Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân lập từ thịt chua Phú Thọ (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân l ập từ thịt chua Phú Thọ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân l ập từ thịt chua Phú Thọ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân l ập từ thịt chua Phú Thọ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân l ập từ thịt chua Phú Thọ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân l ập từ thịt chua Phú Thọ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân l ập từ thịt chua Phú Thọ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân l ập từ thịt chua Phú Thọ (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân l ập từ thịt chua Phú Thọ (Luận văn thạc sĩ)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Bùi Nguyễn Hải Linh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ THỊT CHUA PHÚ THỌ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2017

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Bùi Nguyễn Hải Linh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TỪ THỊT CHUA PHÚ THỌ

Chuyên ngành: Động vật học

Mã số: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Trịnh Thành Trung

Hà Nội - 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài luận văn, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Trịnh Thành Trung, Th.S Trần Thị Lệ Quyên cùng toàn bộ các cán bộ Viện VSVvà Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành đề tại luận văn tốt nghiệp này

Đồng thời, tôi cũng muốn gửi những lời cảm ơn tới TS Nguyễn Thị Thanh Hương và các quý thầy cô giảng dạy ở Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã động viện và hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện

Ngoài ra, tôi cũng cảm ơn những người bạn, những người luôn sát cánh bên tôi những lúc khó khăn và giúp tôi vượt qua để hoàn thành luận văn một cách tốt nhất

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi luôn biết ơn và ghi nhớ những sự giúp

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

I TỔNG QUAN 2

1.1 Probiotic 2

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và định nghĩa probiotic 2

1.1.3 Vai trò của probiotic 3

1.1.4 Cơ chế tác động chung của probiotic 7

1.1.5 Các nhóm VSV có đặc tính probiotic thường gặp 8

1.2 Vi khuẩn lactic 10

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic 10

1.2.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic 11

1.3 Thực phẩm lên men 13

1.3.1 Định nghĩa và các loại thực phẩm lên men 13

1.3.2 Thực phẩm lên men từ thịt heo 14

1.4 Thịt chua Phú Thọ 15

II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.1 Nguyên liệu 18

2.2 Thiết bị và hóa chất 18

2.3 Phương pháp 19

2.3.1 Xử lý mẫu thịt chua 19

2.3.2 Phân lập và xác định số lượng vi khuẩn lactic 19

2.3.3 Hoạt hóa vi khuẩn được lưu giữ ở điều kiện lạnh sâu 20

2.3.4 Giải trình tự gene 20

2.3.5 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái 22

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu đặc tính probiotic 23

2.3.6.1 Hoạt tính kháng khuẩn 23

2.3.6.2 Xác định kiểu lên men 24

2.3.6.3 Hoạt tính β-galactosidase 24

2.3.6.4 Khả năng chịu acid 24

2.3.6.5 Khả năng chịu muối mật 25

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 Phân lập vi khuẩn lactic trong thịt chua Phú Thọ 26

3.2 Phân loại và phân tích tần xuất bắt gặp vi khuẩn lactic trong thịt chua Phú Thọ 28

3.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic 28

3.2.2 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 31

3.2.3 Phân tích tần xuất bắt gặp vi khuẩn lactic 32

3.3 Đặc tính probiotic 34

3.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn 34

3.3.2 Khả năng lên men 37

3.3.3 Hoạt tính β-galactosidase 39

3.3.4 Khả năng chịu acid và muối mật 40

3.3.4.1 Khả năng chịu acid 41

3.3.4.2 Khả năng chịu muối mật 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 54

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ĐC đối chứng LAB Lactic Acid Bacteria VSV vi sinh vật

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Minh họa cơ chế tác động của probiotic 8 Hình 1.2 Nguyên liệu và quy trình sản xuất thịt chua Phú Thọ 16 Hình 2.1 Mẫu thịt chua Phú Thọ………18 Hình 3.1 Phân lập vi khuẩn lactic trên mẫu 12 (hình A), 14 (hình B), 19

(hình C) và 20 (hình D)………28

Hình 3.2 Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gene 16S rRNA của các

loài thuộc chi Lactobacillus 32

Hình 3.3 Tần suất xuất hiện các loài vi khuẩn lactic trong thịt chua Phú Thọ

33

Hình 3.4 Khả năng kháng khuẩn của một số chủng LAB với 6 chủng vi

khuẩn kiểm định E faecalis 52788G (hình A), S aureus 2421Đ (hình B), K

pneumoniae 1465G (hình C), A baumannii 56915Đ (hình D), P aeruginosa

TPM 1304 (3), TPM 1308 (4), TPM 1309 (5), TPM 1503 (6) và TPM 1504 (7) sau 24 giờ 39

Hình 3.10 Khả năng sinh β-galactosidase của chủng LAB qua 24 giờ và 48

Hình 3.13 Giá trị OD600 của các chủng có khả năng chịu acid 44

Hình 3.14 Số lượng chủng có khả năng chịu muối mật 45 Hình 3.15 Giá trị OD600 của các chủng có khả năng chịu muối mật 46

