử vong do mắc liên cầu

Xuất phát từ tình hình thực tiễn, nhằm đáp ứng cơ sở khoa học cho việc

phòng, chống bệnh ở lợn do S suis gây ra, tạo tiền đề cho ngành chăn nuôi lợn

trong nước nói chung và trong tỉnh nói riêng ngày càng đứng vững, phát triển, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn Streptococcus suis gây viêm phổi, viêm khớp ở lợn tại Bắc Giang và biện pháp phòng trị”

2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập và xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi

khuẩn Streptococcus suis gây bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn phân lập được tại

Bắc Giang

Thử nghiệm một số biện pháp phòng, trị bệnh ở lợn do S suis gây ra có hiệu

quả cao, góp phần thúc đẩy chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Bắc Giang phát triển

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ bổ sung vào tài liệu khoa học về đặc điểm

sinh học và vai trò của vi khuẩn S suis gây viêm phổi, viêm khớp ở lợn trên địa bàn

tỉnh Bắc Giang; đề xuất biện pháp phòng, trị bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn do

Streptococcus suis gây ra cho hiệu quả cao

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo để chế tạo vaccine, kháng thể… phòng bệnh và sử dụng kháng sinh điều trị viêm phổi, viêm khớp cho hiệu quả cao, góp phần phục vụ công tác phòng, chống dịch bệnh cho đàn lợn nuôi tại Bắc Giang

Kết quả thử nghiệm biện pháp phòng, trị bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn

có hiệu quả sẽ giúp tăng thu nhập kinh tế cho các hộ chăn nuôi, góp phần phát triển

bền vững nghề chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Bắc Giang

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

1.1.1 Một số hiểu biết về vi khuẩn Streptococcus suis

1.1.1.1 Hình thái, tính chất bắt màu

Vi khuẩn S suis thuộc giống Streptococcus, họ Streptococcaceae, bộ

Lactobacillales, lớp Bacilli

Vi khuẩn S suis có hình cầu hoặc hình bầu dục, đường kính khoảng 1 µm

Vi khuẩn bắt màu Gram dương, không di động, không sinh nha bào Vi khuẩn thường đứng thành chuỗi như chuỗi hạt, có độ dài ngắn không đều nhau tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy, từ 2 cầu khuẩn tạo thành song cầu khuẩn cho đến chuỗi có 6-10 cầu khuẩn và dài hơn tạo thành liên cầu khuẩn Trong bệnh phẩm, vi khuẩn đứng thành chuỗi ngắn, thường có từ 2-8 đơn vị Trong môi trường lỏng, vi khuẩn thành chuỗi dài (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001) [21]

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2005) [7] vi khuẩn bắt màu dễ dàng với một số loại thuốc nhuộm thông thường, thuộc nhóm vi khuẩn gram dương, yếm khí tùy tiện

và không di động Vi khuẩn không sinh nha bào, nhưng có khả năng hình thành giáp mô Sự hình thành giáp mô có thể xác định được khi chúng sinh sống trong các

mô hoặc phát triển trong các môi trường nuôi cấy có chứa huyết thanh

Vi khuẩn được nuôi cấy sau 18 giờ chủ yếu là có dạng hình cầu, kích thước

0,5-1 μm, đứng thành dạng chuỗi 5-0,5-10 tế bào Trong canh trùng già, sau 30 giờ nuôi cấy, vi khuẩn có thể thay đổi tính chất bắt màu, chuỗi cũng thấy dài hơn Đặc biệt, khi nuôi cấy trong môi trường dạng lỏng, hình thái các chuỗi được nhìn thấy rõ nhất Khi làm tiêu bản trực tiếp từ bệnh phẩm lấy từ động vật, có thể quan sát thấy vi khuẩn có hình cầu, nhưng ở môi trường phân lập ban đầu, có thể nhầm với trực khuẩn ngắn

1.1.1.2 Đặc tính nuôi cấy

Theo Nguyễn Như Thanh và cs (2001) [21] liên cầu khuẩn là những vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy tiện, mọc tốt ở tất cả các môi trường phần lớn các liên cầu gây bệnh thích hợp ở nhiệt độ 37oC

Môi trường nước thịt: vi khuẩn hình thành hạt hoặc những bông, rồi lắng xuống đáy ống Vì vậy, sau 2 giờ nuôi cấy môi trường trong, đáy ống có cặn

Môi trường thạch thường: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S, khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám Khi làm tiêu bản, liên cầu không xếp thành chuỗi dài mà thường hình thành chuỗi ngắn

Trên môi trường đặc: có thể quan sát thấy khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy với kích thước khoảng 1-2 mm, còn sau 72 giờ thì kích thước khuẩn lạc lớn nhất, có thể đạt tới 3-4 mm Nếu được nuôi trong điều kiện có 5-10% CO2 thì khuẩn lạc sẽ phát triển nhanh hơn và rộng hơn Khuẩn lạc thường tạo chất nhầy mạnh, độ nhầy càng rõ và tăng nếu như vi khuẩn được nuôi cấy vài giờ trong môi trường nước thịt có bổ xung huyết thanh trước khi cấy sang môi trường đặc hoặc thạch máu Dạng khuẩn lạc trên môi trường thạch thường nhỏ và khô hơn trên môi trường có bổ xung dinh dưỡng

Trên môi trường thạch máu: sau 24 nuôi cấy, hình thành khuẩn lạc nhỏ, hơi vồng và sáng trắng Có thể quan sát thấy các kiểu dung huyết gồm: dung huyết kiểu α: vùng dung huyết xung quanh khuẩn lạc thường có màu xanh (dung huyết từng phần hay dung huyết không hoàn toàn); dung huyết kiểu β: bao quanh khuẩn lạc là một vùng tan máu hoàn toàn trong suốt, có bờ rõ ràng do Hemoglobin được phân huỷ hoàn toàn; dung huyết kiểu  (hay còn gọi là không dung huyết): không làm biến đổi thạch máu

Trên môi trường MacConkey: vi khuẩn mọc tốt, sau 24 giờ nuôi cấy, hình thành các khuẩn lạc nhỏ bằng đầu đinh ghim

Trịnh Phú Ngọc và cs (1999) [11] đã tiến hành nghiên cứu tính chất vi

khuẩn học của các chủng Streptococcus phân lập từ lợn ở các tỉnh phía bắc Việt

Nam và cho kết quả như sau: trên môi trường thạch thường: khuẩn lạc mọc yếu, khuẩn lạc trắng, trong, tròn, gọn; trên thạch máu: mọc tốt, khuẩn lạc trắng, hơi lồi, tròn, gọn, mịn, dung huyết; trên thạch huyết thanh: khuẩn lạc nhỏ, trắng, hơi lồi, trong mịn, gọn, có ánh xanh trong; trên thạch Edward: khuẩn lạc nhỏ mịn, ướt, tròn gọn, trong, mặt hơi lồi, màu hơi tím; trên thạch Shapman: không mọc màu đỏ tươi Trên nước thịt 5% huyết thanh: mọc tốt, hơi đục

1.1.1.3 Đặc tính sinh hóa

Theo nghiên cứu của Trịnh Phú Ngọc và cs (1999) [11] các chủng

Streptococcus phân lập được từ lợn ở các tỉnh phía bắc Việt Nam kiểm tra đặc tính

sinh hóa cho kết quả:

100% lên men trên các loại đường: glucose, lactose, galactose, saccarose, fructose, salicin, trehalose, rhamnose

Tất cả các chủng đều không lên men với các loại đường: sorbit, dulcit, mannit, inulin, xylose, a-rabinose, dextrose, glycerol

Các phản ứng Oxydase, Catalase, Indol: Âm tính

1.1.1.4 Sức đề kháng

Clifton-Hadley F.A và cs (1986a) [29] đã chỉ ra rằng: S suis có thể tồn tại trong

môi trường nhiều ngày Vi khuẩn tồn tại tới 6 tuần trong thịt lợn hoặc xương ướp lạnh và

có thể tìm thấy ở gia súc sống (hạch amidan là chỗ thích hợp nhất) hoặc các bệnh phẩm

sau khi gia súc chết S suis tồn tại lâu trong đờm, chất bài xuất có protein

Vi khuẩn có sức đề kháng tốt trong môi trường acid nên vẫn phát triển bình thường ở pH = 4 Vì vậy, trong đồ ăn phế thải của người để làm thức ăn cho gia súc,

số lượng vi khuẩn đều tăng trong quá trình lên men

Ở 0oC: vi khuẩn có thể sống được 54 ngày trong bụi, 104 ngày trong phân lợn

Ở 9oC: vi khuẩn có thể sống được 25 ngày trong bụi, 10 ngày trong phân lợn

Ở 25oC: vi khuẩn có thể sống được 24 giờ trong bụi, 8 ngày trong phân

Ở 40oC: vi khuẩn có thể sống được 6 tuần và đây có thể là nguồn lây nhiễm tiềm tàng cho con người

