Nghiên cứu thu nhận polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ hải miên thu mẫu tại nha trang bằng kỹ thuật chiết hỗ trợ siêu âm

Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết Hải Miên .... Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng polyphenol và h

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

TRẦN KHẮC TRÍ NHÂN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2017

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

TRẦN KHẮC TRÍ NHÂN

PGS TS Ngô Đăng Nghĩa

Khoa sau đại học:

KHÁNH HÒA - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong các công trình khác

Khánh Hòa, ngày 01 tháng 01 năm 2018

Tác giả luận văn

Trần Khắc Trí Nhân

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn này,

Trước hết, tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm và Phòng Đào tạo Sau đại học sự kính trọng, niềm

tự hào được học tập và nghiên cứu tại Trường trong thời gian qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được dành cho: TS Đặng Xuân Cường - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và PGS TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng Khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn trong suốt quá trình thực hiện Luận văn

Xin chân thành cảm ơn: quý Thầy, Cô giáo - Trung tâm Thí nghiệm Thực hành - Trường Đại học Nha Trang và Phòng Thí nghiệm Phân tích - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện Luận văn

Xin ghi nhận tình cảm và sự giúp đỡ của các Thầy, Cô giáo trong Khoa Công nghệ Thực phẩm đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại Trường vừa qua

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã giúp đỡ động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn vừa qua

Khánh Hòa, ngày 01 tháng 01 năm 2018

Tác giả luận văn

Trần Khắc Trí Nhân

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CÁC BẢNG x

DANH MỤC CÁC HÌNH xi

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 3

1.1.HẢIMIÊN 3

1.1.1 Giới thiệu về Hải Miên 3

1.1.2 Phân loại và phân bố các loài Hải Miên 5

1.1.3 Ứng dụng của Hải Miên ở Việt Nam và trên thế giới 5

1.1.4 Tình hình nghiên cứu Hải Miên trong và ngoài nước 6

1.2.GIỚITHIỆUVỀPOLYPHENOL 8

1.2.1 Sơ lược về polyphenol 8

1.2.2 Phân loại polyphenol 9

1.2.3 Polyphenol Hải Miên 11

1.2.4 Vai trò của polyphenol có trong Hải Miên 14

1.2.5 Cơ chế chống oxy hóa của polyphenol 15

1.3.KỸTHUẬTCHIẾT,ĐỊNHLƯỢNGVÀTINHCHẾPOLYPHENOL 17

1.3.1 Nguyên lý của quá trình chiết 17

1.3.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết 19

1.3.3 Những khó khăn trong nghiên cứu chiết và tìm ra các hoạt chất mới có trong đối tượng Hải Miên 20

1.3.4 Kỹ thuật chiết có sự hỗ trợ sóng siêu âm 20

1.3.5 Các kỹ thuật chiết khác 22

1.4.PHƯƠNGPHÁPĐỊNHLƯỢNGHỢPCHẤTPOLYPHENOL 24

1.5.TÌNHHÌNHNGHIÊNCỨUPOLYPHENOLTRÊNTHẾGIỚIVÀỞVIỆTNAM 25

1.5.1 Tình hình nghiên cứu polyphenol trên thế giới 25

1.5.2 Tình hình nghiên cứu polyphenol ở Việt Nam 27

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1.NGUYÊNVẬTLIỆU 28

2.1.1 Hải Miên nguyên liệu 28

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 28

2.3.PHƯƠNGPHÁPBỐTRÍTHÍNGHIỆM 30

2.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm tổng quát 30

2.3.2 Phương pháp sàng lọc mẫu 32

2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định các thông số của quá trình nghiên cứu 32

2.4.HÓACHẤTVÀTHIẾTBỊ 40

2.5.PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 41

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42

3.1.THUTHẬPMẪUVÀSÀNGLỌC 42

3.1.1 Thu mẫu Hải Miên tại vịnh Nha Trang – Khánh Hòa 42

3.1.2 Cấu trúc đơn vị khung xương của các loài Hải Miên thu mẫu tại Nha Trang 44

3.1.3 Sàng lọc loài Hải Miên có hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy cao 46 3.2 NGHIÊN CỨU CHIẾT POLYPHENOL CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ HẢI MIÊN A SUBERITOIDES THU MẪU TẠI VỊNH NHA TRANG BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾTCÓHỖTRỢSÓNGSIÊUÂM 52 3.2.1 Ảnh hưởng của chế độ chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy

hóa của dịch chiết Hải Miên 55

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết Hải Miên 58

3.2.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/NL (dung môi/nguyên liệu) đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa trong dịch chiết Hải Miên 61

3.2.5 Ảnh hưởng của phương thức chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa trong dịch chiết Hải Miên 64

3.2.6 Ảnh hưởng của pH dung môi chiết lên hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa trong dịch chiết Hải Miên 67

3.2.7 Đề xuất quy trình thu nhận popyphenol hoạt tính chống oxy hóa từ loài Hải Miên (A superitoides) 69

3.3 SƠ BỘ TINH SẠCHPOLYPHENOL CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓACHIẾT TỪ HẢIMIÊNA.SUBERITOIDES 70

3.3.1 Phân đoạn n-hexan 71

3.3.2 Phân đoạn Chloroform 73

3.3.3 Phân đoạn ethanol 76

3.3.5 Phân đoạn ethyl acetate 79

3.3.5 Phân đoạn n-butanol 81

3.3.6 Độ sạch của polyphenol qua từng phân đoạn 84

3.3.7 Đề xuất quy trình thu nhận và tinh sạch sơ bộ polyphenol hoạt tính chống oxy hóa từ Hải Miên 85

3.4 SẢN XUẤT VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG BỘT POLYPHENOL HẢI MIÊN A SUBERITOIDES 87

3.4.1 Thử nghiệm sản xuất bột polyphenol từ Hải Miên A suberitoides bằng kỹ thuật sấy phun…… 87 3.4.2 Đánh giá chất hàm lượng polyphenol hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết Hải

3.4.3 Phân tích phổ IR bột polyphenol từ Hải Miên A suberitoides 90

3.4.4 Phân tích nhiệt vi sai bột polyphenol từ Hải Miên A suberitoides 91

3.4.5 Đánh giá phân bố kích thước hạt bột polyphenol từ Hải Miên A suberitoides 92

3.4.6 Quy trình thu nhận, tinh sạch sơ bộ và sản xuất bột polyphenol hoạt tính chống oxy hóa từ Hải Miên Aaptos suberitoides 93

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 96

TÀI LIỆU THAM KHẢO 98

PHỤ LỤC 109

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A suberitoides : Aaptos suberitoides

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất của một số dung môi phổ biến trong chiết xuất hợp chất tự nhiên 18Bảng 1.2 Thông số kỹ thuật của bể chiết siêu âm Elmasonic S 100H 21Bảng 3.1 Kết quả thu mẫu các loài Hải Miên tại Vịnh Nha Trang – Khánh Hòa 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh về một số loài Hải Miên điển hình 3

Hình 1.2 Cấu tạo và cơ chế dinh dưỡng của Hải Miên 4

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một đơn vị phenol 8

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất polyphenol 9

Hình 1.5 Phân loại polyphenol theo Devanand và cộng sự, 2006 10

Hình 1.6 Phân loại polyphenol theo Singh A và cộng sự, 2011 10

Hình 1.7 Phân loại polyphenol theo Erica Sharpe và cộng sự, 2014 11

Hình 1.8 Cấu trúc 5-bromoindole và Bromophenol 12

Hình 1.9 Polyphenol gốc imidazol mới của loài Hải Miên Leucetta chagosensis colected 12

Hình 1.10 Hợp chất Spironaamidine từ loài Hải Miên Microraphis Leucetta 12

Hình 1.11 Cấu trúc của avarol phân lập từ loài Hải Miên Disidea avara 12

Hình 1.12 Cấu trúc của Papuamide A, B phân lập từ loài Hải Miên Theonella mirabilis và Theonella swinhoei 13

Hình 1.13 Cấu trúc của manzamine A phân lập từ loài Hải Miên Haliclona sp 14

Hình 1.14 Cấu trúc của hợp chất Hamigeran phân lập từ loài Hải Miên Hamigera tarangaensis 14

Hình 1.15 Cơ chế tấn công tế bào của các gốc tự do 16

Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 31

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm sàng lọc mẫu 32

Hình 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ chiết đến hàm lượng polyohenol và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ Hải Miên 33

Hình 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyohenol và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ Hải Miên 34