MỞ ĐẦU

Trong quá trình tiến hóa của con người, rất nhiều loại thực phẩm lên men và đồ uống lên men có cồn đã được tạo ra theo phương cách lên men tự nhiên (sử dụng VSV sẵn có trong tự nhiên) hoặc lên men chủ định (sử dụng các VSV đã tuyển chọn trong giống khởi động) Mỗi đất nước, mỗi dân tộc, mỗi vùng miền và mỗi nền văn hóa khác nhau luôn sở hữu cho riêng mình từng loại thực phẩm lên men đặc trưng Với giá thành rẻ, giá trị dinh dưỡng cao, phù hợp với khẩu vị của từng dân tộc, thực phẩm lên men đã và đang được sử dụng như một nhu cầu tất yếu của cuộc sống

Tại Việt Nam, trong số các loại thực phẩm lên men thì thịt chua là món

ăn phổ biến được nhiều người biết đến Dựa trên kinh nghiệm truyền thống, mỗi vùng miền có các phương cách chế biến và sản xuất thịt chua khác nhau

để tạo nên hương vị riêng Mặc dù phương pháp sản xuất còn thủ công và cơ

sở sản xuất còn nhỏ lẻ nhưng gần đây nhiều loại thịt chua đã được thương mại hóa và bán trong các cửa hàng và siêu thị

Tuy nhiên, hiểu biết khoa học về thành phần VSV hay những loài VSV chính tham gia vào quá trình lên men hình thành chất lượng thịt chua vẫn còn nhiều hạn chế Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân lập từ thịt chua Phú Thọ”

I TỔNG QUAN

1.1 Probiotic

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và định nghĩa probiotic

a, Lịch sử nghiên cứu probiotic

Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ

Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh [32]

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel - đã

chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố

của hệ VSV đường ruột Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” - The Prolongation of life (1908) [32]

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [11]

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [12] Cùng năm đó, các

nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả

năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được [11] Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men - đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là

hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất Khái niệm chung

probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80 [12]

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc

Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những

nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như vật nuôi

đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học: (i) theo Fuller (1989) [11], probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng

có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là

“các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hóa với một số lượng

đủ sẽ đem lại sức khỏe tốt cho vật chủ”

1.1.3 Vai trò của probiotic

Probiotic được coi như là một thực phẩm chức năng rất được ưa chuộng bởi các tính năng của nó mang lại Những tác động chủ yếu của các

chủng vi khuẩn probiotic tới sức khỏe con người gồm những mặt chính như sau

- Ngăn chặn sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách cản

chúng bám vào thành ruột

Probiotic khi được bổ sung vào cơ thể, các VSV này sau khi vượt qua các rào cản về lý học và hóa học trong hệ dạ dày - ruột non thì chúng sẽ tiến hành bám dính vào thành ruột để thực hiện chức năng

có lợi cho cơ thể vật chủ Chúng cạnh tranh nơi ở với vi khuẩn gây bệnh, ngăn cản không cho các vi khuẩn này bám vào thành ruột, từ

đó làm giảm số lượng vi khuẩn ngăn chặn các mầm bệnh [14]

- Giúp cho việc tiêu hóa thức ăn được hữu hiệu hơn

Đối với những người thường bị chứng bất dung nạp đường lactose trong các sản phẩm sữa do trong ruột không có enzyme tiêu hóa loại đường này thì probiotic sẽ giúp họ tiêu hóa được dễ dàng

hơn [14]

- Giảm nguy cơ bị tiêu chảy do uống nhiều thuốc kháng sinh

Việc sử dụng probiotic để phòng ngừa tiêu chảy gây ra bởi thuốc kháng sinh rất được quan tâm

Sự phát triển một cách rộng rãi và đặc hiệu cao của thuốc kháng sinh đã khiến cho ngành y học quá tin tưởng vào phương pháp trị liệu kháng sinh Tuy nhiên, tác động loại bỏ của thuốc kháng sinh không phân biệt được mầm bệnh thực sự và hệ VSV có lợi trong ruột Vì vậy, phương pháp trị liệu kháng sinh cũng dẫn đến thay đổi

hệ cân bằng của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng xấu mà có thể tòn tại lâu dài ngay cả sau khi ngừng sử dụng cách điều trị này

Bên cạnh đó, sự xuất hiện nhanh của nhiều chủng vi khuẩn

kháng lại kháng sinh chẳng hạn như Enterocci kháng vancomycin

và Staphylococcus aureus kháng methicillin là một vấn đề đáng

quan tâm Hơn nữa một vài bệnh lây nhiễm lại gia tăng và trở nên trầm trọng hơn trong điều trị thuốc kháng sinh Ví dụ, bệnh tiêu

chảy có thể do Clostridium difficile, một mầm bệnh cơ hội, hoạt

động và tăng nhanh khi có sự mất cân bằng của hệ VSV trong ruột thông thường diễn ra trong suốt quá trình điều trị kháng sinh [14] Mặc dù bệnh này nói chung được điều trị thành công với một loại thuốc kháng sinh thứ hai, tuy nhiên một vài bệnh lây nhiễm vẫn tái diễn mặc cho các phương pháp trị liệu kháng sinh khác (Sanders, 1999)

Về sau việc sử dụng probiotic đã cải thiện đáng kể hệ VSV nội sinh (Markowitz và Bengmark, 2002) bằng cách thay thế các vi khuẩn có ích bị mất So với các nhược điểm như đắt, tính hóa học và xâm hại ruột của thuốc kháng sinh, ưu điểm của probiotic là an toàn, nguồn gốc tự nhiên và phần lớn không có bất cứ ảnh hưởng có hại nào

