KHẢO SÁT TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KHÁNG SINH HỌ TETRACYCLINE VÀ SỰ HIỆN DIỆN CỦA AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN GIA SÚC TẠI MỘT SỐ TRẠI CHĂN NUÔI HEO TRÊN ĐỊA BÀN TP.HCM

iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài: “ Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh họ tetracycline và sự hiện diện của aflatoxin trong thức ăn gia súc tại các trại chăn nuôi heo trên địa bàn Tp.. T

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y

**************

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KHÁNG SINH HỌ TETRACYCLINE VÀ SỰ HIỆN DIỆN CỦA AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN GIA SÚC TẠI MỘT SỐ TRẠI CHĂN NUÔI HEO TRÊN ĐỊA BÀN TP.HCM

Sinh viên thực hiện: LÂM THỊ KIM LOAN Lớp : DH08TA

Ngành : Chăn Nuôi Niên khoá : 2008-2012

THÁNG 08/2012

Khoá luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư

Ngành Công Nghệ Sản Xuất Thức Ăn

Giáo viên hướng dẫn

PGS.TS NGUYỄN VĂN KHANH

Th.S NGUYỄN LÊ KIỀU THƯ

THÁNG 08/2012

ii

LỜI CẢM TẠ

Con xin khắc ghi công ơn dưỡng dục của cha mẹ, xin cảm ơn cha mẹ và những người thân đã luôn ở bên con, động viên, khích lệ con trong suốt thời gian vừa qua

 Chân thành cảm ơn

Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm Tp.HCM, Ban chủ nhiệm khoa Chăn Nuôi-Thú Y cùng tất cả quý thầy cô trong khoa đã tận tình giảng dạy, hướng dẫn và truyền đạt cho tôi những kiến thức hữu ích trong thời gian học tập tại trường, tạo tiền đề cho tôi thực hiện khoá luận tốt nghiệp này

 Vô cùng nhớ ơn

PGS.TS Nguyễn Văn Khanh đã luôn quan tâm, đôn đốc và tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

 Chân thành cảm ơn

Ban lãnh đạo Trạm Chẩn Đoán Xét Nghiệm Điều Trị chi cục Thú Y thành phố

Hồ Chí Minh cùng các cô chú, anh chị và toàn thể cán bộ công nhân viên chức của Chi cục đã tiếp nhận, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài Đặc biệt, tôi xin chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Lê Kiều Thư đã luôn tận tình hướng dẫn và giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài: “ Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh họ tetracycline và sự hiện

diện của aflatoxin trong thức ăn gia súc tại các trại chăn nuôi heo trên địa bàn

Tp Hồ Chí Minh” được thực hiện tại Trạm Chẩn đoán – Xét nghiệm và Điều trị

thuộc Chi cục Thú Y Tp Hồ Chí Minh từ 02/2012 - 30/06/2012 Chúng tôi đã khảo sát 43 mẫu thức ăn chăn nuôi heo thịt của 34 cơ sở chăn nuôi thuộc địa bàn Tp Hồ Chí Minh bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC để phát hiện tình hình sử dụng kháng sinh họ tetracycline và sự hiện diện của aflatoxin Chúng tôi ghi nhận được kết quả như sau:

Tình hình sử dụng kháng sinh họ tetracyclin trong thức ăn chăn nuôi heo

- Có 17/34 (50%) cơ sở chăn nuôi khảo sát có sử dụng kháng sinh họ tetracyclin, 18/43 (41,86%) mẫu thức ăn gia súc chứa kháng sinh này với hàm lượng từ 1,96 - 74,6 ppm

- Có 3/43 mẫu vi phạm tiêu chuẩn Ngành về hàm lượng tối đa cho phép của các tetracyclin trong thức ăn hỗn hợp cho heo, chiếm tỉ lệ 6,98% số mẫu và 8,82%

số cơ sở chăn nuôi khảo sát Huyện Bình Chánh có tỷ lệ cơ sở chăn nuôi sử dụng và

vi phạm cao nhất là 33,33%

Tình hình nhiễm độc tố nấm mốc aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi heo thịt

- Trong 43 mẫu khảo sát có 40 mẫu dương tính biến động từ 2 - 157,03 ppb

- Có 2/43 (4,65%) mẫu chứa hàm lượng aflatoxin tổng số vượt ngưỡng cho phép của Bộ Nông nghiệp & Phát Triển Nông Thôn (100 ppb)

iv

MỤC LỤC

TRANG

TRANG TỰA i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT LUẬN VĂN iii

MỤC LỤC ivii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iviii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ x

