CHẨN ĐOÁN BỆNH MAREK TRÊN GÀ ĐẺ THƯƠNG PHẨM, GÀ TA CHĂN NUÔI THEO PHƯƠNG THỨC CÔNG NGHIỆP BẰNG KỸ THUẬT PCR, NUÔI CẤY PHÂN LẬP TRÊN PHÔI TRỨNG VÀ BỆNH TÍCH VI THỂ

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y ****************** LÊ THỊ NGA CHẨN ĐOÁN BỆNH MAREK TRÊN GÀ ĐẺ THƯƠNG PHẨM, GÀ TA CHĂN NUÔI

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

******************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CHẨN ĐOÁN BỆNH MAREK TRÊN GÀ ĐẺ THƯƠNG PHẨM,

GÀ TA CHĂN NUÔI THEO PHƯƠNG THỨC CÔNG NGHIỆP

BẰNG KỸ THUẬT PCR, NUÔI CẤY PHÂN LẬP

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

******************

LÊ THỊ NGA

CHẨN ĐOÁN BỆNH MAREK TRÊN GÀ ĐẺ THƯƠNG PHẨM,

GÀ TA CHĂN NUÔI THEO PHƯƠNG THỨC CÔNG NGHIỆP

BẰNG KỸ THUẬT PCR, NUÔI CẤY PHÂN LẬP

TRÊN PHÔI TRỨNG VÀ BỆNH TÍCH VI THỂ

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ Thú y

Giáo viên hướng dẫn

ThS Nguyễn Thị Thu Năm

Tháng 08/2012

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực hiện: Lê Thị Nga

Tên luận văn: “Chẩn đoán bệnh Marek trên gà đẻ thương phẩm, gà ta chăn

nuôi theo phương thức công nghiệp bằng kỹ thuật PCR, nuôi cấy phân lập trên phôi trứng và bệnh tích vi thể”

Đã hoàn thành luận văn theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến nhận xét, đóng góp của Hội đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa ngày……

Giáo viên hướng dẫn

ThS.Nguyễn Thị Thu Năm

Xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy cô trong Khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tận tình truyền đạt cho chúng tôi những kiến thức khoa học chuyên môn, cũng như về thực

tế đời sống trong suốt năm năm qua Đó là những kiến thức vô cùng quý giá, là hành trang không thể thiếu cho mỗi sinh viên trước khi bước vào đời

Xin được khắc ghi lòng kính trọng và nhớ ơn cô Nguyễn Thị Thu Năm đã hết lòng dìu dắt, hướng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài tốt nghiệp, luôn chia sẽ chỉ bảo và động viên em những lúc khó khăn nhất

Xin cảm ơn Ban Quản Lý Bệnh Viện Thú Y đã tạo mọi điều tốt nhất để tôi hoàn thành đề tài

Xin cảm ơn anh Lê Trần Thái Anh (công ty thuốc Viphavet), chị Lê Thị Tuyết Toan, anh Nguyễn Phạm Huỳnh cùng các chị làm việc ở Bệnh Viện Thú Y đã giúp đỡ tôi rất nhiều khi thực tập

Cuối cùng tôi xin cảm ơn tất cả bạn bè của tôi đã giúp đỡ, chia sẽ với tôi những khó khăn trong suốt thời gian học tập và thực tập

Chân thành cảm ơn

Lê Thị Nga

TÓM TẮT

Đề tài “Chẩn đoán bệnh Marek trên gà đẻ thương phẩm, gà ta chăn nuôi

theo phương thức công nghiệp bằng kỹ thuật PCR, nuôi cấy phân lập trên phôi trứng và bệnh tích vi thể” được tiến hành tại Bệnh Viện Thú Y, thời gian từ ngày

01/02/2012 đến 30/06/2012

Chúng tôi thu thập 21 ca có triệu chứng và bệnh tích nghi ngờ bệnh Marek, tiến hành lấy mẫu thực hiện phản ứng PCR, nuôi cấy phân lập trên phôi trứng và cắt vi thể

để xác định bệnh Marek trên gà Chúng tôi ghi nhận được kết quả như sau:

Kỹ thuật PCR xác định bệnh Marek cho kết quả dương tính là: 85,71 %

16 ca nuôi cấy phân lập qua phôi trứng cho kết quả âm tính (không xuất hiện nốt pock)