Ngoài tác dụng giảm nguy cơ bị tiêu chảy do uống nhiều thuốc kháng sinh thì việc sử dụng probiotic còn có tác dụng ngăn ngừa nguy cơ tiêu chảy gây ra bởi các loại virus gây bệnh [14]

- Tăng cường hệ miễn dịch

Probiotic như một vị thuốc chứa các phân tử chống viêm cho đường ruột Đồng thời góp phần đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào vật chủ để giảm các phản ứng viêm bằng cách tạo các phản ứng miễn dịch cho cơ thể

- Giảm cholesterol trong máu

Hàm lượng cholesterol trong huyết thanh ảnh hưởng rất lớn đến các bệnh về tim mạch Nếu hàm lượng này cao hơn 1mmol so với mức bình thường thì người bệnh đang ở mức độ nguy hiểm của các bệnh về tim mạch (35%) và có thể gây chết người nếu cao hơn 45%

Vì vậy chỉ cần giảm 1% hàm lượng cholesterol trong máu là có thể giảm được mức độ nguy hiểm của bệnh về tim mạch từ 2 đến 3% (Masnon, 1992) [20] Và việc sử dụng các sản phẩm probiotic có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu [1] Một trong những bằng chứng đầu tiên đó là việc sử dụng probiotic

Lactobaccilii trong các sản phẩm có ảnh hưởng tốt đến tim mạch,

bao gồm cả khả năng ngăn ngừa và điều trị các hội chứng thiếu máu cục bộ của tim (Oxman, 2001) và giảm đáng kể hàm lượng cholesterol trong máu (De Roos và Katan, 2000) [15]

- Giảm thiểu hiện tượng dị ứng

L rhammousus GG đã được thử nghiệm trên hai đối tượng có

mức độ dị ứng cao đó là phụ nữ 6 tuần trước khi sinh và trẻ sơ sinh trong vòng 6 tháng Kết quả cho thấy sự giảm có ý nghĩa về mức độ

dị ứng (Kalliomaki, 2001) Nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của probiotic trong việc tạo ra các phản ứng giúp cơ thể chống lại các chất lạ xâm nhập vào cơ thể và ngăn ngừa hiện tượng dị ứng xảy ra Trong nghiên cứu y học khác về bệnh dị ứng của trẻ con với sữa bò, người ta thấy rằng chứng viêm da dị ứng này có thể giảm bớt khi sử

dụng thực phẩm probiotic của chủng L rhammousus và B lactic

BB-11 (Majamaa và Isolauri, 1996; 1997; Isolauri và cs, 2000) [15]

Ngoài các ứng dụng chính trên thì probiotic theo như các nghiên cứu khác còn có khả năng thuyên giảm triệu chứng đường ruột của hội chứng ruột

bị kích thích, nhiễm nấm âm đạo, nhiễm Helicobacter pylori ở dạ dày, bệnh

viêm ruột và nhiễm trùng đường tiết niệu

1.1.4 Cơ chế tác động chung của probiotic

Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần lớn các tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại trừ; (ii) đối kháng vi khuẩn và (iii) hỗ trợ miễn dịch (Steiner, 2006) Minh họa

cơ chế hoạt động của probiotic thông qua hình 1.1

Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các VSV Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các VSV ruột là cạnh tranh

vị trí bám dính Các VSV probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các VSV khác như:

Escherichia coli, Salmonella Một số nấm men probiotic (Saccharomyces cereviese, S boulardii) không chỉ cạnh tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn

khác mà còn gắn kết các vi khuẩn có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại) thông qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính

ở niêm mạc ruột (Czerucka, 2002) Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì sự sinh sôi với số lượng lớn của một loài VSV nào đó là một đe dọa nghiêm trọng đối với các loài khác về nguồn

cơ chất cho phát triển

Đồng thời cạnh tranh loại trừ, các VSV probiotic còn sản sinh các chất kìm hãm vi khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng như một

số axit hữu cơ khác Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ yếu là do sự giảm thấp pH trong ruột (Conway, 1996)

Hình 1.1 Minh họa cơ chế tác động của probiotic

Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có vú Giữa hệ VSV ruột và hệ thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù Năng lực miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự cân bằng của hệ VSV ruột (Cebra, 1999) Thông qua tương tác với

hệ thống miễn dịch ruột, các probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc cả hai Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào chủng giống hoặc các loài vi khuẩn probiotic (Dugas, 1999) Tuy nhiên, cơ chế tác động của probiotic đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chưa được hiểu biết đầy đủ

1.1.5 Các nhóm VSV có đặc tính probiotic thường gặp

Các nhóm VSV cơ bản

- Nhóm vi khuẩn lactic

Đây là vi khuẩn thân thuộc với con người từ ngàn xưa Trong tự nhiên, chúng phân bố rất rộng rãi, thường gặp nhiều trong các sản phẩm muối chua như dưa chua, thịt chua và sữa chua Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng, vi khuẩn lactic có một vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa và hấp thụ thức ăn của vật chủ Nhờ khả năng sản sinh ra axit lactic, axit pyruvic, tổng hợp vitamin nhóm B và sản sinh enzyme nên

có tác dụng ức chế VSV, cải thiện tăng trưởng và sức đề kháng của vật chủ

- Nhóm vi khuẩn Bacillus

Các vi khuẩn Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào tử, sống hiếu khí

tùy tiện nhưng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn Chúng phân bố phổ biến trong tự nhiên Một số loại của giống này còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người và động vật Tất các

loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ như protein,

tinh bột, cellulose nhờ khả năng sinh enzyme ngoại bào mạnh như amylase, cellulose, protease