Ở 50oC: vi khuẩn bị diệt trong vòng 2 giờ

Ở 60oC: vi khuẩn bị diệt trong vòng 10 phút

S suis type 2 còn được tìm thấy trên xác những con lợn đã thối rữa trong các

trang trại với thời gian tồn tại là trong 6 tuần ở 4oC và 12 ngày ở 22-25oC Đây chính

là nguồn lây nhiễm bệnh quan trọng một cách gián tiếp thông qua các động vật truyền bệnh trung gian như chim, mèo, chuột hoặc chó

Trịnh Phú Ngọc và cs (1999) [11]: vi khuẩn S suis có sức đề kháng kém đối

với nhiệt độ và hóa chất: ở 70oC liên cầu chết trong vòng 35-40 phút, ở 100oC chết trong 1 phút; các chất sát trùng thông thường dễ tiêu diệt được vi khuẩn

Lê Văn Tạo (2005) [18] cho biết vi khuẩn S suis dễ bị diệt bởi nhiều chất sát

trùng như: phenol, iod, hypochlorid, acid phenic 5% diệt vi khuẩn trong vòng

3-15 phút, formol 1% diệt vi khuẩn trong vòng 60 phút, cồn 70o diệt vi khuẩn trong vòng 30 phút Vi khuẩn có thể sống trong xác lợn chết ở 40oC trong 6 tuần Vi khuẩn tồn tại lâu trong đờm, chất bài xuất có protein Tuy nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại ở trên hạch amidan lợn mang trùng hơn 1 năm, ngay khi các yếu tố thực bào, kháng thể và bổ sung kháng sinh phù hợp trong thức ăn

1.1.1.5 Phân loại

Nếu chỉ căn cứ vào các đặc tính sinh hoá để phân loại vi khuẩn S suis thì sẽ

không chính xác bởi vì tất cả các serotype đều có các tính chất sinh hóa tương tự nhau

Trước đây, S suis được phân loại huyết thanh học thành các nhóm theo ký

hiệu S, R, RS và T (De Moor C.E., 1963) [32] Sau đó, các nhóm S, R và RS này lần lượt được thay thế bằng các serotype ký hiệu lần lượt là 1, 2 và 1/2 (Elliot S.D.,

1966 [33]; Windsor R.S., Elliott S.D., 1975 [65]), còn nhóm T được thay thế bằng serotype 15 (Gottschalk M và cs., 1989) [38]

Các chủng S suis được phân thành 35 serotype dựa trên cấu trúc kháng

nguyên polysaccharide của giáp mô (ký hiệu từ 1 đến 34 và 1/2) (Petch B và cs.,

1983 [52]; Higgins R và cs., 1995 [42]) Trong đó, đáng chú ý nhất là các chủng thuộc serotype 2 phân lập được thường xuyên nhất ở lợn và cũng là nguyên nhân gây ra các thể bệnh nguy hiểm khác nhau ở lợn và người Các chủng thuộc các serotype khác nhau có đặc tính gây bệnh khác nhau và gây ra các thể bệnh khác nhau Thậm chí các chủng vi khuẩn thuộc cùng 1 serotype cũng có thể gây ra các thể bệnh khác nhau do vùng địa lý mà chúng phân bố Một số serotype không có độc lực và có thể được phân lập từ lợn khỏe mạnh, không có triệu chứng lâm sàng như các serotype 17, 18, 19 và 21 (Higgins R và cs., 2002) [43]

Đỗ Ngọc Thúy và cs (2009) [24] xác định serotype trong 211 chủng S suis

phân lập được từ lợn tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam: số chủng thuộc serotype 2 chiếm tỷ lệ cao nhất 14/211 chủng (6,6%); serotype 9 có 10/211 chủng (4,7%); serotype 9, 31, 32 có 7/211 chủng (3,3%); các serotype 7, serotype 17 và serotype

21 có tỷ lệ tương đương là 1,4%; serotype 8 chiếm 0,9%

1.1.1.6 Các loại kháng nguyên của S suis

Vi khuẩn S suis có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp Có rất nhiều kháng

nguyên đã được tìm thấy đó là:

Kháng nguyên thân (Somatic antigen): kháng nguyên thân có ý nghĩa quan trọng trong việc quyết định các yếu tố dịch tễ và độc lực của vi khuẩn Kháng nguyên thân nằm ở thành vi khuẩn (Cell wall) và được cấu tạo bởi các phân tử peptidoglycan ở lớp trong cùng (N-acetylglucosamine và N-acetylmuramic acid), tiếp đến là lớp giữa gồm các polysaccharide (N-acetylglucosamine và rhamnose), lớp ngoài cùng là các protein gồm M protein, lipoteichoic acid, R và T protein

Kháng nguyên bám dính (Fimbriae antigen): vai trò của kháng nguyên bám

dính của S suis còn chưa được biết đến một cách rõ ràng, nhưng có ý kiến cho rằng

chúng đóng vai trò quan trọng trong việc giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào biểu

mô Vi khuẩn S suis là một trong số ít các loại vi khuẩn gram dương có mang cấu trúc này So với các loại vi khuẩn khác thì kháng nguyên bám dính của S suis có

cấu trúc mỏng, ngắn, đường kính khoảng 2 m, và dài có khi tới 200 m (Jacques

M và cs., 1990) [46]

Kháng nguyên giáp mô (Capsule antigen): kháng nguyên giáp mô có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ vi khuẩn, kháng lại khả năng thực bào của cơ thể vật chủ Nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng các chủng có giáp mô thì có độc lực và

có khả năng gây bệnh, còn các chủng không có giáp mô thì không có khả năng này (Higgins R và cs., 2002) [43] Thành phần của kháng nguyên giáp mô khác nhau tùy thuộc vào loại vi khuẩn, ví dụ như các chủng thuộc nhóm A thì giáp mô được tạo thành bởi các hyaluronic acid, còn các chủng thuộc nhóm O thì thành phần của giáp mô là polysaccharide

1.1.1.7 Các yếu tố độc lực của vi khuẩn S suis

Những hiểu biết về các yếu tố độc lực của vi khuẩn S suis còn rất hạn chế

Phần lớn những nghiên cứu được tiến hành với các chủng thuộc serotype 2 Các nhà khoa học đều có chung quan điểm: có sự tồn tại của chủng độc và không độc của vi

khuẩn S suis type 2 Thành phần polysaccharide của giáp mô (capsular

polysaccharide - CPS) được chứng minh là yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn này vì các chủng đột biến không có giáp mô đều thể hiện là không có độc tính và nhanh chóng bị loại bỏ khỏi hệ thống tuần hoàn của lợn và chuột trong các thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm Tuy vậy không phải tất cả các chủng có giáp mô đều là chủng độc (Lun Z.R và cs., 2007) [49]

Các yếu tố độc lực khác, ngoài polysaccharide của giáp mô cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn, bao gồm:

Yếu tố gây dung huyết, hay còn gọi là “suilysin” có trọng lượng phân tử 65 kDa và có độ phóng xạ riêng là 0,7x106 Units/ mg Suilysin (SLY) thuộc về nhóm độc tố với những đặc điểm chung là: dễ bị oxy hoá, dễ bị hoạt hóa bởi một số hóa chất khử, dễ bị ức chế bởi cholesterol với nồng độ loãng, ức chế tính hoạt động của một số lượng ít, gốc N- của chuỗi amino acid của suilysin giống với perfringolysin

O, streptolysin O, listeriolysin O, alveolysin, pneumolysin Trong điều kiện invitro, chuột và lợn đã được chứng minh là có khả năng tạo ra miễn dịch khi được tiêm

vaccine chứa suilysin để kháng lại S suis serotype 2 gây bệnh Suilysin là yếu tố độc lực quan trọng của S suis vì sự trung hoà của yếu tố này đủ để bảo vệ chuột thí nghiệm chống lại các tác động có hại của S suis type 2 (Gottschalk M và cs., 1998)

[39] Tuy nhiên, yếu tố gây dung huyết dường như không phải là yếu tố độc lực quan trọng đối với các chủng phân lập được ở Bắc Mỹ, ngược lại, rất nhiều chủng

có nguồn gốc từ lợn bệnh ở châu Âu lại có hoạt tính này Hoạt tính của suilysin không thể phân biệt được bằng các phương pháp sinh hoá và miễn dịch thông thường, vì vậy, một số nghiên cứu đã cho rằng suilysin có thể là yếu tố độc lực quan

trọng của một số chủng vi khuẩn Mặc dù vậy, một số chủng S suis serotype 2

không có khả năng dung huyết vẫn đã được chứng minh rằng có độc lực cao (Nghiên cứu của nhóm GREMIP-Canada)

Hai loại protein: protein giải phóng muramidase (Muramidase-released protein - MRP) có trọng lượng phân tử 136 kDa và protein giải phóng yếu tố ngoại bào (Extracellular factor - EF) đã được xác định là các yếu tố độc lực quan trọng

trong sinh bệnh học của S suis type 2 gây bệnh ở lợn và người (Vecht U và cs.,

1991) [62] Các nghiên cứu về gây bệnh thực nghiệm trên lợn cũng đã cho thấy các chủng vi khuẩn có mang 2 yếu tố gây bệnh này (MRP+ EF+) đã được phân lập từ các phủ tạng của lợn sau khi gây nhiễm với các triệu chứng điển hình của bệnh, trong khi đó các chủng không mang các yếu tố gây bệnh này (MRP- EF-) có thể phân lập được thường xuyên trong amidan của lợn khỏe và không có khả năng gây bệnh cho lợn thí nghiệm (Vecht U và cs., 1991 [62]; 1992 [63]; Smith H và cs.,