Hình 2.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ Hải Miên 34

Hình 2.6 Khảo sát tỷ lệ DM/NL ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính

chống oxy hóa của dịch chiết từ Hải Miên 35

Hình 2.7 Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ Hải Miên 36

Hình 2.8 Bố trí thí nghiệm xác định pH chiết thích hợp 37

Hình 2.9 Sơ đồ sơ bộ tinh sạch dịch chiết Hải Miên 38

Hình 2.10 Sơ đồ đánh giá chất lượng bột sấy phun dịch chiết Hải Miên 39

Hình 3.1 Khung xương loài Aaptos suberitoides 44

Hình 3.2 Khung xương loài Xestospongia sp 45

Hình 3.3 Khung xương của loài Dasychalina sp 45

Hình 3.4 Khung xương loài Gelliodes fibulata 45

Hình 3.5 Khung xương loài Haliclona (Gellius) amboinensis 45

Hình 3.6 Khung xương loài Lipastrotethya sp 46

Hình 3.7 Khung xương loài Haliclona sp 46

Hình 3.8 Khung xương loài Stylissa sp 46

Hình 3.9 Sự thay đổi hàm lượng polyohenol có trong dịch chiết trong methanol và acetone của 11 loài Hải Miên thu mẫu tại Vịnh Nha Trang 47

Hình 3.10 Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết trong methanol và acetone của 11 loài Hải Miên thu mẫu tại Vịnh Nha Trang 49

Hình 3.11 Sự thay đổi hoạt tính khử sắt của dịch chiết trong methanol và acetone của 11 loài Hải Miên thu mẫu tại Vịnh Nha Trang 50

Hình 3.12 Ảnh hưởng của chế độ chiết đến hàm lượng polyphenol của dịch chiết polyphenol từ Hải Miên A suberitoides 52

Hình 3.13 Ảnh hưởng của chế độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt của dịch chiết polyphenol từ Hải Miên A suberitoides 52

Hình 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng poyphenol của dịch chiết Hải Miên A suberitoides 55

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt

tính khử sắt của dịch chiết Hải Miên A suberitoides 55

Hình 3.16 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng poyphenol của dịch chiết

Hải Miên A suberitoides 58

Hình 3.17 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt

tính khử sắt của dịch chiết Hải Miên A suberitoides 58

Hình 3.18 Ảnh hưởng của DM/NL đến hàm lượng poyphenol của dịch chiết Hải Miên

A suberitoides 61

Hình 3.19 Ảnh hưởng của DM/NL đến hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử

sắt của dịch chiết Hải Miên A suberitoides 61

Hình 3.20 Ảnh hưởng của phương thức chiết đến tổng hàm lượng poyphenol của dịch

chiết từ Hải Miên A suberitoides 64

Hình 3.21 Ảnh hưởng của phương thức chiết đến tổng hoạt tính chống oxy hóa và

tổng hoạt tính khử sắt của dịch chiết từ Hải Miên A suberitoides 65

Hình 3.22 Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng poyphenol của dịch chiết từ Hải Miên

A suberitoides 67

Hình 3.23 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt

của dịch chiết từ Hải Miên A suberitoides 67 Hình 3.24 Quy trình chiết polyphenol hoạt tính chống oxy hóa từ Hải Miên Aaptos

suberitoides 70

Hình 3.25 Sự thay đổi hàm lượng polyphenol của dịch chiết phân đoạn n-hexan được tách phân đoạn trong n-hexan/methanol với tỷ lệ khác nhau 71Hình 3.26 Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt của dịch chiết phân đoạn n-hexan được tách phân đoạn trong n-hexan/methanol với tỷ lệ khác nhau 72Hình 3.27 Sự thay đổi hàm lượng polyphenol của dịch chiết phân đoạn chloroform được tách phân đoạn trong chloroform /methanol với tỷ lệ khác nhau 74Hình 3.28 Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt của dịch chiết phân đoạn chloroform được tách phân đoạn trong chloroform /methanol với tỷ lệ khác nhau 74

Hình 3.29 Sự thay đổi hàm lượng polyphenol của dịch chiết phân đoạn ethanol được tách phân đoạn trong ethanol/chloroform với tỷ lệ khác nhau 77Hình 3.30 Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt của dịch chiết phân đoạn ethanol được tách phân đoạn trong ethanol/chloroform với tỷ lệ khác nhau 77Hình 3.31 Sự thay đổi hàm lượng polyphenol của dịch chiết phân đoạn ethyl acetate được tách phân đoạn trong ethyl acetate/methanol với tỷ lệ khác nhau 79Hình 3.32 Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt của dịch chiết phân đoạn ethyl acetate được tách phân đoạn trong ethyl acetate/methanol với tỷ lệ khác nhau 79Hình 3.33 Sự thay đổi hàm lượng polyphenol của dịch chiết phân đoạn n-butanol được tách phân đoạn trong n-butanol/methanol với tỷ lệ khác nhau 82Hình 3.34 Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt của dịch chiết phân đoạn n-butanol được tách phân đoạn trong n-butanol/methanol với tỷ lệ khác nhau 82Hình 3.35 Quy trình thu nhận và tinh sạch polyphenol hoạt tính chống oxy hóa từ Hải

Miên Aaptos suberitoides 86 Hình 3.36 Hình ảnh bột polyphenol Hải Miên A suberitoides sau sấy phun 88

Hình 3.37 Hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa tổng, hoạt tính khử sắt trước và sau khi tiến hành sấy phun dịch chiết Hải Miên trước và sau khi tiến hành sấy

phun dịch chiết Hải Miên A suberitoides 88

Hình 3.38 Kết quả phân tích phổ IR bột dịch chiết Hải Miên bột polyphenol từ Hải

Miên A suberitoides 90

Hình 3.39 Giản đồ phân tích nhiệt vi sai mẫu bột dịch chiết Hải Miên bột polyphenol

từ Hải Miên A suberitoides 91 Hình 3.40 Giản đồ phân bố kích thước hạt polyphenol từ Hải Miên A suberitoides 92

Hình 3.41 Quy trình thu nhận và tinh sạch sơ bộ polyphenol hoạt tính chống oxy hóa

từ Hải Miên 94

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên luận văn: “Nghiên cứu thu nhận polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ

Hải Miên thu mẫu tại Nha Trang bằng kỹ thuật chiết hỗ trợ siêu âm”

Mục tiêu đạt được là: Đánh giá và sàng lọc được loài Hải miên có hàm lượng polyphenol với hoạt tính chống oxy hóa cao từ 11 loài Hải Miên thu mẫu tại Nha Trang Đưa ra được điều kiện chiết polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ loài Hải

Miên Aaptos suberitoides (A suberitoides) bằng kỹ thuật chiết ngâm dầm có hỗ trợ

sóng siêu âm Sơ bộ tinh sạch, sản xuất bột polyphenol và đánh giá đặc tính bột giàu

polyphenol chống oxy hóa chiết từ Hải Miên A suberitoides sinh trưởng tại Nha

Trang

Các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm được sử dụng bao gồm các phương pháp định lượng protein, polyphenol, phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng, hoạt tính khử sắt Phương pháp định tính, phương pháp xác định đặc tính bột trên cơ sở sử dụng thiết bị DSC Các phương pháp xử lý số liệu và đánh giá kết quả đảm bảo yêu cầu khách quan về độ chính xác cho phép với sự hỗ trợ của phần mềm MS Excel 2010 và SPSS 16.0

Kết quả cho thấy 11 loài Hải Miên đều có hàm lượng polyphenol và hoạt tính

chống oxy hóa Trong đó, Hải Miên A suberitoides có hàm lượng polyphenol, hoạt

tính chống oxy hóa tổng và hoạt tính khử sắt cao nhất, tương ứng 202,157±0,02 mg phloroglucinol/g DW; 397,227±0,002 mg a.ascorbic/g DW; 28,279±0,011 mg

hành nghiên cứu chiết polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp ngâm dầm có hỗ trợ siêu âm và sơ bộ tinh sạch

Điều kiện chiết polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa cụ thể như, sử dụng kỹ thuật chiết hỗ trợ siêu âm chế độ chiết gián đoạn, dung môi chiết là methanol; pH 7;

C; Số lần chiết 1 lần; Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 40/1(v/w) Dịch chiết polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ

Hải Miên (A superitoides) có hàm lượng polyphenol 286,354 mg phloroglucinol/g

DW, hoạt tính chống oxy hóa tổng là 486,238 mg acid ascorbic/ g DW và hoạt tính khử sắt là 48,124 mg FeSO4/g DW

Sơ bộ tinh sạch polyphenol từ Hải Miên cho thấy tách phân đoạn polyphenol từ dịch cô đặc của dịch chiết Hải Miên A suberitoides bằng dung môi hữu cơ n-hexan,

chloroform, ethyl acetate, n-butanol với tỷ lệ dung môi/dịch cô đặc tương ứng là: 9/1; 5/1; 4/1; 1/1 (v/v) là phù hợp cho quá trình thu nhận polyphenol tinh sạch Mặt khác kết quả nghiên cứu cũng cho thấy sử dụng dung môi ethanol tách phân đoạn polyphenol từ phân đoạn chloroform với tỷ lệ ethanol/chloroform: 4/1 (v/v) là phù hợp Phân đoạn chloroform có hàm lượng polyphenol cao nhất là 122,645±0,053 mg phloroglucinol/ml ứng với hoạt tính chống oxy hóa và khử sắt lần lượt là 226,765 mg a.ascorbic/ml và 15,605 mg FeSO4/ml Độ tinh sạch polyphenol ở phân đoạn chloroform là cao nhất, tăng 13.778% so với dịch chiết Hải Miên cô đặc ban đầu Điều