Thực hiện bệnh tích vi thể cho kết quả nghi ngờ bệnh Marek là 100 %

MỤC LỤC

Trang tựa i

Xác nhận của giáo viên hướng dẫn ii

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Mục lục v

Danh sách các chữ viết tắt viii

Danh sách các hình ix

Danh sách các bảng x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Lịch sử bệnh 3

2.2 Căn bệnh 4

2.2.1 Phân loại và hình thái 4

2.2.2 Kháng nguyên 4

2.2.3 Sức đề kháng 5

2.2.4 Nuôi cấy 5

2.2.5 Khả năng gây bệnh 6

2.3 Dịch tễ học 6

2.3.1 Loài mắc bệnh 6

2.3.2 Chất chứa căn bệnh 6

2.3.4 Cơ chế sinh bệnh 7

2.4 Triệu chứng 8

2.4.1 Thể mãn tính 8

2.4.2 Thể cấp tính 10

2.5 Bệnh tích đại thể 11

2.5.1 Thể mãn tính 11

2.5.2 Thể cấp tính 11

2.6 Bệnh tích vi thể 12

2.7 Chẩn đoán 13

2.7.1 Chẩn đoán lâm sàng 13

2.7.2 Chẩn đoán cận lâm sàng 13

2.7.3 Chẩn đoán phân biệt 13

2.8 Phòng bệnh 15

2.3 Giới thiệu phương pháp PCR 15

2.3.1 Giới thiệu 15

.2.3.2 Nguyên tắc chung 15

2.3.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR 16

2.3.4 Thành phần phản ứng PCR 18

2.3.4.1 Tag DNA polymerase 18

2.3.4.2 Đoạn mồi hay primer 18

2.3.4.3 Các nucleotide (dNTP) 18

2.3.4.4 MgCl2 19

2.3.4.5 Bufer 19

2.3.4.6 Nước 19

2.3.4.7 DNA khuôn mẫu 19

2.3.5 Ưu và nhược điểm của kỹ thuật PCR 20

2.3.6 Kiểm tra kết quả PCR 20

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT 22

3.1 Thời gian và địa điểm 22

3.1.1 Thời gian 22

3.1.2 Địa điểm 22

3.2 Đối tượng khảo sát 22

3.3 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 22

3.3.1 Vật liệu 22

3.3.2 Hóa chất 22

3.3.3 Dụng cụ 23

3.4 Nội dung thí nghiệm 23

3.5 Phương pháp nghiên cứu 23

3.5.1 Xác định bệnh Marek bằng kỹ thuật PCR 25

3.5.1.1 Ly trích DNA từ bệnh phẩm 25

3.5.1.2 Phản ứng PCR để xác định bệnh Marek trên gà 26

3.5.2 Phân lập MDV trên phôi trứng gà 27

3.5.3 Lấy mẫu cắt vi thể 30

3.6 Đánh giá 3 phương pháp khi chẩn đoán MD 32

3.7 Phương pháp xử lý số liệu 32

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Kết quả chẩn đoán bệnh Marek bằng kỹ thuật PCR 33

4.3 Kết quả chẩn đoán MD qua bệnh tích vi thể 36

4.4 Đánh giá kỹ thuật PCR, nuôi cấy trên phôi trứng và bệnh tích vi thể dùng trong chẩn đoán MD 38

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC 43

DANH SÁCH CÁC CHỮ TÓM TẮT

MDV: Marek’s Disease Virus

HVT: Herpese Virus of Turkey

MATSA: Marek’s disease turmor – associated surface antigent

dNTP: deoxyribonucleic triphosphate

PBS: Phosphate Buffered Saline

PCR: Polymera Chain Reaction

Ds DNA: Double strand Deoxyribonucleic acid

ss DNA: single strand Deoxyribonucleic acid

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cơ chế sinh bệnh của MDV 8

Hình 2.2 Gà bị liệt 9

Hình 2.3 Trên da có nhiều khối u 9

Hình 2.4 Con ngươi bị hẹp méo mó, mống mắt đổi màu (a), mắt gà bình thường (b)