1992 [59]) Tuy nhiên, quy luật này lại không đúng với trường hợp các chủng S

suis serotype 2 phân lập được từ lợn và người bị bệnh tại Canada và Bắc Mỹ vì hầu

hết các chủng đều không gây dung huyết và không mang các yếu tố gây bệnh MRP

và EF khác biệt hoàn toàn với các chủng phân lập được từ châu Âu, kể cả về cấu trúc di truyền (Gottschalk M và cs., 1998) [39]

Ở Việt Nam, Trịnh Phú Ngọc và cs (1999) [11] cho biết: các chủng vi khuẩn

Sreptococcus phân lập được từ lợn các tỉnh phía bắc Việt Nam đều mang hình thái,

tính chất mọc trên môi trường, tính chất sinh hóa giống như các chủng chuẩn đã được mô tả trong các tài liệu trước đây Trong 449 chủng phân lập có 67,03% có khả năng gây dung huyết và 32% không gây dung huyết Trong số gây dung huyết

có 46% gây dung huyết kiểu β, 32,22% kiểu γ và 21,59% kiểu α

Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Thúy và cs (2009) [24] trong 211 chủng S

suis phân lập được từ lợn tại các tỉnh miền bắc Việt Nam có 7 tổ hợp gen mã hóa

các yếu tố độc lực được xác định

1.1.2 Bệnh do vi khuẩn S suis gây ra ở lợn

Vi khuẩn S suis là một trong số các tác nhân gây bệnh quan trọng ở lợn, là

nguyên nhân gây ra bệnh ở các thể cấp tính như bại huyết, viêm não, viêm màng trong tim, viêm khớp, viêm phổi, thường dẫn đến chết ở lợn, đặc biệt là giai đoạn

lợn đã cai sữa và lợn trưởng thành Bệnh do vi khuẩn này gây ra từ lâu đã và đang được coi là 1 bệnh thu hút được nhiều sự chú ý trong ngành chăn nuôi lợn Bên cạnh đó, tác nhân gây bệnh cũng là nhân tố quan trọng, là nguy cơ tiềm tàng gây các bệnh ở người như viêm não, viêm màng trong tim và nhiễm trùng máu Vi khuẩn này là mối nguy hiểm nghề nghiệp đặc biệt quan trọng với những người trực tiếp làm công tác chăn nuôi, thú y, những người làm nghề giết mổ và bán thịt lợn

- Dịch tễ học:

Bệnh gây ra do S suis xảy ra ở những nơi nuôi lợn trên khắp thế giới Lợn con

sơ sinh đến 22 tuần tuổi dễ bị mắc, đối với lợn sau cai sữa nếu bị stress bởi các vấn đề như vận chuyển, xáo trộn đàn, mật độ nuôi cao, không đủ thông gió… Vi khuẩn cũng được tìm thấy ở lợn rừng, ngựa, dê, trâu, bò, chó, mèo và cả ở các loài chim

S suis có thể gây bệnh quanh năm nhưng sự phát dịch có thể xảy ra dễ dàng

vào giai đoạn đầu xuân hoặc sau những thay đổi thời tiết đột ngột (Hofman L., Henderson L., 1985) [44]

Theo Clifton - Hadley F.A và cs (1986b) [ 30] sự tiếp xúc giữa lợn cai sữa, lợn cái sinh sản, lợn đực khỏe mang trùng với đàn không bị nhiễm thường phát sinh bệnh ở những lợn cai sữa, lợn lớn Lợn con có thể nhiễm chính từ lợn mẹ qua đường hô hấp, từ đây lại gây nhiễm cho những con khác khi chúng nuôi chung với

nhau sau khi cai sữa Vì vậy các bệnh gây ra do S suis là phổ biến ở những trại

chăn nuôi tập chung, mật độ cao

Bằng nhiều phương pháp khác nhau người ta đã xác định được sự lưu hành của vi khuẩn, như nuôi cấy phát hiện vi khuẩn từ các mô lấy từ lò giết mổ,

từ lợn con theo mẹ các lứa tuổi và phản ứng huyết thanh học đối với lợn lớn Một nghiên cứu ở lò mổ lợn của Úc và New Zealand cho thấy ở hạch amidan đã phát

hiện thấy 54% số mẫu nhiễm Streptoccocus suis type 1 và 73% nhiễm

Streptococcus suis type 2; 3% phát hiện thấy vi khuẩn này trong máu lợn khi giết

mổ Có thể phân lập được vi khuẩn này ở nhiều mô khác nhau, trong đó có cả ở đường sinh dục con cái, nhưng không thấy ở con đực Vi khuẩn có thể phân lập từ

âm đạo con nái, điều này làm cho con non bị nhiễm trong khi sinh Nhiễm từ môi trường bên ngoài cũng chiếm tỷ lệ cao

Tỷ lệ lợn mắc bệnh có biểu hiện lâm sàng từ 0-15%, tỷ lệ nhiễm vi khuẩn serotype 2 là 3,8% và tỷ lệ chết là 9,1%

- Phương thức truyền lây:

Những mầm bệnh khác nhau sẽ có những đường xâm nhập khác nhau Một loại mầm bậnh có thể có một hoặc nhiều đường xâm nhập, trong đó có đường xâm

nhập chính Theo Willams D.M và cs (1973) [64], vi khuẩn Streptococcus suis

truyền theo đường hô hấp, xâm nhập vào amindan, vòm họng Từ vị trí đó di chuyển theo hệ lâm ba tới hạch dưới hàm, ở đây chúng có thể cư trú ở các mô, cơ thể không có dấu hiệu gì về triệu chứng lâm sàng của bệnh

Vi khuẩn có thể tồn tại trong phân, bụi bẩn, xác lợn và ở cả ruồi, nhặng trong một thời gian dài Bệnh có thể lây truyền qua đường hô hấp, các chất bài tiết, máu của lợn bệnh, lây lan thông qua tiếp xúc trực tiếp hoặc lây qua kim tiêm nhiễm trùng Lợn con có thể bị lây nhiễm từ lợn mẹ qua đường hô hấp, đường tiêu hóa, đường máu Bệnh có thể bị lây nhiễm từ trại lợn này sang trại khác thông qua vật

chủ trung gian là ruồi Enright M.R và cs (1987) [34] cho biết ruồi có thể mang S

suis serotype 2 tới 5 ngày và có thể làm nhiễm mầm bệnh vào thức ăn mà chúng đậu

phải ít nhất là trong vòng 4 ngày

Vi khuẩn có thể truyền bệnh trực tiếp từ lợn mang trùng hoặc lợn bệnh sang lợn khỏe, vi khuẩn từ con khoẻ này truyền cho lợn không bị nhiễm có thể xảy ra trong vòng 5 ngày sau khi nhốt chung Việc đưa những con nái hậu bị từ đàn nhiễm bệnh có thể gây bệnh cho lợn con theo mẹ và lợn choai ở đàn tiếp nhận Có thể phát hiện tỷ lệ mang trùng ở lợn các lứa tuổi khác nhau từ 0 đến 80% và cao nhất ở nhóm tuổi sau cai sữa từ 4 đến 10 tuần tuổi Trong một đàn có thể có tới 80% số lợn nái là con mang trùng không thể hiện triệu chứng bệnh Vi khuẩn tồn tại ở hạch amidan của lợn mang trùng hơn 1 năm, ngay cả khi có các yếu tố thực bào, kháng thể và bổ sung kháng sinh phù hợp trong thức ăn Điều này cho thấy vi khuẩn mang tính địa phương ở một số đàn nhưng không thể hiện bệnh lâm sàng

- Cách sinh bệnh:

Phạm Sỹ Lăng và cs (2012) [8] cho hay: khi nghiên cứu vai trò gây bệnh của

S suis serotype 2, đã có nhiều kết quả khẳng định vai trò gây bệnh của CPS, các

protein có liên quan đến độc lực như protein giải phòng muramidase và yếu tố ngoài

tế bào, hemolysin hoặc suilysin và một số yếu tố bám dính khác CPS đóng vai trò quan trọng nhất có khả năng kháng lại đại thực bào, gây viêm màng não, tuy nhiên

cơ chế giải thích khả năng phát tán toàn cơ thể của S suis vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ Theo William (1988) S suis sau khi xâm nhập vào hạch amidan hoặc hạch

hầu họng, từ đó di chuyển theo hệ lâm ba tới hạch dưới hàm, cư trú ở các mô Lúc này cơ thể chưa có dấu hiệu về lâm sàng của bệnh Ở các tổ chức cư trú, chúng sống

và nhân lên trong tế nào monocyte, rồi chuyển vào xoang dịch não tủy gây nên

viêm màng não, hoặc có thể thông qua con đường nhiễm trùng huyết để xâm nhập vào màng não, khớp xương và các mô khác