đó cho thấy polyphenol được chiết từ loài Hải Miên A suberitoides có thể được ứng

dụng để sản xuất các sản phẩm y dược phẩm và thực phẩm

Bột giàu polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ Hải Miên A suberitoides

được sản xuất bằng kỹ thuật sấy phun, đặc tính bột được đánh giá cho thấy dịch chiết Hải Miên trước khi sấy phun thì hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa tổng

và hoạt tính khử sắt lần lượt đạt 286,354 mg phloroglucinol/g DW; 486,238 mg acid

hàm lượng polyphenol là 216,714 mg phloroglucinol/g DW, hao hụt hết 24,325% so với dịch chiết Hải Miên trước khi tạo bột Hoạt tính chống oxy hóa tổng là 215,965 mg acid ascorbic/g DW, chỉ còn lại 44,425% so với dịch chiết Hải Miên trước khi tạo bột

Miên trước khi tạo bột Điều này cho thấy sự hao hụt đáng kể polyphenol hoạt tính chống oxy hóa sau khi tiến hành tạo bột bằng kỹ thuật sấy phun

Đánh giá phổ IR từ bột giàu polyphenol sấy phun từ dịch chiết Hải Miên A

suberitoides, nhận thấy có sự xuất hiện vân hấp thụ 3286 cm-1 đó là sự xuất hiện của

đặc trưng cho dao động hóa trị

thể hiện cho các liên kết như C-C, C-O, C-N có mặt trong hợp chất Điều này cho phép bước đầu xác định, trong hợp chất có sự xuất hiện của các hợp chất phenol, điển hình cho hợp chất polyphenol

Các kết quả phân tích nhiệt vi sai chỉ ra rằng Mẫu bột giàu polypehnol sấy phun từ

C có các liên kết hoặc

độ 563,890C các nhóm benzen hoặc có thể hợp chất polyphenol bị phá hủy hoàn toàn Đánh giá phân bố kích thước hạt từ mẫu bột giàu polyphenol sấy phun từ dịch

chiết Hải Miên cho thấy, kích thước các hạt bột dịch chiết Hải Miên A suberitoides

không đồng đều, có kích thước khác nhau, trong đó kích thước lớn nhất có kích thước

là 785,1±1,77 nm, chiếm tỷ lệ 64%, các hạt có kích thước 163,9±41,67 nm, chiếm tỷ lệ 29,323% và các hạt có kích thước 31,78±4,834 nm, chiếm tỷ lệ thấp nhất là 6,6% trong tổng số hạt phân tích Vì vậy, thử nghiệm sản xuất tạo bột này có thể được ứng dụng để sản xuất bột polyphenol từ dịch chiết Hải Miên trong quy mô công nghiệp

Từ khóa: Hải Miên; chiết; polyphenol; hoạt tính chống oxy hóa; Aaptos suberitoide

MỞ ĐẦU

Hải Miên (bọt biển) là loài động vật thân lỗ, đa dạng các loài, sinh sống và phân

bố rộng rãi ở vùng biển Việt Nam cũng như trên thế giới Trong số các loài động vật biển đã nghiên cứu trên thế giới, Hải Miên được cho là loài động vật hàng đầu mà cơ thể chứa rất nhiều các hợp chất tự nhiên cho đến hiện tại theo các thống kê đã công bố Hải Miên có khoảng 4.851 hợp chất chiếm vào khoảng 30% trong tổng số hơn 15.000 hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ sinh vật biển đã được biết [83] Trong đó, có khoảng 1.499 hợp chất mới được phát hiện trong những năm 2008-2012 [93, 99], tương ứng với 200 hợp chất mới được phát hiện mỗi năm trong thập kỷ qua [50] Các chất chuyển hóa thứ cấp được phát hiện ở Hải Miên được các nhà khoa học cho rằng chúng được sản sinh với mục đích bảo vệ chúng khỏi các mối đe dọa trong môi trường sống như các cuộc tấn công từ động vật ăn thịt, nhiễm vi sinh, sinh vật sống bám, [20]

Chất chuyển hóa thứ cấp tồn tại trong Hải Miên bao gồm: polyphenol, steroid, lectin,… Trong số các hợp chất polyphenol phát hiện ở Hải Miên, phải kể đến Avarol -

đây hợp chất lần đầu tiên phát hiện ở loài Hải Miên Disidea avara vào năm 1974 [67]

Hợp chất này có khả năng ức chế hoạt động của virus HIV và virus retrovirus

T-lymphotropic [100] Hay hoạt chất spironaamidine từ loài Hải Miên Microraphis

Leucetta ở phía Bắc đảo Sulawesi - Indonesia Spironaamidine có hoạt tính kháng vi

khuẩn Bacillus cereus với 12 vùng có dấu hiệu ức chế [103] Ngoài ra, trong Hải Miên

các nhà khoa học còn phát hiện thấy nhiều sinh học khác như: polysacharide[19], isobutyl phthalate, di-n-butyl phthalate, acid linoleic, β-sitosterol,cholesterol, bis-(2-ethyl)-hexyl-phthylester, triglyceride, axit béo, ester,…[83] - các hợp chất này đang được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất thực phẩm, dược phẩm [15, 104]

di-Ở Việt Nam ước tính có khoảng 200 loài Hải Miên [37] Tuy nhiên, ở Việt Nam việc nghiên cứu về các chất tự nhiên ở Hải Miên, nhất là polyphenol mới chỉ bắt đầu trong vài năm trở lại đây và hiện có rất ít công trình công bố về lĩnh vực này, bên cạnh đó, kỹ thuật chiết polyhenol từ Hải Miên chưa được hoàn thiện và cải tiến Do vậy, việc nghiên cứu và thu nhận các hợp chất polyphenol cũng như nghiên cứu ứng dụng polyphenol có hoạt chất chống oxy hóa từ Hải Miên trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm là cần thiết Do vậy,

Luận văn tiến hành “Nghiên cứu thu nhận polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ Hải

Miên thu mẫu tại Nha Trang bằng kỹ thuật chiết hỗ trợ siêu âm”

Mục tiêu của luận văn: chiết đƣợc polyphenol từ Hải Miên và đánh giá khả

năng ứng dụng của polyphenol Hải Miên trong sản xuất bột polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa

Nội dung nghiên cứu của luận văn:

1) Đánh giá và sàng lọc loài Hải Miên có hàm lượng polyphenol với hoạt tính chống oxy hóa cao từ 11 loài Hải Miên thu mẫu tại Nha Trang

2) Nghiên cứu chiết polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ loài Hải Miên có chứa polyphenol với hoạt tính oxy hóa cao bằng phương pháp chiết có hỗ trợ sóng siêu âm

3) Sơ bộ tinh sạch và thử nghiệm sản xuất bột polyphenol từ Hải Miên thu mẫu tại Nha Trang

* Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu của luận văn là nguồn dữ liệu mới về việc áp dụng kỹ thuật chiết hỗ trợ siêu âm để chiết các hợp chất polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ Hải Miên có hàm lƣợng polyphenol cao thu mẫu tại Nha Trang - Khánh Hòa Do vậy, kết quả nghiên cứu của luận văn sẽ bổ sung thêm các hiểu biết mới về polyphenol từ Hải Miên - đây là nguồn tài liệu tốt cho các học viên cao học và những ai nghiên cứu

về lĩnh vực này

* Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Luận văn lần đầu tiên sản xuất đƣợc bột các hợp chất polyphenol có hoạt tính chống oxy hóa từ Hải Miên Do vậy, luận văn là cơ sở cho việc nghiên cứu ứng dụng các chất có hoạt chất sinh học từ Hải Miên vào trong cuộc sống

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 HẢI MIÊN

1.1.1 Giới thiệu về Hải Miên

Hải Miên là một ngành động vật đa bào nguyên thuỷ, phát triển từ các cụm đơn bào [104, 15], có cấu trúc tế bào tách biệt, gồm khung xương vô cơ hình ống hoặc mạng lưới được cấu tạo từ silica hoặc calcite và liên kết với nhau bởi những

mô liên kết [56, 33] Trên thế giới ước tính có khoảng hơn 8000 loài Hải Miên đã được phát hiện [104], chúng đa dạng về hình thái như: hình sừng hươu, hình cây xương rồng, hình ống trụ, hình san hô, hình tổ ong, hình hạt mít, hình thù giống hải sâm,…(hình 1.1)

Hình 1.1 Hình ảnh về một số loài Hải Miên điển hình [122]