10

Hình 2.5 Dây thần kinh sưng to 11

Hình 2.6 Gan có nhiều khối u 12

Hình 2.7 Nguyên tắc của PCR 17

Hình 3.1 Cách chọn lông cánh 24

Hình 3.2 Gan có khối u 24

Hình 3.3 Lách sưng, có khối u 25

Hình 3.4 Dạ dày tuyến sưng to, xuất huyết 25

Hình 3.5 Đường tiêm túi lòng đỏ 28

Hình 3.6 (a) sát trùng buồng hơi; (b) tiêm huyễn dịch 28

Hình 3.7 Cắt vỏ trứng và hút nước trứng 29

Hình 4.1 Kết quả chạy PCR .34

Hình 4.2 Màng CAM khi thu hoạch trứng 35

Hình 4.3 Lympho lan tràn khắp nơi trong mô gan 38

Hình 4.4 Lmpho xâm nhập trong các múi tuyến của dạ dày tuyến 37

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Phân biệt bệnh Marek và Lymphoid Leukosis 14

Bảng 3.1 Bảng bố trí các phương pháp khảo sát 23

Bảng 3.2 Số các cơ quan thực hiện cắt mẫu vi thể 30

Bảng 4.1 Kết quả xác định bệnh Marek bằng kỹ thuật PCR 33

Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra MDV từ nước trứng bằng kỹ thuật PCR 35

Bảng 4.3 Kết quả bệnh tích vi thể 36

Bảng 4.4 Đánh giá các kỹ thuật dùng trong chẩn đoán MD 38

Chương 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cùng với sự phát triển của nền kinh tế đất nước, ngành chăn nuôi nói chung và ngành chăn nuôi gia cầm nói riêng đã có những bước tiến đáng kể Chúng góp phần cung cấp một khối lượng lớn thịt, trứng cho nhu cầu sinh hoạt ngày càng tăng của con người Đó là nguồn thực phẩm vô cùng bổ dưỡng làm tăng chất lượng bữa ăn cho gia đình

Để thỏa mãn nhu cầu thịt, trứng gia cầm ngày càng cao, ngành chăn nuôi gia cầm theo hướng công nghiệp hóa đang trên đà phát triển Tuy nhiên, việc phát triển đàn một cách nhanh chóng đã làm tăng nguy cơ lây lan và thậm chí phát sinh nhiều dịch bệnh nguy hiểm gây thiệt hại lớn cho nhà chăn nuôi Hiện nay, tình hình dịch bệnh hết sức phức tạp Trong đó, một trong những bệnh gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi gia cầm là bệnh Marek

Bệnh Marek được phát hiện từ năm 1907, là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của gà do virus thuộc nhóm Herpes gây nên Với các triệu chứng lâm sàng như gầy ốm, mặt mồng tái, đi lại khó khăn, cánh liệt sã xuống một bên hoặc hai bên, viêm mống mắt dẫn đến mù, liệt chân

Bệnh Marek gây chết, làm giảm hiệu quả sử dụng thức ăn, tăng tỉ lệ loại thải, giảm chất lượng quầy thịt, giảm sản lượng trứng, tăng chi phí thuốc thú y, do đó làm giảm hiệu quả chăn nuôi

Vì thế, việc phải chẩn đoán bệnh Marek nhanh và chính xác nhằm kiểm soát, khống chế bệnh có hiệu quả và giảm thiệt hại do MDV gây ra là nhu cầu rất cần thiết trong thực tế sản xuất

Xuất phát từ vấn đề trên, được sự đồng ý của Khoa Chăn nuôi Thú Y – Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và dưới sự hướng dẫn tận tình của ThS

Nguyễn Thị Thu Năm, chúng tôi thực hiện đề tài “Chẩn đoán bệnh Marek trên gà đẻ

thương phẩm, gà ta chăn nuôi theo phương thức công nghiệp bằng kỹ thuật PCR, nuôi cấy phân lập trên phôi trứng và bệnh tích vi thể”

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Chẩn đoán bệnh Marek trên gà đẻ thương phẩm, gà ta chăn nuôi theo phương thức công nghiệp giúp người chăn nuôi tìm được nguyên nhân gây bệnh, từ đó làm giảm thiệt hại kinh tế và có biện pháp phòng bệnh tốt hơn, cũng như trao dồi kinh nghiệm cho bản thân

1.2.2 Yêu cầu

Lấy mẫu thực hiện phản ứng PCR xác định hiện diện của virus Marek

Lấy mẫu nuôi cấy virus gây bệnh Marek trên phôi trứng 4 – 5 ngày tuổi

Thực hiện cắt vi thể nhằm xác định tỷ lệ xuất hiện bệnh tích nghi bệnh Marek trêncác cơ quan