- Nấm men Saccharomyces

Nhóm này được con người biết đến từ rất lâu và được sử dụng trong nghề làm bánh mì, nấu rượu, làm bia và ủ rượu vang Trong thành phần của tế bào nấm men rất giàu protein, vitamin nhóm B và khoáng chất Chúng còn hấp thu và bài thải độc tố ra ngoài, tham gia chuyển hóa glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt động và sinh sản

- Nấm mốc

Điển hình là Aspergillus oryzae, A niger, chúng có vai trò sản sinh

các enzyme amylase, protease, cellulose nhằm tăng cường khả năng tiêu hóa thức ăn của con người và động vật

1.2 Vi khuẩn lactic

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Theo hệ thống phân loại của Bergey (2009), vi khuẩn lactic (LAB) được phân loại như sau:

Họ Lactobacteriaceae

Chi Lactobacillus Paralactobacillus Pediococcus

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, chịu acid, có dạng hình cầu hoặc hình que, không tạo bào tử, có oxidase và catalase âm tính và hầu hết không di động Đa số các loài vi khuẩn lactic lên men kỵ khí bắt buộc Một số loài hiếu khí có thể sử dụng oxi thông qua flavoprotein oxidase

Vi khuẩn lactic có khoảng nhiệt độ sinh trưởng khá rộng Những loài

ưa nhiệt có nhiệt độ tối ưu từ 50C - 65C Trong khi đó, một số loài có thể sinh trưởng ở 5C hoặc thấp hơn nữa Vi khuẩn lactic rất khó nuôi bởi vì hầu hết chúng không có khả năng sinh tổng hợp một số hợp chất hữu cơ phức tạp như vitamin, amino acid, purine và pyrimidine, do đó, cần phải bổ sung các hợp chất này vào môi trường nuôi cấy

Trong quá trình lên men, các VSV sẽ chuyển hóa các chất có trong nguyên liệu thô ban đầu thành sản phẩm lên men có giá trị dinh dưỡng cao hơn và có mùi vị hấp dẫn hơn Hơn nữa, các chất được tạo ra có thể bảo quản được thực phẩm lâu hơn, tăng lượng axít amin cần thiết, axít béo omega-3, isoflavones, các chất có hoạt tính có lợi cho sức khỏe, vitamin và khoáng chất, làm giảm các chất không mong muốn và các chất kháng dinh dưỡng, tạo nên nhiều các chất oxy hóa như α-tocopherol, β-carotene, selenium, phenolic

và chất kháng khuẩn, tăng cường khả năng tiêu hóa và thúc đẩy các chức năng probiotic (Tamang và cs, 2010) Bên cạnh việc tham gia vào hình thành chất lượng sản phẩm, nhiều VSV trong thực phẩm lên men sở hữu các tính trạng

có lợi cho sức khỏe con người (đặc tính probiotic) Vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh β-galactosidase, một enzyme phân cắt đường lactose thành

đường đơn và là enzyme rất cần thiết cho người không có khả năng dung nạp lactose trong sữa (Vrese và cs, 2001; Solomons, 2002) Hơn nữa, vi khuẩn lactic có thể tổng hợp bacteriocin, một loại peptide có chứa các axít amin bất thường “unusual amino acid” được tổng hợp trên hệ thống ribosome của tế bào Bacteriocin có khả năng kháng khuẩn, đặc biệt là những vi khuẩn có quan hệ gần gũi với chủng sản sinh bacteriocin

1.2.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic

Về lý thuyết, bất kỳ loài vi khuẩn lactic không gây độc nào cũng đều có khả năng sử dụng làm probiotic Tuy nhiên, để có thể tác động có lợi lên hệ tiêu hóa của vật chủ thì trước hết chúng phải có khả năng sống sót ở điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa, cụ thể như sau

- Chịu muối mật

Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo

vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh Do vậy, khi thức ăn cùng với VSV probiotic từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột, tại đây, chúng sẽ chịu tác động của muối mật Khả năng sống sót của các chủng VSV sau tác dụng của muối mật là một trong những đặc tính quan trọng của VSV được sử dụng làm probiotic

và phát triển được trong ruột trước khi phát huy vai trò đối với vật chủ

Vì vậy, đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu, là một trong những tiêu chí quan trọng khi sàng lọc, tuyển chọn các chủng probiotic

- Chịu kháng sinh

Kháng sinh được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh đường ruột cho người cũng như động vật Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích do kháng sinh mang lại thì phương pháp trị liệu bằng kháng sinh có một số hạn chế nhất định như: tác động loại bỏ không chọn lọc, không phân biệt được mầm bệnh thật sự và hệ VSV có lợi trong đường ruột Vì thế, phương pháp này đã dẫn đến sự mất cân bằng VSV đường ruột Vì thế, phương pháp này đã dẫn đến sự mất cân bằng hệ VSV đường ruột và

có thể gây ra một số ảnh hưởng xấu cho vật chủ như tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa

Chính vì vậy, việc sử dụng probiotic thường được bổ sung cho vật chủ trong thời gian điều trị bằng kháng sinh để hạn chế sự mất cân bằng

hệ VSV đường ruột Do đó, các chủng dùng làm probiotic cần phải có khả năng chịu được kháng sinh và phải đảm bảo không chuyển gen kháng sinh sang những những vi khuẩn khác có mặt trong đường tiêu hóa, đặc biệt là những vi khuẩn gây bệnh

- Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột

Các chủng vi khuẩn lactic chỉ có thể tác động tốt khi chúng có thể sinh trưởng và phát triển được trong đường tiêu hóa Bên cạnh khả năng sống sót được trong đường tiêu hóa thì chúng phải có khả năng bám dính vào thành biểu mô ruột để không bị rửa trôi ra ngoài cùng với phân

Nhờ khả năng bám dính đó mà các chủng probiotic có thể ngăn cản được sự khu trú của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách giành vị trí bám trên thành ruột hay trên các bề mặt biểu mô khác

Do đó, sự kết bám với tế bào biểu mô ruột của các chủng probiotic

là một yêu cầu quan trọng cho việc định cư lâu dài và tạo ưu thế cạnh tranh trong hệ VSV đường ruột

Bên cạnh khả năng sống sót và phát triển được trong điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa, VSV probiotic còn có khả năng sản sinh những chất có hoạt tính kháng khuẩn như các axit hữu cơ, bacteriocin và H2O2 Những chất này được sản sinh cùng với quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng trong đường tiêu hóa, tác động ức chế và tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ VSV đường ruột Ngoài ra, một số chủng VSV probiotic còn có khả năng sinh nhiều loại enzyme có lợi cho việc tiêu hóa thức ăn, kích thích tăng trọng, điều hòa hệ miễn dịch vật chủ và tăng khả năng

và sử dụng trong nhiều thế kỷ

b, Các loại thực phẩm lên men

Có 4 loại thực phẩm lên men

- Thực phẩm lên men từ rau củ

- Thực phẩm lên men từ thịt heo

- Thực phẩm lên men từ cá

- Thực phẩm lên men từ sữa

1.3.2 Thực phẩm lên men từ thịt heo

Qua cách chế biến và phương cách lên men khác nhau, cùng một loại nguyên liệu ban đầu nhưng mỗi dân tộc tạo cho riêng mình các loại thực phẩm lên men đặc trưng và mỗi loại đó có một tên gọi khác nhau trong từng Quốc gia hay giữa các Quốc gia khác nhau Chẳng hạn, cùng một loại nguyên

liệu là thịt lợn lên men: ở Việt Nam có nem chua, thịt chua; ở Thái Lan có

nham; ở Châu Âu có salami; ở Đức có thuringer; ở Tây Ban Nha có androlla;

ở Ý có mortadello và mỗi sản phẩm lên men đó đều có hương vị đặc trưng

riêng (Tamang và Kailasapathy, 2010) [29] Mặc dù từ xa xưa, con người không có bất cứ kiến thức gì về VSV nhưng bằng kinh nghiệm thực tiễn qua nhiều thế hệ, người cổ xưa đã tạo nên và truyền lại phương pháp chế biến và sản xuất các loại thực phẩm lên men phù hợp với khẩu vị cho riêng dân tộc mình

Trong thời kỳ sinh học hiện đại ngày nay, con người đã biết VSV đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất thực phẩm lên men VSV tham gia vào quá trình lên men đó bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc Các VSV này có thể có sẵn trong gia vị bổ sung, trong nguyên liệu, trong vật dụng chế biến hoặc ở ngoài môi trường Trong quá trình lên men, các VSV sẽ nhân lên

và chiếm ưu thế nhờ thích ứng với nguyên vật liệu ban đầu (Tamang và Kailasapathy, 2010) [29] Vì thế, mỗi sản phẩm lên men khác nhau sẽ có thành phần VSV khác nhau và thành phần VSV này sẽ quyết định chất lượng

và hương vị đặc trưng của từng sản phẩm lên men Các nghiên cứu về VSV tham gia vào quá trình lên men thường tập trung vào xác định mật độ VSV có trong sản phẩm, phân loại VSV, các đặc tính kiểu hình và kiểu gene Phân loại chính xác các VSV có mặt ở thành phẩm cuối cùng của quá trình lên men

có ý nghĩa rất quan trọng vì các VSV này là những VSV đóng góp chính vào việc hình thành chất lượng sản phẩm lên men (Tamang và cs, 2010)

Vi khuẩn (vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic và vi khuẩn Bacillus) đóng

vai trò rất quan trọng trong lên men thực phẩm Trong đó, vi khuẩn lactic là những vi khuẩn chủ yếu tham gia vào quá trình lên men

1.4 Thịt chua Phú Thọ

Thịt chua là một sản phẩm lên men truyền thống của vùng trung du Bắc

bộ Việt Nam, đặc biệt nổi tiếng tại huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ Đây là sản phẩm lên men từ thịt heo, quá trình lên men trong thịt chua là quá trình lên men lactic Axit lactic sinh ra trong quá trình lên men làm pH môi trường giảm làm protein đông tụ, tạo cấu trúc và mùi bị đặc trưng cho thịt chua Cho đến nay thịt chua vẫn chủ yếu được sản xuất thủ công, dựa theo kinh nghiệm

là chính

Nguyên liệu chính dùng sản xuất thịt chua là thịt nạc (chủ yếu là nạc thăn, nạc mông, nạc vai), bì lợn và thính Hỗn hợp này khi đã thấm gia vị được nèn chặt vào ống nứa lót lá ổi, bọc kín đầu bằng lá chuối hoặc lá dong sạch Tuy nhiên hiện nay một số nơi thay ống nứa bằng lọ nhựa sạch PP nắp

kín (Hình 1.2)

