Bảo quản thực phẩm bằng màng sinh học (Biofilm) chứa chất kháng khuẩn

PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ BIOFILM 5 1.1. Nguồn gốc màng sinh học (MSH) 5 1.2. Cách để vi khuẩn tồn tại 5 1.3. Cơ chế chung tạo màng sinh học 6 1.4. Những mối nguy từ MSH 7 1.5. Lợi ích của MSH 8 1.6. Bao bì chứa chất kháng khuẩn 9 1.7. Màng sinh học trong bảo quản thực phẩm 12 PHẦN 2: ỨNG DỤNG CỦA BIOFILM CHỨA CHẤT KHÁNG KHUẨN TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM 14 2.1. Vi sinh vật định hướng 14 2.1.1. Đặc điểm hình thái 14 2.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 15 2.1.3. Cấu trúc màng BC 15 2.2 Phương pháp sản xuất và bảo quản BC 23 2.3 Ứng dụng màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu 25 2.3.1 Nguyên liệu 25 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.3 Qúa trình thực hiện 25 2.4 Ứng dụng màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản quả dừa tươi sơ chế tối thiểu 26 2.4.1 Nguyên liệu 26 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.3 Quy trình 27 2.5 Ứng dụng màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản trứng vịt muối 29 2.6 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng bacteriocin và màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản thực phẩm 32 2.6.1 Các nghiên cứu trong nước 32 2.6.2 Các nghiên cứu ngoài nước 32 PHẦN 3: ĐỊNH HƯỚNG PHÁT TRIỂN TRONG TƯƠNG LAI VÀ KẾT LUẬN 34

DANH SÁCH NHÓM 6 VÀ PHÂN CÔNG NHI M V Ệ Ụ

1 Nguy n Minh Châu ễ 13063901 T ng quan v Biofilm ổ ề

2 Nguy n Th Kim Chi ễ ị 13031901 T ng quan v ch t kháng khu n ổ ề ấ ẩ

3 Lâu Minh Cóong 13041541 Vi sinh v t đ nh h ậ ị ướ ng và y u t h nh ế ố ả

h ưở ng

4 Ngô Th Dung (NT) ị 13059971 Nghiên c u trong và ngoài n ứ ướ c

T ng h p tai li u ổ ợ ệ

5 Vũ Th Dung ị 13032881 Quy trình s n xu t và ng d ng ả ấ ứ ụ

MỤC LỤC

PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ BIOFILM 5

1.1 Nguồn gốc màng sinh học (MSH) 5

1.2 Cách để vi khuẩn tồn tại 5

1.3 Cơ chế chung tạo màng sinh học 6

1.4 Những mối nguy từ MSH 7

1.5 Lợi ích của MSH 8

1.6 Bao bì chứa chất kháng khuẩn 9

1.7 Màng sinh học trong bảo quản thực phẩm 12

PHẦN 2: ỨNG DỤNG CỦA BIOFILM CHỨA CHẤT KHÁNG KHUẨN TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM 14

2.1 Vi sinh vật định hướng 14

2.1.1 Đặc điểm hình thái 14

2.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 15

2.1.3 Cấu trúc màng BC 15

2.2 Phương pháp sản xuất và bảo quản BC 23

2.3 Ứng dụng màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu 25

2.3.1 Nguyên liệu 25

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.3.3 Qúa trình thực hiện 25

2.4 Ứng dụng màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản quả dừa tươi sơ chế tối thiểu 26

2.4.1 Nguyên liệu 26

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.3 Quy trình 27

2.5 Ứng dụng màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản trứng vịt muối 29

2.6 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng bacteriocin và màng BC hấp phụ bacteriocin để bảo quản thực phẩm 32

2.6.1 Các nghiên cứu trong nước 32

2.6.2 Các nghiên cứu ngoài nước 32

PHẦN 3: ĐỊNH HƯỚNG PHÁT TRIỂN TRONG TƯƠNG LAI VÀ KẾT LUẬN 34

TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

PHẦN 1 TỔNG QUAN VỀ BIOFILM 1.1 Nguồn gốc màng sinh học (MSH)

Màng sinh học (biofilm) là một dạng sống tồn tại phổ biến trong tự nhiên của vi sinhvật Việc hình thành biofilm đem lại nhiều lợi ích cho bản thân vi sinh vật như giúp tế bàotồn tại và chống chịu được những điều kiện bất lợi, tận dụng được nguồn dinh dưỡng củamôi trường thông qua mối quan hệ hợp tác giữa các loài trong biofilm Theo nghiên cứu củaKokare và cộng sự trong tự nhiên tồn tại nhiều chủng vi khuẩn có hoạt tính tạo biofilm baogồm các vi khuẩn Gram dương (Streptococcus sp., Bacillus subtilis…) và vi khuẩn Gram

âm (Escheriachia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholera…)[1]

Màng sinh học biofilm là mô hình phát triển tự bảo vệ của vi khuẩn Biofilm được quan tâmnhiều trong môi trường, công nghiệp, y học và vệ sinh thực phẩm do các màng này chứa các

vi khuẩn gây hư hỏng và gây bệnh, làm tăng nguy cơ cho sức khỏe cộng đồng ngoài ra, các

tế bào vi sinh trong biofilm đề kháng hơn với việc làm vệ sinh và khử trùng Sự hình thànhmàng biofilm là một quá trình phức tạp, trong đó liên quan đến các cơ chế di truyền vànhiều yếu tố khác như các đặc tính của bề mặt bám và bề mặt tế bào vi khuẩn [2]