Đánh giá kết quả chẩn đoán bệnh Marek từ 3 phương pháp trên

Chương 2

TỔNG QUAN 2.1 Lịch sử bệnh

Bệnh Marek là bệnh u lympho ở gà với sự xâm nhiễm và tăng sinh cao độ tế bào lympho và sự hủy myelin của tế bào ngoại biên, từ đó gây rối loạn cơ năng vận động làm bại liệt (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010)

Năm 1907, Jozef Marek là nhà nghiên cứu người Hungary lần đầu tiên mô tả hiện tượng bại liệt trên gà cùng những bệnh tích vi thể ở não, tủy sống và thần kinh ngoại biên và gọi là “polyneuritis” (viêm dây thần kinh ngoại biên)

Tính đa dạng về bệnh lâm sàng của bệnh Marek, sự kết hợp triệu chứng bại liệt

và xuất hiện những khối u lympho…khiến nó được gọi dưới nhiều tên khác nhau như: viêm đa dây thần kinh, viêm thần kinh tủy, ung thư thần kinh…và trong thời gian dài

đã lầm lẫn nó với bệnh Leucose do Retrovirus gây nên Trên cơ sở dịch tễ học mô tả,

năm 1961, Biggs đề nghị tên gọi “bệnh Marek” (Marek’s disease) để phân biệt với tăng sinh các tế bào lympho khác

Mãi đến năm 1967, Churchill mới phân lập được virus gây bệnh Một số đặc điểm của virus cho phép hiểu rõ hơn về mặt dịch tễ học của bệnh

Năm 1970 - 1971, vaccin Marek đầu tiên ra đời ở Mỹ từ một loại virus Herpese trên gà tây Đây là sự kiện lịch sử quan trọng trong lịch sử y học – một loại vaccin được dùng để phòng bệnh ung thư

Riêng ở nước ta, trước năm 1975, người ta ghi nhận những biểu hiện trên gà tại một số trại chăn nuôi ở miền Nam Sau đó Nguyễn Văn Hanh (1978 – 1988), Lê Thanh Hòa (1982), Hồ Đình Chúc (1983) nghiên cứu bệnh Marek… Virus Marek đã được Hồ Đình Chúc phân lập và giám định (Trần Thanh Phong, 1996)

2.2 Căn bệnh

2.2.1 Phân loại và hình thái

Năm 1967, Biggs và Churchill đã xác định Marek là do một loại Herpese virus type B gây ra Đến 1969 thì Cook và sau đó là Glasser và cộng sự đã chứng minh virus

có cấu tạo AND, có vỏ bọc hình khối lục giác 6 cạnh với 162 capsul Tóm tắt phân loại của MDV như sau:

Về gen và cấu kháng nguyên của virus

Gen có liên quan đến sinh khối u: pp38 (38 kD) hiện diện trong các dòng

tế bào và các khối u có mặt ở cả 3 serotype và meq (Marek’ EcoQ) 40kD chỉ có mặt ở serotype 1

Gen glycoprotein gồm gen C mã hóa cho kháng nguyên A kích thích sự sản xuất kháng thể kết tủa khuếch tán trên thạch và gen B mã hóa cho kháng nguyên B làm tăng miễn dịch bảo vệ

Kháng nguyên MATSA (Marek’s disease turmor – associated surface antigent) là kháng nguyên bề mặt có liên quan đến khối u ở bệnh Marek, thấy xuất hiện trên những tế bào T bị biến đổi

Những kháng nguyên này tồn tại không chỉ ở trong bản thân virus mà còn tồi tại

ở những tế bào sống chứa virus Marek (Marek’s Disease Virus – MDV)

(Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010)

2.2.3 Sức đề kháng

MDV không có vỏ bọc tức virus chưa hoàn chỉnh do đó có sức đề kháng kém Chúng bị tiêu diệt ở môi trường pH nhỏ hơn 5,5 hoặc lớn hơn 8,4, và ở 56 0C chúng chết trong vài giây

