Nghiên cứu thu nhận enzyme nattokinase bằng phương pháp lên men bề mặt từ phế liệu bã đậu nành

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định điều kiện thích hợp lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis natto thu nhận enzyme nattokinase trên bã đậu nành.. * Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu khả n

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA



VĂN THỊ DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME NATTOKINASE

BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT

TỪ PHẾ LIỆU BÃ ĐẬU NÀNH

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đà Nẵng – Năm 2017

Công trình được hoàn thành tại TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trương Thị Minh Hạnh

Phản biện 1:

TS Lê Lý Thùy Trâm Phản biện 2:

PGS TS Lê Thị Liên Thanh

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Công

nghệ sinh học họp tại Trường Đại học Bách khoa vào ngày 29 tháng 12 năm

2017

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

 Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng tại Trường Đại học Bách khoa

 Thư viện Khoa Hóa, Trường Đại học Bách khoa – ĐHĐN

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Theo các nghiên cứu, nguyên nhân chính gây ra các bệnh lý tim mạch là do

sự hình thành các cục máu đông hay còn gọi là huyết khối Các cục máu đông gây tắc nghẽn các mạch máu, gây tổn hại đến các cơ quan trong cơ thể và là nguyên nhân trực tiếp gây ra các bệnh nguy hiểm như: tai biến do tăng huyết áp, nhồi máu cơ tim, nhồi máu não, suy tim, thuyên tắc phổi,… Việc phát hiện nattokinase mở ra một triển vọng mới cho việc điều trị và phòng ngừa chứng huyết khối So với các loại thuốc tan huyết khối sẵn có hiện nay, nattokinase có nhiều ưu thế như an toàn, giá thành thấp hơn, hiệu quả, tác dụng kéo dài, sử dụng phòng ngừa và các sử dụng qua đường ăn uống dễ dàng

Hiện nay, Enzyme nattokinase chủ yếu được thu nhận từ quá trình lên men với cơ chất là hạt đậu nành Một số nghiên cứu đã đề cập đến các nguồn nguyên liệu khác thay thế như: gạo lức, cao ngô, bã đậu nành,…Trong đó, bã đậu nành

từ các nhà máy sản xuất đậu phụ là nguồn nguyên liệu rẻ tiền cần được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất

Trong sản xuất công nghiệp, bên cạnh việc sản xuất ra các chính phẩm, việc tận dụng các phụ phẩm, phế phẩm là rất cần thiết Ngoài ý nghĩa về mặt tăng cường hiệu quả kinh tế, việc tận dụng các phụ phẩm, phế phẩm còn có nhiều ý nghĩa về mặt bảo vệ môi trường

Từ yêu cầu thực tiễn đó, tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme nattokinase bằng phương pháp lên men bề mặt từ phế liệu bã đậu nành”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xác định điều kiện thích hợp lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis

natto thu nhận enzyme nattokinase trên bã đậu nành

- Xác định tỷ lệ thích hợp ethanol 96% trên dịch chiết enzyme thô trong quá trình thu nhận enzyme nattokinase

- Thu nhận chế phẩm enzyme thô

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

* Đối tượng nghiên cứu

- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto do phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc

trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng cung cấp

- Bã đậu nành lấy từ 03 cơ sở sản xuất đậu phụ trên địa bàn thành phố Quảng Ngãi

* Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme nattokinase trên chủng vi

khuẩn Bacillus subtilis natto với cơ chất là bã đậu nành ở quy mô phòng thí

nghiệm

4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

* Nghiên cứu lý thuyết

* Nghiên cứu thực nghiệm

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

* Ý nghĩa khoa học

- Đóng góp thông tin khoa học về bã đậu nành và làm phong phú thêm những nghiên cứu về ứng dụng của bã đậu nành, cung cấp thêm giải pháp xử lý

và tận dụng nguồn phế liệu bã đậu nành

- Đóng góp thông tin khoa học về điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus

subtilis natto thu nhận enzyme nattokinase bằng phương pháp lên men bề mặt

với cơ chất là bã đậu nành

* Ý nghĩa thực tiễn

Cung cấp thông tin công nghệ của quá trình lên men bề mặt vi khuẩn Bacillus subtilis natto trên bã đậu nành thu enzyme nattokinase nhằm ứng dụng vào quy mô sản xuất công nghiệp Góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do tận dụng phế thải bã đậu nành

6 BỐ CỤC ĐỀ TÀI

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và bàn luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Danh mục tài liệu tham khảo

Phụ lục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ BÃ ĐẬU NÀNH

1.1.1 Giới thiệu về bã đậu nành (okara)

Bã đậu nành (okara) là phần phế phẩm dạng rắn thu được sau quá trình lọc thu dịch sữa đậu nành trong quá trình sản xuất sữa đậu nành, đậu phụ (đậu khuôn) và các sản phẩm khác từ đậu nành