Màng sinh học hiện đang được xác định là một tập hợp của tế bào vi khuẩn bề mặtliên quan được ngậm nước kèm theo trong các chất cao phân tử ngoại bào EPS-ExtraPolySacchride (Sauer, Rickard, & Davies, 2007)

Polysaccharides, protein, phospholipid, teichoic và thậm chí cả axit nucleic là các thànhphần chính của EPS Trong một số thiết lập đặc biệt, tinh thể khoáng chất, các hạt phù sa vàcác thành phần được tìm thấy trong EPS của màng sinh học (Donlan, 2002) Một màng sinhhọc có thể bao gồm đơn hoặc nhiều loài vi khuẩn và tạo thành một lớp duy nhất hoặc bachiều cấu trúc, màng sinh học trưởng thành được tổ chức rất cao của các hệ sinh thái trong

đó nước là kênh phân tán và có thể cung cấp đường đi lại để trao đổi các chất dinh dưỡng,các chất chuyển hóa và các sản phẩm chất thải (Sauer et al., 2007)

Các bề mặt tự nhiên hay nhân tạo khi tiếp xúc với vi sinh vật, vi sinh vật đều tạo quầnthể trên bề mặt đó Sự tạo quần thể trên bề mặt có thể thưa thớt gồm các khuẩn lạc khôngthể nhìn thấy bằng mắt thường hoặc nhiều đến mức có thể nhìn thấy như những nơi nướcđọng trong nhà vệ sinh.[2]

Một màng sinh học hoàn chỉnh có thể dầy từ 600 µm – 900 µm (mỗi vi khuẩn dàikhoảng 1 µm), tức là dầy gấp mấy trăm lần một con vi khuẩn đơn lẻ Màng sinh học khôngphải là một chất vô định hình, hay một khối đặc sệt các polysaccharides và vi khuẩn như cóngười đã nghĩ; nó có tổ chức và cấu trúc Thậm chí là khu vực dầy nhất của màng sinh họccũng cho luồng nước chảy qua Nước chảy qua các cấu trúc hình nấm của những khối cầu vikhuẩn, qua đó, cung cấp dinh dưỡng cho chúng và đem chất thải đi

Vi khuẩn trong màng sinh học có nhiều thuận lợi hơn là những vi khuẩn lơ lửng tự dotrong nước Trước hết, chúng chia sẻ thông tin di truyền và trao đổi chất cho nhau Ví dụnhư, trong màng sinh học ở cao răng, vi khuẩn Veillonella sử dụng lắc-tát do vi khuẩnStreptococcus sinh ra Thứ nhì, vi khuẩn trong màng sinh học được bảo vệ khỏi kẻ thù vàcác hoá chất độc hại

Trong thế giới dưới nước, màng sinh học bảo vệ vi khuẩn khỏi bị các động vật nguyênsinh, các loại tảo độc hại (dinoflagellates – tảo roi) và khuẩn độc (Myxobacteria – niêmkhuẩn) làm hại [4]

1.2 Cách để vi khuẩn tồn tại

Làm thế nào để những vi khuẩn bé nhỏ tồn tại trong thế giới tự nhiên khắc nghiệt?

Nhờ cộng sinh với các loài khác để tự bảo vệ mình

Hình 1.1 Vi khuẩn bám lên các bề mặt

Các vi khuẩn sống bám và gắn kết với nhautrên các bề mặt (giữa chất rắn và chất lỏng,giữa không khí và chất lỏng) - vốn là nơitích tụ nhiều chất dinh dưỡng nhất Theothời gian, tập hợp vi khuẩn và các chất dochúng tiết ra hình thành một lớp vật chấtgọi là màng sinh học (biofilm)

MSH trong thiên nhiên, đặc biệt ở những vùng có độ ẩm cao MSH được tạo thànhtrên cả bề mặt sống lẫn không sống, ở những bề mặt rắn ngập nước, trên bề mặt chất lỏng,nơi tiếp xúc với không khí ẩm; bề mặt lá cây, thậm chí là bề mặt mô mềm trong cơ thể sống.Loại màng này có thể phát triển ở những khu vực khắc nghiệt nhất, cả vùng nước nóng lẫnbăng giá, nước mặn lẫn nước ngọt, cả nước giàu axit hoặc kiềm

Người ta thường bắt gặp MSH dưới dạng lớp váng trên bề mặt các hồ nước tù đọng,nơi lớp đá sỏi ven sông, suối; những mảng bám trên thành tàu… Ở môi trường sống của conngười, MSH sinh sôi tại nơi ẩm thấp như phòng tắm, sàn nhà, đường ống nước và ống dẫnnước thải… Trong cơ thể sống, MSH xuất hiện dưới dạng cao răng; lớp xơ hóa gây nhiễmtrùng phổi, lớp mủ nhiễm trùng trên một vết thương…Ta có thể nhìn thấy màng sinh họcbằng mắt thường

MSH đầu tiên được Anthony Van Leewenhoek (người Anh) nghiên cứu năm 1684 là mộtmảng bám răng Do thiếu công cụ và phương pháp, mãi đến cuối thế kỷ 20, giới khoa họcmới nhận thức hết ý nghĩa và tầm quan trọng của MSH Từ đó đến nay, số lượng nghiên cứu

về MSH tăng vọt Sau nhiều năm tìm hiểu, các nhà khoa học tin rằng, MSH là thành phần tựnhiên trong hệ sinh thái Trái Đất và hình thành MSH là xu hướng chug của các lọai vikhuẩn.[3]

Nguyên nhân hình thành

 Đây là cách tự đề kháng để gia tăng khả năng sống sót

 Biofilm cho phép tế bào duy trì ở một nơi thích hợp

 Biofilm cho phép tế bào vi khuẩn sống gần nhau hơn, thông tin giữa tế bào-tế bào tốthơn, tăng cơ hội sống sót