MDV có vỏ bọc tức virus trưởng thành được thải ra với tế bào biểu bì nang lông

có sức đề kháng cao dưới tác động bất lợi của các yếu tố lý hóa… Trong chuồng trại chúng tồn tại 19 – 44 ngày, trong tế bào nang lông đã thoát ra khỏi cơ thể chúng tiếp tục sống 28 – 42 ngày, trong chất độn chuồng MDV tồn tại 28 – 112 ngày và nếu ở nhiệt độ chuồng 25 0C, độ ẩm 65 – 75 % chúng tồn tại trên 8 tháng, trong điều kiện pH

= 3 hoặc pH = 11 virus Marek bị bất hoạt trong thời gian 10 phút, ở 4 0C trong 2 tuần,

MDV được nuôi cấy tốt trên nhiều môi trường tế bào, đặc biệt là môi trường tế bào thận gà một lớp Sau khi nuôi cấy 4 – 5 ngày hình thành bệnh tích đặc hiệu (CPE –

Cytopathogen Effect) tế bào bị tác động vón lại thành từng đám nhỏ gọi là syncytium

có hai hay nhiều nhân Tạo những plaque có đường kính < 1mm và những thể bao hàm trong nhân (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010)

2.2.5 Khả năng gây bệnh

Khả năng gây bệnh khác nhau tùy chủng, vị trí địa lý phân lập được virus Một

số MDV có độc lực cao luôn gây bệnh Marek ác tính, số khác có động lực trung bình chỉ gây bệnh Marek mãn tính Ngoài ra có một số độc lực yếu không có khả năng gây bệnh, được dùng để điều chế vaccine (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010)

3 – 6 tuần tuổi (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010)

2.3.2 Chất chứa căn bệnh

MDV tồn tại trong tế bào nang lông và sống dai hơn virus trong chất bài tiết của

gà bệnh (Lê Hồng Mận, Trần Công Xuân, Lưu Kỷ và Phùng Đức Tiến, 1999) Sự phát tán những tế bào này trong không khí làm lây lan bệnh Virus cũng được thải qua phân, chất độn chuồng Không thấy virus truyền qua phôi trứng Não, gan, lách, dây thần kinh là nơi chứa virus nhiều nhất

2.3.3 Đường xâm nhập

Bệnh lây lan trực tiếp hoặc gián tiếp, con đường lây lan thông thường là đường

hô hấp và cũng là con đường nguy hiểm nhất Virus trong nang lông phát tán trong không khí theo các tế bào nang lông hoặc do sự tiếp xúc giữa gà bệnh và gà khỏe, giữa

gà và các phương tiện, dụng cụ trong chăn nuôi, kể cả con người Virus từ không khí nhiễm vào nước, thức ăn, dụng cụ chăn nuôi, bụi…từ đó xâm nhập vào cơ thể gây bệnh cho gà qua tiêu hóa hay hô hấp (Phan Đức Thắng, 2007)

2.3.4 Cơ chế sinh bệnh (Trần Thanh Phong, 1996)

Sauk hi gà hít phải bụi bẩn có lẫn nang lông chứa virus, virus Marek sẽ định vị tại đường hô hấp Sau vài ngày, virus sẽ được bạch cầu trong hệ thống hô hấp tiếp nhận

và vận chuyển đến lách, tuyến ức và túi Fabricius Tại đây, virus sẽ gây nhiễm và phá hủy tế bào lympho B, làm cho lách sưng, túi Fabricius sưng hoặc teo

Vào ngày thứ 5, do việc nhiễm, tế bào lympho B bị phá hủy, hệ miễn dịch của

gà bắt đầu nhận ra và phản ứng chống lại virus, điều này lại làm chậm sự tấn công lan rộng của virus

Từ ngày 5 – 7, nhiều tế bào lympho T được sản sinh để đối phó, nhưng chính nó lại là tế bào đích của virus này và bị nhiễm virus một cách từ từ và dần trở thành tế bào ung thư chứa virus

Từ ngày 7 – 14, qua đường máu các bạch cầu bị nhiễm virus sẽ đến các cơ quan khác, đặc biệt là tại tế bào nang lông, tế bào thượng bì (da) Nó phân chia và hình thành những virion gây nhiễm đủ sức truyền lây bệnh cho những gà khác

Sau ngày 14, sự suy giảm miễn dịch thường xuyên bắt đầu xuất hiện Sự phân hủy tế bào T và B xảy ra nặng nề hơn

Tuần thứ 4 – 5 sau khi bị nhiễm, những tế bào lympho xâm nhập thần kinh gây bại liệt

