Kết quả hợp đồng nghiên cứu khoa học đánh giá lâm sàng thuốc artemether 300 MG dạng thuốc bột để pha hỗn dịch

Theo dối độc tính bán cấp trên thỏ thực nghiệm: Artemether liều 40 mg /kg 1 ngdy x 28 ngay lam tang SGOT va SGPT, cdc chi sé khdc bao gém: protein, bilirubin, creatinin, số lượng hông cầ

KET QUA HỢP ĐỒNG NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐÁNH GIÁ TIỀN LÂM SÀNG THUỐC ARTEMETHER 300 MG-

Cơ quan thực hiện: VIỆN SỐT RÉT- KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG

Cơ quan cứng cấp thuốc: côNG TY CỔ PHẦN DƯỢC & THIẾT BỊ VẬT TƯ Y TẾ TRAPHACO

Chủ trì: TS NÔNG THỊ TIẾN

Cán bộ lãnh đạo cam kết hợp đồng nghiên cứu:

—_ T8 Lê Đình Công, Viện trưởng VIỆN SỐT RÉT- KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG

- Th§ Vũ Thị Thuận, Giám đốc côNG TY cd PHAN DƯỢC & THIẾT BỊ VẬT TƯ Y TẾ TRAPHACO

Danh sách những người thực hiện chính:

Nguyễn Thị Hương Liên

TS Y Dược Viện Sốt rét-KST-CT T.Ư

TS Y Dược Viện Sét rét-KST-CT T.U Ctr nhan sinh hoc Vién Sét rét-KST-CT T.U Ths Y Dược Viện Sốt rét-KST-CT T.Ư

Cử nhân hoá sinh Viện Sốt rét-KST-CT T.Ư KTV cao cap Viện Sét rét-KST-CT T.U

Kỹ thuật viên Viện Sốt rét-KST-CT T.Ư

Được sỹ - CÔNG TY CP DƯỢC & TBVT Y TẾ

TRAPHACO

và cộng tác viên khác

LOI CAM ON

(A111 01 lượt chide thiah edie one

— Wes Ct Shi Shudn Git Me ve Ban gine Mbe Cong ty Duve Frauphaco dé tee nol dtu kit dé yitip dé ching 666 Hheue héén Hé tae

— KHbi douy quire tré aia Cing ty Dupe Fraphace dé eip binh pleé oa tao

Wt Ki cÁto chuisg to tue helése dé đều,

14t t60 wire chen tharth etre one

— FE £6 Bink Ciug Otten teuug va F666 ding khoa hoe Clin sb vét RSFOT FU dé tao mot déu hitn dé gtip ae chitug €06 trong, quia trinte 1k “Lượt Wé tal,

— ie Khoa- DPhouy cia Olin Sét rét RSFOF FU dé quan tdne et tao’

Miu kita @é gtiip ME ching 6d bods thawte HE bie

Chit trl đề tà¿

TS HONG THE TIEN

ky sinh tring

ký sinh trùng sốt rét microlit

nanomol/lit phòng chống sốt rét Plasmodium falciparum Plasmodium berghei Standard Deviation (do léch chuẩn) sốt rét lưu hành

tổ chức y tế thế giới

thời gian sạch ký sinh trùng World Health Organization

Tóm tat:

Nghiên cứu tiên lâm sàng của artemether 300 mẹ — dạng thuốc bột (Erapas) để pha hỗn được tiến hành tại Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương, thời gian từ tháng 2/2001 đến tháng 9/2001 l

Kết quả nghiên cứu cho thấy độc tính cấp của artemether trên chuột nhất, đường uống có giá tri LD sy là 840 mgikg (677-1040 mgÍkg)

Theo dối độc tính bán cấp trên thỏ thực nghiệm: Artemether liều 40 mg /kg 1 ngdy x 28 ngay lam tang SGOT va SGPT, cdc chi sé khdc bao gém: protein, bilirubin, creatinin, số lượng hông cầu, huyết sắc tố, số lượng bạch cầu và công thúc bạch cầu tại ngày 14, ngày 28 không có sự khác biệt so với trước khi thỏ uống thuốc Artemether liều

20 mglkglngày x 28 ngày làm tăng SGŒPT, các chỉ số khác bao gôm: SGOT, protein, bilirubin, creatimn, số lượng hông cầu, hemoglobin, số lượng bạch cầu và công thúc bạch câu tại ngày 14, ngày 28 không có sự khác biệt so với trước khi thỏ uống thuốc Artemether liều 20 mglkgingày và liều 40 mgikgingày, thỏ uống liên tục 28 ngày chưa thấy sự thay đổi về nhịp tim, sóng PQ, QRS, ST va QT tại ngày 14 và ngày 2Š so với ngày 0