 Biofilm dường như là tế bào vi khuẩn phát triển tự nhiên

1.3 Cơ chế chung tạo màng sinh học

Hình 1.2 Sự xuất hiện của màng sinh học

 Giai đoạn 1 – Gắn kết: vi khuẩn trôi nổi gặp được một bề mặt ngập nước bắt đầu tiến

hành gắn kết Trong vài phút, chúng tổng hợp các chất ngoại bào cao phân tử (EPS extracellular polysaccharides) để kết dính chặt chẽ với bề mặt

- Giai đoạn 2 – Tăng trưởng: sau vài giờ, lớp “chất nhầy” polysaccharides do vi khuẩn

sản sinh phát triển thành cấu trúc 3 chiều, phức tạp, tạo ra lớp MSH hoàn chỉnh Các vikhuẩn liên tục trao đổi thông tin để đảm bảo cấu thành MSH một cách chính xác

nhờ giải phóng các mô tế bào nhỏ (tương tự cách hạt giống phát tán) Trong điều kiệnthuận lợi, một MSH đã “trưởng thành” có lây lan với tốc độ nhanh chóng không ngờ

Hình 1.3 Các giai đoạn phát triển của một MSH

MSH cung cấp cho vi khuẩn môi trường lý tưởng để sinh trưởng và phát triển

Dưới kính hiển vi, MSH trông như các cấu trúc hình nấm phân cách bởi những conkênh đầy nước Mỗi màng gồm nhiều lớp vi khuẩn sắp xếp trật tự, có độ dầy từ 600 µm –

900 µm (mỗi vi khuẩn dài khoảng 1 µm), liên kết với nhau nhờ các sợi cellulose cao phân tửtạo thành quần thể có tổ chức với các kênh ngang, dọc, cho phép chất lỏng, chất thải vàdưỡng chất lưu thông hoàn hảo Cấu tạo này không chỉ hỗ trợ vi khuẩn trao đổi thông tinbằng tín hiệu sinh hóa mà còn bảo vệ chúng khỏi sự tấn công của kẻ thù và các hóa chất độchại khác (kháng thể, tế bào miễn dịch, thuốc…)

Vi khuẩn tồn tại trong MSH có tính chất khác biệt đáng kể so với các vi khuẩn sốngtrôi nổi trong môi trường Chúng có khuynh hướng thích nghi nhanh chóng, tăng cường sức

đề kháng với độc chất Các vi khuẩn ở trung tâm MSH thương có khả năng kháng thuốcmạnh nhất Khác biệt về môi trường , về loại vi khuẩn, dưỡng chất, điều kiện sống sẽ hìnhthành các loại MSH khác nhau.[3]

Vốn tập hợp một lượng lớn vi khuẩn, MSH còn là nguồn gốc nhiều căn bệnh viêmnhiễm ở người Các nhà khoa học cho biết, có thể tìm thấy hơn 400 loài vi khuẩn khác nhautrong cao răng với mật độ khoảng 10 tỷ con vi khuẩn/ mg Khoảng 15-20% ca nhiễm trùngđường tiết niệu có nguyên nhân bắt nguồn từ MSH trong cơ thể Đặc biệt, MSH sẽ trở thànhnguồn lây nhiễm bệnh cực kỳ nguy hiểm nếu chúng hình thành trên các thiệt bị y tế

Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp trong MSH:

- Staphylococcus aureus: gây nhiễm khuẩn, áp xe

- Salmonella typhi: gây bệnh thương hàn

- Enterococcus faecalis: gây nhiễm trùng đường ruột

- Pseudomonas aeruginosa: làm suy giảm miễn dịch, nhiễm trùng hệ thống hô hấp, viêmphổi, nhiễm trùng đường tiểu, nhiễm trùng máu…

- Vi khuẩn staphylococcus trên màng sinh học

1.5 Lợi ích của MSH

Tiểm ẩn rất nhiều hiểm nguy, nhưng MSH là lĩnh vực nghiên cứu thú vị và đầy thửthách, mang lại kho kiến thức hữu ích về tác động của vi khuẩn đối với mọi thứ xung quanh.Những nghiên cứu về MSH không chỉ ngăn ngừa tác hại của vi khuẩn mà còn ứng dụngchúng trong nhiều lĩnh vực, từ công nghiệp cho đến y tế Bằng cách chọn lựa loại vi khuẩnđặc trưng, thay đổi tỷ lệ vi khuẩn, dung môi,… các nhà khoa học có thể tạo ra MSH vớicông dụng đa dạng

Những ứng dụng phổ biến của MSH:

 Làm sạch không khí

MSH sử dụng trong công nghệ lọc sinh học khá thông dụng, dùng vi sinh vật loại bỏcác hợp chất khí bị nhiễm bẩn Trong hệ thống lọc, khí ô nhiễm sẽ được khuếch tán và đượcMSH hấp thụ

 Lọc nước

MBR (Membrance Bio Reactor) tức “bể lọc sinh học bằng màng” là một trong nhữngcông nghệ lọc nước vi sinh triển vọng hiện nay Công nghệ này phát triển lần đầu tiên vàothập niên 1970 Trong quy trình xử lý nước thải, vi khuẩn trong MSH sẽ giúp loại bỏ chấthữu cơ, một số tác nhân gây bệnh và vi sinh vật trong nước Không chỉ vậy, MSH còn có thểloại bỏ dầu ô nhiễm trên đại dương và trong các đường ống lọc dầu trên biển