* Bệnh liên cầu ở lợn do vi khuẩn S suis gây ra:

Bệnh do vi khuẩn S suis gây ra ở lợn đã được thông báo là xảy ra ở hầu khắp

các nước trên thế giới đặc biệt là các nước có ngành chăn nuôi lợn phát triển Khả

năng gây bệnh của S suis phụ thuộc vào nhiều yếu tố như sức đề kháng của con vật,

điều kiện vệ sinh môi trường, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng, thời tiết khí hậu, tính chất kháng nguyên và độc lực của vi khuẩn sản sinh Pijoan C (1996) [53] đã xác

định hầu hết lợn sau cai sữa đều có mang các chủng vi khuẩn S suis nhưng chỉ có

một số ít các chủng này có khả năng gây bệnh cho lợn giai đoạn sau đó

Triệu chứng và bệnh tích:

Các thể bệnh và bệnh tích của bệnh do các serotype khác nhau gây ra là không giống nhau (Vansconcelos D và cs., 1994) [60] Các biến đổi về bệnh tích vi thể không có sự sai khác giữa các serotype gây bệnh và thường tập trung ở não, phổi, tim

và các khớp Các tổn thương quan sát thấy như viêm màng não, viêm não, viêm phổi - màng phổi có mủ hoặc viêm phổi kẽ (Reams R.Y.và cs., 1994) [54] Triệu

chứng và các thể bệnh do vi khuẩn S suis gây ra ở lợn là rất phức tạp, khó nhận biết

và khó phân biệt khi bệnh có biểu hiện bội nhiễm, kế phát bởi một số vi khuẩn khác (Hoàng Văn Năm, 2007) [9]

Lê Văn Tạo (2007) [20] cho biết để gây bệnh vi khuẩn S suis sau khi vào cơ

thể sẽ nhân lên tại hạch hạch nhân rồi vào máu gây nhiễm trùng huyết, nên triệu chứng đầu tiên là sốt 40,6-41,7oC, triệu chứng thần kinh như run rẩy, đứng không vững, liệt, dẫn đến chết Triệu chứng, bệnh tích và các thể bệnh thường thấy:

- Thể nhiễm trùng huyết: lợn bệnh sốt rất cao (41-42oC), chảy nước mắt, ly bì, nằm bệt, niêm mạc đỏ sẫm, da đỏ tím từng mảng Lợn bệnh chết trong khoảng 1 đến

3 ngày, tỷ lệ chết lên đến 100% Bệnh tích: da đỏ tím từng mảng, tụ huyết và xuất huyết ở một số phủ tạng (lách, thận, hạch lâm ba)

- Thể viêm não tuỷ: lợn bệnh sốt cao, bỏ ăn, đi lại siêu vẹo, run rẩy, co giật, nôn mửa, hôn mê và chết sau 2-3 ngày Bệnh thường thấy ở lợn sau cai sữa

và lợn từ 2-3 tháng tuổi, tỷ lệ chết 100% Bệnh tích: màng não tụ huyết và xuất huyết, dịch não và tủy vẩn đục

- Thể viêm họng, viêm phế quản, viêm phổi: lợn bệnh sốt cao, chảy nước mắt, dịch mũi, họng sưng, bỏ ăn, thở khó, thở nhanh; da tụ huyết từng mảng Thể này thường gặp ở lợn con và lợn sau cai sữa, tỷ lệ chết 60-70% Bệnh tích: hạch amidan

sưng, tụ máu, niêm mạc phế quản tụ huyết, niêm mạc mũi có màng giả, tiểu phế quản

và phế nang viêm có dịch thẩm xuất, có mủ và bọt khí; hạch phổi sưng, tụ huyết Lợn

bị bệnh thể phổi gây ra bệnh tích ở phổi có các mức độ biểu hiện khác nhau từ viêm phổi - màng phổi dạng nhục hoá đến viêm phổi dạng fibrin có mủ

- Thể viêm hạch: sốt cao, hạch hầu và hạch mang tai sưng thủy thũng, sau thành áp xe mủ, lâu thành bã đậu Bệnh thấy ở lợn vỗ béo, diễn biến 5-8 ngày, tỷ lệ chết 20-30% Bệnh tích: hạch hầu, hạch trước vai, trước đùi sưng tụ huyết ở giai đoạn đầu, giai đoạn cuối viêm bã đậu

Các biện pháp phòng bệnh

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2012) [8] có thể phòng bệnh bằng vệ sinh, chăm

sóc, nuôi dưỡng và quản lý S suis là vi sinh vật thường xuyên cư trú ở niêm mạc

và các hốc tự nhiên trong cơ thể lợn, đồng thời nó cũng được phân bố rộng rãi trong môi trường thiên nhiên, giữa vi khuẩn và động vật ở trạng thái cân bằng Khi trạng thái cân bằng bị phá vỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn tăng cường độc lực và trở thành tác nhân gây bệnh Vì vậy, để phòng bệnh, biện pháp vệ sinh chuồng trại, chăm sóc nuôi dưỡng, quản lý và phân đàn, chia ô là yếu tố vô cùng quan trọng đối với công việc chăn nuôi lợn Việc diệt trừ tận gốc mầm bệnh bằng cách giảm mật

độ và nuôi trong các ô chuồng sạch sẽ là điều kiện cần thiết và có hiệu quả

Để chủ động phòng bệnh ở lợn do vi khuẩn S suis gây ra cần:

+ Thường xuyên thực hiện phun thuốc diệt ruồi, muỗi để ngăn chặn nguồn mang mầm bệnh vào chuồng trại Thu gom rác, phân, chất độn chuồng, nước thải; phun thuốc tiêu độc, tẩy uế chuồng trại bằng các loại thuốc sát trùng như NaOH 2%, Benkocid Han-Iodine 10% theo đúng qui định

+ Chú trọng khâu chăm sóc nuôi dưỡng và quản lý đàn; hạn chế sự xâm nhiễm và lây lan dịch bệnh nên thực hiện chính sách “Cùng vào cùng ra”

+ Bổ sung kháng sinh vào thức ăn để giảm tỷ lệ lợn khoẻ mang trùng

+ Lợn con sau khi sinh cần được bú đầy đủ sữa đầu của mẹ để có đủ kháng thể bảo vệ chúng trong giai đoạn đầu - là giai đoạn dễ cảm nhiễm với bệnh nhất

+ Loại bỏ những lợn mang trùng và có hướng điều trị kịp thời lợn mắc bệnh + Không được vận chuyển lợn từ vùng có dịch sang vùng khác Đối với các vùng chăn nuôi tập trung và các trang trại, biện pháp tốt nhất là tự sản xuất lấy con giống Khi nhập lợn về phải nuôi cách ly tại khu vực nuôi cách ly ít nhất 15 ngày Sau đó kiểm tra thấy lợn khoẻ mạnh bình thường và không có dấu hiệu gì về bệnh thì mới tiến hành cho nhập đàn

+ Khi có dịch xảy ra, phải cách ly những con bệnh ra khu vực nuôi cách ly để tránh lây lan Theo dõi và điều trị kịp thời những con bị bệnh Với những con không

có khả năng chữa khỏi thì tiến hành loại thải Trong quá trình theo dõi, phải cách ly tuyệt đối không được nhập đàn mới vào, thường xuyên phun thuốc tiêu độc, tẩy uế chuồng trại bằng các thuốc sát trùng nhằm nhanh chóng tiêu diệt mầm bệnh

- Phòng bệnh bằng vaccine

Hiện nay, các loại vaccine được sử dụng để phòng bệnh do S suis gây ra cho

lợn chủ yếu là các vaccine chuồng và hiệu quả bảo hộ của các loại vaccine này cũng chưa được xác định một cách rõ ràng Có thể do một số nguyên nhân của hiện tượng kháng nguyên bị biến tính, mất tính đặc hiệu do quá trình xử lý bằng nhiệt hoặc formalin, do sự sản sinh kháng thể đối với các kháng nguyên mà không có liên quan

đến độc lực của vi khuẩn và sự thiếu hụt các chủng S suis hay serotype liên quan đến

quá trình sinh bệnh học (Higgins R., Gottschalk M., 2002) [43] Các nhà khoa học cũng đã chế tạo thử nghiệm nhiều loại vaccine khác nhau như vaccine toàn khuẩn, vaccine sống nhược độc, vaccine tiểu phần (chế từ kháng nguyên giáp mô hoặc các protein thành tế bào) Tuy nhiên, miễn dịch bảo hộ ở chuột hoặc lợn thí nghiệm được tiêm các loại vaccine này cũng rất thất thường và không ổn định Trong một

số trường hợp khẩn cấp, việc lựa chọn dùng vaccine vẫn là phương thức tối ưu nhất

để bảo vệ đàn lợn Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng vaccine cầu khuẩn để tiêm phòng cho đàn lợn ở nước ta chưa được phổ biến rộng rãi, bệnh liên cầu khuẩn vẫn thường xuyên xảy ra ở lợn gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi

Điều trị bệnh

Trong thực tế, khi sử dụng kháng sinh có độ mẫn cảm cao để điều trị cho lợn

mắc bệnh do vi khuẩn S suis gây ra đã mang lại hiệu quả Chẩn đoán phát hiện sớm bệnh do vi khuẩn S suis gây ra và điều trị bằng kháng sinh thích hợp là biện pháp

nhằm tăng khả năng sống sót cho đàn lợn

Việc dùng thuốc kháng sinh để điều trị bệnh do vi khuẩn Streptococcus gây

ra là rất cần thiết Trong thực tế dùng kháng sinh để điều trị bệnh luôn đem lại hiệu quả tốt Khi dùng kháng sinh để điều trị bệnh phải dùng sớm và chỉ có hiệu quả khi con vật chưa có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nặng Nếu điều trị muộn thì sẽ kém hoặc không có hiệu quả (Armstrong C.H., 1982) [26]

* Bệnh viêm khớp ở lợn do vi khuẩn S suis gây ra

Bệnh viêm khớp làm ảnh hưởng đến chất lượng thân thịt khi xuất chuồng, gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi; đồng thời bệnh làm cho lợn tăng trọng

kém và giảm số lượng lợn con sau cai sữa trong đàn Bệnh này thường gây ra trên lợn con 1-6 tuần tuổi, bệnh được phân loại như một phần của hội chứng “yếu khớp” kết hợp với viêm rốn

Triệu chứng:

Clifton-Hadley F.A (1983) [28] nghiên cứu ở lợn gây bệnh thực nghiệm và quan sát lợn trong các ổ dịch tự nhiên cho thấy lợn từ 1-3 tuần tuổi thường mắc thể viêm não và viêm màng não với các triệu chứng như ủ rũ, kém ăn, sưng hầu, khó nuốt, đi lại khó khăn, lông khô, dựng đứng, sốt, da mẩn đỏ Lợn hoạt động khó khăn, đi lại loạng choạng, khi nằm có biểu hiện tư thế như bơi chèo, tê liệt Lợn mắc bệnh có hiện tượng viêm một khớp, khớp viêm thường là khớp bẹn, đầu gối hoặc khớp bàn chân Các tổn thương đầu tiên bao gồm thủy thũng, sưng khớp, màng khớp xung huyết, dịch khớp đục Thường có các thể sau:

- Thể quá cấp tính: gây chết lợn rất nhanh, lợn sốt rất cao, bỏ ăn, lờ đờ, suy yếu Lợn thể hiện triệu chứng thần kinh như mất thăng bằng, liệt, đi lại khập khiễng, uốn người ra sau, run rẩy, co giật, què Lợn có thể bị mù, điếc Lợn có hiện tượng viêm màng não gây tụ máu não, màng não, dịch não, tủy nhiều và có màu đục

- Thể cấp tính: đặc trưng bởi sốt, lông da sởn lên, suy nhược và què Khi bệnh tiến triển, lợn bệnh có thể sút cân, các khớp bị nhiễm sưng to Một hoặc vài khớp có thể bị tổn thương, các khớp chân trước và sau, mắt cá chân thường sưng phồng lên Bệnh làm cho lợn đau đớn không thể di chuyển được, hạn chế khả năng

đi lại để bú của lợn con

- Thể mãn tính: lợn bệnh còi cọc và bị viêm khớp mãn tính suốt đời Các khớp bệnh chứa nhiều dịch khớp đục với các cục sợi tơ huyết (fibrin) Các màng sưng phồng, mất màu và tấy đỏ Các mô liên kết bọc xung quanh mô dày lên và có thể chứa các ổ mủ nhỏ (áp xe) Khi bệnh trở thành mãn tính có thể làm tổn thương sụn khớp Các bệnh tích cũng có thể thấy trong sự phát triển của các khúc xương

Các dấu hiệu nhiễm trùng toàn thân khác cũng có thể thấy trong bệnh viêm

khớp do Streptococcus suis

Bệnh tích:

Các hạch sưng to, viêm màng não, viêm khớp và viêm màng trong tim Có thể tìm thấy các dịch tiết fibrin trong não, khớp sưng, phế quản và sùi van tim Lách xuất huyết và gây nhiễm trùng huyết là chủ yếu Có thể tìm thấy các tổn thương vi thể ở não, tim và khớp

Phòng và trị bệnh:

Phòng bệnh: vệ sinh chuồng trại sạch sẽ, định kỳ phun thuốc sát trùng để diệt mầm bệnh trong môi trường chăn nuôi, có thể sử dụng: Vimekon (pha 100gr với 20 lít nước) hay Vime-Iodine (pha 15 - 20 ml/4 lít nước) phun khắp chuồng, định kỳ 3-

4 tuần sử dụng 1 lần

- Hạn chế tối đa các yếu tố làm giảm sức đề kháng của lợn: thay đổi thức ăn, môi trường nuôi đột ngột, chuyển đàn, nuôi nhốt quá chật, điều kiện vệ sinh thông thoáng kém…

- Cho lợn ăn đầy đủ dưỡng chất, thường xuyên cung cấp vào thức ăn các dưỡng chất giúp cân bằng khẩu phần, hạn chế suy dinh dưỡng như: Vime – Amino: 100gr/20kg thức ăn; Vimix plus: 100gr/120 lít nước, dùng hàng ngày; Biotin H AD: 100gr/100kg thức ăn

Trị bệnh: trong bệnh viêm khớp do S suis ở lợn con, điều trị sớm sẽ rất hiệu

quả Điều trị đúng liệu trình giúp lợn hồi phục tốt hơn, có thể sử dụng một trong các loại thuốc sau liên tục 3 - 5 ngày: Kampico: 1ml/4kg thể trọng; Procain Penicillin: 1ml/10kg thể trọng; Colamp: 1ml/10kg thể trọng Kết hợp Ketovet: 1ml/15kg thể trọng/ngày nhằm giảm đau, hạ sốt cho lợn Nên bổ sung tiêm Vimekat: 1ml/5kg thể trọng, lặp lại sau 4 - 5 ngày giúp tăng cường trao đổi chất giúp lợn mau hồi phục sau bệnh (Trung tâm nghiên cứu khoa học Nông vận, 2016) [66]

1.2 Nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn S suis gây bệnh trên lợn

1.2.1 Những nghiên cứu nước ngoài

S suis phổ biến khắp thế giới, nhất là tại những quốc gia có kỹ nghệ chăn

nuôi lợn phát triển và thâm canh Bệnh đã được thông báo ở Hà Lan, Đan Mạch, Ý, Đức, Bỉ, Anh Quốc, Thụy Điển, Brazil, Áo, HongKong, Croatia, Nhật Bản, Úc, New Zealand, Singapore, Đài Loan, Argentina Các thông báo đầu tiên về bệnh do

vi khuẩn S suis gây ra ở lợn đã được chính thức xác nhận lần đầu tiên ở Hà Lan vào

năm 1951 (Jansen E.J., Van Dorssen C.A., 1951) [47] và ở Anh vào năm 1954 (Field H.I và cs., 1954) [36]

Austrian R (1976) [27] nhận thấy rằng 30-70% số vi khuẩn cư trú ở đường

hô hấp trên của vật khỏe mạnh nhưng lại hay gây bệnh đường hô hấp dưới và ở phổi Khi hệ thống hàng rào của cơ thể bị suy giảm thì vi khuẩn sẽ xâm nhập vào đường hô hấp dưới gây viêm phổi, sau đó vào hệ thống tuần hoàn gây nhiễm trùng huyết rồi tràn vào nội, ngoại tâm mạc, màng não, xoang, khớp để gây bệnh

Theo Higgins R., Gottschalk M (2002) [43]; Lun Z.R và cs (2007) [49], các

dạng bệnh do vi khuẩn S suis gây ra ở lợn rất đa dạng, bao gồm như viêm não,

nhiễm trùng máu, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, viêm đa thanh mạc, viêm màng bụng, viêm phổi, và thường dẫn đến chết đột ngột

Vi khuẩn còn có thể phân lập được trong các trường hợp lợn bị mắc bệnh

viêm teo mũi và sảy thai, ngoài ra, vi khuẩn S suis còn là nguyên nhân gây ra các

thể bệnh như viêm phế quản - phổi, viêm màng phổi và viêm phổi ở các lứa tuổi của

lợn (Sanford S.E., Tilker A.M.E., 1982 [56]; Erickson E.D và cs., 1984 [35])

Vi khuẩn S suis type 1 thường gây bệnh cho lợn còn đang theo mẹ (1-3 tuần

tuổi), có khi tới 6 tuần tuổi và thường ở thể bại huyết hoặc các nhiễm trùng tại chỗ như viêm màng não, viêm não, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, đặc biệt là lợn con từ 1-7 ngày tuổi (Cook R.W và cs., 1988) [31] Đôi khi, nhóm vi khuẩn thuộc type 2

cũng gây bệnh cho lứa tuổi này, nhưng thường ít gặp hơn, các chủng thuộc S suis

type 2 thường gây ra bệnh cho lợn giai đoạn sau cai sữa và vỗ béo (4-16 tuần tuổi) với rất nhiều thể bệnh như viêm não, viêm nội tâm mạc, ngoại tâm mạc, cơ tim hoại

tử, viêm phổi, viêm khớp và bại huyết (Vecht U và cs., 1985 [61]; Sanford S.E 1987a [57]; 1987b [58]; Gogolewski R.P và cs., 1990 [37]) Các nghiên cứu từ Anh lại kết luận rằng vi khuẩn này là nguyên nhân chính gây bại huyết, viêm não và viêm