Thịt chua thành phẩm phải có vị chua của thịt lên men, vị giòn của bì

và hương thơm bùi bùi của thính hòa quyện

Hình 1.2 Nguyên liệu và quy trình sản xuất thịt chua Phú Thọ

Nguyên liệu

Xử lý nguyên liệu

Ướp trộn Bao gói

Ủ

Sản phẩm thịt chua Bảo quản

Trong đó, công đoạn ủ là công đoạn chế biến quan trọng nhất Đầu tiên,

lá ổi được lót xuống dưới dụng cụ chứa đựng thành một lớp, lèn thật chặt thịt vào trong Sau đó, phủ vài lớp lá ổi lên lớp thịt trên bề mặt dụng cụ chứa đựng

và nén chặt bằng thanh nẹp tre Trong điều kiện thích hợp, các VSV sẽ tiến hành quá trình trao đổi chất sinh nhiệt làm chín thịt Quá trình này chỉ cần từ

3 đến 7 ngày và được gọi là quá trình lên men

Tuy nhiên, hiểu biết khoa học về những loài vi khuẩn lactic chính tham gia vào quá trình hình thành chất lượng thịt chua và các đặc tính probiotic của chúng vẫn còn nhiều hạn chế Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân lập

từ thịt chua Phú Thọ” với mục tiêu:

- Nghiên cứu thành phần vi khuẩn lactic chính tham gia vào quá trình hình thành chất lượng sản phẩm thịt chua Phú Thọ

- Nghiên cứu các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân lập từ thịt chua

II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu

Vào tháng 2 năm 2016, chúng tôi tiến hành lấy 9 mẫu thịt chua bán ở các cửa hàng tại tỉnh Phú Thọ 9 mẫu thịt chua này được sản xuất từ 8 cơ sở sản xuất khác nhau Các mẫu lấy đảm bảo là các sản phẩm mới sản xuất

- Cân điện tử AL - 300 (Osi, Mỹ)

- Nồi hấp khử trùng Hiclave HV - 85 (Hirayama, Nhật)

- Tủ cấy (Nuaire, Mỹ)

- Kính hiển vi quang học Axio (Zeiss, Đức)

- Máy li tâm 5417R (Eppendorf, Đức)

- Máy PCR (Eppendorf, Đức)

- Máy điện di (Bio - Rad, Mỹ)

- Máy giải trình tự 3100 - Avant Gentic Analyzer (AB, Mỹ)

- Máy đo pH (Horiba Navih, Nhật Bản)

Ngoài ra, còn sử dụng các dụng cụ thí nghiệm như bình tam giác (250 ml), ống falcon (15 ml), ống giữ lạnh sâu, ống nghiệm và đĩa Petri

b, Hóa chất

- Các môi trường sử dụng: MRS, MH, NA, LB (xem phần Phụ lục)

- Nhóm hóa chất dùng cho sinh học phân tử: Tris HCl, Na2EDTA, NaCl, lysozyme, proteinase K, SDS 10%, hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol (49 : 1) và isopropanol

2.3 Phương pháp

2.3.1 Xử lý mẫu thịt chua

Cân 10 gram thịt chua và nghiền mẫu vào 90 ml nước muối sinh lý (NaCl 0,85%) Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng để đảm bảo không có sự nhiễm chéo giữa các mẫu thịt chua Sau đó, dịch thịt chua đã bị nghiền tiếp tục được lắc trong bình tam giác ở tốc độ 160 vòng/phút trong 30 phút để hòa tan mẫu thịt chua vào trong nước muối sinh lý và giải phóng tế bào bám trên mẫu thịt chua vào trong nước muối sinh lý Sau khi đặt yên tĩnh bình tam giác trong 10 phút, phần dịch nổi được hút ra để phân lập vi khuẩn

và đo pH

2.3.2 Phân lập và xác định số lượng vi khuẩn lactic

Phần dịch nổi thu được ở mục 2.2.1 được pha loãng từ nồng độ 10-4 đến

10-7 Tiến hành cấy gạt 100 µl các dịch pha loãng lên đĩa Petri chứa môi trường MRS Các đĩa Petri sau đó được nuôi ở nhiệt độ 30o

C trong bình kín ở điều kiện kỵ khí sử dụng túi tạo kỵ khí (Sachet gaspak EZ anaerobe, Becton

Diskinson) Sau 72 giờ, số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa tại các nồng độ pha loãng thích hợp (~ 100 khuẩn lạc/ đĩa Petri) được đếm Số lượng vi khuẩn lactic có trong 1 gram thịt chua được tính theo công thức sau:

CFU/ gram thịt chua = Số lượng vi khuẩn mọc trên đĩa thạch × 10

× hệ số pha loãng Trên từng mẫu thịt chua phân lập, chúng tôi tiến hành cấy ria các chủng

có các đặc điểm khác biệt về màu sắc, kích thước, cấu trúc bề mặt và mép viền ngoài khuẩn lạc sang các đĩa môi trường MRS khác Sau 2 ngày nuôi cấy

ở 30o

C, khuẩn lạc thuần mọc trên đĩa thạch được lưu giữ và bảo quản ở -70oC trong môi trường LB dịch thể chứa 20% glycerol