 Làm màng trị bỏng

Khả năng che phủ và bảo vệ khiến MSH rất được “ưu ái” nghiên cứu làm màng trịbỏng Bằng cách chọn lọc vi khuẩn phù hợp, các nhà khoa học tạo ra được loại MSH giúpche phủ vết thương, chống nhiễm trùng, thoát nước rất tốt và nhanh liền sẹo

Màng sinh học lọc nước Màng sinh học trị bỏng Màng sinh học trong thực

pháp điều trị hỗ trợ miễn dịch đã ra đời Nước súc miệng, thuốc kháng sinh, nước tẩy rửagia dụng, chất khử trùng,… đều ra đời từ các phòng thí nghiệm nghiên cứu MSH

Trên thế giới, ngày càng nhiều công dụng độc đáo của MSH được khám phá như làmmôi trường cơ chất trong sinh học, chất mang năng lượng cho pin, làm mạch máu nhân tạo,mặt nạ dưỡng da… Yêu cầu đặt ra cho những nghiên cứu MSH trong tương lai là sản xuấttrên quy mô công nghiệp.[3]

Nhiều nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và quy mô thí điểm đã chứng tỏ nhiều ưuđiểm các phản ứng màng sinh học trong sản xuất các sản phẩm giá trị gia tăng khác nhau,đặc biệt là trong rượu vang và sản xuất axit hữu cơ Phản ứng màng sinh học, như các phảnứng cố định khác, không chỉ mang lại năng suất cao hơn,mà còn có tiềm năng lớn hơn sovới các phản ứng tế bào bị gián đoạn để phát triển trong môi trường liên tục (mà đáng kểhơn là sản xuất về thời gian lên men cuối trên một đơn vị sản phẩm được sản xuất) Kết hợp

ổn định đặc biệt và nhu cầu dinh dưỡng thấp hơn, các phản ứng màng sinh học thể hiện tiềmnăng cao cho các ứng dụng trong quy mô lớn sản xuất nhiều sản phẩm như rượu, axit hữu

cơ, thuốc kháng sinh, và các enzym Tuy nhiên, trước khi các phản ứng màng sinh học cóthể được áp dụng trong sản xuất quy mô công nghiệp, thêm nhiều nghiên cứu quy mô lêntrên nhiều thông số như điều kiện môi trường, khối lượng và hạn chế truyền nhiệt, và độnghọc là cần thiết

Về nguyên tắc, có hai cách để kiểm soát các màng sinh học Điều quan trọng nhấtchiến lược là để ngăn chặn sự hình thành của họ bằng cách áp dụng một trong nhữngphương pháp tiếp cận Điều này có thể đạt được bằng cách loại bỏ vi khuẩn trước khi chúng

có thể hình thành màng sinh học hoặc bằng sử dụng kháng bề mặt để hình thành màng sinhhọc Hướng tiếp cận thứ hai này có nghĩa là tính chất hóa lý của các bề mặt được sửa đổihoặc tráng với một trong hai các kháng sinh hoặc các chất khác, chẳng hạn như benzyldimethyl dodecyl amoni clorua và bạc (Srey et al., 2013)

1.6 Bao bì chứa chất kháng khuẩn

Đặc điểm nổi bật: [5]

 Bao bì kháng khuẩn là đa chức năng bằng cách giảm hoạt động của vi sinh vật có hạitrong thực phẩm.

Bao bì kháng khuẩn giúp tăng tính an toàn thực phẩm

Bao bì kháng khuẩn làm giảm lãng phí lương thực và cải thiện tuổi thọ thực phẩm

Tác nhân kháng khuẩn có trong biofilm đóng gói cung cấp thêm an toàn cho cho sứckhỏe

Thực phẩm nhiễm bẩn dẫn đến sự hư hỏng và sự tăng trưởng của vi sinh vật gây bệnh

có thể xảy ra khi tiếp xúc với môi trường trong quá trình giết mổ, chế biến, đóng gói và vậnchuyển Mặc dù các phương pháp bảo quản thực phẩm truyền thống như sấy khô, sưởi ấm,làm lạnh, lên men và muối có thể mở rộng thực phẩm hạn sử dụng, nó không phải làconsummate đặc biệt là để ức chế sự tăng trưởng của vi sinh vật gây bệnh có thể gây nguyhiểm cho sức khỏe người tiêu dùng Bao bì kháng khuẩn là một sự phát triển mới mà kếthợp tác nhân kháng khuẩn vào màng polymer để đàn áp các hoạt động của vi sinh vật mụctiêu Tuy nhiên, bao bì kháng khuẩn vẫn là một công nghệ cực kỳ khó khăn và chỉ có mộtvài sản phẩm thương mại hóa được tìm thấy trong thị trường Đánh giá này tập trung phântích sự phát triển bao bì kháng khuẩn cho những thập kỷ qua cho đến khi công nghệ gầnđây Các thông tin về hoạt động của bao bì kháng khuẩn như hiệu suất vi trùng học và tínhchất cơ lý của màng bao bì đã được thảo luận Dự kiến các thông tin như vậy sẽ cung cấpmột cái nhìn tổng quan cũng như thúc đẩy sự phát triển của bao bì kháng sinh trong lĩnh vựcthực phẩm liên quan và công nghiệp

Bao bì AM (kháng khuẩn) được chia làm 2 nhóm chính gọi là bao bì phân hủy sinhhọc và bao bì không phân hủy sinh học Hầu hết các loại polyme tổng hợp là không phânhủy và đáp ứng tốt cho việc sử dụng như vật liệu bao gói thực phẩm với những lợi thế vềchi phí thấp, mật độ thấp, trơ, đặc tính cản rất tốt, độ bền cơ học tốt, tính rõ ràng cao, có khảnăng kín nhiệt và dễ dàng được in lên trên