Tuần 5 – 6 sau khi nhiễm, gà bắt đầu hình thành khối u do sự biến đổi nhanh chóng của tế bào lymppho T thành tế bào ung thư

Thể thần kinh: Theo Lê Văn Năm (2003) thì tác giả thường quan sát thấy các

biểu hiện của thần kinh ngoại biên nhiều hơn là thần kinh trung ương Đó là gà bị liệt hoặc bán bại liệt Lúc đầu thì gà đi lặc nhẹ, ngón chân chụm lại với nhau, gà sã một trong hai cánh, sau đó nặng dần lên và liệt hoặc bán liệt Gà đi không cân đối loạng choạng thất thểu, lúc ngã bên này lúc ngã bên kia Khi bệnh nặng chân gà có thể bị liệt hoàn toàn, gà nằm với tư thế rất điển hình: một chân duỗi thẳng căng ra phía trước, chân còn lại duỗi căng ra phía sau, bàn chân sau ngửa hẳn lên trời Liệt cánh một hoặc hai bên

Hình 2.2 Gà bị liệt

(http://gatredatviet.com/showthread.php?422-B%E1%BB%87nh-Marek)

Thông thường gà liệt hay bán liệt vẫn ăn uống bình thường Song vì không có khả năng tự tìm kiếm thức ăn, nước uống nên chúng cứ gầy dần và chết vì đói và khát hoặc bị những con khát chèn đạp đến chết Một số khác cũng vì lí do trên sinh bệnh thứ phát và cũng chết vì bệnh thứ phát

Thể da, mắt: Một số gà chết hoặc chưa chết, quan sát kỹ da và sờ vào chân

lông đùi, hai bên cánh, bụng sẽ thấy các nốt thịt thừa có độ lớn khác nhau, kích thước

từ hạt kê đến hạt đỗ hoặc sau khi vặt lông ta còn thấy những lỗ chân lông nổi cộm lên như các nốt thịt thừa bám chặt vào da ở đùi, bụng, ngực, vai, cánh…những nốt thịt thừa đó là những khối u da của bệnh Marek

Hình 2.3 Trên da có nhiều khối u

(http://agriviet.com/nd/2788-benh-marek/)

Ngoài những biến đổi ở da, còn thấy một số ít gà có những biểu hiện ở mắt Con ngươi bị hẹp lại hoặc biến dạng một trong hai mắt, ít khi cả hai mắt Con ngươi mắt có hình lá, hình sao, tam – tứ giác hoặc nhiều góc cạnh Theo Biggs và Payner thì thể mắt xảy ra ở gà lớn tuổi, thường là trên 134 ngày tuổi Bình thường, mống mắt có màu da cam, đồng tử tròn to, ở gà con thì mống mắt có màu đen Khi bị bệnh thần kinh, thị giác mắt bị tổn thương không hoàn thành chức năng điều tiết dẫn đến đồng tử mắt bị biến đổi hay bị sưng, thủy tinh thể đục lại, mống mắt chuyển sang màu vàng lưu huỳnh

và bị biến dạng hình sao, có thể bị mù

Bệnh ở thể dạng này thì ít gây chết (Lê Văn Năm, 2003)

Hình 2.4 Con ngươi bị hẹp méo mó, mống mắt đổi màu (a), mắt gà bình thường (b)

(http://www.aquabird.com.vn/forum/showthread.php?t=80377&page=1 (a);

http://chovietvn.com/thu-nuoi-cay-canh/33948-ha-noi-hcm-ga-tre-choi-nuoc-gia - 300k.html (b))

2.4.2 Thể cấp tính

Bệnh Marek cấp tính thường biểu hiện chủ yếu ở trạng thái ức chế và thần kinh ngoại biên Tỷ lệ chết cao từ 10 – 30 %, có khi lên tới 70 % (OIE Terestrial Mannual 2010) Tất cả gà ốm và chết do bệnh Marek cấp tính đều có khối u nội tạng Gà bị bệnh

có biểu hiện lâm sàng sớm: 1,5 – 5 tháng tuổi đối với gà hướng thịt và 2 – 2,5 tháng

tuổi đối với gà hướng trứng Gà ít có triệu chứng bệnh điển hình, gà thường chết đột ngột, gà suy yếu, liệt rồi chết Gà chết nhiều lúc trước và sau khi đẻ vài ba tuần Khả năng đẻ và tỉ lệ trứng giảm sút ghê gớm Nhiều khi hiện tượng giảm đẻ là hiện tượng đáng chú ý nhất của bệnh (Lê Văn Năm, 2003)