Đây là ngành động vật có những mô khác nhau nhưng không có cơ, hệ thần kinh,

cơ quan bên trong, hay khả năng vận động Chúng đã từng bị nhầm lẫn là một loài thực vật giống như đã từng nhầm lẫn về loài san hô [53, 108] Hải Miên xuất hiện hầu hết các vùng nước trên trái đất, từ những hồ nước ngọt tới các vùng biển nhiệt đới, bao gồm cả những vùng lạnh giá ở Bắc Cực [8, 41, 93, 106]

Ở Việt Nam, riêng Vịnh Nha Trang - Khánh Hòa và một số vùng biển nông ở Ninh Thuận, qua kết quả khảo sát, chúng tôi đã tìm thấy có khoảng 18 loài Hải Miên,

chúng có màu sắc, hình thái và đặc điểm môi trường sinh sống rất đa dạng

Nhiều nghiên cứu sinh thái đã chỉ ra rằng các chất chuyển hóa thứ cấp được sản sinh từ Hải Miên thường vai trò phòng thủ, bảo vệ chúng khỏi các mối đe dọa như các cuộc tấn công từ động vật ăn thịt, nhiễm vi sinh vật dưới biển, biofouling [93], cũng như chống lại sự phát triển quá mức của các sinh vật không xương sống khác [20, 83]

Vì lý do này Hải Miên là đối tượng hấp dẫn đối với các nhà hóa học nghiên cứu về hợp chất tự nhiên, cụ thể họ nghiên cứu về số lượng của các chất chuyển hóa được sản xuất, tính mới của cấu trúc, và có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh cho con người Có bằng chứng cho thấy một số hợp chất ban đầu được tìm thấy trong các tế bào Hải Miên được tổng hợp bởi các vi sinh vật kết hợp với chúng [6, 100, 104]

Hình 1.2 Cấu tạo và cơ chế dinh dưỡng của Hải Miên (1: gap, 2: khoang trung tâm, 3: tường bên trong, 4: lỗ chân lông, 5: septum,

6: tường bên ngoài, 7: rizoid) [112, 113, 114]

Hải Miên thường ăn bằng cách hút nước qua các lỗ nhỏ li ti, sau đó lọc nước, giữ lại các sinh vật phù du, vi khuẩn và khoáng chất sau đó đẩy nước ra lỗ chính (lỗ to nhất) [33, 56] Hầu hết chúng dựa vào việc duy trì một dòng chảy liên tục qua cơ thể

để lấy thức ăn, oxy cũng như loại bỏ chất thải Việc duy trì dòng chảy là sự kết hợp đều đặn của nhiều tế bào bên trong thành ống, mỗi tế bào bên trong thành ống có một hoặc hai sợi roi (lông), có thể là gai chuyển động liên tục, đều đặn cùng theo một hướng tạo thành một luồng nước một chiều hút nước từ bên ngoài vào bên trong cơ thể

Hải Miên và thải ra lỗ chính [56, 104]

Hải Miên sinh sản hữu tính [85], giải phóng tế bào tinh trùng vào trong nước để thụ tinh cho trứng cũng được phát tán trong nước bởi những con Hải Miên cái Hải Miên còn được biết đến với khả năng tái sinh từ những mảnh vỡ, với điều kiện còn lại các cơ quan chủ chốt của tế bào Một số loài sinh sản bằng nảy chồi như loài thủy tức [23, 93, 106]

1.1.2 Phân loại và phân bố các loài Hải Miên

Hải Miên xuất hiện trên toàn thế giới, sống hoàn toàn trong môi trường nước, phần lớn sống trong môi trường nước mặn của đại dương, từ các vùng cực đến vùng nhiệt đới, từ vùng nước sâu đến vùng nước nông [38, 41, 44, 92] Hầu hết sống trong vùng nước tĩnh, vùng biển rõ ràng, bởi vì trầm tích khuấy động bởi sóng hoặc dòng chảy mạnh sẽ chặn lỗ hút nước của Hải Miên, làm chúng khó khăn trong quá trình ăn

và hô hấp [94] Phần lớn, số lượng Hải Miên thường được tìm thấy trên bề mặt vững chắc như đá, san hô Một số loài Hải Miên có thể gắn vào trầm tích mềm bằng bộ phận bám giống như rễ cây của các loài thực vật hoặc bằng gai móc,…[63]

Hải Miên được phân loại thành ba lớp chính: Hải Miên có chứa canxi (Calcarea), Hải Miên thủy tinh (Hexactinellida) và Demosponges (Demospongiae) Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nhóm Homoscleromorpha, một nhóm được cho là thuộc về nhóm Demospongiae, thực sự là phylogenetically cũng tách ra [16] Do đó, nhóm này gần đây đã được công nhận là lớp thứ tư của Hải Miên [35, 77] Tại Việt Nam hay cụ thể hơn là tại Nha Trang và Ninh Thuận, qua điều tra cho thấy, Hải Miên chủ yếu được tìm thấy thuộc về lớp Demospongiae

Tại Việt Nam, theo nghiên cứu của các chuyên gia viện Hải Dương học, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa thì chỉ phát hiện duy nhất một loài Hải Miên sống ở nước lợ, bám vào rễ các loại cây ven cửa sông như vẹm, đước, sú, bần tuy nhiên không phát hiện được loài Hải Miên sống ở nước ngọt Còn lại chủ yếu sống ở các vùng biển

từ Bắc chí Nam Việt Nam [37, 99]

1.1.3 Ứng dụng của Hải Miên ở Việt Nam và trên thế giới

Hải Miên được ứng dụng nhiều nhất trong y học với nhiều hoạt chất sinh học có hoạt tính cao trong việc chữa bệnh bởi số lượng lớn các chất chuyển hóa được sản xuất, tính mới của cấu trúc, và khả năng điều trị của các hợp chất này

trong việc điều trị bệnh cho con người [6] Nhiều tài liệu nghiên cứu ghi nhận sự tồn tại của một số hợp chất có trong Hải Miên như: di-isobutyl phthalate, di-n-butyl phthalate [66], acid linoleic [69], β –sitosterol [19], triglyceride axit béo ester [83] Đặc biệt, công nhận sự tồn tại của các polyphenol có khả năng chống oxy hóa cao như spongouridine [104, 15], spongothymidine [104], spongosine [51], crotonoside [78], Suberitine A-D [72] Trong đó có hợp chất polyphenol như spongouridine [15], spongothymidine [104], có khả năng chống viêm, giảm đau, giãn mạch máu [72]; crotonoside,…) và một số tác dụng khác như: chống oxy hóa, gây độc cho tế bào ung thư, chống lại bệnh ngủ ở Châu Phi, có hiệu quả trong việc bảo vệ chống lại các tổn thương gan [20], chống lại bệnh xơ vữa động mạch, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, tiểu đường,…[13]

Ngoài ra Hải Miên còn được nuôi để khai thác khung xương collagen đối với nhiều loài Hải Miên có tính đàn hồi, xốp, có kích thước lớn, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong cuộc sống như chà rửa, bông tắm, bông massage, bông tẩy trang, trang điểm,

mỹ phẩm,… [27, 59] Một số nghiên cứu ứng dụng khác liên quan đến công nghiệp đóng tàu như việc phát triển sơn chống hà, chóng hàu (sinh vật bám vỏ tàu, gây rạn nứt, mất thẩm mỹ tàu) Loại sơn này không độc hại, thân thiện với môi trường và dễ sử dụng nhờ một loại hợp chất sinh học được chiết xuất từ Hải Miên [99]

Từ các nghiên cứu ứng dụng trên, nhất là các ứng dụng trong ngành dược phẩm thì việc nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của các hợp chất có hoạt tính sinh học có trong Hải Miên ở vùng biển Việt Nam là hướng đi đầy triển vọng góp phần đẩy mạnh việc nghiên cứu chuyên sâu về Hải Miên cũng như ứng dụng vào các ngành dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm

1.1.4 Tình hình nghiên cứu Hải Miên trong và ngoài nước

Ở Việt Nam, các nhà khoa học từ lâu đã biết đến Hải Miên và những lợi ích từ chúng, tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu về polyphenol hay các hợp chất tương tự polyphenol từ Hải Miên Do đó, phải kể đến các nghiên cứu nổi bật nhất về một số lĩnh vực khai thác từ Hải Miên như:

Nghiên cứu của Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Nguyễn Khắc Bát (2016) công bố ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất bằng nước với sự hỗ trợ siêu âm đến hoạt tính chống

oxy hóa của dịch chiết Hải Miên Ircinia mutan [1]

Võ Thị Kim Thuyền (2015) đã nghiên cứu khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ 15 loài hải miên ở vùng biển Việt Nam và hoàn thiện quy trình chiết tách hoạt chất sinh học chống oxy hóa từ hải miên [9]

Nghiên cứu của Thái Minh Quang (thuộc viện Hải Dương học Nha Trang) và cộng sự (2016) Nghiên cứu, định danh các loài Hải Miên từ eo biển Singapore đến eo biển Đài Loan và dọc theo bờ biển phía Tây của biển Nam Trung Quốc [99]

