LUẬN văn CÔNG NGHỆ hóa KHẢO sát sự THAY đổi hàm LƯỢNG ENROFLOXACIN và THIAMPHENICOL TRONG HUYẾT TƯƠNG HEO THEO THỜI GIAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

Bước 3: Tách và thu hồi dung môi chiết từ hai pha dịch chiết và dịch bã Sự làm giàu chất và hiệu quả của phương pháp chiết phụ thuộc tỉ số thể tích của mẫu và dung môi chiết, phụ thuộc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA CÔNG NGHỆ

KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG ENROFLOXACIN VÀ THIAMPHENICOL TRONG HUYẾT TƯƠNG HEO THEO THỜI

GIAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

MSSV: 2072136 Ngành: Công Nghệ Hóa Học Khóa 33

Tháng 4/2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA CÔNG NGHỆ

KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG ENROFLOXACIN VÀ THIAMPHENICOL TRONG HUYẾT TƯƠNG HEO THEO THỜI

GIAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

MSSV: 2072136 Ngành: Công Nghệ Hóa Học

Khóa 33

Tháng 4/2011

NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

i

LỜI CÁM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô đặc biệt là Thầy Cô Bộ Môn Công Nghệ Hóa Học, Khoa Công Nghệ trường Đại Học Cần Thơ Các Thầy, Cô đã tận tình truyền đạt cho em kiến thức và kinh nghiệm quý báo trong suốt thời gian em theo học tại trường

Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin chân thành cảm ơn chú Phạm Văn Dũng – phòng R&D, Công ty Vemedim đã chỉ bảo tận tình và truyền đạt cho

em những kiến thức, kinh nghiệm vô cùng quý báu trong suốt thời gian em thực hiện Luận Văn Tốt Nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Công ty Vemedim đã chấp nhận và tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn quý Cô, Chú, Anh Chị công tác tại phòng R&D

đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Một lần nữa con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình đã động viên giúp đỡ con thực hiện luận văn này Cùng tất cả các bạn sinh viên ngành Công nghệ Hóa học, Khoa Công nghệ, Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ nhiệt tình và giúp tôi hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn!

Cần thơ, ngày 15 tháng 4 năm 2011

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Minh Điện

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC HÌNH v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 2

CHƯƠNG I SƠ LƯỢC THIAMPHENICOL VÀ ENROFLOXACIN 3

1 Sơ lược về Thiamphenicol 3

1 1 Cấu tạo 3

1.2 Tính chất 3

1 3 Ứng dụng 4

2 Sơ lược về Enrofloxacin 4

2 1 Cấu tạo 4

2 2 Tính chất 5

2 3 Ứng dụng 6

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH 7

1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 7

2 Phương pháp chiết mẫu 7

2.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng (Liquid – liquid extration) 7

2.2 Kỹ thuật chiết lỏng - rắn 8

2.2.1 Chiết bằng phương pháp xay trộn với dung môi 8

2.2.2 Chiết bằng phương pháp cơ học trộn rung (Vortex) 9

2.2.3 Chiết bằng phương pháp chiết Soxhlet mẫu rắn 9

2.2.4 Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method) 10

2.2.5 Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid phase extraction, SPE) 11

CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 19

1 Sơ lược về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 19

iii

1.1 Lịch sử phát triển của HPLC 19

1.2 Khái niệm và nguyên tắc hoạt động của HPLC 20

1 2 1 Khái niệm 20

1.2 2 Nguyên tắc hoạt động 20

1.3 Cách phân loại sắc ký trong HPLC 22

1.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC 22

1.4.1 Dung môi 23

1 4 2 Bộ khử khí Degasse 23

1 4 3 Bơm (Pump) 23

1 4 4 Hệ thống tiêm mẫu (injector) 23

1 4 5 Cột (Column) 24

1 4 6 Đầu dò (Detector) 24

1 4 7 Hệ dữ liệu (Data system) 25

2 Phân tích định tính 25

3 Phân tích định lượng 27

3.1 Dựng đường chuẩn 27

3.2 Hiệu suất thu hồi 27

3.3 Xác định RSD, LOD, LOQ 28

PHẦN 2 THỰC NGHIỆM 30

CHƯƠNG IV THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 31

1 Phương tiện nghiên cứu 31

1.1 Hóa chất 31

1.2 Dụng cụ 31

1.3 Thiết bị 31

2 Địa điểm tiến hành 31

3 Thực nghiệm – Kết quả 32

3.1 Định tính Thiamphenicol và Enrofloxacin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 32

3 1 1 Định tính Thiamphenicol 32

3 1 2 Định tính Enrofloxacin 33

3.2 Lựa chọn quy trình phân tích Enrofloxacin và Thiamphenicol bằng phương pháp HPLC 34

3 2 1 Mục đích 34

3 2 2 Phương pháp tiến hành 34

3.2 3 Lựa chọn quy trình 35

3.2 3 1 Lựa chọn quy trình phân tích Thiamphenicol 35

a) Quy trình phân tích Thiamphenicol theo sự chiết tách lỏng – lỏng 35

b) Quy trình phân tích Thiamphenicol theo sự chiết tách pha rắn SPE 39

3.2 3 2 Lựa chọn quy trình phân tích Enrofloxacin 41

a) Quy trình phân tích Enrofloxacin theo sự chiết tách lỏng – lỏng 41

b) Quy trình phân tích Enrofloxacin theo sự chiết tách pha rắn SPE 45

3.2.4 Đánh giá quy trình 47

3.3 Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của Enrofloxacin và Thiamphenicol 48

3 3 1 Mục đích 48

3 3 2 Phương pháp tiến hành khảo sát 48

3 3 2 1 Khảo sát hàm lượng của Thiamphenicol 48

3 3 2 2 Khảo sát hàm lượng của Enrofloxacin 51

PHẦN 3 NHẬN XÉT – KIẾN NGHỊ 55

CHƯƠNG V KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 56

1 Kết luận 56

2 Kiến nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC: HÌNH ẢNH MỘT SỐ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN LUẬN VĂN TẠI CÔNG TY VEMEDIM 60

ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 63

v

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Công thức cấu tạo Thiamphenicol 3

Hình 1 2 Công thức cấu tạo Enrofloxacin 4

Hình 2 1 Sơ đồ chiết Soxhlet 9

Hình 2 2 Hình dạng cột SPE 12

Hình 2 3 Cấu tạo bộ chiết SPE 13

Hình 2 4 Các bước tiến hành kỹ thuât chiết SPE 15

Hình 3 1 Hệ thống HPLC 22

Hình 3 2 Bình sắc ký lớp mỏng 25

Hình 3 3 Mô hình chấm sắc ký 26

Hình 4 1 Chuẩn bị bản mỏng định tính 32

Hình 4 2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 33

Hình 4.3 Quy trình phân tích Thiamphenicol bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng 36

Hình 4 4 Phương trình đường chuẩn của Thiamphenicol 38

Hình 4 5 Quy trình phân tích Thiamphenicol bằng phương pháp chiết tách SPE 39

Hình 4.6 Quy trình phân tích Enrofloxacin bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng 42

Hình 4 7 Phương trình đường chuẩn của Enrofloxacin 44

Hình 4 8 Quy trình phân tích Enrofloxacin bằng phương pháp chiết tách SPE 46

Hình 4 9 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ Thiamphenicol trong huyết tương theo thời gian 50

Hình 4 10 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ Enrofloxacin còn lại trong huyết tương theo thời gian 53

trong huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng 38 Bảng 4 3 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Thiamphenicol

trong huyết tương bằng phương pháp chiết SPE 40 Bảng 4 4 Kết quả xây dựng đường chuẩn của Enrofloxacin 44 Bảng 4 5 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Enrofloxacin

trong huyết tương bằng phương pháp chiết tách lỏng – lỏng 45 Bảng 4 6 Kết quả tính hiệu suất thu hồi trung bình của Enrofloxacin

trong huyết tương bằng phương pháp chiết SPE 47 Bảng 4 7 Kết quả phân tích hàm lượng Thiamphenicol trung bình trong

huyết tương với thuốc của Công ty Vemedim 49 Bảng 4 8 Kết quả phân tích hàm lượng Thiamphenicol trung bình trong

huyết tương với thuốc của Công ty khác 50 Bảng 4 9 Kết quả phân tích hàm lượng Enrofloxacin trung bình trong

huyết tương Với thuốc của Công ty Vemedim 52 Bảng 4 10 Kết quả phân tích hàm lượng Enrofloxacin trung bình trong

huyết tương với thuốc của Công ty khác 53

vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

HPLC High performance liquid

MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ tối thiểu kiềm khuẩn SPE Solid phase extraction Kỹ thuật chiết pha rắn

SPME Solid phase micro extraction Kỹ thuật vi ly trích trên pha rắn

LC Liquid chromatography Kỹ thuật sắc ký lỏng

TLC Think Layer Chromatography Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

ACN Acetonitrile

MeOH Methanol

EDTA Etilendiamin tetraaxetic axit

RSD Relactive Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng

MRL Maximum Residue Limits Giới hạn dư lượng tối đa

Mẫu T Mẫu trắng

Mẫu PT Mẫu phân tích

LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay, thuốc kháng sinh được sử dụng ngày càng nhiều vào các mục đích khác nhau: phòng, điều trị bệnh và kích thích tăng trọng cho vật nuôi Tuy nhiên, do thiếu hiểu biết, người chăn nuôi đã sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị chưa đúng nguyên tắc, không có cơ sở khoa học dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng như:

Giảm hiệu lực của thuốc, tạo sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, gây khó khăn cho công tác phòng và điều trị

Ngoài việc có thể gây độc hại cho gia súc, thuốc kháng sinh còn tồn lưu trong thịt, trứng, sữa ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm chăn nuôi và gây hại cho sức khoẻ người tiêu dùng

Trong số rất nhiều các loại kháng sinh đang lưu hành trên thị trường, Enrofloxacin

là loại thuốc kháng sinh thuộc nhóm Fluoroquinolon và Thiamphenicol là loại thuốc kháng sinh thuộc nhóm Phenicol có hoạt phổ kháng khuẩn rộng đang được sử dụng rộng rãi trong việc phòng trị bệnh cho vật nuôi, đặc biệt ở heo

Vấn đề đặt ra là tồn dư của loại kháng sinh trong heo ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ cộng đồng và môi trường, là một trong những nguyên nhân gây bệnh cho con người

và làm tăng nguy cơ xuất hiện nguồn gen kháng thuốc ở các chủng vi sinh vật, đặc biệt vi sinh vật gây bệnh Xuất phát từ nhu cầu trên của thực tiễn, em tiến hành

nghiên cứu đề tài “Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của Enrofloxacin và Thiamphenicol trong huyết tương heo theo thời gian bằng phương pháp High Performance Liquid Chromatography (HPLC)” với sự giúp đỡ của Công ty Cổ

Phần Kinh Doanh Vật Tư và Thuốc Thú Y (Vemedim)

2

PHẦN 1 TỔNG QUAN

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo Thiamphenicol

Tên hóa học: 2,2 – dichloro – N – [(1R,2R) – 2 – hydroxy – 1 – (hydroxymethyl)

Là chất bột tinh thể hay dạng tinh thể màu trắng hoặc vàng nhạt

Nhiệt độ nóng chảy : 165 3oC

Thiamphenicol có khả năng hòa tan tốt trong dimethyl acetamide tỉ lệ (1:1), tan trong dimethyl formamide và acetonitrile theo tỉ lệ (1:10), trong methanol với tỉ lê (1:20), tan ít trong nước, ethanol 95% và acetone

Dược động học:

Hấp thu: Thiamphenicol hấp thu cả đường uống và đường tiêm

SVTH Nguyễn Minh Điện 4

Phân bố: thuốc phân bố rộng rãi vào các mô và dịch cơ thể, qua nhau thai, sữa mẹ

và dịch não tuỷ

Chuyển hoá: thuốc ít chuyển hoá qua gan

Thải trừ: chủ yếu thận dưới dạng không đổi

Tác dụng:

Thiamphenicol là kháng sinh phổ rộng, có tác dụng lên nhiều vi khuẩn gram dương

và âm Thuốc có tác dụng tốt với Salmonella, Salmonella typhi, Shigella, Vibrio

cholerae và các vi khuẩn kị khí gram âm như bacteroides fragilis, nhưng không có

Độc tính: có thể gây suy tủy xương, suy thận

1.3 Ứng dụng

Thiamphenicol dùng điều trị nhiễm trùng hô hấp, tiêu hóa, niệu dục, thương hàn,

viêm màng não do Hoemophilus, Gonococcus gây ra

Công thức cấu tạo:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo Enrofloxacin

Phân bố: Thuốc được phân bố điều và rộng khắp các tổ chức Nồng độ thuốc trong các tổ chức gan, tim phổi thận đều cao hơn trong huyết thanh Thuốc được chuyển hóa chủ yếu ở tế bào gan Thời gian bán thải t1/2 khoảng 3 giờ nếu tiêm tĩnh mạch, hay 6 giờ nếu tiêm bắp hoặc uống

Thải trừ: Thuốc thải trừ qua thận và phân, nhưng nếu công năng của gan, thận kém

sẽ tăng thời gian t1/2 lên cao T1/2 với chó khoảng 2 – 3 giờ bằng đường uống, 3 – 5 giờ tiêm, mèo 3 – 4 giờ, cừu 5 – 6 giờ

Tác dụng :

Enrofloxacin là loại thuốc được tổng hợp đầu tiên vào năm 1983 Thuốc được dùng rộng rãi trong thú y

Thuốc có phổ tác dụng rộng và mạnh Với các vi khuẩn Gram âm như E.coli,

Salmonella, Klebssiella, Pseudomonas, aeruginossa, Mycoplasma.spp có MIC

(Minimum Inhibitory Concentration hay nồng độ tối thiểu kiềm khuẩn) bằng 0 01 –

1 25 mg/ mL Với các vi khuẩn như Bacteroides.spp, Bordetelle bronchiseptica,

Pasteurella.spp, Treponema hyodysenteriae (vi khuẩn gây bệnh hồng lỵ tiêu chải

trên heo choai) có MIC bằng 0 05 – 2.0 mg/ mL

Các vi khuẩn gram dương như Staphyloccocus aureus, steptoccocus agalactiae,

steptoccocus dysgalactiae, Corynebacterium pyogenes, Clostridium spp với MIC

bằng 0 16 – 1 mg/ mL

SVTH Nguyễn Minh Điện 6

Thuốc dùng ưu tiên trị các bệnh do vi khuẩn Staphyloccocus, steptoccocus với MIC

bằng 0 15mg/ mL, Mycoplasma có MIC bằng 0 5 mg/ mL Kém tác dụng với

Corynebacterium pyogenes, các vi khuẩn kỵ khí có MIC bằng 1 mg/ mL

Độc tính

Thuốc có khả năng gây ra những ảnh hưởng từ nhẹ đến nặng như buồn nôn, nôn, tiêu chảy, dị ứng ngoài da, tăng áp lực nội sọ (chóng mặt, nhức đầu, lú lẫn, co giật,

ảo giác) Trên trẻ nhỏ, có thể gây đau và sưng khớp, đau cơ

Thực nghiệm trên súc vật còn non thấy mô sụn bị huỷ hoại

2.3 Ứng dụng

Dùng trị các bệnh do Mycoplasma gây viêm phổi của trâu, bò, heo Bệnh viêm phổi

do Pneumoniae, các bệnh viêm phổi, viêm đường hô hấp của động vật nuôi do

E.coli và Salmonella typhimurium

Liều dùng 2 5 mg/kg cho uống hay tiêm Thuốc hay có tác dụng phụ trên chó, mèo

và ngựa Trong điều trị không dùng cho ngựa

CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH

1 Phương pháp chuẩn bị mẫu[12]

Chuẩn bị mẫu là công việc đầu tiên và cần thiết cho các quá trình phân tích nhằm mục đích tách các chất cần xác định ra khỏi nền mẫu Đây là quá trình rất quan trọng, có thể mất chất hay nhiễm thêm chất vào làm sai kết quả phân tích

Yêu cầu chung của quá trình chuẩn bị mẫu :

Lấy hết các chất cần xác định ra khỏi mẫu phân tích

Không làm nhiễm bẩn thêm chất vào mẫu

Không đưa thêm chất khác vào gây ảnh hưởng cho quá trình phân tích

Dung dịch mẫu thu được phải phù hợp cho quá trình phân tích

Làm giàu được các chất cần tách và xác định

2 Phương pháp chiết mẫu

Nguyên tắc cơ bản của quá trình chiết lỏng – lỏng là sự phân bố của một chất tan vào hai pha lỏng, hai pha này không hòa tan vào nhau

Khi thêm một cấu tử thứ ba vào hệ dung dịch có hai cấu tử không tan hoàn toàn vào nhau hoặc tan có giới hạn thì sự hòa tan của cấu tử này vào hai cấu tử kia theo một

tỉ lệ nhất định ở nhiệt độ nhất định gọi là hằng số phân bố Nernst K

Hằng số phân bố của chất tan được tính theo công thức:

b a b

a

S

S C

C

=

K Trong đó K là hằng số phân bố của chất tan

Ca là nồng độ chất tan trong pha a tại thời điểm cân bằng

Ca là nồng độ chất tan trong pha b tại thời điểm cân bằng

S1, S2: Độ tan hai cấu tử Hằng số phân bố của một chất cho biết khả năng hòa tan của chất đó đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, hằng số phân bố của một chất tương đối ít thay đổi theo nhiệt độ và nồng độ của chất đó có trong dung dịch ban đầu, tuy nhiên phụ thuộc nhiều vào dung môi (độ phân cực, đặc tính ái nước của dung môi) và pH, lực ion của dung dịch nước

