Đầy đủ về enzyme lipase luôn này...Có cả file powpoint luôn nhé..Tìm tiếp là có à...Chúc các bạn báo cáo tốt nhé.......................................................................................................................................................................Good luck...
Phương pháp đĩa Wilhelmy
2.1 Cơ chất là những màng film đơn phân tử thuần khiết:
Kỹ thuật màng film đơn phân tử tại bề mặt tiếp xúc của không khí - nước đã được phát triển và áp dụng rộng rãi bởi nhóm nghiên cứu của Fréderic Beisson, Claude Rivìere và nhóm Brockman để xác định sức căng bề mặt Phương pháp này bao gồm việc sử dụng một lớp Teflon phủ trên máng chứa dung dịch, trong đó một bản mỏng Pt được nhúng vào bề mặt pha nước Bản mỏng này được kết nối với một electromicrobalance để đo áp suất bề mặt, từ đó xác định sức căng bề mặt một cách chính xác.
Một màng film đơn phân tử của chất béo có thể được phân bố trên bề mặt của pha nước bằng cách sử dụng dung môi dễ bay hơi như chloroform để hòa tan chất béo Dung dịch chất béo được áp dụng dưới dạng những giọt nhỏ có khả năng bay hơi Khu vực mà lớp chất béo chiếm giữ có thể được điều chỉnh bằng một lớp Teflon quét trên bề mặt pha nước Áp suất bề mặt được duy trì ổn định tự động thông qua sự thuyên chuyển của Teflon, được kiểm soát và điều chỉnh dựa trên đầu ra của electromicrobalance.
Dung dịch enzyme Lipase được tiêm dưới màng film chất béo, làm giảm áp suất bề mặt nhờ sự hòa tan của sản phẩm phản ứng thủy phân chất béo Sự di chuyển của lớp màng chắn này duy trì hằng số áp suất bề mặt, cho phép theo dõi động học của phản ứng qua chuyển động của lớp màng theo thời gian.
Kỹ thuật này cho phép đo và điều khiển các tham số bề mặt quan trọng như áp suất bề mặt và vùng phân tử của cơ chất Phương pháp màng film đơn phân tử là lựa chọn lý tưởng để nghiên cứu các phản ứng enzym trên chất béo tại bề mặt tiếp xúc giữa không khí và nước.
Phương pháp này có độ nhạy cao, và lương chất béo thấp đáp ứng yêu cầu để thực hiện những phép đo động học đáng tin cậy.
2.2 Màng film đơn phân tử được trộn lẫn với cơ chất:
Hầu hết các nghiên cứu về enzym thuỷ phân chất béo đều được thực hiện in vitro với các chất béo thuần khiết, trong khi thực tế, các mặt phân cách sinh vật là sự pha trộn phức tạp của lipit và protein Kỹ thuật đơn lớp lý tưởng là phương pháp hiệu quả để nghiên cứu hoạt động của hệ enzym thuỷ phân chất béo tại mặt phân cách, sử dụng hỗn hợp chất béo đã điều chỉnh Có hai phương pháp chính để tạo màng đơn lớp từ hỗn hợp chất béo: một là tạo màng tại bề mặt phân pha khí-nước, và hai là phân bố hỗn hợp chất béo không tan trong nước vào dung môi hữu cơ dễ bay hơi hoặc tiêm dung dịch nhũ tương chất tẩy rửa vào pha nước, được bao phủ bởi lớp đơn chất béo không tan.
Một ứng dụng mới của máng "Zero-order" đã được Píeroni và Verger đề xuất để nghiên cứu sự thủy phân của lớp đơn phân tử hỗn hợp Ứng dụng này hoạt động ở mật độ bề mặt không thay đổi và với thành phần chất béo cố định, như được mô tả trong hình Fig 1A.
Màng chắn teflon được lắp đặt ngang qua kênh nhỏ của máng “Zero-order” nhằm ngăn chặn sự truyền thông bề mặt giữa màng chứa và bộ phận phản ứng Để xác định áp suất bề mặt, bản Pt được đặt vào bộ phận phản ứng, nơi hỗn hợp film được phân bố ở áp suất yêu cầu Áp suất bề mặt sẽ được đo sau khi chuyển bản.
Màng chứa đóng vai trò quan trọng trong việc phân bố film cơ chất thuần khiết Áp suất bề mặt của màng chứa được điều chỉnh bằng cách di chuyển lớp màng chắn di động, giúp đồng bộ với áp suất bề mặt của bộ phận phản ứng Việc chuyển dịch màng chắn giữa hai bộ phận cho phép tiếp xúc trực tiếp, tạo điều kiện cho enzyme được tiêm vào bộ phận phản ứng.