Nói chung, bao bì AM phân hủy sinh học được sản xuất bởi sự có polymer tự nhiênvốn có phản ứng AM hoặc thông qua việc bổ sung của các tác nhân AM vào polyme tựnhiên Ví dụ về các polyme sinh học tái tạo là polysaccharides, protein, chất keo, chất béo

và phức của chúng, xuất phát từ nguồn gốc động vật và thực vật Hầu hết các nghiên cứubao bì phân hủy sinh học được tập trung vào sự pha trộn của tinh bột nhiệt dẻo (TPS) vớicác polyeste phân hủy sinh học như polycaprolactone (PCL), axit polylactic (PLA),polyhydroxybutyrate-đồng hydroxyvalerate, polybutylene succinate-adipate, poly(butylenes adipate-co-terephtalate), và poly (hydroxyl ester ether) Trong số các thành phầnphân huỷ sinh học, PLA được sử dụng rộng rãi nhất trong các polyme PLA là một nhựanhiệt dẻo phân hủy sinh học và tương thích sinh học được sản xuất bởi lên men từ cácnguồn tái tạo Nó cũng có thể được tổng hợp bằng cách trùng hợp ngưng tụ của axit lactichoặc bằng polyme hóa mở vòng của lactide với sự hiện diện của một chất xúc tác (Sin et al.,2013)

Bên cạnh các vật liệu phân hủy sinh học mà thảo luận trước đó, các bao bì ăn đượclàm từ polymer sinh học (ví dụ như: protein, lipid, polysaccharides) và phụ gia thực phẩmcác cấp (ví dụ như: chất tạo dẻo, tác nhân AM, chất tạo màu, hương liệu, chất nhũ hoá) cũng

là những ứng sự lựa chọn tốt cho sự chế tạo các bao bì AM Bằng cách kết hợp các tácnhân AM và chất chống oxy hóa vào màng sinh học, sản phẩm thực phẩm có thể được bảo

vệ khỏi sự tăng trưởng vi khuẩn, chuyển độ ẩm và oxy hóa các chất dinh dưỡng Các ứngdụng của bao bì ăn được là chủ yếu vào các loại hạt, bánh kẹo và hoa quả

Một số lượng lớn nghiên cứu chỉ ra rằng có thể ngăn chặn một số loại vi sinh vật hiệuquả khi cho một lượng nhân tố kháng khuẩn vào polymer Tính hiệu quả của phương phápnày tốt hơn so với phương pháp thêm trực tiếp các nhân tố bảo quản vào thức ăn do 2nguyên nhân chính Thứ nhất, thêm các nhân tố AM vào polime cho phép các chức năng củanhân tố AM giải phóng chậm trong thời gian dài Thứ 2 tính hoạt hoá của AM có thể bấthoạt hoá bằng cách (như trung hòa, thủy phân, pha loãng và vv) của ma trận thực phẩm vàcác thành phần khi được bổ sung trực tiếp vào thực phẩm (Appendini & Hotchkiss, 2002;Muriel-Galet, Cerisuelo, Lopez-Carballo, Lara, Gavara, & Hernandez-Munoz, 2012) Bêncạnh đó, bổ sung trực tiếp của tác nhân bảo quản vào thức ăn có thể làm giảm chất lượngthực phẩm như là kết quả của việc thay đổi những tính chất cảm quan và kết cấu của thựcphẩm Như vậy, bao bì AM đang đóng vai trò quan trọng để ức chế sự tăng trưởng của vikhuẩn nhắm mục tiêu vào việc cải thiện an toàn thực phẩm và kéo dài thời hạn sử dụng màkhông ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm.

Một số chất kháng khuẩn thường sử dụng trong bao bì thực phẩm

 Bao bì kháng khuẩn với tinh dầu và chiết xuất từ thực vật

Các thành phần hoạt động của các loại tinh dầu thực vật ức chế các vi sinh vật thôngqua sự xáo trộn của các màng tế bào chất, phá vỡ các động lực proton, dòng electron, vậnchuyển tích cực và ức chế tổng hợp protein Ví dụ về các chất chiết xuất từ thực vật và tinhdầu kết hợp rộng rãi nhất vào bao bì thực phẩm là linalool, thymol, carvacrol, dầu cây đinhhương, cinnamaldehyde và tinh dầu húng quế

 Bao bì kháng khuẩn chứa enzyme

Lysozyme, thu được từ trứng gà là một enzyme được phân loại như một tác nhânkháng khuẩn tự nhiên và thường được đưa vào các vật liệu đóng gói Giống với các tác nhânkháng khuẩn tự nhiên khác, lysozyme thì kém hiệu quả đối với vi khuẩn Gram âm do sự tồntạo lớp lipopolysaccharide (LPS) trên thành tế bào vi khuẩn Vi khuẩn Gram dương rất nhạycảm với lysozyme bởi vì màng của chúng được cấu tạo từ 90% peptidoglucan mà ở đó sựthủy phân liên kết glycoside β-1-4 giữa nhóm N-acetyl của acid muramic và nhóm N-acetylcủa nhóm glucosamine diễn ra Nhằm nâng cao hơn nữa hiệu quả kháng khuẩn của enzyme,một vài tác nhân kháng khuẩn như chất tẩy rửa và chelators thì thường được thêm vào

 Bao bì kháng khuẩn chứa chitosan

Chitosan rất hấp dẫn đối với các nhà nghiên cứu khoa học do một số tính chất thú vịcủa nó như là một hợp chất polyne tự nhiên, không độc, khả năng tạo màng và phân hủysinh học (Torlak và cộng sự 2011, Cooksey 2010) Bên cạnh đó, chitosan có tính chất khángkhuẩn và có thể vô hoạt vi khuẩn Bởi vì phân tử chitosan tích điện dương có thể tương táctốt hơn với acid teichoic trong thành tế bào của vi khuẩn Gram âm