đa khớp, ít khi gây viêm phổi (Mac Lennan M và cs., 1996 [50]; Heath P.J và cs.,

1996 [41]); trong khi đó, các bệnh tích ở phổi vẫn là chủ yếu trong các trường hợp lợn bị bệnh tại Bắc Mỹ (Reams R.Y.và cs., 1994 [54]; Hogg A và cs., 1996 [45])

Theo Harry H và cs (1992) [40] vi khuẩn thường gắn liền với lợn viêm

khớp là Erysipelothrix rhusiopathiae, Actinomyces pyogenes, Streptococcus, S

aureus, Mycoplasma hyorhinis, Haemophillus suis và Escherichia coli Trong 153

mẫu khớp phân lập cho kết quả 45% là E rhusiopathiae, S suis (16%), A pyogenes (10%), M hyorhinis (7%), tụ cầu (7%), Streptococcus spp (6%) và các sinh vật có ý nghĩa không chắc chắn (7%) Từ nghiên cứu trên cho thấy: S suis là nguyên nhân gây viêm khớp có mức độ phổ biến thứ 2 sau E rhusiopathiae

Bệnh xảy ra ở lợn mọi lứa tuổi, nhưng thường gặp nhất ở giai đoạn 3-16 tuần

tuổi do lợn thời kỳ sau cai sữa trở nên đặc biệt mẫn cảm với vi khuẩn S suis

(Lamont M.H và cs., 1980) [48]

Theo Erickson E.D (1984) [35] bệnh thường xảy ra vào mùa xuân khi điều

kiện chăn nuôi bất lợi và thuận lợi cho sự phát triển của các loại cầu khuẩn

Những nghiên cứu về dịch tễ học cho thấy S suis type 2 có thể lây từ đàn

này sang đàn khác do sự di chuyển của một số cá thể nào đó trong đàn Ngay trong cùng một đàn, sự lây lan chủ yếu là do tiếp xúc giữa các cá thể với nhau hoặc với chất thải nhiễm vi khuẩn Enright M.R và cs (1987) [34] cho rằng các vật chủ trung gian cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền lây: ruồi có thể mang

S suis type 2 trong vòng ít nhất là 5 ngày và có thể gây nhiễm thức ăn, nguyên liệu

mà chúng đậu vào trong vòng ít nhất là 4 ngày

Bởi vậy, chính ruồi đóng vai trò quan trọng trong việc làm lây lan dịch bệnh giữa các cá thể trong cùng một đàn và giữa các đàn Vai trò của các loài động vật khác, kể cả chim như là nguồn lây nhiễm vẫn còn đang được tiến hành nghiên cứu, con người cũng có thể là nguồn mang trùng (Sala V và cs., 1989) [55]

1.2.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam

Ở Việt Nam, nghiên cứu của Khương Thị Bích Ngọc (1996) [10] bệnh cầu khuẩn xảy ra ở hầu khắp các trại chăn nuôi tập trung trong những năm 70 và 80 đã

cho thấy vi khuẩn thuộc nhóm cầu khuẩn, bao gồm S aureus, S suis và

Diplococcus là các nguyên nhân chính gây ra "Bệnh cầu khuẩn ở lợn" với các triệu

chứng như con vật bỏ ăn, sốt cao, chết đột ngột, khớp chân sưng to, liệt chân Bệnh tích mổ khám bao gồm: toàn bộ phủ tạng xuất huyết, phổi viêm hóa mủ, dính với lồng ngực và hoành cách mô, tim nhão, cơ tim xuất huyết, xoang bụng tích đầy nước vàng, toàn bộ ruột bị viêm kết dính, khớp viêm sưng to, thịt nhão và có mùi hôi thối Kết quả phân lập vi khuẩn từ phủ tạng lợn bệnh cũng đã cho thấy vi khuẩn

S suis chiếm tỷ lệ cao nhất 60%, tiếp đến là Diplococcus 33% và S aureus 7%

Trong khi đó nghiên cứu của Nguyễn Thị Nội và Nguyễn Ngọc Nhiên (1993) [14]: vi khuẩn đường hô hấp của 162 lợn bị bệnh ho thở truyền nhiễm cho thấy tỷ lệ

nhiễm vi khuẩn S suis là 74%

Cù Hữu Phú (1998) [15] đã phân lập được vi khuẩn S suis từ bệnh phẩm của lợn ốm chết nghi do vi khuẩn S suis gây ra ở cả 2 phương thức chăn nuôi là rất cao,

trong đó chăn nuôi tập trung chiếm 93,9%, chăn nuôi hộ gia đình chiếm 95,3%

Khi tiến hành xác định nguyên nhân gây bệnh đường hô hấp của lợn nuôi tại một số tỉnh phía Bắc, Cù Hữu Phú và Nguyễn Ngọc Nhiên (1999) [16] cho biết: với

tổng số 53 mẫu phổi và hạch phổi đã phân lập được 8 chủng Streptococcus chiếm tỷ

lệ 15,09%, không phân lập được P multocida Từ 542 mẫu dịch ngoáy mũi đã phân lập được 48 chủng Pasteurella (8,86%) và 36 chủng Streptococcus (6,64%)

Bệnh do vi khuẩn S suis gây ra ở lợn hay còn gọi là bệnh liên cầu ở lợn xảy

ra ở lợn mọi lứa tuổi, nhưng phổ biến ở lợn con một vài tuần tuổi đến sau cai sữa vài tuần Đặc trưng lâm sàng của bệnh là nhiễm trùng huyết, viêm màng não, viêm khớp (Phạm Sỹ Lăng và cs., 2005 [7])

Theo Văn Đăng Kỳ (2007) [6] trong các ổ dịch rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn thuộc các tỉnh Đồng bằng Sông Hồng, lợn con và lợn sau cai sữa đã bị chết với

tỷ lệ cao do viêm phổi kế phát của các loại vi khuẩn khác nhau trong đó có S suis,

Staphylococcus aureus, Mycoplasma hyopneumoniae

Theo Đặng Xuân Bình và cs., (2007) [1] lợn thịt giai đoạn 2 - 3 tháng tuổi tại

Hà Tây và Thái Nguyên mắc bệnh viêm phổi thì tỷ lệ mắc theo đàn là 100% và 36,53% theo cá thể

Khương Thị Bích Ngọc (1996) [10] đã chế tạo vaccine cầu khuẩn chết có bổ trợ keo phèn từ những kết quả nghiên cứu về bệnh cầu khuẩn ở lợn để tiêm phòng cho lợn nái và đạt hiệu quả bảo hộ cao

Năm 2005, Trung Quốc cũng đã kiểm soát dịch bệnh do S suis gây ra ở lợn bằng vaccine vô hoạt chế từ các chủng S suis serotype 2 (Lê Văn Tạo và Đỗ Ngọc

Thúy, 2006) [19]

Trịnh Phú Ngọc (2002) [12] cho biết vi khuẩn S suis phân lập được mẫn

cảm với penicilin và trong thực tế, khi sử dụng penicilin kết hợp dexamethasone

điều trị bệnh do S suis gây ra ở lợn, điều trị từng cá thể kết hợp với chăm sóc và

nuôi dưỡng tốt có thể khỏi bệnh hoàn toàn

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, phạm vi, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Lợn nghi mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn nuôi tại tỉnh Bắc Giang

- Vi khuẩn S suis gây bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn phân lập được

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

- Địa bàn nghiên cứu: một số trang trại, hộ gia đình chăn nuôi lợn tại các

huyện Yên Thế, Hiệp Hòa và Yên Dũng thuộc tỉnh Bắc Giang

- Địa điểm xét nghiệm mẫu: Trung tâm Nghiên cứu và bảo tồn giống vaccine, Công ty cổ phần MARPHAVET

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

2.1.4.2 Động vật thí nghiệm

- Chuột nhắt trắng khoẻ mạnh (18 - 20 gam/con);

- Lợn 6 tuần tuổi, khỏe mạnh chưa được tiêm vaccine phòng viêm phổi, viêm

khớp chế từ vi khuẩn S suis

2.1.4.3 Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu

- Các loại môi trường dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn do hãng Oxoid (Anh) và Merck (Pháp) sản xuất: Môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate,

- Môi trường phân lập vi khuẩn và tăng sinh như thạch BHI có bổ xung 5% máu cừu hoặc máu bò; thạch chocolate; thạch TSA (Tryptone soya agar) có bổ xung 1-3% fresh Yeast Extract; TSB (Tryptone soya broth) có bổ xung 1-3% fresh Yeast Extract và 5% huyết thanh ngựa; nước thịt TYE (Tryptone Yeast Extract Broth); thạch dinh dưỡng PPLO có bổ xung 0,1% glucose, 8-10% YE tươi và 5% huyết thanh ngựa;