2.5 Bệnh tích đại thể

2.5.1 Thể mãn tính

Viêm tăng sinh dây thần kinh ngoại biên, dây thần kinh đùi, hông – chậu, cánh… sưng to gấp 4 – 5 lần, mất vân óng ánh, có màu trắng đục và dễ đứt Mống mắt viêm, đổi màu, con ngươi biến dạng Khối u trên các cơ quan nội tạng, da và cơ (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010)

Hình 2.5 Dây thần kinh sưng to

Những khối u trên da đóng vai trò quan trọng trong việc lây truyền bệnh Marek

Vì chân lông nơi có nhiều khối u đặc biệt là các tế bào hóa sừng chứa rất nhiều virus hoàn chỉnh có khả năng gây bệnh

Hình 2.6 Gan có nhiều khối u

(http://www.biopharmachemie.com/vi/technical/benh-marek-tren-ga-de-va-ga-thit-109)

2.6 Bệnh tích vi thể

Dạng A: Thường đặc trưng cho thể Marek cấp tính Thành phần khối u chủ yếu

là sự tăng sinh của các tế bào bạch huyết, tế bào nguyên thủy, tế bào lưới hoạt động và lympho bào Tế bào lympho có dạng to, nhỏ, trung bình

Dạng B: Thường đặc trưng cho thể Marek mãn tính Gây viêm dây thần kinh, phù, tăng sinh cao độ các tế bào lympho, tập trung ở mức độ vừa và nhẹ của tương bào

và tế bào lympho dạng nhỏ

Dạng C: Là loại bệnh tích nhẹ của thể bệnh ẩn không có triệu chứng lâm sàng

Xuất hiện những vùng biến đổi nhỏ và phân tán, tập trung các tế bào lympho non và

tương bào

Dạng bệnh tích A và B phá hủy myelin của thần kinh dẫn đến bại liệt

(Lê Văn Năm, 2003)

2.7 Chẩn đoán

2.7.1 Chẩn đoán lâm sàng

Dựa vào các triệu chứng điển hình của bệnh Marek như: các triệu chứng thần kinh liệt hoặc bán liệt với sự có mặt của các khối u nội tạng, u da, và biến đổi ở mắt, các trạng thái thuộc triệu chứng ức chế: xù lông, sệ cánh, gầy tọp, teo cơ và chết trong khi gà vẫn ăn uống bình thường Cần chú ý hiện tượng liệt cũng có thể xuất hiện ở nhiều bệnh khác song ở đây liệt xuất hiện từ từ và trở nên cố định Bên cạnh đó, chúng

ta cần kết hợp với việc mổ khám để xác định các bệnh tích đại thể cũng như vi thể

2.7.2 Chẩn đoán cận lâm sàng

Những khối u, dây thần kinh đùi, mắt gà bị bệnh…được phân lập trên môi trường tế bào một lớp (tế bào thận gà, tế bào xơ phôi vịt) và phôi trứng gà 4 – 6 ngày tuổi là các phương pháp thường được sử dụng trong chẩn đoán bệnh Marek

Để chẩn đoán nhanh bệnh Marek, ngày nay người ta thường sử dụng phương pháp huyết thanh học Xác định kháng nguyên bằng PCR hoặc sử dụng kính hiển vi điện tử Xác định kháng thể bằng các phương pháp như: kết tủa khuếch tán trên thạch, miễn dịch huỳnh quang, ELISA hay phản ứng trung hòa (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010)

2.7.3 Chẩn đoán phân biệt

Theo Trần Thanh Phong, 1996, cần phân biệt bệnh Marek với:

o Bệnh Newcastle: Triệu chứng thần kinh thường đi kèm với gây bệnh tích đường hô hấp, đường tiêu hóa, không có khối u

o Bênh viêm não tủy truyền nhiễm: Triệu chứng thần kinh thường thấy trên

gà con và không có khối u

o Bệnh nấm phổi (Aspergillosis): Triệu chứng thần kinh với các u nấm ở đường hô hấp, ở não

o Bệnh độc thịt (Botulism): Sự bại liệt mềm, lan rộng khắp toàn thân gà

Gà không có khối u

o Bệnh Lymphoid Leukosis (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Phân biệt bệnh Marek và Lymphoid Leukosis