1.1.2 Một số ứng dụng của bã đậu nành

Đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền cho ngành chăn nuôi và công nghệ sinh học

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME NATTOKINASE

1.2.1 Giới thiệu về nattokinase

Nattokinase hay còn gọi là subtilisin NAT (ký hiệu EC 3.4.21.62) là một protease serine, có cấu trúc là một chuỗi polypeptide đơn gồm 275 gốc acid amin, khối lượng phân tử là 27,728 kDa và pI=8,6 Là một protease không chứa cysteine, nattokinase không có cầu nối disulfua trong phân tử

1.2.2 Cơ chế tác dụng của nattokinase

Nattokinase không chỉ làm tan huyết khối mà còn có tác dụng phòng ngừa

sự hình thành huyết khối Ngoài ra, enzyme nattokinase không ảnh hưởng đến

sự hình thành fibrin từ fibrinogen nên không làm suy giảm khả năng đông máu

tự nhiên của cơ thể

1.3 TỔNG QUAN VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS NATTO

1.3.1 Giới thiệu về Bacillus subtilis natto

Bacillus subtilis natto được phân lập lần đầu tiên vào năm 1906 từ natto bởi

tiến sỹ Shin Sawamura, thuộc trường Đại học Tokyo, Nhật Bản Bacillus subtilis

natto được biết đến là loại vi khuẩn lên men hạt đậu nành tạo mùi hương đặc

biệt cho natto

1.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa của Bacillus subtilis natto

Bacillus subtilis natto là vi sinh vật hiếu khí bắt buộc Bacillus subtilis natto có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 300C – 500C, pH hơi kiềm hoặc trung tính Nhiệt độ tối ưu là 37oC, pH thích hợp khoảng 7,2 - 7,6

1.3.3 Khả năng sinh tổng hợp enzyme của Bacillus subtilis natto

1.3.3.1 Các enzyme nội bào Bacillus subtilis natto

Các enzyme nội bào của Bacillus subtilis natto: các enzyme thủy phân như

protease nội bào (thường là peptidase và một số protease), pennicillin amidase, catalase, amylase nội bào…; các enzyme tổng hợp như aspagagin-syntetase; các enzyme tham gia các quá trình oxy hóa - khử như dehydrogenase, oxydase, cytochrom, peroxydase và các enzyme tham gia chuyển hóa vật chất có trong tế bào

1.3.3.2 Các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis natto

Bacillus subtilis natto có thể sinh tổng hợp nhiều loại enzyme: amylase

(α-amylase), -glucanase, xylanase, protease… Trong đó, enzyme nattokinase là một loại protease được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng nhiều

1.3.4 Các phương pháp lên men

Trong nghiên cứu này, tôi chọn phương pháp lên men bề mặt để lên men vi

khuẩn Bacillus subtilis natto thu enzyme nattokinase vì nhiều lý do như: phương

pháp lên men dễ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm, việc xử lý thu chế phẩm sau lên men đơn giản, ít tổn hao về hoạt tính enzyme, dễ bảo quản, kỹ thuật lên men đơn giản

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme

của vi khuẩn Bacillus subtilis natto

1.3.5.1 Nhiệt độ: Nhiệt độ không những tác động trực tiếp đến sự sự phát

triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của Bacillus subtilis natto mà còn ảnh

hưởng đến tính chất của enzyme

1.3.5.2 pH: Theo El-Safey E M.và Abdul-Raouf U M, ở pH= 7 vi khuẩn

Bacillus subtilis natto sinh tổng hợp thu enzyme nattokinase có hoạt độ cao

nhất

1.3.5.3 Thời gian nuôi cấy: Thời gian nuôi cấy thích hợp là thời gian cho

phép tích tụ lượng enzyme tối đa và chủ yếu phụ thuộc vào chủng vi sinh vật

nattokinase của vi khuẩn Bacillus subtilis natto

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1998, Hidehiro Miyamura và các cộng sự đã nghiên cứu lên men

Bacillus subtilis trên bã đậu nành ở điều kiện thích hợp là nhiệt độ 370C, độ ẩm 80%, thời gian 24 giờ Năm 2010, Xiaoyan Zu và các cộng sự đã khảo sát cho thấy: sản lượng enzyme sản xuất từ bã thãi đậu nành cao hơn và có hoạt tính không thấp hơn so với lên men natto hạt đậu nành Năm 2013, Rohit Kapoor và

Bibhu Prasad Panda đã nghiên cứu lên men B subtilis với cơ chất là hạt đậu

nành bổ sung 1% khối lượng sữa bột, 30% nước (v/w) thu được enzyme protease có hoạt độ cao nhất khi thu nhận enzyme bằng đệm Tris pH 9