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Kháng sinh 3

2.1.1 Sơ lược về kháng sinh 3

2.1.1.1 Khái niệm 3

2.1.1.2 Phân loại 3

2.1.1.3 Sự sử dụng kháng sinh 4

2.1.2 Kháng sinh trong chăn nuôi 5

2.1.2.1 Lợi ích của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi 5

2.1.2.2 Hậu quả việc lạm dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi 6

2.1.2.3 Tình hình sử dụng kháng sinh ở Việt Nam và một số nước 7

2.1.3 Kháng sinh họ tetracycline 9

2.1.3.1 Giới thiệu chung họ tetracycline 9

v

2.1.3.2 Cơ chế tác động 10

2.1.3.3 Dược động học 10

2.1.3.4 Phổ kháng khuẩn 11

2.1.3.5 Tác dụng 12

2.1.3.6 Tác dụng phụ - Độc tính 12

2.1.3.7 Lược duyệt một số công trình nghiên cứu về khảo sát hàm lượng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi 12

2.2 Độc tố nấm mốc aflatoxin 13

2.2.1 Lịch sử phát hiện aflatoxin (AF) 13

2.2.2 Các đặc điểm của aflatoxin 14

2.2.2.1 Cấu trúc hóa học của aflatoxin 14

2.2.2.2 Đặc điểm lý hóa 15

2.2.3 Sự hiện diện và điều kiện phát triển của Aflatoxin trong tự nhiên 16

2.2.3.1 Sự hiện diện của Aflatoxin 16

2.2.3.2 Điều kiện phát triển aflatoxin trong tự nhiên 16

2.2.4 Tác hại của độc tố Aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi 16

2.2.5 Quy định mức aflatoxin được phép trên thức ăn hỗn hợp cho gia súc 18

2.2.6 Một số phương pháp phân tích aflatoxin 19

2.2.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 20

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 22

3.1 Thời gian thực hiện 22

3.2 Địa điểm 22

3.3 Đối tượng khảo sát 22

3.4 Hóa chất- dụng cụ và thiết bị 22

3.4.1 Đối với quy trình phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline 22

3.4.2 Đối với quy trình phân tích aflatoxin 23

3.5 Nội dung và chỉ tiêu khảo sát 24

3.6 Phương pháp tiến hành 26

3.6.1 Thu thập mẫu 26

vi

3.6.2 Quy trình phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline: 27

3.6.3 Quy trình phân tích aflatoxin trong thức ăn 30

3.7 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Tình hình sử dụng kháng sinh họ tetracycline trong thức ăn chăn nuôi heo thịt 34 4.1.1 Tình hình sử dụng các tetracycline 34

4.1.2 Hàm lượng kháng sinh họ tetracycline trong các mẫu thức ăn dương tính 36

4.2 Tình hình nhiễm aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi cho heo thịt 41

4.2.1 Tỷ lệ phát hiện các loại AF trên tổng số mẫu phân tích 41

4.2.2 Mức độ nhiễm giữa các aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp cho heo thịt 42

4.2.3 Mức nhiễm AF tổng số theo dạng thức ăn 43

4.2.4 Hàm lượng aflatoxin trong các mẫu vi phạm 45

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 51

vii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chú Giải

EDTA Ethylene Diamine triacetic Acid

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

HPLC High Performance Liquid Chromatograpphy NN&PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn

OTC Oxytetracycline

TĂCN Thức ăn chăn nuôi

TC Tetracycline

Tp HCM Thành phố Hồ Chí Minh

SPE Solid Phase Extraction (cột chiết pha rắn)

UV-VIS Utra- violet/visible (Quang phổ tử ngoại khả kiến) VSTP Vệ sinh thực phẩm

WHO World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

x

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

TRANG

Sơ đồ 3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu được công bố bởi Bộ NN&PTNT……… 28

Sơ đồ 3.2 Quy trình ly trích aflatoxin……… 30

Sơ đồ 3.3 Tạo dẫn xuất aflatoxin……… 32

xi

ăn gia súc phát triển Tuy nhiên, các nhà sản xuất thức ăn cũng như người chăn nuôi

có thể lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp các chất kích thích sinh trưởng như kháng sinh hoặc các nguyên liệu kém chất lượng có chứa độc tố nấm mốc Kháng sinh họ tetracycline là một trong những kháng sinh được ưa dùng trong chăn nuôi heo vì ngoài phổ kháng khuẩn rộng, an toàn, phổ biến, giá rẻ và dễ sử dụng, chúng còn kích thích tăng trưởng cho đàn heo Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh thường không hợp lý nên hàm lượng kháng sinh vượt ngưỡng cho phép nhiều lần gây tích lũy trong các sản phẩm thịt, mỡ, sữa của động vật và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người

Thêm vào đó, việc chọn nguyên liệu chế biến và bảo quản thức ăn gia súc không đạt yêu cầu làm cho nấm mốc và độc tố nấm mốc trong thức ăn chăn nuôi có ảnh hưởng rất lớn đến năng suất vật nuôi Nấm mốc phát triển trong thức ăn chăn nuôi không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn mà còn sản sinh ra các độc tố nguy hiểm nhất là Aflatoxin Aflatoxin không chỉ gây nhiễm độc, làm rối loạn chức năng, suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận mà còn gây đột biến gen tạo ra ung thư và quái thai trên động vật Chính vì vậy, việc kiểm soát hàm lượng chất kháng sinh và sự hiện diện độc tố aflatoxin trong thức ăn gia súc là rất quan trọng và cần thiết để đảm bảo chất lượng sản phẩm đạt yêu cầu vệ sinh và an toàn cho gia súc và cả cho con người