Nghiên cứu hoạt động của màng chitosan-tinh bột ăn được với Thynus kotschyanus

được nghiên cứu bởi Mehdizadeh (2012) có khả năng ức chế chống lại L.monocytogenes,

E.Coli, S.aureus, S.typhimurium với những mức độ khác nhau Màng không có dầu nguyên

chất thì không hiệu quả đối với S.typhimurium mà ở đó vùng ức chế không được tạo thành

L.monocytogenes rất nhạy cảm với màng được thêm kotschyanus Bởi vì nồng độ của

kotschyanus được tăng lên, vùng ức chế của E.Coli mở rộng có ý nghĩa Chỉ thị kotschyanus

là một phản ứng chọn lọc trên khoảng vi khuẩn Gram âm và Gram dương

 Bao bì kháng khuẩn chứa Bacteriocin

Khác với các tác nhân kháng khuẩn chiết xuất từ thực vật, động vật, tác nhân khángkhuẩn được tạo thành từ vi khuẩn gọi là bacteriocin thì dần dần đạt được dân số trong môitrường nhiệt độ cao và acid Bacteriocin là sản phẩm đồng hóa (peptide kháng khuẩn) được

sản xuất bởi hệ thống phòng thủ của hầu hết các vi khuẩn Hoạt động tự nhiên này cho phéphoạt động của vi khuẩn chủng này ức chế sự phát triển của các chủng khác Bacteriocinđược sản xuất bởi vi khuẩn acid lactic (LAB) được đánh giá cao bởi vì LAB là vi khuẩn lênnen quan trọng trong nhiều thế kỉ.Ví dụ như phô mai, rượu vang, kim chi, nước tương…

Nisin, được sản xuất bởi vi khuẩn lactobacillus lactis, thường được xuất hiện trong sữa và

được công nhận bởi FDA Nó là bacteriocin đầu tiên được tinh sạch và đặc biệt sử dụng để

ngăn chặn sự phát triển của bào tử Clostridium botulinum trong phô mai.

Bacteriocin như enterrocins A và B, Sakacin, enterocin 416K1, pediocin AcH đã

được chứng minh có khả năng kiểm soát sự gia tăng của L monocytogenes trong thực phẩm

có chứa chất ô nhiễm nhân tạo Siragusa và cộng sự (1999) báo cáo rằng bacteriocin bọcmàng PE chế tạo bởi quá trình kiểm tra ép đùn bao bì thịt tiêm chân không với

B.thermosphacta đã ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn này An và cộng sự (2000)

cũng báo cáo rằng bacteriocin được bao bọc bởi màng LDPE ức chế chống lại Micrococus

flavus và L.monocytogenes Kim và cộng sự (2002) nghiên cứu trên bacteriocin phủ LDPE

thấy rằng việc sử dụng nisin và màng bọc lacticin NK24 kéo dài tuổi thọ của sò và thịt bòtương ứng được bảo quản tại 30C từ 10 đến 12 ngày và 9 đến 13 ngày Trong khi đó, tuổi thọcủa sò và thịt bod kéo dài từ 5 đến 12 ngày và 5 đến 9 ngày khi được bảo quản ở 100C

 Bao bì kháng khuẩn với hạt nano vô cơ

Việc sử dụng các hạt nano vô cơ như các tác nhân kháng khuẩn gần đây trở nên phổbiến mà do sự ổn định tốt của các vật liệu này chịu được quá trình khắc nghiệt như áp lựccao hoặc nhiệt độ trong quá trình chế tạo bằng nhựa Các hạt nano vô cơ được nghiên cứurộng rãi cho mục đích kháng khuẩn là titan đioxit (TiO2) và oxit kẽm (ZnO) Titaniumdioxide (TiO2) là không độc hại và được chấp nhận bởi FDA cho sử dụng trong thực phẩm,thuốc và nguyên liệu thực phẩm Đó là một xúc tác quang học được sử dụng rộng rãi để làmbất hoạt rộng phần lớn vi sinh vật

Việc thành lập các tác nhân - vào polymer có thể ảnh hưởng xấu đến tính chất vật lý,tính toàn vẹn cơ học và ổn định nhiệt của bao bì khi các tác nhân _ sử dụng không tươngthích với các polymer Trong khi đó, AM tác nhân tương thích với các vật liệu đóng gói cóthể dò ra được cũng vào không gian giữa các chuỗi polymer Nói cách khác, nó không ảnhhưởng đến các tính chất ,màng khi số lượng hợp lý được thêm vào (Han, 1996) Vì vậy,nghiên cứu về hóa học và cấu trúc polymer rất quan trọng trong việc dự đoán những ảnhhưởng của các tác nhân - đặc biệt trên bao bì Sau đó, việc lựa chọn các tác nhân polymebao bì và phương pháp kết hợp có thể có hiệu quả hơn

1.7 Màng sinh học trong bảo quản thực phẩm

Theo phương pháp sản xuất, vật liệu polymer sinh học được chia thành 3 nhóm chính:+ Polymer được tách trực tiếp từ các nguồn tự nhiên (chủ yếu là thực vật), ví dụ như cácpolysaccharit (tinh bột, cellulose) và protein (casein, gluten của bột mì)

+ Polymer được tổng hợp bằng phương pháp hóa học từ monome Ví dụ, vật liệu polylactat

là một polyeste sinh học được polymer hóa từ monome acid lactic Các monome này đượcsản xuất nhờ lên men Cacbonhydrat tự nhiên