Triệu chứng Thường xuyên liệt Không

Bệnh tích đại thể

U ở da, cơ và dạ dày tuyến Có thể có Thường không có

Bệnh tích vi thể

Túi Fabracius U giữa nang hay teo các nang U bên trong nang

Tăng sinh bạch huyết ở da hay

Tế bào khối u

Tế bào bạch huyết đa dạng:

nguyên bào lympho, tế bào lympho lớn, vừa, nhỏ và những

tế bào lưới Hiếm khi chỉ có nguyên bào

Nguyên bào lympho

Loại của tế bào bạch huyết

(OIE Terestrial Mannual 2010)

2.8 Phòng bệnh

Căn nguyên của bệnh Marek là do virus, nên chưa có thuốc điều trị Do vậy, vấn

đề phòng bệnh cho đàn gà là giải pháp được đặt lên hàng đầu

- Dinh dưỡng:Thức ăn phải đầy đủ chất dinh dưỡng, tốt nhất là sử dụng thức ăn tổng hợp Nguồn nước và thức ăn phải luôn luôn giữ cho sạch

- Quản lý đàn thật tốt: Cần thực hiện chính sách cùng vào cùng ra

- Vệ sinh thú y: kiểm tra và vệ sinh trạm ấp, chuồng trại và các dụng cụ chăn nuôi, giữ vệ sinh cho gà 1 ngày tuổi, tăng độ thông thoáng cho chuồng nuôi

- Vaccine: sử dụng vaccine có hiệu quả phòng bệnh một liều duy nhất lúc 1 ngày tuổi

2.3 Giới thiệu phương pháp PCR

2.3.1 Giới thiệu

Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) được phát minh bởi K.Mullis và cộng sự vào năm 1985 Đây là một phương pháp dùng để khuếch đại một đoạn gen mong muốn lên hàng triệu lần trong thời gian ngắn nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh và y học nhằm phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các các sinh vật biến đổi gen, phát hiện nhanh các mầm bệnh ở mức độ thấp, là một phương tiện hữu ích trong việc sàng lọc bộ gen để phát hiện sự có mặt của một gen đích bất kỳ nào đó

Kỹ thuật PCR được ứng dụng để chẩn đoán một số bệnh di truyền, nhận dạng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene và phát hiện huyết thống (Tạ Thành Văn, 2010)

.2.3.2 Nguyên tắc chung

Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn mẫu điều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn

oligonucleotide ngắn dài khoản 20 – 30 base có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase Kỹ thuật PCR đòi hỏi chúng ta phải biết trình tự các đầu tận cùng của đoạn DNA cần khuếch đại, để tạo nên các olygonucleotide bổ sung chúng Đoạn mồi tác động lên sợi DNA theo chiều từ 3’ → 5’ gọi là mồi xuôi Đoạn mồi tác động theo chiều 5’ → 3’ gọi là mồi ngược

PCR là kỹ thuật khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (có thể từ 30 – 40 lần) gồm đun nóng (94 – 95 oC), làm nguội (45 – 60 oC),

và ủ dài ở 72 oC Trong dung dịch có các primer (thường có 2 primer) bắt cặp bổ sung

ở hai đầu mạch đơn tương ứng

2.3.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Một phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:

 Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ tăng lên 94 – 96 oC để làm biến tính

nucleic acid đích từ dạng sợi đôi (dsDNA) thành sợi đơn (ssDNA), dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới Thời gian 1 – 2 phút

 Giai đoạn bắt cặp: Lúc này nhiệt độ trong buồng ủ PCR hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của các mồi để các đoạn mồi (primer) bắt cặp theo nguyên tắc

bổ sung vào hai đầu của chuỗi nucleic acid đích, đây là giai đoạn quyết định nên tính đặc hiệu thì những sản phẩm PCR (PCR product) sẽ đặc hiệu Bước này gọi là gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn này thường dao động trong khoảng 45 – 60 oC tùy thuộc vào nhiệt

độ biến tính (Tm :Temperature melting) của các mồi sử dụng Thời gian 1 – 2 phút tùy thuộc vào kích thước của sản phẩm khuếch đại