2

Được sự đồng ý của Bộ môn Bệnh Lý – Ký Sinh, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và Ban lãnh đạo Trạm Chẩn Đoán - Xét Nghiệm và Điều Trị, Chi Cục Thú Y Tp HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Văn Khanh và Th.S Nguyễn Lê Kiều Thư, chúng tôi tiến hành

thực hiện đề tài “ Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh họ tetracyclin và sự

hiện diện của aflatoxin trong thức ăn gia súc tại một số trại chăn nuôi heo trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh”

1.2.2 Yêu cầu

- Lấy mẫu thức ăn tại các cơ sở chăn nuôi heo trên địa bàn TP HCM

- Phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline và phát hiện độc tố nấm mốc aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp cho heo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

3

Chương 2 TỔNG QUAN

Theo quan niệm mới ngày nay, thuốc kháng sinh là tất cả những chất hoá học, không kể nguồn gốc (chiết xuất từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật, bán tổng hợp hay tổng hợp) có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn (bacteriostatic) hoặc tiêu diệt vi khuẩn (bactericidal) bằng cách tác động chuyên biệt trên một giai đoạn chuyển hoá cần thiết của vi sinh vật Với định nghĩa này, nhiều thuốc trước đây xếp vào loại chất kháng khuẩn tổng hợp (như sulfamid, quinolone) bây giờ cùng được xếp vào loại kháng sinh (Võ Thị Trà An, 2007)

2.1.1.2 Phân loại

Theo Võ Thị Trà An (2007), có 3 cách phân loại kháng sinh được dùng phổ biến hiện nay:

Phân loại theo cấu trúc hoá học

- Nhóm beta-Lactam: penicillin, ampicillin, amoxycillin, cephalosporin…

- Nhóm aminoglycosid: streptomycin, gentamycin, kanamycin, neomycin…

- Nhóm polypeptid: colistin, bacitracin, polymyxin…

- Nhóm tetracycline: tetracycline, oxytetracycline, chlortetracycline, doxycycline…

4

- Nhóm phenicol: chloramphenicol, thiamphenicol…

- Nhóm macrolide: erythromycin, spiramycin, tylosin…

- Nhóm kháng sinh gần gũi với macrolide: lincomycin, virginiamycin…

- Nhóm sulfamid: Sulfadimidin, sulfaguanidin, sulfacetamid, sulfamethoxazol…

- Nhóm diaminopyrimidin: trimethoprim, diaveridin…

- Nhóm quinolone: acid nalidixic, flumequin, norfloxacin…

- Nhóm nitrofuran: nitrofurazol, furazolidon, furaltadon…

- Các nhóm khác: glycopeptid, pleuromutilin, polyether ionophore…

Phân loại theo cơ chế tác động

- Kháng sinh tác động lên thành tế bào vi khuẩn: vancomycin, bacitracin, penicillin,…

- Kháng sinh tác động lên màng tế bào chất: nhóm polypeptid (colistin, polymycin) và polyens (chất kháng nấm)

- Kháng sinh tác động lên quá trình tổng hợp acid nucleic: nhóm quinolon, nhóm sulfamid,…

- Kháng sinh tác động lên quá trình tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn: nhóm aminosid, nhóm tetracycline, nhóm macrolide

Phân loại theo tác động kháng khuẩn

- Nhóm kháng sinh kìm khuẩn: tetracycline, macrolid, phenicol

- Nhóm kháng sinh sát khuẩn: sulfamid, diaminopyrimidin, aminosid, polypeptide

- Cơ địa của thú (thú có mang, thú non, thú bệnh gan thận…)

- Chi phí của việc điều trị, đi kèm với hiệu quả điều trị và giá trị kinh tế

Phối hợp kháng sinh

Để cho việc điều trị có hiệu quả thì đôi khi người ta còn phối hợp kháng sinh nhằm mở rộng phổ kháng khuẩn, tăng cường tác động diệt khuẩn và ngăn ngừa sự phát sinh các chủng đề kháng

Phối hợp kháng sinh cũng có những bất lợi như tăng độc tính đối với cơ thể, hao tốn chi phí mà hiệu quả không tăng Phối hợp làm tăng phổ kháng khuẩn cũng dẫn đến nguy cơ làm mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, dùng nhiều kháng sinh trong một liệu pháp cũng tăng nguy cơ chọn lọc vi khuẩn đề kháng với một hay nhiều kháng sinh (Võ Thị Trà An, 2007)

2.1.2 Kháng sinh trong chăn nuôi

2.1.2.1 Lợi ích của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi

Trong chăn nuôi, kháng sinh được sử dụng với 3 mục đích: điều trị bệnh, phòng bệnh và dùng như chất kích thích sinh trưởng Tuỳ theo mục đích sử dụng

mà liều lượng và phương thức sử dụng kháng sinh có khác nhau Có nhiều ý kiến khác nhau về lợi ích của việc sử dụng kháng sinh bổ sung trong thức ăn như chất kích thích sinh trưởng, nhưng tựu chung lại những lợi ích chính như sau:

- Tăng năng suất sinh trưởng và sinh sản ở gia súc, gia cầm

- Tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, làm cho vật nuôi thích ứng nhanh chóng với

sự thay đổi bất thường về cơ cấu và chủng loại nguyên liệu trong khẩu phần ăn

- Nâng cao chất lượng sản phẩm (giảm tỷ lệ thịt mỡ, tăng tỷ lệ thịt nạc, làm cho thịt trở nên mềm hơn và không nhiễm mầm bệnh)

6

- Phòng các bệnh mãn tính và ngăn chặn những dịch bệnh do vi trùng gây ra

- Tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi.(trích dẫn Trần Quốc Việt, 2006)

2.1.2.2 Hậu quả việc lạm dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi

Vi khuẩn gây bệnh tiếp xúc thường xuyên với kháng sinh liều thấp sẽ tạo thích ứng Một số biến chủng thay đổi cấu trúc DNA để chống lại kháng sinh, dần dần, chúng biến kháng sinh thành yếu tố cần thiết để tránh sự tấn công của vi khuẩn khác

- Đối với vật nuôi và con người: gây rối loạn tiêu hóa, cơ thể mất đi sức đề kháng bản thân, sức chống chọi với bệnh tật ngày càng yếu Sử dụng kháng sinh thời gian dài làm tăng hiện tượng kháng kháng sinh, làm cho việc điều trị bệnh không còn hiệu quả

- Đối với chất lượng sản phẩm chăn nuôi: vật nuôi ăn thức ăn bị nhiễm kháng sinh trong thời gian dài sẽ để lại lượng tồn dư kháng sinh trong sữa, gây ức chế vi khuẩn sử dụng trong chế biến các sản phẩm từ sữa như phomat, sữa chua…

- Đối với môi trường: kháng sinh do vật nuôi đào thải ra ngoài môi trường trong thời gian dài, gây ảnh hưởng có hại đến môi trường sống, phá vỡ hệ sinh thái

vi sinh vật đất, sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường…

Hiện nay, việc bổ sung kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ở nước ta khá phổ biến và được nhà nước cho phép trong khuôn khổ Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về hàm lượng kháng sinh, hóa dược, vi sinh vật và kim loại nặng tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho heo mà Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn ban hành tháng 12/2009 (QCVN 01-12:2009/BNNPTNT)

7

Bảng 2.1 Hàm lượng kháng sinh, hóa dược tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp

hoàn chỉnh cho heo

(Nguồn: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia, “Thức ăn chăn nuôi- Hàm lượng kháng sinh,

hóa dược, vi sinh vật và kim loại nặng tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho heo”, Hà Nội, 2009)

2.1.2.3 Tình hình sử dụng kháng sinh ở Việt Nam và một số nước

Ngoài các kháng sinh bị cấm sử dụng ở Việt Nam thì hầu như tất cả các loại kháng sinh được phép sử dụng theo quy định của Bộ Nông Nghiệp đều có mặt trên thị trường thú y Theo danh mục các sản phẩm thuốc thú y được phép lưu hành tại Việt Nam (Bộ Nông Nghiệp & Phát triển Nông Thôn, 2009) thì cả nước có 85 công

ty sản xuất thuốc thú y trong đó có 37 công ty tại Tp HCM và các tỉnh lân cận Chưa kể còn có hàng chục công ty được phép đóng gói và phân phối thuốc trên thị trường Về nhập khẩu thuốc và nguyên liệu làm thuốc có 32 nước trên thế giới tham

8

gia nhập khẩu thuốc vào thị trường Việt Nam Kháng sinh chiếm từ 70 - 75% số lượng các sản phẩm thuốc thú y Các loại kháng sinh đa dạng về mẫu mã, chủng loại (Võ Thị Trà An, 2001)

Theo Jone và Richke (2003), ở Mỹ có 32 loại kháng sinh và biệt dược được phép sử dụng trong thức ăn gia cầm, trong đó 15 loại thuốc phòng cầu trùng, 11 loại dùng như chất kích thích sinh trưởng và 6 loại được dùng cho các mục đích khác Trong số 32 loại kháng sinh này có 7 loại (bacitracin, chlortetracycline, erythromycin, lincomycin, novobiocin, oxytetracycline và penicillin) được dùng trong dân y

Theo số liệu của viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi ở Mỹ năm 1999 là khoảng 20,42 triệu lbs (9270 tấn), trong đó kháng sinh nhóm Ionophore và arsen chiếm nhiều nhất (47,5%), tetracycline (15,67%); penicillin (4,26%) và các loại khác (32,57%) Trong số 20,42 triệu lbs, có khoảng 2,8 triệu lbs (13,7%) được dùng như chất kích thích sinh trưởng