2.3.3 Hoạt hóa vi khuẩn được lưu giữ ở điều kiện lạnh sâu

Các chủng vi khuẩn lactic đang bảo quản ở điều kiện lạnh sâu -70C (môi trường LB dịch thể chứa 20% glycerol) được hoạt hóa trên đĩa chứa môi trường thạch MRS Sau 48 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 30o

C, tiến hành quan sát khả năng sinh trưởng

2.3.4 Giải trình tự gene

a Tách DNA vi khuẩn

DNA của các chủng vi khuẩn được tách chiết theo phương pháp của Gabor

và cộng sự (2003) với một số bước cải biến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Đầu tiên, các chủng vi khuẩn giữ trong ống lạnh sâu được cấy ria trên môi trường MRS Sau 24 giờ nuôi cấy ở 30o

C, dùng que cấy lấy một vài khuẩn lạc thuần khiết mọc trên thạch vào các ống 1,5 ml chứa 200 µl đệm phá

tế bào (100 mM Tris HCl, 100 mM Na2EDTA, 1,5 mM NaCl, pH 8.0), 10 µl lysozyme (50 mg/ml) và 10 µl proteinase K (10 mg/ml) Hỗn hợp đệm này được ủ ở 37o

C trong 30 phút Sau khi bổ sung thêm 50 µl SDS 10%, hỗn hợp

này được ủ thêm ở 56o

C trong 2 tiếng nhằm phá vỡ hoàn toàn tế bào và giải phóng DNA vào đệm chiết Bổ sung một lượng tương đương (~ 250 µl) hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol (49 : 1) vào hỗn hợp đệm chứa các tế bào

đã bị phá vỡ, lắc nhẹ nhàng trong một phút sau đó ly tâm 15,000 vòng/phút trong 7 phút Hút khoảng 200 µl phần dịch trong phía trên có chứa DNA sang ống 1,5 ml mới Thêm 0,6 lượng thể tích isopropanol lạnh vào ống này và ủ ở -20oC trong 1 tiếng để DNA dễ dàng kết tủa Tiến hành ly tâm ở 15,000 vòng/phút để thu hồi DNA kết tủa Rửa tủa bằng cồn lạnh 70o

và hòa tan DNA vào 200 µl đệm TE (10 mM Tris HCl, 0,1 mM Na2EDTA) Cất giữ DNA ở -20oC cho đến khi sử dụng

b Phản ứng PCR khuếch đại gene 16S rRNA

Phản ứng PCR khuếch đại gene 16S rRNAđược tiến hành trong thể tích 25

µl chứa các chất phản ứng sau: 1X đệm PCR, 1 U TaKaRa Ex Taq

polymerase (Katara), 125 µM mỗi loại dNTP, 1µl DNAđã tách chiết như đã miêu tả ở trên và 400 nM mỗi loại mồi gồm 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1525R (5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3') Sau khi biến tính DNA ở 95oC trong 5 phút, phản ứng khuếch đại gen được thực hiện trong 35 chu trình, với mỗi chu trình nhiệt được cài đặt như sau: 95oC trong 30 giây để biến tính tách mạchDNA, 55oC trong 30 giây để gắn mồi, 72oC trong 1 phút 45 giây để khuếch đại gen Sản phẩm PCRđược điện di và kiểm tra trên gel agarose 1%

có bổ sung với chất phát huỳnh quang Redsafe (Intron Biotechnology)

c Giải trình tự DNA

Sản phẩm PCR được tinh sạch sử dụng kit Qiaquick của hãng Qiagen Nồng độ DNA tinh sạch được đo trên máy quang phổ tại bước sóng 260 nm Với mỗi phản ứng giải trình tự, 20 ng sản phẩm PCR tinh sạch được đưa vào

các phản ứng khuếch đại sử dụng kit Bigdye® terminator v3.1 theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Applied Biosystem).Sau khi khuếch đại bằng mồi mô tả như trên, trình tự DNA được đọc trên máy giải trình tự 3100 Avant Genetic Analyzer sử dụng POP-6 polymer Sắc đồ trình tự được kiểm tra và chỉnh sửa trên phần mềm Chromas lite 2.1.Trình tự của 2 mồi được kết nối trên phần mềm Clone Manager (Clone Manager Professional Suite version 8) Mức độ tương đồng về trình tự gen mã hóa riboxôm 16S của chủng nghiên cứu so với các chủng đã công bố trên ngân hàng gen được so sánh sử dụng công cụ tra cứu BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Mức độ tương đồng cao nhất về trình tự đoạn 16S rDNA của chủng nghiên cứu so với các chủng chuẩn đã công bố được tra cứu sử dụng công cụ Eztaxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/) với số liệu cập nhật đến ngày 20/04/2017

d Cây phát sinh chủng loại

Sau khi đã xác định được tên chi của các chủng nghiên cứu, trình tự gene 16S rRNA của các chủng chuẩn của các loài trong chi được tải về từ ngân hàng gen dựa trên mã số trình tự của các chủng chuẩn Kết hợp với chủng được phát hiện thấy trong nghiên cứu này, trình nucleotit được sắp xếp

sử dụng công cụ ClustalW Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp Neighbor joining sử dụng phép toán Jukes-Cantor với độ lặp lại 1,000 lần trên phần mềm MEGA 5

2.3.5 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái

a, Phương pháp quan sát khuẩn lạc

Từ các chủng vi khuẩn đã tinh sạch, tiến hành cấy ria 3 pha trên môi trường MRS Sau 72 giờ nuôi cấy ở 30o

C, khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch tách rời nhau, quan sát màu sắc, cấu trúc bề mặt và dùng thước đo kích thước đường kính khuẩn lạc

b, Phương pháp quan sát hình thái tế bào

Chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm Gram Các bước nhuộm được tiến hành như sau:

- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ mọc trên

bề mặt thạch (khi đã hoạt hóa sau 24 giờ) Hòa vi khuẩn vào 1 giọt nước cất

đã được nhỏ sẵn trên lam kính

- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khô

- Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước

- Nhuộm bằng dung dịch I ốt trong 1 phút, rửa nước

- Rửa bằng dung dịch tẩy màu (cồn tuyệt đối) trong 30 giây, rửa nước

- Nhuộm bổ sung dung dịch Safranin trong 1 phút, rửa nước, để khô trong không khí

37oC Đọc kết quả sau 24 giờ, hoạt tính kháng sinh được xác định bằng kích thước vòng vô khuẩn theo công thức

pneumonia 1465G, Acinetobacter baumannii56915Đ, Pseudomonas aeruginosa 47793Đ và Escherichia coli 2361G được phân lập từ các mẫu

bệnh phẩm tại bệnh viện Bạch Mai

2.3.6.2 Xác định kiểu lên men

Chủng vi khuẩn được hoạt hóa và cấy đều½ vòng que cấy vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS dịch thể có ống Durham úp ngược Nuôi cấy tĩnh được tiến hành 48 giờ ở nhiệt độ 30oC Khả năng lên men của các chủng được xác định bằng các quan sát ống Durham nếu chủng nào tạo khí

CO2 trong ống Durham thì là chủng lên men dị hình, chủng nào không tạo khí

CO2 thì là chủng lên men đồng hình

2.3.6.3 Hoạt tính β-galactosidase

Chủng vi khuẩn được hoạt hóa và cấy chấm lên đĩa Petri chứa môi trường MRS và 40 µl X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside pha trong 20 mg/ml DMF) Các đĩa Petri được nuôi ở 37oC trong 24 giờ và 48 giờ Vi khuẩn lactic sinh hoạt tính β-galactosidase sẽ có màu xanh

2.3.6.4 Khả năng chịu acid

Chủng vi khuẩn được hoạt hóa và cấy đều ½ vòng que cấy vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS dịch thể được điểu chỉnh pH từ 2 đến 6 bằng HCl Sau 24 giờ nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37oC, để đánh giá mức độ sống sót hoặc sinh trưởng của tế bào chúng tôi sử dụng môi trường MRS dịch thể (không bổ sung HCl) đã cấy chủng vi khuẩn làm mẫu Blank và so sánh dựa trên chỉ số đo mật độ tế bào ở OD600 Chủng mọc tốt có OD600 > 2,5; chủng mọc trung bình có 2,5 ≤ OD600 ≥ 1,0; chủng mọc yếu có OD600 < 1,0

2.3.6.5 Khả năng chịu muối mật

Chủng vi khuẩn được hoạt hóa và cấy đều ½ vòng que cấy vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MRS dịch thể có bổ sung 0,1; 0,3; 0,5 và 0,8% (w/v) muối mật Sau 24 giờ nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37oC, để đánh giá mức độ sống sót hoặc sinh trưởng của tế bào chúng tôi sử dụng môi trường MRS dịch thể (không bổ sung muối mật) đã cấy chủng vi khuẩn làm mẫu Blank và so sánh dựa trên chỉ số đo mật độ tế bào ở OD600 Chủng mọc tốt có

OD600 > 2,5; chủng mọc trung bình có 2,5 ≤ OD600 ≥ 1,0; chủng mọc yếu có

OD600 < 1,0

III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Phân lập vi khuẩn lactic trong thịt chua Phú Thọ

Theo Nguyen và cs (2016), trong 6 mẫu nem chua - một loại thực phẩm lên men từ thịt heo - tổng số vi khuẩn lactic đếm được trên môi trường MRS dao động từ 106

đến 107 CFU/g, giá trị pH dao động từ 4,3 đến 5,0 [23]

Còn trong mẫu thịt chua, chúng tôi ghi nhận tổng số vi khuẩn lactic đếm được trên môi trường MRS là 6,05 x 109

CFU/g (dao động từ 0,84 x 109đến 14,5 x 109

CFU/g) Điều đó cho thấy, tổng số vi khuẩn lactic đếm được trên môi trường MRS của thịt chua cao hơn so với mẫu nem chua

Mẫu 14 là mẫu có số lượng vi khuẩn lactic đếm được nhiều nhất trên môi trường MRS với 14,5 × 109

CFU/g, số lượng ít nhất là mẫu 12 với 0,84 ×

109 CFU/g (Hình 3.1)

Giá trị pH trung bình của thịt chua trong dung dịch nước muối sinh lý

là 4,92 (dao động từ 4,80 đến 5,10) Giá trị pH và chỉ số vi sinh được trình

bày trong Bảng 3.1

Dựa vào các đặc điểm mầu sắc, kích thước, cấu trúc bề mặt, mép rìa ngoài và mức độ lồi của khuẩn lạc trong từng mẫu nghiên cứu, chúng tôi đã thu giữ 87 chủng vi khuẩn mọc trên môi trường MRS, trung bình 9

chủng/mẫu (Bảng 3.1)