SVTH Nguyễn Minh Điện 8

Chiết lỏng – lỏng là một kỹ thuật tách đơn giản nhất được sử dụng để làm sạch hoặc tách một cấu tử riêng hoặc một loại cấu tử khỏi mẫu Mẫu rắn hoặc lỏng được chiết bằng dung môi thích hợp Sự lựa chọn dung môi chiết phụ thuộc vào tính tan của chất phân tích ở trong dung môi đó và phụ thuộc vào sự dễ dàng tách được chất cần tách ra khỏi mẫu

Quá trình chiết lỏng lỏng tiến hành theo ba bước:

Bước 1: Cho dung môi thích hợp tiếp xúc với dung dịch chứa chất phân tích

Bước 2: Phân tách thành hai pha: dịch chiết (E-extract) và dịch bã (R-raffinate) Bước 3: Tách và thu hồi dung môi chiết từ hai pha dịch chiết và dịch bã

Sự làm giàu chất và hiệu quả của phương pháp chiết phụ thuộc tỉ số thể tích của mẫu và dung môi chiết, phụ thuộc hệ số phân bố của chất cần phân tích trong dịch chiết và dịch bã Tỷ lệ thể tích của mẫu và dung môi không thể lấy quá rộng vì nó ảnh hưởng đến độ chính xác khi định lượng Hệ số phân bố có thể cải thiện nhờ thay đổi pH mẫu, khử muối hoặc sử dụng ion đối…

từ những dung môi hidrocarbon nhẹ đối với những chất ít phân cực đến những dung môi phân cực hơn như diethyl ether, acetone, ethanol kể cả nước đối với những chất phân cực

Áp dụng đối với mẫu rau cải, thịt cá Dung môi phải đi sâu được vào nền mẫu vì vậy cần xay nhuyễn mẫu để tạo diện tích tiếp xúc lớn giữa mẫu và dung môi Sau

đó, dùng dung môi thích hợp để hòa tan chất phân tích Mục đích của quá trình này

là tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu và hạn chế đến mức tối thiểu chất đồng trích

ly

2.1.2.2 Chiết bằng phương pháp cơ học trộn rung (Vortex) [2]

Áp dụng cho rau cải đã xắt nhuyễn, hạt nhỏ, chất lỏng Mẫu được trộn đều với dung môi ở tốc độ cao, với tác động mạnh của lực cơ học, dung môi sẽ thấm sâu vào bên trong các cơ thịt, mô tế bào làm phá vỡ cấu trúc của chúng thành những mảnh vụn

Do đó chất phân tích dễ dàng phân bố vào pha hữu cơ hơn Dịch chiết thu được sau quá trình này cần phải xử lý tiếp để loại tạp chất

Nguyên tắc: chưng cất hồi lưu liên tục mẫu với dung môi hữu cơ, làm chất phân tích trong mẫu tan vào dung môi hữu cơ

Chất phân tích phải tan tốt vào trong dung môi hữu cơ, pha chiết phải tinh khiết, bền, không làm hỏng chất phân tích, nhiệt độ thích hợp

Thích hợp cho các mẫu rắn như lá cây, rau quả, đất…

Hình 2.1 Sơ đồ chiết Soxhlet

Bếp đun: cung cấp nhiệt độ cho dung môi bay hơi và hòa tan chất phân tích vào dung môi

Dung môi: hòa tan chất phân tích, tách chất cần phân tích ra khỏi mẫu ban đầu Nước vào và ra: làm dung môi ngưng tụ trở lại thu dịch chiết và hồi lưu một phần dịch chiết về bình chiết

Ưu điểm:

SVTH Nguyễn Minh Điện 10

Tiết kiệm dung môi, không phải tốn công lọc và bổ sung thêm dung môi mới như các kỹ thuật chiết khác

Tương đối trích được hết chất

Ly trích tự động liên tục

Nhược điểm:

Không chiết được lượng lớn mẫu

Không chiết được các chất kém bền nhiệt do dịch lượng mẫu chiết phụ thuộc vào kích thước của máy Soxhlet chiết liên tục bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi

Giá thành thiết bị khá cao, dễ hư hỏng, dễ vỡ và khó thay thế

2.2.4 Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method) [8]

Tuy đã được biết đến cách đây rất lâu (1879) nhưng mãi đến thập niên 1980, phương pháp này mới được áp dụng rộng rãi trong kỹ thuật chiết các hợp chất thiên nhiên ra khỏi thục vật như tinh dầu cà phê, trà, gia vị…

Một hợp chất sẽ hiện diện ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó có nhiệt độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn tương ứng của nó

Ưu điểm

Chất lỏng siêu tới hạn có khả năng khuếch tán thấm vào bên trong mẫu chiết nhiều so với sự chiết bằng dung môi theo các phương pháp khác Chất lỏng siêu tới hạn có độ nhớt thấp, có áp suất hơi cao

Có sự chọn lọc cao đối với chất cần chiết tách

Phù hợp với loại hợp chất nhạy với nhiệt độ

Phương pháp thân thiện với môi trường

Nhược điểm

Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền

Sự hiện diên của nước trong mẫu chiết thường gây khó khăn cho quá trình chiết Phương pháp này không thích hợp đối với mẫu chiết ở dạng lỏng Phương pháp này thường sử dụng dung môi là CO2 lỏng nên không phù hợp

để chiết các hợp chất có tính phân cực

2.2.5 Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid phase extraction, SPE) [2,8]

Ngày nay hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký đều sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn Ứng dụng cho nhiều loại nền mẫu khác nhau như: các loại mẫu môi trường, mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu thực phẩm…

Kỹ thuật chiết pha rắn là sự tương tác giữa các chất tan (solutes) trong một dung dịch lên trên chất hấp thu (adsorbent)

Kỹ thuật chiết pha rắn thường được áp dụng nhằm các mục đích sau:

Xác định mức độ phân cực của một hợp chất chưa biết

Làm giàu mẫu nhằm làm tăng độ nhạy cho quá trình phân tích mẫu, loại bỏ các tạo chất gây nhiễu nền không mong muốn, thay đổi nền mẫu của chất phân tích

Phân chia hỗn hợp ban đầu chứa các hợp chất từ không phân cực đến phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau

Các cấu tử cần phân tích và các chất cản trở nằm trong pha lỏng Khi cho chất lỏng chảy qua cột nhồi chất hấp thu (conditioning of the absorbent), quá trình chiết tách xảy ra theo các trường hợp sau:

Các cấu tử cần phân tích được lưu giữ lại trên chất hấp thu, còn các chất cản trở không bị lưu giữ được thải ra khỏi cột theo dòng chảy, sau đó chất cần phân tích được rửa giải ra khỏi cột bằng dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp

Ngược lại, các chất cản trở bị lưu giữ lại trên chất hấp thu, còn cấu tử cần phân tích không bị lưu giữ chảy ra khỏi cột theo dòng chảy

Trong đa số trường hợp, các cấu tử cần phân tích và các chất cản trở cùng bị giữ lại trên cột chất hấp thu Khi đó cần rửa chọn lọc bằng những dung môi đủ mạnh để loại bỏ các chất cản trở, nhưng lại đủ yếu để các cấu tử cần phân tích nằm lại sau, hoặc rửa giải chọn lọc các cấu tử cần phân tích trong dung môi và để lại các chất cản trở bị lưu giữ mạnh trên cột chất hấp thu

SVTH Nguyễn Minh Điện 12

Cấu tạo của cột SPE: Cột gồm hai bộ phận chính:

Thân cột: có dạng giống vỏ bơm tiêm, thể tích từ 1 mL – vài chục mL, vỏ bên ngoài được chế tạo bằng chất dẻo chịu dung môi, có ghi ký hiệu, chủng loại và tính chất của cột

Lòng cột: từ 0 5 - vài cm chứa luợng pha rắn có khối lượng thường từ 100 – 500

mg, kích thước hạt thường 5µm

Hình 2.2 Hình dạng cột SPE

Thân cột: chứa dung môi và các dung dịch cho qua cột Chất hấp thu: lưu giữ các chất phân tích lại trên cột Đuôi cột: gắn kết cột vời bộ chiết

Hình 2.3 Cấu tạo bộ chiết SPE

Van điều chỉnh áp suất: dùng để điều chỉnh độ chân không trong bình chiết Đồng hồ chỉ thị độ chân không trong bình chiết

SVTH Nguyễn Minh Điện 14

CN – cuối dây có cyanopropyl Không phân cực vừa phải/phân cực Chất

SCH – acid benzensulfonic Cation mạnh

PRS – acid propylsulfonic Cation mạnh

CAB – acd carboxylic Cation yếu

Chất

trao

đổi

anion

PSA – amin nhất và nhị cấp Anion yếu/phân cực

NH2 – aminopropyl Anion yếu/phân cực

DEA – dietylaminopropyl Anion yếu/phân cực

Các bước tiến hành trong quá trình chiết pha rắn

Hình 2.4 Các bước tiến hành kỹ thuât chiết SPE

Bước 1: Lựa chọn cột SPE thích hợp dựa vào thể tích mẫu chiết, mức độ tạp chất,

tích phức tạp của mẫu, lượng các chất quan tâm, loại dung môi

Bước 2: Hoạt hóa cột

Mục đích làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp phụ chất phân tích Việc hoạt hóa pha rắn không phân cực được thực hiện qua hai giai đoạn:

Giai đoạn 1: Hoạt hóa với dung môi tan tốt trong nước như methanol, isopropanol… Thể tích dung môi sử dụng bằng 4 - 8 lần tổng thể tích của các khe hở giữa các hạt trong cột cộng với thể tích xốp của chất hấp thu (bed volume) hoặc 2 - 3 lần thể tích cột Nếu sử dụng ít hơn thể tích qui định sẽ làm cho pha rắn không được solvate hóa hoàn toàn dẫn đến kết quả độ thu hồi thấp

Giai đoạn 2: Hoạt hóa với dung môi hòa tan mẫu, thể tích dung môi sử dụng tương tự giai đoạn 1

Đối với pha rắn phân cực hoạt hóa với dung môi không phân cực Sau bước này cột SPE không được làm khô vì nếu cột bị khô quá trình solvate hóa sẽ bị phá hủy

Bước 3: Mẫu chứa chất phân tích được chảy qua cột

Mẫu được cho qua cột SPE với tốc độ dòng chảy của mẫu khoảng 1 mL/ phút Có thể nạp một lượng mẫu khoảng 5% lượng pha tĩnh, mẫu phải được hòa tan trong dung môi thích hợp

SVTH Nguyễn Minh Điện 16

Bước 4: Rửa cột để loại bỏ các chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột để giữ lại chất phân

tích Trong suốt quá trình thực hiện từ bước 1 đến bước 4 không để cột bị khô Sau khi quá trình rửa cột kết thúc mới tiến hành làm khô cột

Bước 5: Rửa giải chất cần phân tích ra khỏi chất hấp thu bằng dung môi thích hợp,

dung môi được chọn này phải đặc trưng để phá vỡ tương tác giữa chất phân tích và chất hấp thu với mục đích rửa giải được chất phân tích

Tốc độ rửa giải vừa phải, khoảng 1 mL/phút không được chảy quá nhanh

Bảng 2.2 Các dung môi thường dùng trong chiết pha rắn có tính phân cực tăng

môi ở 25 o

C

Khả năng tan trong nước

Không phân

cực

Phân cực

Hexan Cyclohexan Carbon tetrahydrochloride Diethyl ether

Chloroform Ethyl acetate Acid acetic Tetrahydrofuran Dichlorometan Aceton

Methanol Acetonitrile Nước

1.9 2.0 2.2 4.2 4.7 6.0 6.2 7.4 8.9 20.7 32.6 37.5 78.5

Không Không Không Không Không

ít

Có

Có Không

Có

Có

Có

Có Những tương tác của phân tử ở cột SPE:

Tương tác không phân cực (nonpolar interactions)

Tương tác không phân cực là tương tác xuất hiện giữa những hydrocarbon của các nhóm chức của chất hấp thu và chất phân tích Hầu hết các hợp chất hữu cơ có cấu trúc không phân cực có thể được hấp thu trên các chất hấp thu không phân cực nhờ lực hút Van – der –waals

Những chất hấp thu không phân cực đặc trưng là các silica được bổ sung C18, C18 hydra, C8 Do các nhóm chức của các chất hấp thu này là các nhóm alkyl, các alkyl này có thể tương tác với hầu hết các chất phân tích không phân cực nên tính chọn lọc của các chất hấp thu loại này kém

Vì vậy các chất hấp thu này có thể được dùng để tách những hợp chất có cấu trúc khác nhau

Tương tác phân cực (polar interactions):

Tương tác phân cực bao gồm các liên kết hydrogen, liên kết lưỡng cực và các liên kết - Các liên kết này xuất hiện giữa nhiều chất hấp thu khác nhau và các nhóm chức của chất phân tích Các tương tác này có thể là giữa nhóm amino, nhóm hydroxyl với nhóm carbonyl hay giữa các vòng thơm, các liên kết đôi với các nguyên tử như Nitrogen, Sulfur, Phospho và Oxy

Những chất hấp thu đặc trưng cho tương tác phân cực là unmodified silica, và các silica được bổ sung các nhóm -CN, -NH2 và diol

Thông thường, những hợp chất phân cực được hấp thu một cách dễ dàng lên các chất hấp thu phân cực từ môi trường không phân cực và được rửa giải với dung môi phân cực Ngược lại, những hợp chất không phân cực được hấp thu từ môi trường phân cực lên các bề mặt phân cực Quá trình rửa giải được tiến hành với những dung môi ít phân cực hơn

Tương tác ion (Ionic interactions):

Tương tác ion là tương tác giữa các chất phân tích mang điện tích với những nhóm chức mang điện tích ngược lại Các nhóm cation tồn tại ở dạng amin bậc 1, 2, 3 và

4 Các cation vô cơ như là magie, canxi… nhóm các anion là cacboxilic, sulfonic acid, phosphate và những nhóm tương tự

Ưu điểm của phương pháp SPE

Khả năng tự động hóa và làm hàng loạt cao

Tính đặc hiệu và chọn lọc đối với hất phân tích cao, có khả năng tương thích với phân tích sắc ký

Tiết kiệm dung môi tiêu thụ

Hiệu suất thu hồi cao

Khả năng làm sạch chất phân tích lớn

Tiết kiệm thời gian

SVTH Nguyễn Minh Điện 18

Ngoài ra, còn nhiều kỹ thuật chiết tách khác nhƣ ly trích bằng siêu âm, ly trích bằng

vi sóng, kỹ thuật vi ly trích trên pha rắn SPME (Solid Phase Micro Extraction), kỹ thuật phân tán trên pha rắn,… cũng đƣợc áp dụng với các mục đích nhƣ làm giàu mẫu và phân lập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu khác nhau

CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, kỹ thuật phân tích trong hóa học cũng đã phát triển rất mạnh mẽ với nhiều phương pháp tích khác nhau như phương pháp hóa học, phương pháp vật lý và phương pháp hóa lý Trong phương pháp vật lý thì kỹ thuật sắc ký nói chung và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao nói riêng đã được ứng dụng rất rộng rãi để tiến hành định tính và định lượng trong hóa học Trong điều kiện thực hiện đề tài này, chỉ giới thiệu phương pháp định lượng Thiamphenicol và Enrofloxacin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Năm 1967, Horvath C là tác giả đầu tiên đã tạo ra máy HPLC để nghiên cứu về nucleotid Ngày nay, với các ưu diểm như áp suất cao, độ phân giải cao, vận tốc sắc

ký nhanh… HPLC được áp dụng trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu đa dạng như phân tích dược phẩm, các dung dịch sinh lý, polymer thiên nhiên hoặc tổng hợp, các loại dư lượng trong môi trường, nhiều loại hợp chất vô cơ, các loại nguyên tố hiện diện trong mẫu phân tích ở dạng vết,… Hơn nữa, các loại đầu dò dùng cho HPLC không làm hư hại mẫu phân tích, có thể thu hồi mẫu để thực hiện các nghiên cứu khác như phân tích phổ, thử nghiệm hoạt tính sinh học…

Trong sắc ký cột (có dạng rắn - lỏng hay lỏng - lỏng ), kỹ thuật sắc ký lỏng áp suất thường đã ra đời và được ứng dụng từ lâu (trên 60 năm) Nhưng hiệu suất tách không cao, độ nhạy thấp và tốn nhiều thời gian cũng như dung môi để chạy sắc ký Ngược lại kỹ thuật HPLC tuy mới ra đời và phát triển khoảng trên chục năm lại đây, nhưng hiện nay đang được phát triển rất nhanh và đã ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của nghiên cứu khoa học và công nghệ Vì kỹ thuật tách sắc ký này có độ nhạy cao, hiệu suất tách cao, tốn ít thời gian cũng như tốn ít mẫu

SVTH Nguyễn Minh Điện 20

Năm1906 Tswett (Nga) cho dung dịch sắc tố thực vật lên cột nhồi bằng CaCO3, các sắc tố di chuyển xuống với tốc độ riêng, tách thành những vùng màu Ông gọi phương pháp này là sắc ký

Năm 1938 Izmailov và Schaiber xây dựng sắc ký lớp mỏng

Năm 1958 Stahl hoàn thiện sắc ký lớp mỏng

Năm 1941 Martin và Synge đặt nền tảng cho sắc ký phân bố

Năm 1952 Martin và Tames công bố sắc ký khí Năm 1960 phương pháp này phát triển mạnh