2.3 Liên kết bề mặt và sự phục hồi lớp:
Nghiên cứu cho thấy, thông qua kỹ thuật lớp đơn phân tử, có sự tương quan tối ưu giữa vận tốc và áp suất bề mặt Điểm tối ưu này thay đổi tùy thuộc vào sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất được sử dụng.
Một cách giải thích hợp lý đã được đưa ra để giải thích hiện tượng này là:
Sự định hướng phụ thuộc màng bao của cơ chất là yếu tố quan trọng trong quá trình phân giải chất béo Nghiên cứu của Verger và Pattus sử dụng enzyme đánh dấu phóng xạ để chỉ ra rằng mối tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt sẽ giảm khi tính hoạt động bề mặt của enzyme tăng lên.
Sự khác biệt chính giữa lớp đơn và khối lớn (bulk system) nằm ở bề mặt giao tiếp và tỉ lệ thể tích, với nhiều trật tự sắp xếp trong hệ thống lớp đơn Tỉ lệ này thường có sự khác biệt đáng kể.
1 cm -1 , phụ thuộc vào độ sâu của cái máng Trong khi đó, ở khối lớn tỉ lệ này có thể cao khoảng
Khi nghiên cứu sự phân giải lipit, kích thước của enzyme và lượng lipit sử dụng có ảnh hưởng lớn đến quá trình này Trong trường hợp khối lớn, hầu hết enzyme sẽ tập trung ở bề mặt giao tiếp, trong khi ở lớp đơn chỉ có một phân tử enzyme trong hàng trăm enzyme có thể xuất hiện Điều này dẫn đến việc một lượng nhỏ không xác định có thể ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ thủy phân trên lớp đơn Để khắc phục giới hạn này, nhiều phương pháp đã được đề xuất nhằm phục hồi và đo lường lượng enzyme đã hấp phụ tại bề mặt giao tiếp.
Sau khi đo tốc độ, Momsen và Brockman đã chuyển lớp đơn đến một mẩu giấy kỵ nước, sau đó phân tích enzyme được hấp phụ bằng phương pháp chuẩn độ Số lượng enzyme hấp phụ được tính toán dựa trên vận tốc của mạng lưới và hoạt động của enzyme đặc hiệu, so sánh với tốc độ của mẫu trắng và pha mang.
Trong nghiên cứu enzyme hoạt động phóng xạ, màng film được tạo ra bằng cách lồng đáy ống mao quản thuỷ tinh vào chất lỏng, nổi lên trên thành Teflon Khi enzyme phóng xạ hòa tan trong pha mang, chúng sẽ được hút ra cùng với màng film Kết quả được kiểm tra qua hoạt động phóng xạ trong thể tích pha mang được hút ra, cho thấy sự khác biệt giữa hai giá trị phản ánh hoạt động phóng xạ vượt mức tại bề mặt tiếp xúc, liên quan đến enzyme kết nối với màng film Kỹ thuật lớp đơn cho phép đo tốc độ phản ứng bằng mol.cm -2 min -1 và lượng enzyme vượt mức ở bề mặt bằng mg.cm -2, từ đó tính toán giá trị hoạt động đặc hiệu của enzyme bằng mol.min -1 mg -1 ( IU.mg -1 ).
Bằng cách kết hợp kỹ thuật ELISA và lớp đơn phân tử, chúng ta có thể đo hoạt tính enzyme Lipase (HGL) trong đường ruột người Trên lớp màng 1,2 didecanoyl-sn-glycerol, sự vượt mức của enzyme bề mặt tương ứng cũng được xác định HGL luân chuyển tăng ổn định với màng lipid, và hoạt tính đặc hiệu trên lớp dicaprin đạt 35mN.m -1 khi phân tích với chất nhũ hóa tributyrin (1000IU cho 1mg enzyme) Đặc biệt, sự liên kết bề mặt của HGL với lớp màng phosphatidylcholine ưa béo của lòng đỏ trứng chậm hơn 10 lần so với lớp màng dicaprin.
Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân
3.1 Sự giải phóng Proton như một phép phân tích gián tiếp:
Chất chỉ thị màu trong môi trường rắn cho phép theo dõi độ pH thông qua sự thay đổi màu sắc khi dung dịch lipase tác động lên đĩa agar chứa ester carboxylic, do axit béo được giải phóng trong phản ứng thủy phân Mối quan hệ tuyến tính giữa đường kính đốm khuyếch tán axit béo và logarit vùng phân bố enzym giúp sàng lọc nhanh chóng vi sinh vật phân hủy lipid Tuy nhiên, cần lưu ý rằng quá trình axit hóa có thể gây ra sai sót do sự phát sinh của các chất chuyển hóa axit khác Trong môi trường chất lỏng, mặc dù phương pháp này mang tính định tính, nó vẫn cung cấp cách đơn giản để phát hiện hoạt tính của lipase thông qua sự thay đổi màu sắc của chất chỉ thị khi trộn với các cơ chất ester trong các giai đoạn làm sạch lipase.
Phương pháp định tính này đơn giản hơn, dựa vào việc phát hiện những đặc trưng mạnh mẽ của mùi axit butyric và axit caproic Hai loại axit này có mùi giống như những giọt sữa đã bị thủy phân, thường được sử dụng làm cơ chất cho lipase.
Phương pháp pH-stat là một kỹ thuật hiệu quả để mô tả các đặc điểm và tính chất đặc biệt của Lipase, đồng thời giúp hiểu rõ hiện tượng kích hoạt bề mặt tiếp xúc giữa các pha.
Phương pháp pH-stat cho phép đo hoạt động của Lipase trên máy khuấy trộn nhũ tương của TAGs tự nhiên hoặc tổng hợp bằng cách trung hòa FFAs được giải phóng theo thời gian thông qua việc thêm NaOH, nhằm duy trì pH tại giá trị điểm cuối ổn định Thiết bị pH-stat đã được sản xuất thương mại, như bức xạ kế từ Copenhagen, Đan Mạch và Metrohm Ltd từ Herisau, Thụy Sĩ.
Phương pháp pH-stat là kỹ thuật hiệu quả để xác định hoạt tính của lipase trong dịch mô đồng thể thực vật Phương pháp này sử dụng deoxycholate và triolein được nhũ hóa với keo arabic làm cơ chất.
Kỹ thuật pH-stat đã được dùng để xác định những hoạt tính Lipase trong huyết thanh, plasma và dịch tá tràng
Phương pháp pH-stat là một kỹ thuật định lượng chính xác cho phép đo lường sự giải phóng axit béo trong khoảng 1 mol/phút Tuy nhiên, khi sử dụng NaOH 0.1M làm chất chuẩn độ, phương pháp này không đáng tin cậy để phát hiện mức độ hoạt động dưới 0.1 mol/phút.
Phương pháp pH-stat, mặc dù có tính nhạy thấp, gặp phải nhược điểm là vùng phân bố hẹp của các giá trị pH có thể nghiên cứu Đặc biệt, việc phát hiện proton được giải phóng trong quá trình phản ứng thủy phân do enzyme Lipase xúc tác yêu cầu ion hóa một phần axit béo Do đó, giá trị pH tại điểm cuối của môi trường phản ứng cần gần giống hoặc cao hơn giá trị pKa của axit béo đã giải phóng Thêm vào đó, sự ion hóa và sự hiện diện của ion Canxi có thể giảm độ chính xác của các giá trị pKa Ion Ca 2+ có tác động tích cực đến hiệu quả ion hóa của axit béo mạch dài, và hiện tượng kết tủa vi mô này điều chỉnh cân bằng hóa học theo định luật hoạt động khối lượng.
1 Ứng dụng của Lipase trong công nghiệp
Công nghiệp Hoạt tính Sản phẩm/ứng dụng
Chất tẩy Thủy phân chất béo Loại các vết bẩn dầu từ vải
Thủy phân chất béo của sữa, làm chín phomat, biến đổi chất béo của bơ.
Tăng cường các chất mùi thơm trong sữa, phomat và bơ.
Các loại bánh Cải thiện mùi thơm Kéo dài thời gian sử dụng
Nước giải khát Cải tiến mùi hương Các loại nước giải khát
Cải tiến chất lượng Mayonnaise, các loại bao bì và các loại chỉ khâu
Thực phẩm chức năng Chuyển đổi sự ester hóa Thực phẩm chức năng
Thịt và cá Tăng cường hương vị Các sản phẩm thịt và cá, loại bỏ chất béo
Các chất béo và dầu
Chuyển đổi sự ester hóa, thủy phân Bơ cocoa, margarine, các acid béo, glycerol, các glyceride đơn, đôi
Hóa chất Chọn lọc đối kháng, tổng hợp Các khối kết tinh, hóa chất
Dược phẩm Chuyển đổi sự ester hóa, thủy phân Các lipid đặc trưng, các chất trợ tiêu hóa
Mỹ phẩm Tổng hợp Chất nhũ tương hóa, chất tạo ẩm
Da Thủy phân Các sản phẩm da
Giấy Thủy phân Cải thiện chất lượng giấy
Chất làm trắng Thủy phân Loại bỏ chất béo
Lipase đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp tẩy rửa, được sử dụng làm phụ gia trong các chất tẩy rửa và bột giặt gia đình Để nâng cao hiệu quả tẩy rửa, nhiều sản phẩm tẩy rửa hiện đại đều tích hợp một hoặc nhiều loại enzyme như protease, amylase, cellulose và lipase.