Artemether liều 20 mglkglngày x 7 ngày, có hiệu lực cao điều trị trên chuột nhiém P.berghei ching nhay chloroquine, dac biệt hỗn dịch sau khi pha để Ï tuần và 2 tuần vẫn còn hiệu lực cao diệt ký sinh trùng và không tái phát trong 28 ngày theo dõi sau điều trị

Artemether liêu 20 mgikgingày x 7 ngày, có khả năng ức chế ký sinh trùng phát triển trên chuột nhiễm P.berghei chủng kháng chloroquine

1 DAT VAN DE

Theo số liệu từ các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng về phác đồ thuốc sốt rét tại thực địa gần đây cho thấy: số bệnh nhân sốt rét có ký sinh trùng (KST) ở

trẻ em dưới 14 tuổi chiếm tỷ lệ 50 -70% ở các điểm nghiên cứu thuộc khu vực

SỐt rét vùng sâu vùng xa Trong công tác điều trị bệnh nhân sốt rét tại cộng đồng

thường gặp phải khó khăn về việc tuân thủ điều trị của người bệnh thường rất

thấp, một trong những lý do bỏ thuốc là do thuốc sốt rét có vị rất đắng nếu ở : dạng uống, đặc biệt là sốt rét ở trẻ em việc uống thuốc đủ liều lượng hàng ngày

và uống đủ liệu trình theo phác đô điều trị thực sự là một khó khăn cho cán bộ y

tế khi thực thi nhiệm vụ Hiện nay ở một số nơi có một số dạng thuốc uống đễ

sử dụng cho trẻ em như chloroquine dạng sirô, thuốc được đóng túi nhỏ dạng bột _như mefloquine, artesunate để pha thành hỗn địch (hãng DECHIRER ICI) Tuy nhiên dạng thuốc này còn rất ít sử dụng tại Việt Nam

Để tạo ra dạng thuốc thích hợp với sốt rét trẻ em, CÔNG TY DƯỢC TRAPHACO

đã điều chế artemether 300 mg- dạng thuốc bột để pha hỗn dịch (Erapas) có Vị ngọt, dùng theo đường uống Thuốc đã có giấy phép sản xuất (phụ lục 1) và đã

xuất khẩu sang một số nước Châu Phi để chữa sốt rét (phụ lục 2) Ở Việt Nam hiện nay chưa sử dụng dạng thuốc này điều trị sốt rét Để xem xét việc có thể sử

dụng Erapas trong điều trị sốt rét tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành kiểm chứng

về tính an toàn và tính hiệu lực của Erapas trên mô hình động vật thực nghiệm với các mục tiêu như sau:

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Xác định độc tính cấp (LD.o) của artemether trên chuột nhắt

+2 Theo dõi độc tính bán cấp của hỗn địch artemether trên thỏ

3 Đánh giá hiệu lực điều trị của hỗn dịch artemether trên chuột nhất nhiễm P.berghei

2 TONG QUAN

2.1 Tình hình nghiên cứu ở ngoài nước

Artermether là dẫn chất của artemisinin, có tác dụng diệt thể vô tính của

ký sinh trùng sốt rét (KSTSR) Hấp thu toàn bộ và nhanh khi tiêm bắp, 6 giờ sau

khi tiêm đạt nồng độ tối đa trong máu (200 ng/m]); thời gian bán thải 4-11 giờ

Liều độc trên chuột LDạy tiêm bắp: 269 mg/kg, đường uống: 895 mg/kg L8],

Artemether cé hoat tinh in vitro cao đối với cả cac phan lap P falciparum

nhay va khang chloroquine 23], Néng do artemether tic ché KST phat trién

trén céc phan lap P.falciparum nhạy chloroquine với giá trị IC,, 1a 2,37- 3,46 nmol/l va trén cdc phan lap Pfalciparum khang chloroquine véi giá trị IC, là

1,61 - 2,8 nmol/ 8311,

Artermether có tác dụng diệt ký sinh trùng giai đoạn hồng cầu trên chuột nhiễm P.berghei Sử dụng artemether điều trị sốt rét trên bệnh nhân nhiễm