Bên cạnh đó, một số nghiên cứu được thực hiện theo hướng tận dụng những nguồn cơ chất rẻ tiền, sẵn có khác

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2012, Lê Thị Bích Phượng và cộng sự đã phân lập thành công hai

chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 sinh tổng hợp enzyme nattokinase trên

môi trường đậu nành hấp chín nuôi cấy trên đĩa Petri và khay Năm 2013, Bùi Thị Nhung và cộng sự đã nghiên cứu thu được kết quả điều kiện lên men bề mặt

Bacillus subtilis với cơ chất là bột đậu nành và cám mì thu enzyme nattokinase

có hoạt lực cao nhất ở pH 9, độ ẩm từ 50-60% và thời gian lên men 48h Năm

2016, Nguyen Nhut Huy và Nguyen Thuy Huong đã thực hiện lên men bề mặt

vi khuẩn Bacillus subtilis natto với cơ chất là hạt đậu nành ở điều kiện nhiệt độ

370C; pH 7,5; thời gian lên men 36h thu nhận được enzyme nattokinase có hoạt lực cao nhất Năm 2016, Nguyễn Thị Minh Nguyệt đã phân lập và định danh

được 2 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ natto thương phẩm của Nhật

Bản Tại Việt Nam, chưa ghi nhận được nghiên cứu nào về lên men vi khuẩn

Bacillus subtilis natto trên cơ chất bã đậu nành thu nhận enzyme nattokinase Do

đó, tôi chọn nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như thời gian lên

men, tỷ lệ giống, bề dày lớp cơ chất đối với quá trình lên men Bacillus subtilis

natto trên cơ chất bã đậu nành thu nhận enzyme nattokinase

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ

2.1.1 Nguyên liệu

- Bã đậu nành lấy từ 3 cơ sở sản xuất đậu phụ trên địa bàn thành phố Quảng Ngãi

- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis natto do phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa

Hóa thuộc trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng cung cấp

- Bột đậu nành được tạo thành bằng cách sử dụng hạt đậu nành rang chín, xay mịn

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ: được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Bộ môn

công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Khoa Hóa, trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng

2.1.3 Hóa chất: được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Bộ môn công nghệ

sinh học và Công nghệ thực phẩm, Khoa Hóa, trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

lipid bằng phương pháp Soxhlet, protein, tinh bột bằng cách gửi mẫu kiểm nghiệm

2.2.2 Phương pháp hoạt hóa và giữ giống

Cấy chuyền và bảo quản các ống giống trong môi trường thạch nghiêng ở nhiệt độ 4-50C Thực hiện lặp lại việc cấy truyền 1-2 tháng/lần

2.2.3 Phương pháp nhân giống:

Sử dụng sữa đậu nành làm môi trường nhân giống, nuôi trên máy lắc ở tốc

độ 180 vòng/phút, trong điều kiện 370

370C Sau 24h, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng tế bào trong 0,1ml mẫu

Mật độ tế bào là: Mi (CFU/ml) = Ai x Di/ V

Trong đó: Ai: số lượng tế bào

Di: là độ pha loãng V: là dung dịch huyền phù tế bào (ml)

2.2.5 Phương pháp lên men

Hình 2.2 Quy trình lên men bã đậu nành bằng phương pháp lên men bề mặt

Nhân giống

Bacillus subtilis natto

Bã đậu nành lên men Lên men bề mặt

Bã đậu nành

Hấp chín (1210C, 1atm, 30 phút)

Bổ sung nước

Để nguội (36-390C)

2.2.5.1 Khảo sát thời gian lên men

Để xác định thời gian lên men thích hợp thu enzyme có hoạt lực cao nhất,

tiến hành lên men 05 mẫu, mỗi mẫu gồm 02 thí nghiệm thực hiện với tỷ lệ giống 10% (v/w) Dựa vào giá trị hoạt độ enzyme protease đo được tại các thí nghiệm,

xác định thời gian lên men thích hợp

2.2.5.2 Khảo sát tỷ lệ giống

Vi khuẩn Bacillus subtilis natto được nuôi cấy trong 5 mẫu, mỗi mẫu gồm

02 thí nghiệm Các tỷ lệ giống được khảo sát gồm: 10%, 12%, 14%, 16%, 18% (v/w) Dựa vào giá trị hoạt độ enzyme protease đo được tại các thí nghiệm, xác

định tỷ lệ giống thích hợp

2.2.5.3 Khảo sát tỷ lệ bột đậu nành được bổ sung

Bã đậu nành sau khi được hấp tiệt trùng, tiến hành bổ sung bột đậu nành theo các tỷ lệ: 10%, 20%, 30%, 40%, trộn đều, đánh cho tơi xốp và phân phối vào các khay lên men Giống vi khuẩn được cấy vào môi trường lên men với tỷ

lệ thích hợp đã được xác định thí nghịệm và lên men trong thời gian thích hợp

đã được xác định Dựa vào giá trị hoạt độ enzyme protease đo được tại các thí nghiệm, xác định tỷ lệ bột đậu nành được bổ sung thích hợp