+ Polyme được sản xuất nhờ vi khuẩn cấy truyền gen hoặc vi sinh vật (hay còn gọi làBiofilm) Vật liệu polyme sinh học điển hình nhất là polyhydroxy – alkanoat, chủ yếu làpolyhydroxybutyrat (HB), và copolyme của HB và hydroxy – valerat (tên thương mại làbiopol)

Ba loại polyme sinh học trên có tiềm năng làm nguồn vật liệu cho bao bì trong tươnglai và gần như thay thế các loại vật liệu bao bì hiện tại có nguồn gốc dầu mỏ (như PE, PS).Nhìn chung các polyme sinh học nói trên đều có hiệu quả cao và dễ chế biến thành màngmỏng bằng công nghệ gia công chất dẻo thông thường nên còn hơi đắt, còn đối với polyme

đi từ từ polysaccharid và protein, vấn đề càng hiệu quả rõ ràng hơn, đặc biệt là cellulose,nguồn polyme tự nhiên có sẵn và rất rẻ Các loại giấy bóng kính (celophan) khá bên, nhạycảm với độ ẩm được sản xuất từ cellulose là một loại vật liệu rất thích hợp làm bao bì

PHẦN 2: ỨNG DỤNG CỦA BIOFILM CHỨA CHẤT KHÁNG KHUẨN TRONG

BẢO QUẢN THỰC PHẨM 2.1 Vi sinh vật định hướng

BC được tổng hợp bởi một số loài vi khuẩn khác nhau Con đường sinh tổng hợp và

cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở các loài tương đối giống nhau, nhưng cấu trúc BC ở mỗi loàithì khác nhau Có các điểm khác biệt đáng kể về thuộc tính vật lý của các sản phẩmcellulose chủ yếu là chiều dài của chuỗi glucan (được đặc trưng bởi mức độ polymer hóa),tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó Tùy thuộc vào mỗi loài mà trạng thái kết tinh củacellulose khác nhau, từ đó xác định các tính chất vật lý của sản phẩm như độ bền, độ hòa tantrong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác nhân biến tính

Bảng 2.1 Cấu trúc màng BC của một số vi khuẩn.

Vi sinh vật Cấu trúc cellulose Vai trò sinh học

Dải cellulose

Để giữ vi khuẩn trong môi trườnghiếu khí

Acetobacter xylinum (A aceti ssp xylinum, A xylinus), là vi sinh vật tạo cellulose

hữu hiệu nhất Acetobacter orleanse váng mỏng nhưng chắc, A pasteurianum váng khô và nhăn nheo, A.suboxydans váng mỏng dễ tan rã, A.curvum sinh ra acid acetic với nồng độ ca nhưng tạo váng không rắn chắc.Gần đây, nó được xếp vào giống mới Gluconacetobacter bao gồm các loài là G xylinum, G europaeus, G oboediens và G intermedius.

2.1.1 Đặc điểm hình thái

A xylinum là vi khuẩn hình que dài khoảng 2m, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành

chuỗi, không di động Là vi khuẩn Gram âm, vỏ nhầy được cấu tạo bởi cellulose A xylinum

thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, nên chúng tăng trưởng trên bề mặt tiếp xúc giữamôi trường lỏng và môi trường không khí

2.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Điều kiện tối ưu để A xylinum sinh trưởng ở pH = 4 - 4,5, nhiệt độ từ 25-320C Acid

acetic là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của A xylinum Nhưng khi lượng acid

tích lũy quá cao thì sẽ ức chế chúng

A xylinum hấp thụ đường glucose rất tốt từ môi trường nuôi cấy Trong tế bào vi

khuẩn, glucose sẽ kết hợp với acid béo tạo thành tiền chất nằm trên màng tế bào Sau đó nóđược thoát ra ngoài tế bào cùng với một loại enzyme Enzyme này có thể polymer hóa thành

cellulose A xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào nguồn

đường nào được sử dụng tốt nhất

Bảng 2.1.2 Đặc điểm sinh hóa của A xylinum

ST

T Đặc điểm sinh hóa của A.xylinum Hiện tượng Kết quả

1 Oxy hóa ethanol thành acid acetic Acid acetic tạo ra kết hợp vớiCaCO3 làm vòng sáng rộng hơn

và tạo lớp cặn, đục rõ

+

4 Chuyển hóa glucose thành acid Vòng sáng sung quanh khuẩn lạc +

5 Chuyển hóa glycerol thành

dihydroxyaceton

Vòng CuO xuất hiện xung quanh

6 Kiểm tra sinh sắc tố nâu Không thấy sắc tố nâu

-7 Kiểm tra tổng hợp cellulose Váng vi khuẩn xuất hiện màu lam +

2.1.3 Cấu trúc màng BC

Cellulose là một polymer không phân nhánh của các liên kết -1,4 glucopyranose.Các nghiên cứu cho thấy BC có cấu trúc hóa học giống với cấu trúc của cellulose thực vật.Tuy nhiên, cấu trúc đa phân tử và thuộc tính của cellulose vi khuẩn khác với cellulose thựcvật Các chuỗi mới sinh của BC tập hợp lại hình thành nên các siêu sợi có độ rộng khoảng1.5nm Các siêu sợi này lại hình thành nên các vi sợi (Jonas and Farab, 1998), sau đó chúngđược bó lại và hình thành nên các ribbon (Yamanaka và cộng sự, 2000) Kích thước của cácribbon là 3-4 x 70-80 nm Các BC khác nhau thường có độ polymer hóa khác nhau thườngnằm trong khoảng 2000 đến 6000, trong một số trường hợp lên đến 16000 – 20000 Trongkhi đó mức polymer hóa trung bình của thực vật thường nằm trong khoảng 13000 – 14000

2.1.3.1 Đặc điểm của Cellulose vi khuẩn

- Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành

phần tỉ lệ Iα cao

- Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là cellulose I.

- Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc.

- Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và

hemicellulose

- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể

phục hồi

- Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt.

- Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao,

ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao

- Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản xuất một số

sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian Đặc biệt vi khuẩn

có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉcực nhỏ

- Có thể kiểm soát được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn bằng cách

tác động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A xylinum Từ đó có thể kiểm

soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose

Hình 2.1.3.1 Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki et al., 2001)

2.1.3.2 Yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo BC của vi khuẩn

 Kiểu nuôi cấy

Có 2 kiểu nuôi cấy thường được sử dụng để sản xuất cellulose vi khuẩn, đó là nuôicấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo

Nuôi cấy tĩnh

Đối với nuôi cấy tĩnh, người ta sử dụng những khay nhựa đã chuẩn bị môi trường và

tiến hành nuôi cấy chủng A xylinum ở điều kiện tĩnh.

Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, những thớ sợi thứ cấp liên tục được lộ ra từ lỗ sắp xếpthẳng hàng trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết thành những vi sợi, lắng sâu xuống môitrường sinh trưởng, sau đó dải cellulose chồng chập và xoắn với nhau tạo thành tấmcellulose trên bề mặt canh trường dinh dưỡng, ngay mặt phân cách pha lỏng khí giàu oxy

Dù vẫn được sử dụng để sản xuất cellulose nhưng nuôi cấy tĩnh cho sản lượng thấp

và mang tính thủ công Do đó, để sản xuất công nghiệp, cần thiết để thiết lập hệ thống sảnxuất hàng loạt sử dụng kĩ thuật nuôi cấy hiệu quả hơn (Edwards, 1995)

Nuôi cấy có khuấy đảo

Tiến hành nuôi cấy trong thiết bị lên men chứa dung dịch môi trường, có cánh khuấy,thổi khí oxy hoặc lắc Vi khuẩn phân bố đều trong toàn dung dịch và phát triển theo chiềusâu của môi trường Cellulose được tạo ra có dạng viên hình cầu, elip…

Đây là kĩ thuật nuôi cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo cellulose cao, có thể ứngdụng trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ

mới được sản xuất với sản lượng thấp Sản xuất cellulose từ A xylinum bằng phương pháp

nuôi cấy có khuấy đảo gặp phải một số trở ngại, trở ngại lớn nhất cho đến nay là tính không

ổn định khi nuôi cấy Tính không ổn định được thể hiện bởi sự mất khả năng sản xuấtcellulose và thay thế dần tế bào sản xuất cellulose bằng chủng đột biến không có khả năng

sản xuất cellulose (Hai-Peng et al., 2002; Chao et al., 1997).

Từ việc quan sát thấy rằng cellulose tổng hợp nhanh khi tế bào A xylinum được gắn

vào những phần tĩnh trong bình lên men như điện cực, cánh khuấy, màng ngăn, Vandamme

et al (1998) đã giới thiệu “điểm dính đa chức năng” trong bình nuôi cấy bằng cách cung

cấp vào môi trường những phần tử nhỏ không tan như diatonit, silicagel, cát biển, những hạtthủy tinh nhỏ, đất mùn, cellulose thực vật được giã nhỏ Nồng độ phần tử nhỏ đưa vào

được tối ưu tuỳ theo mức độ khuấy, cũng như mức độ lắc của khay (Yoshinaga et al., 1997).

Sự lựa chọn kỹ thuật nuôi cấy phụ thuộc vào mục đích thương mại của polymer sinhhọc, hơn nữa cấu trúc cellulose và đặc tính cơ lý của nó bị ảnh hưởng rất lớn của phương

pháp nuôi cấy (Hai-Peng et al., 2002) Trong điều kiện nuôi cấy bề mặt, màng cellulose dày

được tạo thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy Trong khi dưới điều kiện nuôi cấy chìm,cellulose lại được sản xuất dưới dạng huyền phù thớ sợi, những khối không đều, dạng viênkết hay dạng cầu kích thước từ 10 µm đến 1000 µm

Hình 2.1.3.2.Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (trái) và có khuấy

đảo (phải)(El-Saied et al., 2004)

Những phần tử hình cầu mịn của cellulose trong nuôi cấy chìm (Agitated bacterialcellulose – Ag-BC) có cấu trúc mắt lưới tương tự cấu trúc mắt lưới của màng mỏngcellulose thu được khi nuôi cấy bề mặt (Static bacterial cellulose – St-BC) Tuy nhiên cóvài sự khác biệt về hình thái trong những sợi nhỏ và trong cấu trúc này giữa St-BC và Ag-

BC Sợi cellulose của St-BC duỗi thẳng trong khi sợi cellulose Ag-BC cong và rối, làm cấutrúc mắt lưới dày hơn so với cấu trúc St-BC Bên cạnh đó, chiều rộng sợi Ag-BC mỏng hơn

so với St-BC, mặc dù rất khó xác định chính xác kích thước của mỗi sợi Hình thái này cóđược có thể do dòng chảy rối loạn và áp lực do dịch chuyển không ngừng của môi trườngkhi nuôi cấy dưới điều kiện có khuấy đảo Những thay đổi về hình thái học có liên quan đếnnhững thay đổi trong cấu trúc vi mô như trọng lượng phân tử, độ kết tinh, thành phần Iα,bảng 2.2 cho thấy rõ điều này