Theo số liệu của Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong dân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10500 tấn (qui theo mức 100% tinh khiết của các thành phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong dân y, 33% trong điều trị thú y và 15% như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi Trong đó, tỷ lệ các loại kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi: penicillin: 9%; tetracycline: 66%; macrolide: 12%; aminoglycoside: 4%; fluoroquinolone: 1% và các kháng sinh khác: 6% (trích dẫn Trần Quốc Việt, 2006)

9

2.1.3 Kháng sinh họ tetracycline

2.1.3.1 Giới thiệu chung họ tetracycline

Tetracycline được chiết xuất từ Streptomyces aureofaciens năm 1948, dẫn

xuất đầu tiên được tìm thấy là chlortetracycline (aureomycin), 2 năm sau tìm được oxytetracycline (tetramycin) Đến năm 1952 tổng hợp được tetracycline Những năm sau doxycyclin, minocyclin, metacyclin, amycyclin là các chất bán tổng hợp được tìm ra Năm 2005, sau 20 năm nghiên cứu, thử nghiệm và đăng ký, tigecyclin

đã được đưa vào sử dụng trong lâm sàng (Võ Thị Trà An, 2007)

Các kháng sinh họ tetracycline có cấu trúc cơ bản giống nhau gồm 4 vòng 6 cạnh, chúng khác nhau ở gốc R

10

2.1.3.2 Cơ chế tác động

Các kháng sinh họ tetracycline kết dính với tiểu thể 30S của ribosome sau khi

đi qua màng tế bào của vi khuẩn Sự kết dính dẫn đến ngăn cản ARN-t gắn vào ARN-m, cuối cùng acid amin không được phóng thích tại ribosome, do vậy sự tổng hợp protein bị ức chế

Sự đề kháng thu nhận của các tetracyclin xảy ra phổ biến ở các vi khuẩn gram

âm và gram dương và Mycoplasma, làm giảm đi sự hữu dụng của nhóm này, cơ chế

Ngoài ra, việc hấp thu các tetracycline bị ảnh hưởng rất nhiều bởi sự hiện diện của thức ăn trừ minocycline và doxycycline Các yếu tố làm giảm hấp thu của thuốc

ở ruột như pH kiềm, các ion kim loại hoá trị II và III Gốc phosphat làm tăng sự hấp thu

Vào máu, các tetracycline gắn với các protein huyết tương và được phân phối tốt ở các mô, đặc biệt có khả năng thâm nhập vào bên trong tế bào nhưng kém vào dịch não tủy và dịch khớp

Qua nhau thai và hiện diện trong sữa

Tích trữ ở gan, tỳ tạng, xương và răng

11

Thời gian bán hủy chủ yếu qua đường tiểu, ngoại trừ doxycycline được thải qua mật Các tetracycline có đi qua chu kỳ gan ruột

Tetracycline tăng hiệu lực chống đông của các thuốc vitamin K

Bảng 2.2 Một số chỉ tiêu dược lý của các kháng sinh họ tetracycline

(Nguồn: http://www.benhhoc.com/post/1539/)

2.1.3.4 Phổ kháng khuẩn

Các kháng sinh họ tetracyclin có phổ kháng khuẩn rất rộng, bao gồm nhiều vi

khuẩn gram dương, gram âm và trên một số nấm nội bào như: Chlamydia,

Mycoplasma, Rickettsia…Tuy nhiên, do mức đề kháng của nhiều loại vi khuẩn như

: Streptococcus, Staphylococcus, Pseudomonas, E.coli…nên các tetracyclin không

còn được sử dụng trong điều trị nhiễm trùng do các vi khuẩn vừa kể trên

Minocyclin được xem là chất có hiệu lực mạnh nhất, kế đến là doxycyclin, hiệu lực yếu nhất là tetracyclin và oxytetracyclin

Kháng sinh nhóm này tác động trên vi khuẩn gram dương ở liều thấp hơn so với vi khuẩn gram âm, nhưng thực tế ít dùng điều trị nhiễm khuẩn gram dương do các chủng này đề kháng nhanh với thuốc

Tên thuốc

Hấp thu theo đường uống (%)

Độ thanh thải củathận (ml/phút)

Thời gian bán huỷ (s)

Phân loại tác dụng

Chlortetracycline

Oxytetracycline

Tetracycline

30 60-70

(Nguồn: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia, “ Thức ăn chăn nuôi – Hàm lượng kháng

sinh, hóa dược, vi sinh vật và kim loại nặng tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp

hoàn chỉnh cho lợn”, Hà Nội, 2009)

2.1.3.5 Tác dụng

Điều trị nhiều bệnh nhiễm khuẩn:

- Nhiễm khuẩn đường ruột, tiêu chảy do E.coli, Salmonella, Shigella

- Nhiễm khuẩn đường hô hấp do Chlamydia, Mycoplasma

- Bệnh sẩy thai truyền nhiễm

- Nhiễm khuẩn đường sinh dục, tiết niệu

- Nhiễm khuẩn da

- Do phổ kháng khuẩn rộng, dễ gây rối loạn tiêu hóa: nôn mửa, tiêu chảy,

viêm ruột, bệnh do nấm Candida…

- Suy gan thận khi sử dụng liều cao

- Gây bất thường ở xương và răng

- Gây nhạy cảm quang học làm tổn thương da, bong móng

- Phản ứng dị ứng và gây kích thích ở nơi tiêm (rất đau)

lượng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi

Hà Diệu Thúy (2009) đã dùng phương pháp HPLC để khảo sát tình hình sử

dụng và tồn dư các tetracycline trên heo thịt được giết mổ tại địa bàn TP.HCM Kết

quả tỷ lệ CSCN bổ sung TCs trong thức ăn cho heo thịt là 35,9% trên tổng số CSCN

khảo sát là 57

13

Lưu Nguyễn Minh Thư (2010) đã dùng phương pháp HPLC để khảo sát tình hình bổ sung và tồn dư TCs trong thức ăn chăn nuôi heo thịt và heo được hạ thịt tại địa bàn TP.HCM Kết quả tỷ lệ CSCN bổ sung TCs trong thức ăn cho heo thịt là 57,38% (35/61 CSCN) Trong đó mẫu vượt mức vi phạm chiếm 50,82% (31/61) Lâm Thị Thảo My (2010) đã dùng phương pháp HPLC để khảo sát tình hình

bổ sung kháng sinh họ tetracycline và amoxycilline trong thức ăn chăn nuôi trên địa bàn TP.HCM Kết quả có 55,74% mẫu thức ăn dương tính với CTC, 52,46% mẫu thức ăn dương tính với OTC và 24,59% mẫu dương tính với amoxycillin

2.2 Độc tố nấm mốc aflatoxin

2.2.1 Lịch sử phát hiện aflatoxin (AF)

Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị thương tổn rất nặng nề, lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “bệnh gà tây X” (Turkey X disease) Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất nhiều Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra Đến năm 1961 người ta đã tìm ra bản chất

hóa học của độc chất này là Aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus

parasiticus Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2

Giữa 4 loại trên thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất (Nabil Saad, 2004)

Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng Aflatoxin được tạo ra

bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u ở gan của động

vật (Dollar et al, 1967; Halver, 1969; Wales, 1970; Alpert et al, 1971; New, 1987 trích dẫn bởi Chaver- Sanchehez, 1994)

14

2.2.2 Các đặc điểm của aflatoxin

2.2.2.1 Cấu trúc hóa học của aflatoxin

Có thể nói Sargeant (1962), là người có công xác định công thức này Aflatoxin là nhóm các chất có cấu trúc hóa học rất gần nhau và có khung hóa học giống với dẫn xuất của cumarin nên gọi là flavacumarin Phân tử aflatoxin gồm một gốc cumarin, 2 nhân furan và một vòng lacton

Các aflatoxin được sản sinh nhiều nhất trong tự nhiên gồm 4 loại ký hiệu B1, B2, G1, G2 (được gọi tên do tính huỳnh quang dưới tia UV) Aflatoxin nhóm B và

G khác nhau ở chỗ nhóm B chỉ có một nhóm chức lacton trong khi đó nhóm G có 2 nhóm chức lacton Thứ tự 1, 2 trong mỗi nhóm là do di chuyển nhanh hay chậm trên sắc ký đồ Các loại aflatoxin khác là do sự chuyển hóa của các aflatoxin kể trên trong nấm và cơ thể động vật Hiện nay người ta biết có đến 20 loại aflatoxin (Quinn, 1998) Sau đây là cấu trúc hóa học của các aflatoxin chính

Hình 2.2 Công thức hóa học của một số loại aflatoxin

15

Quan hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính của aflatoxin

Bốn loại aflatoxin có độc tính xếp theo thứ tự giảm dần B1>G1>B2>G2 Sự

thiếu nối đôi giữa C8 và C9 làm giảm rõ rệt khả năng gây độc của aflatoxin B1>B2,

G1>G2 (Goldblatt; Heathcote, 1978)

2.2.2.2 Đặc điểm lý hóa

Aflatoxin dễ bị hủy bởi chất kiềm nhưng tương đối bền với nhiệt, ở nhiệt độ

cao hơn 100OC chỉ khử một phần nào aflatoxin Aflatoxin tan trong một số dung

môi hữu cơ như chloroform, acetonitril, ethanol, aceton, benzen nhưng không tan

trong một số dung môi béo như hexan, ether ethylic, ether dầu hỏa

Lợi dụng đặc điểm này có thể chiết xuất aflatoxin trong nguyên liệu bằng các

dung môi hữu cơ rồi làm tinh khiết bằng sắc ký và có thể định lượng dựa trên đặc

tính phổ huỳnh quang dưới ánh sáng tia cực tím: aflatoxin B1 có màu xanh tím,

trong khi aflatoxin G1 có màu xanh lục

Bảng 2.4 Tính chất lý hóa của Aflatoxin (theo Jone, 1977)

Độc tố Công thức

hóa học

Khối lượng phân tử gam

Điểm nóng chảy ( 0 C)