Báo cáo của Lindgren và cộng sự (1897, 1898) công bố khoảng 20 loài Hải Miên tại khu vực quần đảo Malaysia và vùng biển Đông [61]

Nguyễn Xuân Cường và các cộng sự (2007) đã nghiên cứu và phân lập các thành

phần hóa học của loài Hải Miên Xestospongia testudinaria thu thập tại Việt nam

Trong nghiên cứu này, họ đã phân lập và xác định cấu trúc của 8 hợp chất là:

thymidine, thymine, batilo và chimyl alcohol [4 ]

Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về tính đa dạng sinh học của Hải Miên, do

có nhiều điều kiện thuận lợi về trang thiết bị, đội ngũ các chuyên gia nghiên cứu với trình độ cao, nhất là các phương tiện tối tân như tàu ngầm chịu được áp suất lớn, có thể thu thập các mẫu vật Hải Miên từ các vùng biển sâu,… Chủ yếu các nhà khoa học nghiên cứu về các hoạt chất có hoạt tính sinh học cao trong Hải Miên như hoạt tính chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, an thần, sơn vỏ tàu,… Một số nghiên cứu về Hải Miên nổi bật như:

Báo cáo của Vacelet và Kelly (2008), tìm thấy các loài mới từ vùng biển Thái Bình Dương và nghiên cứu cho thấy những Loài Hải Miên ăn thịt có niên đại từ thời tiền Jura [94]

Leys, Cheung, Boury-Esnault (2006), nghiên cứu sự hình thành phôi của loài Hải

Miên thủy tinh Oopsacas minuta: Sự hình thành syncytia bằng sự kết hợp của các

blastomeres Trong cuốn sách Sinh học tổng hợp và so sánh [59]

Halliwell (1994), Chairman (2012) đã nghiên cứu một số chất chuyển hóa có nguồn gốc từ loài Hải Miên như polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside và các hợp chất phenol cho thấy có khả năng chống oxy hóa mạnh so với vitamin E và

vitamin C [41, 43]

Reddy và cộng sự (2011) cũng đã nghiên cứu khả năng chống oxy hóa, chống

viêm và chống nấm của loài Hải Miên Subergargoria suberosa Kết quả cho thấy, acid

subergargoric 1 có tác dụng chống oxy hóa và chống viêm cao nhất và cũng cho thấy hợp chất 7 có hoạt tính chống oxy hóa và chống viêm cao hơn hợp chất 2 Những kết quả này gợi ý rằng acid subergorgic cũng như các dẫn xuất của chúng tương tự hợp chất 2 và hợp chất 7 có tiềm năng lớn như một chất có nguồn gốc tự nhiên có khả năng chống oxy hóa và chống viêm [77]

Orhan và cộng sự (2012) tiến hành nghiên cứu các chất chiết xuất từ Hải Miên của nhiều loài khác nhau trên biển Địa trung hải thuộc địa phận Thổ Nhĩ Kỳ Kết quả các chất chiết xuất Hải Miên cho thấy tính kháng khuẩn đáng chú ý, hoạt động chống AChE và gốc tự do DPPH hiệu quả [70]

Thông qua các nghiên cứu trên, cho thấy phần lớn các hoạt chất sinh học có trong Hải Miên đều có hoạt tính oxy hóa, cũng qua các nghiên cứu đó, thấy được mức độ chống oxy hóa, kháng khuẩn của Hải Miên phụ thuộc vào loài, môi trường sống, thức

ăn của chúng và kỹ thuật chiết,… Hơn nữa cho thấy giá trị của Hải Miên mang lại rất

đa dạng và vô cùng lớn do mức độ phong phú của loài

1.2 GIỚI THIỆU VỀ POLYPHENOL

1.2.1 Sơ lược về polyphenol

Polyphenol là thuật ngữ được sử dụng vào năm 1894 [2]

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của một đơn vị phenol

Polyphenol có cấu trúc đa phân tử được chia thành nhiều lớp con, bao gồm nhiều vòng phenol, các hợp chất phenol là nhóm hợp chất hữu cơ có chứa một hay nhiều nhóm hydroxyl (-OH) gắnvới một hay nhiều vòng thơm Cấu trúc của chúng tương tự các hợp chất dạng rượu nhưng lớp phenol có các thuộc tính duy nhất chỉ chúng có do nhóm hydroxyl không liên kết với nguyên tử cacbon no Trong cấu trúc của chúng, vòng thơm kết hợp mạnh với nguyên tử oxy và liên kết tương đối lỏng lẻo giữa nguyên

tử oxy này với nguyên tử hydro trong nhóm hydroxyl do đó dễ tách nguyên tử hydro

ra khỏi nhóm nên chúng có tính acid tương đối cao [4]

Polyhydroxynaphthoquione là polyphenol nguồn gốc động vật được phân lập lần

đầu tiên từ hải sâm Polycheria rufescens vào năm 1959 Naphthoquinone cũng được

pháp hiện có trong cầu gai và lần đầu tiên được phân lập bởi các nhà khoa học Nhật Bản (1958-1961) bởi các nhà khoa Mukai, Yamaguchi [2, 72]

Bên cạnh việc tìm ra các loại polyphenol có hoạt tính sinh học cao từ các loài động, thực vật, các nhà nghiên cứu còn nghiên cứu các phương pháp chiết, thu nhận các hoạt chất đó, sàn lọc khả năng cung cấp các hoạt chất polyphenol ở mỗi loài, đánh giá hoạt tính sinh học, cũng như khảo sát hàm lượng hoạt chất có trong các loài Hải Miên, tương ứng với mùa vụ sinh trưởng, khu vực xuất hiện, môi trường sinh sống của chúng

1.2.2 Phân loại polyphenol

Các hợp chất polyphenols được phân loại thành nhiều nhóm khác nhau theo chức năng và cấu trúc của số vòng phenol và các phân tử xung quanh vòng có trong hợp chất Chúng có thể được kết hợp với các axit hữu cơ khác nhau và carbohydrate Carbohydrates và axit hữu cơ có thể bị ràng buộc ở các vị trí khác nhau trên “bộ xương” polyphenol

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của một số hợp chất polyphenol [1, 2, 3]

Các hợp chất này có thể được phân loại thành các nhóm khác nhau như là một chức năng của số lượng các vòng phenol mà chúng chứa và của các yếu tố kết cấu mà

ràng buộc các vòng với nhau Sự khác biệt đƣợc tạo ra giữa các axit phenolic, flavonoid, stilbenes và lignans [30]

Polyphenol có thể đƣợc sinh tổng hợp hoặc bán tổng hợp [76] Số lƣợng và đặc tính cấu trúc của những chất sẽ là cơ sở cho việc phân loại cũng nhƣ quyết định đặc tính lý, hóa học của chất đó Mỗi chất thuộc nhóm polyphenol lại có những đặc tính vật lý, hóa học và sinh học khác nhau

Hình 1.5 Phân loại polyphenol theo Devanand và cộng sự, 2006

Hình 1.6 Phân loại polyphenol theo Singh A và cộng sự, 2011

Theo phân loại của Devannand và cộng sự (hình 1.5.), trong lớp phenolics có nhóm polyohenol, acid phenolics và miscellaneous, trong nhóm polyphenol có tannins

và flvonoids Theo phân loại của Singh A và cộng sự (hình 1.6.) cho thây trong nhóm polyphenol có các nhóm ligin, flavonoids, acid phenolic, acid Ellagic, Stillbenes và

Polyphenol

Coumarins Stilbenes Lignans

Flavone Chalcone Flavonol Flavanone Isoflanvone Flavanol Anthocynldin

* These compounds can occur in free from (aglycon) or conjugated from with sugar or acid units

Phenolic acids (ferulic acid)

Isoflavones (genistein)

POLYPHENOLS

Stilbenes

(resvaratrol)

Lignans (Pinoresionl)

Flavonoids Ellagic acid/

ellagitannins

Anthocianidin

s (genistein)

Flavonols (quercetin)

(luteolin)

Flavonones (hesperetin)

Catechins catechin)

(+-Flavonols (quercetin)

Flavonones (hesperetin)

Pro(antho)cyanidins (procyanidin B2)

Lignans Điều này cho thấy rằng, để phân loại chất hoặc nhóm chất và nhóm polyphenol phải dựa vào đặc tính hóa học, vật lý của chúng [2, 30, 89]

Trong nghiên cứu gần đây nhất của Erica Sharpe và cộng sự (2014) [87] cho thấy trong nhóm polyphenols bao gồm nhóm Flavonoid, acids phenolic, polyphenol amides, Artificial, Trolox, acid ellagic, resveratrol, curcumin, acid rosmarinic, acid ascorbic,…[2] (hình 1.7)