Từ năm 1960-1970 HPLC được xây dựng và phát triển

1.2.1 Khái niệm

Sắc ký là những kỹ thuật tách và phân tích các chất trong một hỗn hợp mẫu dựa theo những tính chất hóa học, vật lý và hóa lý của các chất trong những điều kiện nhất định Các tính chất đó có thể là tính chất hấp phụ của chất rắn, tính chất trao đổi ion, tạo cặp ion, sự rây phân tử theo kích thước của chúng, sự tạo phức và sự liên hợp phân tử, sự phân bố của các chất giữa hai pha không tan vào nhau…

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) Pha tĩnh (stationnary phase) có tác dụng giữ hóa chất

Pha động (mobile phase) trong đó hóa chất hòa tan

Nguyên tắc:

Hợp chất có ái lực ít với pha tĩnh thì có xu hướng ra khỏi cột trước

Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh bị giữ lại lâu hơn trong cột và ra sau

1.2.2 Nguyên tắc hoạt động

Hệ thống dung môi đóng vai trò là pha động được máy bơm cao áp hút qua bộ khử khí (Degasse) nhằm loại bỏ hết bọt khí còn sót lại trong dung môi trước khi qua máy bơm, sau đó dung môi được trộn với nhau theo tỷ lệ đã chọn (điều khiển bằng máy tính) và được bơm liên tục qua cột tách

Mẫu phân tích được đưa vào cột tách bằng bộ phận tiêm mẫu sau đó được pha động đẩy qua cột tách, quá trính tách chất phân tích xảy ra ở đây

Các chất sau khi ra khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau lần lượt vào đầu dò (detector) thích hợp và được chuyển thành tín hiệu, được khuếch đại và chuyển đến

Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion

Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử

Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một pha động

Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất ( F1) và ngược lại

Đối với mỗi chất, sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1, F2, F3 Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn

Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột

Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau, kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột

SVTH Nguyễn Minh Điện 22

Trong HPLC được chia thành hai loại chính:

HPLC với pha thường (Normal – phase HPLC)

Pha tĩnh như silica ( pH = 2 – 8 ), alumina ( pH = 2 – 12 ), diol, -NH2 ghép nhánh,…

Pha động: Dung môi ít phân cực hơn như hexan, CHCl3,…

HPLC pha thường còn được xem là kỹ thuật sắc ký hấp thu, đây là phương pháp sử dụng một pha động không phân cực kết hợp với một pha tĩnh phân cực

HPLC với pha đảo (Reversed – Phase HPLC)

Pha tĩnh: bề mặt kỵ nước tạo bởi các dây nhánh C18, C8, C4, Phenyl,… Pha động: thông dụng Metanol, Acetonitrile, nước hay hỗn hợp hai hay ba dung môi trên

Áp dụng: trên 80% trường hợp sử dụng cột pha đảo trong phân tích HPLC là do:

Chất phân tích được giữ trên pha tĩnh phân cực nhỏ hơn cho đến khi bị rữa trôi bởi pha động phân cực đủ lớn

Thao tác đơn giản Hiệu quả cao

Cột làm việc ổn định Có thể phân tích cho cả hai loại cấu tử có đặc tính tương tự hoặc khác xa nhau

Hình 3.1 Hệ thống HPLC

1.4.1 Dung môi

Hệ thống HPLC thường có 4 bình chứa dung môi để rửa giải cột, cho phép sử dụng đến 4 loại dung môi cho việc rửa giải nhờ bộ phận trộn sau máy bơm Tuy nhiên thực tế thường chỉ sử dụng 2 loại dung môi để quá trình pha trộn dung môi được đồng nhất và hệ pha động đơn giản giúp quá trình rửa giải ổn định

Dung môi dùng cho HPLC có thể là nước, các loại dung dịch đệm, methanol, acetonitrile hoặc hỗn hợp các loại trên Tất cả dung môi phải có độ tinh khiết cao đạt tiêu chuẩn HPLC, không có lẫn bụi bẫn, bọt khí Trước khi lắp đặt vào hệ thống, các bình dung môi cần được khử hết bọt khí còn lẫn trong dung môi bằng cách đặt bình dung môi đã mở nắp vào bồn siêu âm và cho máy siêu âm hoạt động trong 5 –

Trong trường hợp bọt quá nhiều bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì

có thể bơm sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

1.4.3 Bơm (Pump)

Mục dích là bơm pha động vào cột để thực hiện quá trình sắc ký,bơm của máy HPLC là loại máy bơm cao áp dùng để duy trì một tốc độ chảy của pha động qua cột một cách liên tục, áp suất có thể đạt đến 400 bar, có thể điều chỉnh tốc độ dòng trong khoảng 0 05-10 mL/phút, bơm có thể dùng để trộn 2 đến 4 lọai dung môi khác nhau

1.4.4 Hệ thống tiêm mẫu (injector)

Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích với thể tích từ 1µl - 100µl

Có hai cách đưa mẫu vào cột là tiêm mẫu bằng phương pháp thủ công (bằng tay) và tiêm mẫu tự động (Autosample)

SVTH Nguyễn Minh Điện 24

1.4.5 Cột (Column)

Cột sắc ký chứa pha tĩnh thường làm bằng thép không gỉ có nhiều kích thước khác nhau, thông thường từ 10-30cm hạt nhồi cột đường kính của hạt khác nhau (Φ =3-10µm) tùy thuộc vào mục đích sử dụng Chất nhồi cột thông thường: C18 còn gọi là octadecyl hoặc ODS; C8, còn gọi là octyl; trimethylsilyl, còn gọi là TMS hoặc Methyl; Phenyl Chất nhồi thường có hai dạng là dạng hình cầu và dạng vô định hình, kích thước thường ở 3 cỡ là 3μm, 5μm và 10μm Hạt càng nhỏ thì khả năng tách càng tốt nhưng chậm ra peak và làm tăng áp lực bơm pha động