Huỳnh quang

16

2.2.3 Sự hiện diện và điều kiện phát triển của Aflatoxin trong tự nhiên

2.2.3.1 Sự hiện diện của Aflatoxin

Aflatoxin thường xuất hiện trong các sản phẩm nông nghiệp trên cánh đồng trước hoặc sau khi thu hoạch nếu sản phẩm không được phơi khô ngay hay ẩm độ trong sản phẩm cao tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển Trong điều kiện bảo quản không tốt, sản phẩm bị sâu bọ hoặc các loài gặm nhấm đục khoét cũng là điều kiện thuận lợi làm cho sản phẩm bị nhiễm aflatoxin Đôi khi sữa, trứng, thịt cũng bị phát hiện có aflatoxin do động vật đã ăn những loại thức ăn bị nhiễm aflatoxin

2.2.3.2 Điều kiện phát triển aflatoxin trong tự nhiên

Trong tự nhiên cũng như trong nuôi cấy, aflatoxin B1 (AFB1) được tạo ra nhiều nhất, kế đến là aflatoxin G1 (AFG1), aflatoxin B2 (AFB2) và các loại aflatoxin khác có tỷ lệ thấp Điều kiện phát triển chủ yếu vào 3 yếu tố sau: loài nấm mốc, loại cơ chất và điều kiện ngoại cảnh (Moreau, 1974)

Loài nấm mốc: hầu hết các chủng A nominus, A parasiticus đều sản xuất 4 loại AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 Trong khi đó, chỉ khoảng 50% số chủng A flavus

là có khả năng sinh độc tố aflatoxin và chỉ sinh nhóm B (Klich và Pitt, 1998) Điều này cho thấy, cấu trúc di truyền của từng loại nấm mốc khác nhau thì khả năng sinh aflatoxin khác nhau

Loại cơ chất: các loại cơ chất có chứa nhiều chất béo nhất là các acid béo không no rất thích hợp cho sư phát triển của nấm sinh aflatoxin Sự peroxy hóa chất béo giữ vai trò chủ chốt trong việc hình thành aflatoxin do liên hệ đến sự hình thành acid norsolorinic là tiền chất của aflatoxin (Lê Anh Phụng, 2002)

Điều kiện ngoại cảnh: nhiệt độ, ẩm độ, nồng độ O2 và CO2

+ Nhiệt độ tối ưu: 24-35OC

+ Ẩm độ tương đối: >80%

2.2.4 Tác hại của độc tố Aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi

Kết quả lâm sàng gây ra cho heo do nhiễm độc tố được tóm tắt trong bảng 2.5 Phản ứng lâm sàng của heo phụ thuộc vào thời gian bị nhiễm và hàm lượng độc tố trong thức ăn, chúng có thể gây ra thể cấp tính hay mãn tính cho heo thông qua

17

phản ứng lâm sàng để nhận biết ảnh hưởng của độc tố về triệu chứng lâm sàng và

về hướng trầm trọng của bệnh như: gây cấp tính hoặc mãn tính thì không dễ phát hiện và khó chính xác (Osweiler, 1992)

Bảng 2.5 Chỉ định lâm sàng về độc tố aflatoxin trong chăn nuôi heo

200- 400 ppb Giảm tăng trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn

Suy giảm hệ thống miễn dịch

500- 750 ppb Phối giống không có kết quả, nếu có thụ thai

heo con sinh ra cũng rất chậm lớn

(Nguồn tài liệu: www.vcn.vnn.vn)

18

2.2.5 Quy định mức aflatoxin được phép trên thức ăn hỗn hợp cho gia súc

Để hạn chế tối đa tác hại của aflatoxin đến sức khỏe con người và vật nuôi,

nhiều nước đã đưa ra quy định về mức tối đa của hàm lượng aflatoxin trong các loại

thực phẩm và thức ăn hỗn hợp cho gia súc và gia cầm Theo quy định của Bộ Nông

Nghiệp Và Phát Triển Nông Thôn (2001), hàm lượng các loại thức ăn gia súc chứa

aflatoxin không quá 30 ppb Ở Hoa Kỳ mức độ cho phép tối đa aflatoxin trong thức

ăn cho bò sữa là dưới 20 ppb và trong sữa dưới 0,5 ppb (Dương Thanh Liêm, Bùi

Huy Như Phúc, 2002)

Bảng 2.6 Quy định hàm lượng tối đa độc tố nấm mốc aflatoxin B1 và hàm lượng

tổng số các aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho heo

STT Loại độc tố

Hàm lượng aflatoxin tính theo microgam/kg (ppb) tối đa cho phép

Heo con từ 1-28 ngày tuổi Nhóm heo còn lại

2 Tổng số các aflatoxin

(Nguồn: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia, “ Thức ăn chăn nuôi – Hàm lượng kháng

sinh, hóa dược, vi sinh vật và kim loại nặng tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp

hoàn chỉnh cho lợn”, Hà Nội, 2009)

19

Bảng 2.7 Những quy định về hàm lượng Aflatoxin B1 tối đa trong thức ăn gia súc,

gia cầm ở các nước thuộc EU

Các loại nguyên liệu và thức ăn động vật Hàm lượng tối đa (µg/kg)