Hình 1.7 Phân loại polyphenol theo Erica Sharpe và cộng sự, 2014

1.2.3 Polyphenol Hải Miên

Hải Miên đƣợc công nhận là loài giàu sản phẩm tự nhiên vào bậc nhất, với khoảng

4851 hợp chất cho đến nay, góp phần gần 30% (trong tổng số hơn 15.000) [62] của tất

cả các sản phẩm tự nhiên biển đƣợc phát hiện cho đến thời điểm hiện tại Trong đó, 1.499 hợp chất mới đƣợc phân lập trong những năm 2008-2012 [71, 75] với hơn 200 hợp chất mới đƣợc báo cáo mỗi năm trong thập kỷ qua [99] Theo thống kê Ở Việt Nam, ƣớc tính có khoảng 200 loài Hải Miên [96] Một số chất chuyển hóa có nguồn gốc từ Hải Miên nhƣ polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside và các hợp chất phenol cho thấy khả năng chống oxy hóa mạnh so với vitamin E và vitamin C [4, 44, 76]

Các hợp chất polyphenol chứa brom nhƣ bromoindoles, bromophenols, và

bromopyrroles (Hình 1.8) đƣợc tìm thấy trong loài Hải Miên Aplysina aerophoba

Những polyphenol này đƣợc hình thành nhờ sự hỗ trợ thông qua hoạt động dehalogenation của các vi sinh vật cộng sinh với Hải Miên kết hợp với các haloaromatics khác nhau Các Polyphenol chứa gốc bromopyrrole đƣợc phân lập lần

đầu tiên vào năm 1971 từ loài Hải Miên Agelas oroides [35] Gốc Bromopyrrole rất

đƣợc các nhà nghiên cứu quan tâm trong thập kỷ qua là do nó là hoạt chất sinh học hoạt động khá mạnh, bao gồm cả khả năng gây độc, kháng khuẩn, và các hoạt động ức chế miễn dịch, và quan trọng nhất là khả năng chống oxy hóa

Hình 1.8 Cấu trúc 5-bromoindole và

Bromophenol [8, 100]

Hình 1.9 Polyphenol gốc imidazol mới

của loài Hải Miên Leucetta chagosensis

colected [42]

Polyphenol gốc imidazol đƣợc phân lập từ loài Hải Miên Leucetta chagosensis

Bắc Sulawesi, Indonesia vào năm 2007 (Hình 1.9) và đƣợc phân lập năm 2004 trên

loài Hải Miên Leucetta chagosensis colected từ Nam Sulawesi, Indonesia [42, 43]

Hình 1.10 Hợp chất Spironaamidine từ

loài Hải Miên Microraphis Leucetta [122]

Hình 1.11 Cấu trúc của avarol phân

lập từ loài Hải Miên Disidea avara [81]

Hoạt chất Spironaamidine (Hình 1.10) là một polyphenol chứa gốc spiroquinone

độc đáo, đã đƣợc phân lập từ loài Hải Miên Microraphis Leucetta thu ở Bắc Sulawesi,

Indonesia Spironaamidine cho thấy hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Bacillus cereus với 12 vùng có dấu hiệu ức chế bằng phương pháp xét nghiệm trên đĩa petri (10 mg/6 mm diện tích đĩa) [122]

Avarol (Hình 1.11) là một hydroquinone sesquiterpenoid với cấu trúc phân tử

được sắp xếp lại từ drimane, lần đầu tiên được phân lập từ loài Hải Miên Disidea

avara vào năm 1974 [66] Cấu trúc hóa học của avarol được xác định bằng các phương

pháp phân tích tiêu chuẩn về sự thoái hóa hóa học và tổng hợp tổng thể của nó được kiểm soát [81] Sự tổng hợp tổng hợp enaroselective của avarol được báo cáo bởi Ling

et al [59] Trong một nghiên cứu khác, mô hình primmorph (nuôi cấy in vitro của tế bào Hải Miên) được sử dụng làm hệ thống mô hình để sản xuất avarol trong phòng thí nghiệm Các phương pháp nuôi cấy tế bào và kỹ thuật gen sử dụng để sản xuất avarol bền vững cũng đã được đẩy mạnh nghiên cứu [67]

Hình 1.12 Cấu trúc của Papuamide A, B phân lập từ loài Hải Miên Theonella

mirabilis và Theonella swinhoei [33]

Papuamide A, B, (Hình 1.12) là các hợp chất polyphenol depsipeptide tuần

hoàn được phân lập từ loài Hải Miên Theonella mirabilis và Theonella swinhoei

thu thập dọc theo bờ biển phía Bắc của Papua New Guinea [33] Có khả năng làm chết virus HIV và cytotoxic, papuamides, Viện Ung thư Quốc gia và Đại học British Columbia độc lập báo cáo sự cô lập của papuamides A và B từ T mirabilis

và papuamides A, B, C, và D từ T swinhoei

Manzamine A (Hình 1.13) đã được phân lập từ loài Hải Miên Haliclona sp

Tìm thấy ở vùng biển gần Okinawa (Nhật Bản) bởi Sakai và Higa trong cuộc tìm kiếm của họ để tìm các hợp chất chống lại các sinh vật biển Nghiên cứu này cũng báo cáo hoạt tính chống virus HSV-II đầu tiên của hợp chất này với nồng độ tối thiểu 0,05 μg/ml Việc phân lập manzamine A cũng đã được báo cáo từ các loài

Hải Miên khác [67, 80, 100]

Hình 1.13 Cấu trúc của manzamine A

phân lập từ loài Hải Miên Haliclona sp

[80, 100]

Hình 1.14 Cấu trúc của hợp chất Hamigeran phân lập từ loài Hải

Miên Hamigera tarangaensis [100]

Hợp chất Hamigeran (Hình 1.14) đã được phân lập từ loài Hải Miên Hamigera

tarangaensis ở vùng biển New Zealand và cho thấy sự ức chế 100% virus (in vitro) đối

với cả virus gây ra mụn rộp và vi khuẩn bại liệt chỉ với sự gây độc tế bào ở mức độ

132 μg trên đĩa petri [100]

1.2.4 Vai trò của polyphenol có trong Hải Miên

Theo nghiên cứu của Caixia Liu, Xuli Tang, Pinglin Li và Guoqiang Li năm

2012 đã tìm ra bốn loại Cytotoxic dime Aaptamine mới từ loài Hải Miên Aaptos

Suberitoides Các hợp chất Suberitine 2 và Suberitine 6 cho thấy khả năng gây độc

mạnh, chống lại các dòng tế bào P388 (tế bào khối u từ P388 bệnh bạch cầu, ung thư phổi và u tủy ở động vật) với giá trị IC50 (là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát) tương ứng là 1,8mM và 3,5mM [48]

Spongouridine là những hợp chất polyphenol được thu nhận từ loài Hải Miên

Cryptotethya crypta Trong đó, hợp chất spongouridine có khả năng kiềm hãm sự phát

triển của tế bào ung thư, hoạt động kháng virus, chống lại virus vaccinia nhiễm trong các nguyên bào sợi da người, được đánh giá là sự ức chế của cytopathogenicity do virus gây ra,…[26]

Papuamides A và B đã được đánh giá về hoạt động chống HIV của chúng trong các thử nghiệm dựa trên tế bào trong nuôi cấy tế bào T của CEM-SS và thấy rằng có

hiệu lực cao với nồng độ hiệu quả là 3,6 ng/mL [100] Các hoạt động cho cả hai hợp chất đã được tìm thấy là hầu như giống hệt nhau Các nghiên cứu về hoạt động chống HIV của papuamides A và B đã được thực hiện bởi Andjelic et al [24] Cơ chế tương tác trực tiếp giữa papuamide A với virus đã được đề xuất với cơ chế nhắm mục tiêu là màng tế bào được cho là chịu trách nhiệm cho hoạt động diệt virus của hợp chất Một loại cơ chế tương tự đã được đề xuất cho lipopeptide phụ thuộc kháng nấm chống nấm [97] Papuamide B cũng ức chế sự xâm nhập của virus ở nồng độ 710 nM, với cơ chế

đề xuất nhằm vào phosphatidylserine, một chất phospholipid có trong màng virus Papuamides C và D được tìm thấy có hiệu lực ít hơn với sự ức chế 30% và 55% ở nồng độ cao gấp 40 và 20 lần so với papuamides A và B Trong một nghiên cứu gần đây Xie và các cộng sự báo cáo tổng hợp tổng số papuamide B [100]