Việc sử dụng lipase để loại bỏ dầu mỡ trong ngành công nghiệp chất tẩy rửa đang cho thấy tiềm năng lớn Lipase hoạt động hiệu quả trong điều kiện giặt tẩy bình thường, tuy nhiên, để đạt hiệu quả tối ưu, lipase cần có các đặc tính như khả năng chịu nhiệt, chịu kiềm (pH khoảng 7.5 đến 11) và khả năng kháng lại các tác động từ các thành phần cấu tạo của chất tẩy rửa (Jọeger và cs, 1994) Đặc biệt, lipase kiềm chịu nhiệt đã được áp dụng để loại bỏ các vết triglyceride từ cơ thể và thực phẩm, điều mà trước đây rất khó khăn trong điều kiện giặt ủi thông thường.
Năm 1988, Lipase được cho vào chất tẩy rửa dưới tên thương mại là lipolase 100T thu từ Humicola lanuginose được sản xuất bởi Novo Nordisk Bioindustry (Jọeger và cs, 1994).
Lipase from the bacterial strains Pseudomonas medocina and Pseudomonas alcaligenes has been produced and incorporated into detergents by Genencor International USA (Joeger et al., 1994; Reetz and Joeger, 1998).
3 Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy
Quá trình thuộc da là một quy trình phức tạp bao gồm loại bỏ chất béo, rủ lông và làm mềm da Việc sử dụng môi trường kiềm trong quá trình này giúp tăng cường hiệu quả, đặc biệt khi kết hợp với các vi khuẩn kiềm Dòng bacillus sp có khả năng phát triển trong môi trường kiềm và sinh tổng hợp lipase kiềm, do đó chúng rất phù hợp cho quy trình thuộc da (Haalck và cs, 1992; Wang và cs, 1995).
Lợi ích của việc sử dụng lipase là giữ nguyên màu sắc và đảm bảo sự sạch sẽ Ngoài ra, lipase còn tăng cường tính không thấm nước của da, giúp da không bị vết ố như khi sử dụng dung môi và chất hoạt động bề mặt.
Trong ngành công nghiệp giấy, việc loại bỏ sáp và triglyceride là rất quan trọng để nâng cao hiệu quả sản xuất (Bajpai 1999) Công ty giấy Nippon tại Nhật Bản đã áp dụng enzyme lipase từ nấm Canada rugosa để loại bỏ tới 90% các chất này có trong gỗ.
Một số sản phẩm lipase được thương mại hóa dùng cho công nghệ thuộc da:Greasex®, NovoCor® ADL, dệt: Novozyme® 375, giấy: Resinase®.
4 Ứng dụng lipase trong công nghiệp hóa chất
Chất trung gian chiral đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp các hợp chất trị liệu, hóa nông và hương liệu Tuy nhiên, việc tổng hợp các chất này bằng phương pháp hóa học gặp nhiều khó khăn.
2 đồng phân của thuốc có dược tính, việc tổng hợp đồng phân thuần khiết là bước quan trọng trong công nghiệp dược.
There are two types of selective biotransformations of organic compounds catalyzed by lipases: the reactions of prochiral substrates and the kinetic resolution of racemates (Kazlauskas et al., 1998) Traditionally, prochiral compounds or chiral alcohols and esters of carboxylic acids have been considered the primary substrates; however, over the years, the range of applicable compounds has rapidly expanded to include diols, α and β acids, hydroxyls, cyanohydrins, chlorohydrins, diesters, lactones, amines, diamines, amino-alcohols, and derivatives of α and β amino acids (Kazlauskas et al., 1998) The lipases that catalyze these reactions are sourced from bacteria such as Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, and other Pseudomonas species, as well as Burkholderia cepacia, Corynebacterium viscosum, Bacillus subtilis (Chunyuan et al., 2008), Achromobacter sp., Alcaligenes sp., and Serratia marcescens.
5 Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế
Lipase được sử dụng để xúc tác ester hóa tinh bột sắn làm chất mang dược chất và làm vật liệu trong điều trị gãy xương (Rajan và cs, 2008).