Các loại thức ăn đơn chất 50 TAHH cho bò, cừu (ngoại trừ bò sữa, bê cừu non) 50

TAHH cho heo và gia cầm (ngoại trừ heo con và gia

Các loại TAHH khác còn lại 10 Thức ăn bổ sung cho bò, cừu, dê (ngoại trừ cho bò

Thức ăn bổ sung cho heo, gia cầm (ngoại trừ thú non) 30

(Nguồn: http://www.Profeed.vn) TAHH: thức ăn hỗn hợp

2.2.6 Một số phương pháp phân tích aflatoxin

 Phương pháp vật lý hoá học

Phương pháp này dựa trên nguyên lý các aflatoxin dễ dàng tách khỏi mẫu

phân tích bằng các dung môi hữu cơ phân cực mạnh như cloroform, methanol,

ethanol, benzen,…

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC): Phương pháp này được sử dụng lần đầu

tiên vào những năm 1960 Người ta sử dụng các bản mỏng được tráng bởi silica gel

để xác định aflatoxin Khi so sánh giữa mẫu thực và mẫu chuẩn có thể có sự sai lệch

kết quả từ 20-30%

Phương pháp sắc khí lớp mỏng hiệu suất cao (HPTLC): Phương pháp này có

tính thuyết phục cao hơn TLC ở 3 khía cạnh sau: Đưa mẫu lên bản mỏng một cách

tự động, cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp thụ, chạy bản mỏng trong dung môi

có kiểm soát

20

Phương pháp sắc khí lỏng cao áp (HPLC): HPLC là hệ thống phân tích aflatoxin tự động, có chọn lọc Có thế xác định được aflatoxin B1, B2, G1, G2 ở nồng

độ 5 ppb Đây là phương pháp định lượng aflatoxin có hiệu quả nhất

 Phương pháp hoá sinh học

Phương pháp hoá sinh học miễn dịch mang đặc hiệu cao, dựa trên nguyên lý kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu Do sự tiến bộ của kỹ thuật miễn dịch trong những năm qua, đã phát triển nhiều hệ thống ELISA khác nhau để xác định aflatoxin và kháng thể đơn và đa dòng

Phương pháp sử dụng kit ELISA thương phẩm: các kit ELISA được sử dụng đơn giản, nhanh chóng và thích hợp ở lượng aflatoxin 20 ppb Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này là giá bán kít cũng cao chỉ phù hợp cho kiểm tra sản phẩm xuất nhập khẩu và các chương trình giám sát aflatoxin

2.2.7 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

- Tình hình nghiên cứu trong nước

Đậu Ngọc Hào và ctv (2003), đã nghiên cứu khả năng sinh độc tố của

A.flavus và kết luận rằng có khoảng 73% chủng A.flavus có khả năng sinh aflatoxin,

trong đó có 23% sản sinh aflatoxin ở mức cao nhất

Lại Kiều Oanh (2003), đã khảo sát tình hình nhiễm AFB1 trên thức ăn hỗn hợp cho heo tại TP.HCM, kết quả là đã phân tích 67 mẫu thức ăn hỗn hợp và phát hiện có 55 mẫu có aflatoxin (82,1%)

Hồ Hoa Phương Thảo (2006), đã khảo sát tình hình nhiễm AFB1 trên thức ăn hỗn hợp cho heo tại Bà Rịa Vũng tàu Với 109 mẫu thức ăn hỗn hợp được phân tích, kết quả có 73 mẫu có AFB1 chiếm 67%

Phạm Thị Kiều Nga (2008), đã khảo sát tình hình nhiễm Aflatoxin trên thức

ăn hỗn hợp cho heo tại TP.HCM Với 50 mẫu thức ăn hỗn hợp được phân tích, kết quả có 15 mẫu dương tính chiếm 30%

- Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

Cealtier (1997) và Le Bar (1982), đã công bố tỷ lệ các chủng A.flavus có khả

năng sinh aflatoxin B1 (AFB1) ở Pháp là 30% (Lê Anh Phụng, 2001)

21

Barry và Yeerongpilly (1971- 1988), đã phân tích 161 mẫu thức ăn gia cầm kết quả có 13 mẫu chứa aflatoxin (8,074%), trong đó có 4 mẫu đạt hàm lượng 50 ppb

Choudary (1992), đã phân tích mẫu bắp dùng làm nguyên liệu thức ăn tại một

trại gà thương phẩm ở Ấn Độ thì thấy chứa từ 1400- 3600 ppb aflatoxin

22

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian thực hiện

Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2012 - 30/06/2012

3.3 Đối tượng khảo sát

43 mẫu thức ăn hỗn hợp đang dùng cho heo thịt trên 60kg tại 34 cơ sở chăn nuôi heo thuộc 6 quận huyện trên địa bàn Tp HCM

- Máy nghiền mẫu phòng thí nghiệm (máy nghiền búa mini)

- Máy đo pH (đo được 0,05 đơn vị)

- Thiết bị trộn mẫu vortex mixer