Spongothymidine là những hợp chất polyphenol được thu nhận từ loài Hải Miên

Cryptotethya crypta Có khả năng làm giảm sự hình thành mảng bám của virus herpes

simplex type 1 (HSV-1) với 50% trong phôi nguyên bào sợi phổi, ức chế chống lại vi rút Varicella- zoster thymidine kinase (VZV TK) là loại virus gây ra bệnh thủy đậu, zona, ức chế chống lại virus Herpes simplex type 1 thymidine kinase (HSV-1 TK) là loại virus gây ra bệnh mụn rộp,…[57, 107] Ngoài ra người ta còn phân lập được hợp chất spongosine từ loài Hải Miên này, các hoạt động sinh học đầu tiên của spongosine được mô tả bởi Bartlett, người đã cho thấy rằng hợp chất này có giãn cơ bắp, giảm nhiệt độ cơ thể, hạ huyết áp, và các hoạt động chống viêm ở chuột (hoạt động chống viêm được đánh giá bằng cách ức chế phù nề carrageenan gây ra trong một chân chuột) Hợp chất spongosine (2-methoxyadenosine), của lớp adenosines, có tác dụng như là một loại thuốc giảm đau, đặc biệt là trong các phương pháp phòng ngừa, điều trị bệnh, hoặc việc giảm các cơn đau [89]

Hợp chất manzamine A từ loài Hải Miên thuộc chi Acanthostrongylophora từ Vịnh Manado, Inđônêxia báo cáo hoạt động chống virus HIV-1 của manzamin A, 8-hydroxymanzamin A, 6-deoxymanzamin X, và neokauluamine với EC50 lần lượt là 4,2 μM; 0,6 μM; 1,6 μM và 2,3 μM [88]

1.2.5 Cơ chế chống oxy hóa của polyphenol

Polyphenol là một trong những hoạt chất tự nhiên có nhiều tác dụng như chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, chống dị ứng và chống lão hóa cho con người Nhiều kết quả thử nghiệm cho thấy chế độ ăn giàu polyphenol sẽ làm

hạn chế sự oxy hóa và nhiều bệnh liên quan [87] Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về polyphenol có trong Hải Miên

Trong điều kiện bình thường các phân tử trong từng tế bào của cơ thể sinh vật ở trạng thái cân bằng Trong quá trình trao đổi chất có một số nguyên tử bị mất electron

do các tác nhân bên trong hoặc bên ngoài cợ thể (môi trường, tia tử ngoại…) Những nguyên tử này có xu hướng lấy các electron từ những nguyên tử lành lặn khác Những nguyên tử đó chính là các gốc tự do Những gốc tự do thường thấy nhất là gốc hydroxyl

hoại protein, lipid, DNA, dẫn đến lão hóa và một số bênh như ung thư, những bệnh thoái hóa thần kinh như Alzheimer và Parkinson, các bệnh về tim mạch,…

Hình 1.15 Cơ chế tấn công tế bào của các gốc tự do [113]

Nhiều cơ chế chống oxy hóa của polyphenol đối với sự oxy hóa gây ra bởi stress và hệ thống tạo ra chất hoạt động chứa oxy và nito (ROS/RNS) cả trong thí nghiệm và trên cơ thể người Cơ chế loại bỏ gốc tự do của polyphenol là cơ chế được công bố rộng rãi nhất là hoạt tính chống oxy hóa SciFinder (2008) thống kê có hơn 700 bài báo công bố về hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol tính từ năm 1995 Trong cơ chế thải gốc tự do, lượng polyphenol thay thế

tới phân tử sinh học hoặc tạo ra ROS tích cực hơn [14, 19, 20, 24, 39, 74]

Phản ứng củachất chống oxy hóa với gốc tự do [1, 2]

R* + A*  RA

1.3 KỸ THUẬT CHIẾT, ĐỊNH LƯỢNG VÀ TINH CHẾ POLYPHENOL 1.3.1 Nguyên lý của quá trình chiết

Chiết là quá trình dung môi chiết thẩm thấu vào nguyên liệu, thẩm thấu vào tế bào, hòa tan các hợp chất tan được trong dung môi, sau đó khuếch tán ra ngoài, do

sự chênh lệch nồng độ, quá trình này lặp đi lặp lại cho đến khi nồng độ chất tan trong nguyên liệu cân bằng với nồng độ chất tan trong dung môi Làm rõ hơn quá trình này, bao gồm 2 giai đoạn chính:

Giai đoạn 1: Dung môi thấm ướt lên bề mặt nguyên liệu, sau đó dung môi thấm sâu vào bên trong nguyên liệu do quá trình thẩm thấu Với sự tương đồng về

độ phân cực giữa dung môi và các hoạt chất bên trong nguyên liệu, các hoạt chất dần hòa tan vào dung môi

Giai đoạn 2: Do sự chênh lệch nồng độ của các chất hòa tan giữa bên trong nguyên liệu và bên ngoài nên các chất hòa tan sẽ theo dung môi khuếch tán ra bên ngoài màng tế bào, ra khỏi nguyên liệu cho đến khi cân bằng nồng độ chất tan bên ngoài và bên trong nguyên liệu

Dung môi chiết là một chất lỏng hoặc khí dùng để hòa tan một chất tan rắn, lỏng, hoặc khí khác, tạo thành một dung dịch có thể hòa tan trong một thể tích dung môi nhất định ở một nhiệt độ quy định Dung môi có thể được chia thành hai loại: phân cực và không phân cực, trong đó nước là một dung môi protic Về mặt kỹ thuật, hằng số điện môi phản ánh khả năng làm giảm cường độ trường điện của điện trường xung quanh một hạt tích điện nằm trong đó Sự giảm đi này sau đó được

so sánh với cường độ trường điện của các hạt tích điện trong chân không

Ethanol, methanol,… có thể hòa tan các chất không phân cực, đồng thời cũng có khả năng tạo cầu nối với các nhóm phân cực khác Vì thế methanol, ethanol,… được coi là dung môi vạn năng Nước ít sử dụng trong nghiên cứu vì độ phân cực quá cao,

ngoài khả năng chiết đƣợc nhứng hợp chất cần thiết, nó cũng làm rã protein – là thành phần không thể thiếu của Hải Miên, làm protein lẫn vào dịch chiết nên tốn nhiều hơn công sức để loại bỏ, làm sạch dịch chiết [1, 2, 3]

- Dung môi sử dụng trong quá trình chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau:

- Dung môi hòa tan đƣợc các chất cần thu nhận trong nghiên cứu

- Dễ dàng tách ra khỏi hỗn hợp dịch chiết

- Có tính trơ, không phản ứng với chất tan

- Không độc

- Có thể không đƣợc dễ cháy

- Có độ nhớt thấp, tăng nhanh tốc độ chiết

- Dung môi phải có độ tinh khiết nhất định

Hiện nay, khó có loại dung môi nào đảm bảo hết tất cả các yêu cầu trên, vì vậy khi nghiên cứu cần tuân thủ các nguyên tắc làm việc phòng thí nghiệm

Bảng 1.1 Tính chất của một số dung môi phổ biến trong chiết xuất hợp chất tự

nhiên [16]

Dung môi Công thức hóa học Điểm sôi Hằng số điện môi

Dung môi không phân cực

Dung môi phân cực protic

n-Butanol CH3-CH2-CH2-CH2-OH 1180C 18

1.3.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết [107]

Màng tế bào là áo giáp vững chắc bảo vệ tế bào khỏi những tác nhân bên ngoài,

vì thế nó ít nhiều cản trở sự thẩm thấu của dung môi xâm nhập vào bên trong tế bào, khiến cho hiệu xuất chiết bị giảm xuống Một số tạp chất có trong nguyên liệu chẳn hạn như nguyên liệu chứa nhiều chất keo hoặc chất nhầy khiến cho độ nhớt của nguyên liệu tăng, dẫn đến sự thẩm thấu của dung môi chiết một phần bị cản trở, ngoài

ra nguyên liệu chứa chất béo, dầu mỡ, tinh dầu, sáp, nhựa làm độ phân cực của dung môi chiết bị thay đổi, khiến cho các hoạt chất cần thu nhận không thể hoặc hòa tan kém vào dung môi chiết Nguyên liệu chứa enzym cũng khiến cho quá trình chiết xuất

bị ảnh hưởng

Độ phân cực của dung môi quyết định sự hòa tan của các hoạt chất, dung môi chiết có độ phân cực mạnh (vd: nước) không thể hòa tan được các hoạt chất có độ phân cực kém và không phân cực (vd: ete dầu) Độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi ảnh hưởng đến tốc độ và hiệu xuất của quá trình chiết Dung môi có độ nhớt càng cao thì tốc độ chiết càng chậm và ngược lại

Nhiệt độ chiết là yếu tố quan trọng nhất trong quá trình chiết nhiệt độ càng cao thì tốc độ chiết càng tăng, và ngược lại, tuy nhiên, nếu nhiệt độ tăng quá cao thì một số hoạt chất bị biến đổi hoặc mất đi, vì thế việc lựa chọn ngưỡng nhiệt độ chiết tối ưu là công việc quan trọng nhất

Thời gian chiết là yếu tố quan trọng trong công nghiệp Thời gian chiết ngắn quá thì lượng hoạt chất có trong nguyên liệu vẫn còn tồn lại, thời gian chiết quá lâu thì ảnh hưởng đến kinh phí và thời gian, vì thế cần phải xác định được thời gian chiết tối ưu