- Các loại môi trường, hóa chất dùng để giám định, xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: Môi trường đường các loại, dung dịch Kovac’s, dung dịch

H2O2 3%, giấy thử Oxidase, nước muối 6,5%

- Giấy thử kháng sinh đồ do hãng Oxoid (Anh) sản xuất

- Các loại hoá chất, môi trường dùng cho các phản ứng ngưng kết, huyết thanh học và kỹ thuật PCR

2.1.4.4 Giống vi khuẩn

Chủng vi khuẩn S suis chuẩn và các huyết thanh chuẩn tương ứng do Viện

sức khỏe động vật Nhật Bản và Australia cung cấp Sử dụng là chủng tham chiếu với các chủng vi khuẩn phân lập được trong phản ứng PCR và huyết thanh học;

2.1.4.5 Máy móc, dụng cụ thí nghiệm

Các dụng cụ thí nghiệm thông dụng, buồng cấy vô trùng, nồi hấp, máy ly tâm, máy lắc giàn, máy dùng cho phản ứng PCR, máy rửa, máy lên men sục khí sản xuất vaccine thuộc phòng thí nghiệm, Trung tâm Nghiên cứu và bảo tồn giống

vaccine, Công ty cổ phần MARPHAVET

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xác định một số đặc điểm dịch tễ của bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn nuôi tại Bắc Giang

2.2.1.1 Xác định tỷ lệ lợn mắc và chết trong bệnh viêm phổi, viêm khớp tại một số huyện tỉnh Bắc Giang

2.2.1.2 Xác định tỷ lệ mắc, chết trong bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn nuôi tại Bắc Giang qua các lứa tuổi

2.2.2 Phân lập và xác định một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn S suis

ở lợn mắc viêm phổi, viêm khớp tại tỉnh Bắc Giang

2.2.2.1 Phân lập và xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được

2.2.2.2 Xác định serotype của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được

2.2.2.3 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được

2.2.2.4 Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được

2.2.3 Nghiên cứu biện pháp phòng, trị bệnh viêm phổi, viêm khớp cho lợn

2.2.3.1 Chế tạo Autovaccine thử nghiệm phòng viêm phổi, viêm khớp cho lợn, ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tại tỉnh Bắc Giang

2.2.3.2 Thử nghiệm một số phác đồ điều trị lợn nghi mắc viêm phổi, viêm khớp do

S suis gây ra

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ

Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive study), dịch

tế học phân tích (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm của Nguyễn Như Thanh (2011) [22]

Phương pháp nghiên cứu cắt ngang tìm căn nguyên của bệnh, so sánh tần suất bệnh giữa các nhóm khác nhau Các cá thể trong cùng nhóm cũng như các yếu

tố nguy cơ và các thông tin khác đều được tiến hành trong cùng một thời gian, thời điểm nghiên cứu

2.3.1.1 Chọn mẫu điều tra

Chọn mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên, mẫu chùm nhiều bậc Chọn ngẫu nhiên mỗi huyện 3 xã, mỗi xã ngẫu nhiên chọn 3 thôn; trong thôn điều tra các hộ chăn nuôi lợn Tổng số huyện được điều tra: 3; số xã, thị trấn là: 9; số thôn là: 27

2.3.1.2 Phương pháp điều tra

- Trực tiếp quan sát để phát hiện lợn mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp

+ Những lợn có triệu chứng sốt cao, ho, chảy nước mắt, dịch mũi, họng sưng, khó thở, kém hoặc bỏ ăn,da tụ huyết từng mảng… được coi là bị mắc bệnh viêm phổi

+ Những lợn có triệu chứng sốt cao, ăn ít hoặc bỏ ăn, khớp chân sưng to, run rẩy, đi lại khập khiễng, què, nằm như bơi chèo, có thể liệt… được coi là viêm khớp

- Phỏng vấn chủ hộ chăn nuôi về những thông tin cần thiết

- Thông tin điều tra được ghi vào các phiếu điều tra

2.3.1.3 Nội dung điều tra, theo dõi

Số lợn mắc bệnh, chết do bệnh viêm phổi, viêm khớp tại các hộ, các trang trại chăn nuôi, phân loại theo địa bàn từng huyện điều tra và theo lứa tuổi của lợn

2.3.1.4 Các phương pháp đo lường trong dịch tễ

Tỷ lệ lợn mắc bệnh (%) = Số con mắc bệnh x 100

Tổng số lợn điều tra

Tỷ lệ chết do mắc bệnh (%) = Số con chết do bệnh x 100

Tổng số lợn mắc bệnh

Tỷ lệ khỏi bệnh (%) = Số con sống (không có triệu chứng của bệnh) x 100

Tổng số con điều trị Ghi chú: lợn sau khi được điều trị không còn các triệu chứng của bệnh được xem là lợn đã khỏi bệnh

Tỷ lệ bảo hộ (%) = Số con sống x 100

Số con thí nghiệm

a Trong đó: a là tỷ lệ % vùng không tiêm phòng;

Để so sánh một yếu tố nguy cơ với các nhóm bệnh và nhóm đối chứng liệu dịch tễ học được thể hiện ở bảng sau:

Khai thác sau

khi chọn

Chủ động chọn vào nghiên cứu

a: Số gia súc được chọn là có bệnh, có tiếp xúc với yếu tố nguy cơ

b: Số gia súc không có bệnh, nhưng tiếp xúc với yếu tố nguy cơ

c: Số gia súc có bệnh nhưng không có tiếp xúc

d: Số gia súc không có bệnh và cũng không có tiếp xúc

Nguy cơ tương đối được tính theo công thức sau:

Io c c d

Trong đó:

Ielà tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm có cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ

Io là tỷ lệ mắc bệnh ở nhóm không cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ

Đánh giá kết quả:

+ Nếu RR > 1 nói lên sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ, trị số RR càng lớn thì sự kết hợp giữa bệnh và cảm nhiễm càng mạnh

+ RR = 1 nói lên bệnh và cảm nhiễm không có liên quan gì đến nhau

+ RR < 1 nói lên một kết hợp âm tính

* Dùng khi bình phương (2 ) so sánh tần suất bệnh:

Bằng công thức của Nguyễn Văn Thiện (2002) [23]:

  tức P < 0,05 thì kết luận có sự sai khác giữa 2 tỷ lệ ở mức 

* Dùng SE (sai số của số trung bình) để tính độ phân tán của giá trị trung bình:

SE = ±

S (với n > 30, trong đó n là dung lượng

mẫu, S là độ lệch tiêu chuẩn)

2.3.2 Phương pháp lấy mẫu

Lấy bệnh phẩm là phổi của những lợn ốm hoặc chết có triệu chứng, bệnh tích nghi mắc viêm phổi và dịch ổ khớp của những lợn ốm hoặc chết có triệu chứng, bệnh tích nghi mắc viêm khớp Các mẫu được bảo quản lạnh và đưa ngay về phòng thí nghiệm để tiến hành các bước nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S suis

Các mẫu bệnh phẩm được ria cấy trên các loại môi trường như nước thịt thường, thạch máu, thạch Mac Conkey, thạch Chocolate Bệnh phẩm trước khi ria cấy vào các môi trường phải dùng bông tẩm cồn đốt mặt ngoài để diệt tạp khuẩn Sau đó dùng kéo đã được sát trùng cẩn thận cắt sâu vào bên trong phần đã đốt, lấy một mẩu nhỏ các mô, rồi phết lên mặt các loại môi trường thạch, đồng thời cho vào môi trường nước thịt, bồi dưỡng ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ Căn cứ vào tính chất mọc và hình thái của khuẩn lạc trên các môi trường sẽ tiến hành chọn khuẩn lạc

nghi của S suis, phết kính nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi khuẩn dưới kính hiển

vi, đồng thời tiến hành giám định vi khuẩn qua các phản ứng sinh hóa và cấy giữ giống để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo Có thể tóm tắt phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm theo hình 2.1:

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn S suis (Viện Thú y Quốc gia)

Các phản ứng lên men đường

Giữ giống

Phản ứng API

20 Strep

2.3.4 Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập được

- Thử phản ứng Oxydase: tiến hành trên giấy được thấm 1% dung dịch

Tetrametyl-p-Phenylenediamine hydrochloride Dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên trên mặt giấy đã thấm thuốc thử Nếu thấy xuất hiện màu tím đen sau 30 giây là phản ứng dương tính Nếu không thấy xuất hiện màu tím

đen hoặc không đổi màu là phản ứng âm tính

- Thử phản ứng Catalase: dùng phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy

già (H2O2 3%) lên trên, que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch trộn đều với giọt H2O2 3%, nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính

- Thử phản ứng sinh Indol: cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường

nước thịt Để tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ Nhỏ 0,5 ml dung dịch Kovac’s vào, phản

ứng dương tính khi quan sát thấy một vòng màu đỏ trên mặt môi trường

- Thử phản ứng lên men đường: cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào môi

trường nước thịt, nuôi ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ, sau đó nhỏ 0,2 ml canh khuẩn vào dung dịch đường đã chuẩn bị trước Sau 24 giờ giữ ở tủ ấm 37oC, nếu quan sát thấy màu của môi trường thay đổi thành mầu đỏ là dương tính, nếu vi khuẩn có sinh hơi thì thấy hơi trong ống Durham và đẩy mực nước trong ống Durham xuống