P falciparum, tiém bap téng liêu 640 mg, liệu trình 3 ngày sạch ký sinh trùng

trong vòng 7 ngày sau điều trị (Roche G, 1992)18],

Sử dụng artemether dạng uống, tổng liều là 700 mg, liệu trình 5 ngày điều trị sốt rết P falciparum chua bién ching cé ty 1é điều trị khỏi là 97%(Bunnag et

al, 1992) 91

Artemether tiém bap, téng liéu 600 mg, liéu trinh 5 ngay diéu trị sốt rét

P falciparum chua bién ching cé ty 1é diéu trị khỏi là 92%; sử dụng artemether

tiém bap téng liéu 600 mg, liéu trình 5 ngày điều trị sốt rét ác tính có tỷ lệ điều trị khỏi 76% (Karbwang et al,1992 sử dụng H5},

Nghiên cứu so sánh artemnether và chloroquine trên sốt rết trẻ em Gambian cho thấy thời gian sạch KST của nhóm điều trị artemether nhanh hơn nhóm điều

tri chloroquine (White NJ et al, 1992 22),

So sánh hiệu lực điều trị trên sốt rét trẻ em giữa nhóm điều trị artemether liều 1,2mg/kg/12 giờ x 6 lần với nhóm điều trị sulfadoxine-pyrimethamine (25mg/kg sulfadoxine + 1,25 mg/kg pyrimethamine) liéu duy nhất, kết quả cho thấy thời gian sạch ký sinh trùng và thời gian cắt sốt nhóm trẻ điều trị artemether nhanh hơn nhóm điều trị sulfadoxine / pyrimethamine ( Walker O et al,1992)1,

So sánh artemether với quinine (dạng tiêm) trên bệnh nhân sốt rét ác tính

P falciparum cho thấy tỷ lệ cứu sống của artemether là 87% tốt hơn so với quinine là 63%, thời gian sạch ký sinh trùng của artemether là 54 giờ nhanh hơn

quinine là 78 giờ ( Karbwang ƒ et al., 1992) I8]

Thử nghiệm lâm sàng của artemether trên sốt rét P falciparum khang thuốc cho thấy ATM tổng liều 480 mg, liệu trình 5 ngày có tỷ lệ điều trị kết quả

là 100% và không thấy phản ứng ngoại ý trầm trọng Thời gian cắt sốt và sạch

KST ngắn (Bunnag D et al, 1992) DỊ,

Phối hợp artemether + pyrimethamine điều trị sốt rét P falciparum cho tỷ

lệ chữa khỏi 14 75% (Bangchang KN et al., 1996) !1,

Phối hợp của artemether + lumefantrine thành một dạng thuốc uống COARTEM Loại thuốc đã được nghiên cứu trên 3265 bệnh nhân sốt rét từ 1 tuổi trở lên ở Ấn độ, Tanzania Tại Thái lan, COARTEM dùng phác đồ 6 liều điều trị cho những trường hợp sốt rét P ƒalciparum đa kháng, thuốc đạt tỷ lệ chữa khỏi

tính đến Ngày 28 là 95% (Vugt MV et al, 1998)°Ì Đã có nghiên cứu chứng

mình về không có bằng chứng độc tính trên tim mạch của artemether ~ lumefantrine sử dụng trong điều trị sốt rét (Vugt MV et al, 1999) 201,

Phối hợp artemether + benflumetol có kết quả hiệp đồng tác dụng trên sốt tết P falciparum và cho kết quả điều trị kết quả của phối hợp thuốc này trên bệnh nhân sốt rét chưa biến chứng P falciparum là 100% (Hassan Alin M, et al, 1999)

2.1 Tình hình nghiên cứu ở trong nước

Ở Việt Nam trong những năm gần đây, artemisinin và dẫn chất của

artemisinin như: artesunate, artelinat, dihydroartemisinm, arteether và

artemether dạng viên và đạng tiêm đã được đánh giá tiền lâm sàng và lâm sàng

Artemisinin (ART): Kết quả nghiên cứu độc tính cấp trên chuột nhất có gid tri LD, đường uống là 4228 mg/kg Đáp ứng in vitro cha P falciparum chủng nhạy chloroquine (T96) đối với ART có giá trị ICzạ là 12,5 + 0,6 nmol/l ART có tác dụng diệt ký sinh trùng giai đoạn hồng cầu ở chuột nhiễm ?