A = k.C Trong đó: A – Tín hiệu thu được

C – Nồng độ chất phân tích

k – Hằng số thực nghiệm của đầu dò đã chọn Tín hiệu này có thể là

độ hấp thu, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất…)

Trên cơ sở đó người ta chế tạo ra các loại đầu dò sau:

- Đầu dò quang phổ tử ngoại (UV )

- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS ): đây là loại thông dụng nhất hiện nay dùng để phát hiện các chất hấp thụ quang

- Đầu dò huỳnh quang: để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn xuất có huỳnh quang các hydrocacbon thơm đa vòng (Polyaromatic hydrocarbon), các aminoacide, các Peptide, Vitamincatecholamines, Aflatoxine, ngoài ra người ta còn dùng kỹ thuật tạo dẫn xuất để phát hiện các hợp chất không có khả năng phát huỳnh quang

- Đầu dò Diod Array (PDA/DAD photodiode Array/Diod Array Detector): là loại đầu dò mạnh nhất trong các loại đầu dò để đo phổ tử ngoại vì các số liệu quang phổ cho mỗi peak sắc ký được ghi nhận và lưu lại ở một dãy phổ Giúp ích cho việc xác định bước sóng tối ưu của các chất

Ngoài ra, trong HPLC còn sử dụng một số đầu do khác như đầu dò chỉ số khúc xạ (Refractive index detector, RI detector), đầu dò đo độ dẫn điện (Conductivity detector), đầu dò amper kế (Amperometric detector), đầu dò LC – MS…

1.4.7 Hệ dữ liệu (Data system)

Thông thường người ta dùng máy tự ghi (recorder) để ghi sắc đồ của sự tách, hay có thể dùng máy in (printer), bộ tích phân kế (intergrator), máy vi tính…

2 Phân tích định tính[8]

Có nhiều phương pháp định tính Thiamphenicol và Enrofloxacin như phương pháp hóa học, phương pháp HPLC (dựa vào thời gian lưu của chúng trong cột sắc ký), phương pháp sắc ký lớp mỏng (Think Layer Chromatography - TLC) Ở nội dung

đề tài này chỉ giới thiệu phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc một hỗn hợp dung môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất háp thu trơ như silica gel hoặc oxid alumin Pha tĩnh này được trang thành một lớp mỏng đều, phủ lên một nền phẳng như tấp kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic

Hình 3.2 Bình sắc ký lớp mỏng

Bình sắc ký bằng thủy tinh có nắp đậy

Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0 25mm của một loại chất hấp thu như silica gel, alumin,… được tráng thành một lớp mỏng đều phủ lên một nền phẳng như tấm

Pha động (dung môi)

Tấm nền mỏng Bình sắc ký

Nắp đậy

Pha tĩnh (chất hấp thu)

Mẫu cần phân tích

SVTH Nguyễn Minh Điện 26

kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ sulfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ

Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp nhiều chất có độ phân cực khác nhau, sử dụng vi quản chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng (pha động) đang chứa trong bình sắc ký

Pha động: một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển dọc theo tấm lớp mỏng

và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển nhờ vào tính mao quản Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với với mỗi vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện giữa pha tĩnh và các thành phần của mẫu chất (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ tan của mẫu chất trong dung môi

Phương pháp tiến hành

Dùng ống mao quản chấm lần lượt các điểm của dung dịch chuẩn đối chứng và dung dịch mẫu cần phân tích lên bản sắc ký Với mỗi điểm, chấm nhiều lần nhưng giữ cho vết chấm không lan rộng Sau khi chấm hoàn tất, tiến hành làm khô để dung môi bay đi khỏi vết chấm rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly, đậy nắp bình sắc ký lại

Khi dung môi di chuyển lên tới mức tiền tuyến thì lấy bản sắc ký ra khỏi bình giải

ly, sau đó làm khô bản rồi tiến hành quan sát các vết của mẫu dưới đèn tia tử ngoại (UV) Đo vị trí các vết và vị trí mực dung môi di chuyển được rồi tính giá trị Rf của từng vết So sánh Rf của vết bên dung dịch chuẩn và vết bên dung dịch mẫu để xác định xem trong mẫu có chứa chất cần phân tích hay không

Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng: chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích, có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc lớp mỏng

3 Phân tích định lượng[1,2,9]

Đường chuẩn thể hiện cho tính tuyến tính của quy trình phân tích Tính tuyến tính của quy trình phân tích là khả năng luận ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng (response) của đại lượng đo được (y)

và nồng độ (concentration) là một một đường thẳng (x)

y = ax + b

Đại lượng đặc trưng cho tính tuyến tính là hệ số tương quan R (coefficient of correlation) Thường chấp nhận sự tuyến tính khi 0 95 ≤ R2 ≤ 1

3.2 Hiệu suất thu hồi

Hiệu suất thu hồi là % hàm lượng chất phân tích đo được sau một hay nhiều giai đoạn thực hiện của phương pháp phân tích so với hàm lượng chất phân tích thực ban đầu

Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 80 – 100%, quy trình lý tưởng thì hiệu suất đạt 95% Đối với các mẫu phức tạp hiệu suất thu hồi có thể đạt từ 70 – 75%

Cách đo hiệu suất thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn:

Mẫu trắng không chứa chất phân tích có nền mẫu giống như mẫu muốn đo

Mẫu phân tích có chứa chất phân tích: tiến hành quy trình phân tích để xác định lượng chất phân tích ban đầu có trong mẫu ký hiệu CM

Thêm vào một lượng chất phân tích có nồng độ xác định (CC) vào mẫu cần phân tích, thực hiện quy trình phân tích để xác định lượng chất phân tích (CMC) đã thêm vào mẫu và tính hiệu suất thu hồi theo công thức:

Trong đó: CB – nồng độ chất phân tích có trong mẫu trắng (bị nhiễm mẫu)

CM – nồng độ chất tích có trong mẫu phân tích

CC – nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu phân tích

CMC – nồng độ chất tích có trong mẫu phân tích đã được thêm chuẩn

CMC – CM – CB

CC

%H = x 100