* Phương pháp thực hiện các phản ứng nhận biết cấp I đối với S suis

- Kiểm tra khả năng dung huyết: quan sát khả năng làm tan huyết xung quanh khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần kiểm tra sau khi đã nuôi cấy trên đĩa thạch máu cừu, ủ ở tủ ấm 37oC (5% CO2) qua 24 giờ

+ Dung huyết kiểu α: vùng dung huyết xung quanh khuẩn lạc thường có màu xanh (dung huyết từng phần hay dung huyết không hoàn toàn)

+ Dung huyết kiểu β: bao quanh khuẩn lạc là một vùng tan máu hoàn toàn trong suốt, có bờ rõ ràng do Hemoglobin bị phân huỷ hoàn toàn

+ Dung huyết kiểu  (hay còn gọi là không dung huyết): không làm biến đổi thạch máu

- Phản ứng với KOH: dùng que cấy nhựa, phết khuẩn lạc của vi khuẩn S suis

mọc trên môi trường thạch máu lên một phiến kính sạch Sau khi nhỏ 1 giọt dung

dịch KOH 3% mà không thấy có hiện tượng tạo thành lớp keo dính giữa khuẩn lạc

và thuốc thử trong vòng 60 giây thì chủng vi khuẩn kiểm tra được đánh giá là phản

ứng âm tính Vi khuẩn S suis cho phản ứng với KOH 3% âm tính

- Phản ứng Catalase: thực hiện tương tự như trong phản ứng với KOH, chỉ khác là thay thuốc thử KOH 3% bằng dung dịch H2O2 3% Nếu không quan sát thấy hiện tượng sủi bong bóng trong vòng vài giây thì chủng vi khuẩn kiểm tra

sẽ được đánh giá là có phản ứng Catalase âm tính Vi khuẩn S suis cho phản ứng

Catalase âm tính

- Kiểm tra khả năng phát triển trong môi trường NaCl 6,5%: Chủng vi khuẩn cần kiểm tra được cấy vào môi trường NaCl 6,5% Sau khi ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ, nếu quan sát mà không thấy môi trường có hiện tượng đục là phản ứng âm tính

Vi khuẩn S suis không phát triển trong môi trường NaCl 6.5% (phản ứng âm tính)

* Phương pháp thực hiện hệ thống API 20 Strep đối với S suis

Sau khi thực hiện phản ứng nhận biết cấp I, chỉ các chủng vi khuẩn được kết

luận là S suis mới được tiến hành các phản ứng với hệ thống định danh API 20 Strep

Việc thực hiện hệ thống API20 Strep với các chủng vi khuẩn đã được xác

định là S suis nhằm các mục đích: định danh và giám định vi khuẩn S suis; nghiên

cứu một số đặc tính sinh vật, hoá học của chúng

Cách tiến hành như sau: mỗi chủng vi khuẩn cần kiểm tra được cấy thành một lớp dày đặc trên mặt đĩa thạch máu Columbia, nuôi cấy ở 370C/24 giờ (5%

CO2) Dùng tăm bông vô trùng thu hoạch vi khuẩn từ đĩa thạch, rồi hòa tan vào 2 ml nước cất vô trùng để đạt được độ đục tương đương với ống số 4 của dãy so độ đục chuẩn McFarland Trong khay nhựa đã có chứa các loại thuốc thử, tiến hành nhỏ khoảng 100l huyễn dịch này vào mỗi lỗ đối với các phản ứng từ VP đến ADH Phần huyễn dịch còn lại được trộn đều với 1 ampule môi trường API GP có sẵn trong bộ kit thử và nhỏ vào các lỗ còn lại, từ ADH đến GLYG Toàn bộ khay nhựa

có chứa các phản ứng được đặt vào một giá nhựa có chứa khoảng 5 ml nước cất bên dưới để làm ẩm Ủ ở tủ ấm 370C Sau 4 giờ, tiến hành nhỏ các thuốc thử thích hợp:

VP 1 và VP 2 đối với phản ứng VP, NIN đối với phản ứng HIP, ZYM A và ZYM B đối với các phản ứng PYRA, GAL, GUR, GAL, PAL và LAP, rồi tiến hành đọc kết quả sau 10 phút Đối với một số phản ứng, nếu kết quả chưa rõ ràng thì có thể đọc lại sau 24 giờ

Cách đọc kết quả: các phản ứng được đánh giá là dương tính hay âm tính dựa vào một bảng so màu sẵn được cung cấp bởi nhà sản xuất, được tính điểm và mã hóa bằng các chữ số Kết quả của mỗi chủng vi khuẩn, cuối cùng sẽ được hiển thị bằng một dãy số gồm 7 chữ số Tiến hành tra bảng nhận biết để có thể kết luận là chủng vi khuẩn kiểm tra thuộc loại vi khuẩn nào

2.3.5 Phương pháp xác định serotype của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được bằng phản ứng PCR

Các serotype 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn S suis thường gặp gây bệnh nhất ở

lợn được xác định bằng phản ứng Multiplex PCR Các cặp mồi dùng để xác định

các serotype 1, 2, 7 và 9 của S suis được lựa chọn dựa vào chuỗi gen mã hoá quá

trình sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giáp mô (cps), gồm 4 cặp mồi: cps 1J-F và cps 1J-R để xác định serotype 1, cps 2J-F và cps 2J-R để xác định serotype 2, cps 7H-F và cps 7H-R để xác định serotype 7, cps 9H-F và cps 9H-R để xác định serotype 9 Trình tự các cặp mồi và các sản phẩm tương ứng của chúng được trình bày ở bảng 2.1

1 cps1J-F

cps1J-R

5'-TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T -3' 5'-TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A-3' 637

2 cps2J-F

cps2J-R

5'-TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG-3' 5'-TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC -3' 498

Thành phần của phản ứng Multiplex PCR dùng để xác định serotype của vi

khuẩn S suis được thực hiện với tổng thể tích là 25µl như được trình bày chi tiết

trong bảng sau:

Chu kỳ nhiệt của phản ứng gồm:

Bảng 2.3 Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng để xác định

một số gen mã hoá các yếu tố độc lực

Các giai đoạn của phản ứng Nhiệt độ

( o C)

Thời gian (phút)

Số chu

kỳ nhiệt

Giai đoạn biến tính

35

2.3.6 Phương pháp tính LD 50 của vi khuẩn S suis trên chuột bạch

Cách tiến hành: canh trùng S suis bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ và được pha loãng hệ số 10, mỗi nồng độ tiêm cho 5 chuột bạch với liều 0,2 ml canh trùng/con, tính số chuột sống và số chuột chết theo phương pháp cộng dồn Công thức tính LD50 theo Reed & Muench (1938):

Trong đó: A là nồng độ pha loãng gây chết sát trên 50% chuột; a là tỷ lệ chuột

chết do liều A gây ra (%); b là tỷ lệ chuột chết do liều B gây ra (%) (cộng dồn) với B là nồng độ pha loãng gây chết sát dưới 50% chuột; d là lg của nồng độ pha loãng

2.3.7 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn

Mẫu canh khuẩn cần xác định được lấy vô trùng, sau đó pha loãng canh khuẩn với nước muối sinh lý vô trùng thành các độ pha loãng khác nhau từ 10-1 đến

10-8 Dùng 3 độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8 mỗi độ pha loãng cấy trên 3 đĩa thạch TSA (1-3% YE), mỗi đĩa nhỏ 0,1ml, dàn đều trên mặt thạch Sau 18 giờ nuôi cấy ở tủ ấm

37oC có 5% CO2, tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc mọc ở các đĩa thạch

Số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn được tính theo công thức dưới đây với đơn vị tính là CFU: X = a x N x 10

Trong đó: X là số lượng tế bào vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn; N

là hệ số pha loãng; a là số khuẩn lạc trung bình có trong 0,1ml canh khuẩn pha loãng

2.3.8 Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được trên động vật thí nghiệm

Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được trên chuột

bạch theo phương pháp của Sawada (1985):

Canh trùng vi khuẩn cần kiểm tra được nuôi cấy ở 37oC trong 24 giờ, trong quá trình nuôi cấy có lắc để kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn Tiêm canh trùng vào xoang phúc mạc của chuột bạch khỏe mạnh, liều tiêm 0,2m/chuột, tiêm 2 con bằng dung dịch BHI để làm đối chứng (mỗi lô tiêm cho 2 chuột) Theo dõi thời gian chuột chết trong vòng 7 ngày Những chuột chết được đánh giá qua lâm sàng, mổ khám quan sát sự biến đổi của nội tạng, lấy máu tim cấy lên môi trường giám định

đẻ phân lập vi khuẩn

2.3.9 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng

vi khuẩn S suis phân lập được

Phương pháp làm kháng sinh đồ: xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh

của vi khuẩn S suis phân lập theo phương pháp của Bauer (1966)