berghei, sit dung liéu ART 150 mg/kg/ ngay x 7 ngày điều trị trên chuột nhiễm

P.berghei chủng nhạy chloroquine có tỷ lệ điều trị kết quả là 100%, nhưng chỉ

có tác dụng ức chế KST trên chủng P.berghei kháng chloroquine với tỷ lệ tái

phát 100 % (Nguyễn Duy Sỹ & cs, 1996) "1

Artesunate (AS): Kết quả nghiên cứu độc tính cấp trên chuột nhất có giá trị „ LD¿ạ; đường uống là 1180 mg/kg; tiém bap là 620mg/kg Nghiên cứu độc tính bán cấp trên thỏ thực nghiệm với liều 40 mg/kg/ngầy x 28 ngày uống liên tục không làm thay đổi số lượng hồng cầu, bạch cầu, Hb, SGOT, SGPT, creatinine,

và không làm tổn thương về thực thể tế bào gan thận Với liều 100 mg/kg x 28

ngày uống liên tục gây tổn thương ở gan, thận thỏ nhưng được hồi phục sau 7 ngày ngừng thuốc; làm giảm HC, giảm Hb, tăng BC, tăng SGPT nhưng các chỉ

số trở lại bình thường sau 7 ngày dừng thuốc AS không làm thay đổi một số chỉ

s6 tim mạch: nhịp tim, sóng P, sóng PQ, sóng QT và phức bộ QRS 1221, Tác

dụng in vữro của artesunate trên P,falciparum chủng kháng chloroquine (F25)

có gid tri ICs) 14 3,56 nmol/1 PÌ,

Dihydroartemisinin (DHA); Két qua nghiên cứu độc tính cấp cla DHA trên chuột nhắt, đường uống có giá trị LD;; là 1150 mg/kg Nghiên cứu độc tính bán cấp trên thỏ thực nghiệm với liều 20 mg/kg/ngày x 14 ngày không làm thay đổi số lượng hồng cầu, bạch cầu, huyết sắc tố, không làm thay đổi các chỉ số

4

sinh hod (SGOT, SGPT, Creatinine), không làm tổn thương về thực thể tế bào

gan thận, không làm thay đổi chỉ số điện tim và trọng lượng của thỏ thực nghiệm ( Trương Văn Như & CTV, 1999) Tác dụng in vitro cla DHA trén P falciparum chủng nhạy chloroquine (T96) có giá trị trung bình ICs, 1a: 3,31 + 0,96 nmoll, trén P falciparum ching khang chloroquine (K1) 1a: 2,93 + 0,33 nmol/l DHA có tác dụng diệt ký sinh trùng giai đoạn hồng cầu trên chuột nhiễm

P berghei Sử dụng liêu DHA là 25 mg/kg/ngày x 7 ngày điều tri trên chuột nhiễm P.berghei chủng nhạy chloroquine (T) có thời' gian sạch KST là 2,3+ 6,5 ngày Sử dụng liều DHA là 50 mg/kg/ngày x 7 ngày điều trị thì thời gian sạch KST là 1,8 + 0,4 ngày và không tái phát ở 3 tuần theo dõi tiếp theo Đối với chủng P berghei kháng chloroquine, liéu DHA: 25 mg/kg x 7 ngay diéu tri chi

có khả năng ức chế KST, không sạch KST trong tuần đầu điều trị: liều DHA 50 mg/kg x 7 ngày điều trị có khả năng giảm KST và sạch KST trong tuần đầu điểu trị, nhưng tái phát 100% ở 3 tuần tiếp theo ( Nông Thị Tiến & CTV, 2001) DỊ, Artemether (ATM) và arteether đã được điều chế từ 1992 ở Việt Nam Kết quả nghiên cứu độc tính cấp trên chuột nhắt có giá trị LŨ đường tiêm là 256,52 + 3,11 mg/kg ATM có tác dung in vitro trén P falciparum ching nhay chloroquine (T96) va ching khang chloroquine (K1) véi giá trị MIC 14 5 x 10° mol/l ATM cé6 tac dung in vitro trén P falciparum manh hon artemisinin tir 2

dén 4 lan (Dang Ngoc Quynh & CS, 1993) 81,

Phối hợp của artemether + lumefantrine thành một dạng thuốc uống COARTEM Loại thuốc đã được nghiên cứu trên bệnh nhân sốt rét ở Việt Nam, COARTEM dùng phác dé 6 liéu diéu tri cho những trường hợp sốt rét

P falciparum chưa biến chứng, thuốc đạt tỷ lệ điều trị kết quả tính đến N gày 28

là 100% ( Số liệu chưa công bố) J9,

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Địa điểm nghiên cứu

; Phòng thí nghiệm nghiên cứu độc tính, nghiên cứu sinh học thực nghiệm của Viện sốt rét — Ky sinh trùng — Côn trùng Trung ương

3.2 Vật liệu và phương tiện nghiên cứu

Chuột nhất trắng thuần chủng (dòng Swiss) khoẻ mạnh, có trọng lượng 22

gam + 2 gam được nuôi trong cùng một điều kiện và chế độ ăn và nước uống như nhau