để đạt hiệu quả cao nhất

Độ mịn của nguyên liệu đóng một vai trò quan trọng trong hiệu xuất chiết nguyên liệu càng tán mịn thì diện tích tiếp xúc của nguyên liệu với dung môi càng tăng, vì thế tốc độ và hiệu xuất chiết cao hơn và ngược lại

Khuấy trộn giúp cho nguyên liệu ma sát với dung môi chiết, làm tăng hiệu quả chiết vượt trội

Siêu âm là phương pháp chiết công nghệ cao, tạo ra những xung động đều, liên tục khiến cho quá trình thẩm thấu và khuếch tán diễn ra nhanh vượt trội

1.3.3 Những khó khăn trong nghiên cứu chiết và tìm ra các hoạt chất mới có trong đối tượng Hải Miên

Ảnh hưởng của muối và nước đến quá trình tinh chế các hợp chất hòa tan trong nước cũng khiến cho quá trình chiết gặp nhiều khó khăn vì để chiết tách các hợp chất hòa tan trong nước phải dùng nước hoặc dung môi có độ phân cực cao như Methanol, aceton,…Trong môi trường nước, sự phát triển của vi sinh vật có thể gây sai lệch kết quả đánh giá hoạt tính sinh học, Cô đặc khó khăn, Khử muối rất phức tạp còn trong dung môi hữu cơ: Dịch chiết có lẫn các tạp chất không ưa nước; Làm biến tính hoặc thúc đẩy các phản ứng gây biến đổi cấu trúc Dư lượng dung môi có thể gây sai lệch kết quả đánh giá hoặc tính sinh học

Chi phí và thời gian cũng là yếu tố gây nên những kết quả không mong muốn đến quá trình nghiên cứu, một số thí nghiệm phải thực hiện trong một thời gian khá lâu, đôi khi lại không ra kết quả khiến cho tâm lý chán nản, đôi lúc muốn từ bỏ

Phương pháp phân tích đắt tiền, sử dụng nhiều thiết bị công nghệ cao với độ phức tạp không nhỏ, đồng thời chi phí cho việc tu sửa, bảo trì thiết bị lớn Việc sử dụng thành thạo, nhanh chóng các thiết bị hiện đại phải trải qua quá trình học hỏi, luyện tập Rất ít PTN có thể thực hiện được tất cả các phương pháp đánh giá

1.3.4 Kỹ thuật chiết có sự hỗ trợ sóng siêu âm [107]

Sóng siêu âm thường được sử dụng trong chiết xuất có tần số từ 20KHz đến 100MHz Dưới tác dụng của sóng siêu âm, dung môi chiết lúc thì bị ép lại đặc hơn, lúc thì bị dãn ra loãng hơn Do dung môi chiết không chịu nổi lực kéo nên khi bị kéo giãn

ra đã tạo thành những chỗ trống, sinh ra rất nhiều bọt không khí nhỏ Những bọt này trong chớp mắt sẽ vỡ tan ra Quá trình vỡ bọt sinh ra những luồng sóng xung kích nhỏ

rất mạnh, được gọi là “hiện tượng tạo chân không” Dung môi tại các hốc nhỏ, lỗ nhỏ trên nguyên liệu bị sủi bọt, đẩy chất cần chiết ra khỏi nguyên liệu, chất tan vào trong dung môi Sóng siêu âm có tác dụng phá vỡ cấu trúc tế bào do tạo ra sự rung động đều làm cho các pha ma sát với nhau mạnh, tăng cường khả năng tiếp xúc giữa các dung môi với các chất tan có trong nguyên liệu, làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuếch tán chất tan Sóng siêu âm làm hỗn hợp chiết với dung môi phân cực sẽ nóng lên Trong một số trường hợp có thể kết hợp gia nhiệt để tăng cường quá trình chiết xuất [107]

 Ưu điểm và nhược điểm

Thiết bị tương đối đơn giản, bảo quản và vận hành đơn giản, thiết bị không quá đắt tiền Chiết được nhiều nhóm hoạt chất, dung môi chiết khá đa dạng Lượng mẫu có thể lên đến hàng trăm gam Giảm được nhiệt độ và áp suất, ưu điểm này được ưu tiên áp dụng để chiết cho các hoạt chất không bền với nhiệt Tăng được khối lượng dịch chiết và rút ngắn được thời gian chiết, và như vậy cũng kéo theo tiết kiệm năng lượng đầu vào

Tuy nhiên có nhược điểm là dung môi khó được làm mới trong suốt quá trình chiết xuất, vì vậy hiệu lực chiết của nó là một hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly Thời gian lọc và rửa dịch chiết kéo dài, vì vậy sẽ tốn nhiều dung môi, làm mất một lượng dịch chiết hoặc dịch chiết có thể bị nhiễm bẩn Sự thoái hóa bề mặt của đầu dò theo thời gian sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết

Trong nghiên cứu này, sử dụng bể chiết siêu âm Elmasonic S 100H được trang bị các tính năng được điều khiển bằng bộ vi xử lý như Gián đoạn và Gián đoạn có bài khí (degas) Nhiệt độ và thời gian làm sạch cũng có thể được điều chỉnh thủ công và được hiển thị bằng LED Thông số kỹ thuật chi tiết trong bảng 1.3

Bảng 1.2 Thông số kỹ thuật của bể chiết siêu âm Elmasonic S 100H

Kích thước máy chính (D x R x C, mm) 365 x 278 x 264

Phạm vi ứng dụng của siêu âm là khá rộng, có thể áp dụng cho nhiều loại nguyên liệu với nhiều hợp chất khác nhau, chiết xuất nhiều nhóm hợp chất từ nhiều dược liệu khác nhau đặt biệt là những chất dùng cho thực phẩm Phá hũy hiệu quả cấu trúc tế bào làm phân tán đều chất tan

1.3.5 Các kỹ thuật chiết khác [1, 2, 3]

Ngoài kỹ thuật chiết có hỗ trợ sóng siêu âm, còn có rất nhiều kỹ thuật chiết khác

từ đơn giản, cổ điển cho đến hiện đại Điều đó dẫn đến hiệu xuất chiết trong mỗi kỹ thuật khác nhau, thời gian chiết được hoàn toàn các hợp chất trong nguyên liệu cũng khác nhau, lượng dung môi được sử dụng và tiêu tốn cũng thay đổi tùy vào các loại thiết bị và kỹ thuật chiết

 Kỹ thuật ngâm dầm

Là kỹ thuật truyền thống nhất, được sử dụng lâu đời nhất bằng cách ngâm nguyên liệu đã được xử lý ngập vào dung môi trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rữa nguyên liệu bằng một lượng dung môi thích hợp Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cánh khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cưỡng bức dung môi) Cách ngâm có thể là tĩnh hoặc động, nóng hoặc lạnh, ngâm một lần hoặc nhiều lần Ưu điểm là kỹ thuật này rẻ tiền, thiết bị đơn giản, dễ thực hiện nhược điểm

là năng suất thấp, thao tác thủ công trong giai đoạn tháo bã và nạp liệu, nếu chỉ chiết một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong nguyên liệu, nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết

Nguyên liệu sau khi chuẩn bị được ngâm vào dung môi trong bình ngấm kiệt sau một thời gian xác định, rút nhỏ giọt dịch chiết phía dưới, đồng thời bổ sung thêm dung môi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp nguyên liệu nằm yên Lớp dung môi trong bình chiết thường được để ngập bề mặt nguyên liệu khoảng 3 – 4 cm phương pháp ngấm kiệt đơn giản, luôn sử dụng dung môi mới để chiết kiệt hoạt chất trong nguyên liệu Kỹ thuật ngấm kiệt phân đoạn sử dụng dịch chiết loãng để chiết nguyên liệu mới hoặc nguyên liệu chưa dược chiết kiệt Ưu điểm là nguyên liệu được chiết kiệt, tiết kiệm được dung môi (tái ngấm kiệt), nhược điểm là năng suất thấp, lao động thủ công (trong quá trình tháo bã và nạp liệu), cách tiến hành phức tạp hơn so với kỹ thuật ngâm, tốn dung môi (ngấm kiệt đơn giản) [69]

Kỹ thuật này được Hannay và Hogarth công bố đầu tiên vào năm 1879, đến những năm 1960, kỹ thuật này mới được nghiên cứu kỹ lưỡng để áp dụng thay thế cho các phương pháp chiết xuất thông thường Kỹ thuật này sử dụng dung môi hữu cơ như: n-hexan, dichloromethan, chloroform và những dung môi khác thường được sử dụng trong chiết công nghiệp Kỹ thuật SFE cho phép chiết các chất một cách nhanh chóng, tự động, chọn lọc, không gây cháy nổ và tránh việc sử dụng một số lượng lớn các dung môi độc Dung môi chủ yếu sử dụng trong kỹ