2.2.5 Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô

Hỗn hợp sau lên men được giữ ở nhiệt độ 40C trong 10 phút Thêm dần dần dung dịch NaCl 0,9% ở nhiệt độ 40C vào hỗn hợp sau lên men đồng thời khuấy đều, để yên trong 40 phút Tiến hành lọc và ly tâm 4000 vòng/phút, 20 phút để

thu dịch chiết enzyme thô

2.2.6 Phương pháp kết tủa enzyme nattokinase bằng dung môi ethanol

96%

Dịch chiết enzyme được giữ ở nhiệt độ 40C và ethanol ở nhiệt độ -40

C trong 1 giờ Thêm dần dần ethanol vào dịch chiết enzyme với tỷ lệ nghiên cứu

và dùng đũa khuấy nhẹ để dịch enzyme hòa đều với ethanol, xuất hiện kết tủa để yên trong 15-24 giờ để dung dịch phân lớp Tiến hành li tâm với tốc độ 15000 vòng/20 phút để thu tủa enzyme

2.2.7 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease

Sử dụng phương pháp Amano xác định hoạt độ enzyme protease Đơn vị hoạt độ protease là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương tương với

100µg tyrosin trong 1µl dịch lọc ở điều kiện thí nghiệm

3.2.8 Phương pháp sấy thăng hoa

Lạnh đông kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (-150C đến -100C); sau đó cho mẫu vào thiết bị sấy thăng hoa Quá trình sấy thực hiện ở nhiệt độ < 500

C trong thời gian 10-14 giờ Sản phẩm sau khi sấy được nghiền mịn, cho vào lọ kín và

bảo quản

3.2.9 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả thí nghiệm là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại thí nghiệm Xử lý

số liệu thí nghiệm bằng phần mềm Anova trên Excel 2016

CHƯƠNG 3 KẾT LUẬN VÀ BÀN LUẬN 3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA BÃ ĐẬU NÀNH

Bảng 3.1 Một số thành phần hóa học của bã đậu nành

Thành phần hóa học Protein Tinh bột Lipid

Kết quả trên phù hợp với số liệu của tác giả Suhong Li và cộng sự (2013)

đã công bố về thành phần của bã đậu nành So với nguồn nguyên liệu truyền thống thu nhận enzyme nattokinase - đậu nành thì thành phần dinh dưỡng của bã đậu nành thấp hơn về hàm lượng protein và tinh bột

3.2 XÂY DỰNG DƯỜNG CHUẨN TYROSIN

Căn cứ vào đường chuẩn tyrosin, xác định hoạt độ enzyme protease theo lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên

Với hệ số tương quan R2

= 0,9912, đường chuẩn tyrosin đã xây dựng có

độ tin cậy lớn, phù hợp sử dụng để xác định hoạt lực enzyme Số liệu tại Phụ lục

1

Hình 3.1 Đồ thị đường chuẩn tyrosine

3.3 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG

Để chọn thời gian nhân giống, tôi xây dựng đường cong sinh trưởng của

Bacillus subtilis natto Số liệu tại Phụ lục 2

Qua phân tích, cho thấy đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus

subtilis natto trải qua các giai đoạn sau:

- Pha tiềm phát: Giai đoạn này xảy ra trong 4 giờ, đây là thời gian tương đối ngắn, chứng tỏ tế bào vi khuẩn trong ống giống ở trạng thái tốt

- Pha logarit: Đây chính là pha quan trọng nhất đối với quá trình nhân giống, vì thế nên chọn thời điểm kết thúc quá trình nhân giống nằm trong pha logarit

- Pha cân bằng: tốc độ sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật giảm

dần Do đó, cần kết thúc quá trình nhân giống trước khi vi sinh vật bước vào pha cân bằng

- Pha suy vong: sau 36 giờ số lượng tế bào giảm do bị phân huỷ ngày càng nhiều, chất dinh dưỡng cạn kiệt, chất độc hại tăng ức chế vi khuẩn sinh trưởng, phát triển

Kết luận: Tôi quyết định chọn thời gian kết thúc quá trình nhân giống là 24 giờ với mật độ tế bào là 8,86 x 108

CFU/ml nhằm thu được số lượng tế bào vi khuẩn cao đồng thời thuận lợi cho thời gian lên men và thu nhận enzyme sau đó

Hình 3.2 Đường cong sinh trưởng của Bacillus subtilis natto

3.4 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG QUÁ TRÌNH LÊN MEN

3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men

Kết quả cho thấy hoạt độ enzyme cao nhất ở thời điểm 24h là 3,26