Ký sinh trùng sốt rét P.berghe: chủng nhạy chloroquine và chủng kháng

chloroquine có tại labo VIỆN SỐT RÉT-KST-CT T.Ư

Thỏ trưởng thành, không phân biệt đực, cái có trọng lượng 2kg + 0,2kg được nuôi trong cùng một điều kiện và chế độ ăn và nước uống như nhau Bột artemether dạng tinh khiết đo Công ty Dược Traphaco cung cấp

Artemether dạng thuốc bột để pha hỗn dịch, đóng chai 38 gam trong đó chứa 300 mg artemether do Công ty Dược Traphaco cung cấp

Tá dược, đống chai 38 gam không có artemether do Công ty Dược Traphaco cung cấp

Bột artesunate dạng tỉnh khiết do Công ty Dược Traphaco cung cấp

Bột artemisinin dạng tinh khiết do Viện Khoa học Việt Nam cung cấp Gôm arabic tiêu chuẩn được dụng do Arập sản xuất dùng để pha thuốc Xét nghiệm sinh hóa được đo trên máy Photometer 5010 của hãng Mannhein-Boringer

Ghi điện tâm đồ bằng máy Cardiofax ECG - 8820 Nihonkohden Nhật Bản Liều lượng artemether dùng cho các loại thực nghiệm:

“

Liều lượng artemether để xác định độc tính cấp: 400 mg/kg +1600 mg/kg Liều lượng artemether để đánh giá độc tính bán cấp:

+ Liều thấp hơn 20 lần (1/20) liéu LDgo 14: 40 mg/kg/ngay x 28 ngày

+ Liều thấp hơn 40 lần (1/40) liều LDạạ là: 20 mg/kg/ngày x 28 ngày

- Liéu lugng artemether ding cho đánh giá hiệu lực điều trị trên chuột nhất trắng nhiễm P.berghei là: 20 mg/ kg/ ngày x 7 ngày, liều này thấp hơn 40 lần liều LDzg và cao gấp 10 lần liều điều trị trên người (tổng liều điều trị

- trên người là 12-16 mg/kg tuỳ liệu trình 5 hoặc 7 ngày)

—_ Liều lượng artesunate dùng cho đánh giá hiệu lực điều trị trên chuột nhắt trắng nhiễm P.berghei là: 20 mg/ kg/ ngày x 7 ngày, liều này thấp hơn 59 lần liều LDsạ và cao gấp 10 lần liều điều trị trên người (tổng liều điều trị trên người là 12 - 16 mg/kg tuỳ liệu trình 5 hoặc 7 ngày)

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu là thử nghiệm tiền lâm sàng trên mô hình động vật thực

nghiệm là chuột nhất trắng và thỏ, theo kỹ thuật thường qui đánh giá tiền lâm

sàng của thuốc sốt rét

3.3.2 Nội dung nghiên cứu

3.3.2.1 Đánh giá độc tính cấp trên chuột nhắt

Xác định iiều độc LD¿ theo phương pháp của Lichied-Wilconson Theo dõi triệu chứng và dấu hiệu của động vật khi bị tác động của thuốc, các hành vi

và hoạt động của chuột, tính số chuột chết trong thời gian 24, 48 và 72 giờ Thí nghiệm được tiến hành 3 đợt thử nghiệm liên tiếp

3.3.2.2 Đánh giá độc tính bán cấp trên thỏ

Độc tính bán cấp của artemether được đánh giá theo phương pháp của thương qui của Dược điển Thỏ thử nghiệm gồm 30 con được chia ngẫu nhiên thành 3 lô, cho thỏ uống thuốc hàng ngày vào 9 giờ sáng

Lô 1: Lô chứng, thỏ uống tá được (n = 10)

.Lô 2: Thỏ uống thuốc ATM với liều 20 mg/kg x 28 ngay (n= 10)

Lô 3: Thỏ uống thuốc ATM với liều 40 mg/kg x 28 ngày (n = 10)

—_ Theo dõi ảnh hưởng của thuốc đối với tim trên thỏ thực nghiệm Ghi điện tim thỏ trước, trong và sau khi cho uống thuốc vào các ngày Nụ, N¡x và Nog (nhip tim, sóng PQ, ST, QT va phitc b6 QRS)

— Theo đõi ảnh hưởng của thuốc đối với một số chỉ số sinh hoá: SGOT;

‘SGPT, Creatinin; Protein; Bilirubinai dic ngay No, Nig Nog

— Theo dối ảnh hưởng của thuốc đối với một số chỉ số huyết học: số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, số lượng bạch cầu và công thức BC tại các ngày

No > Nụ ’ Nog *

3.3.2.3 Đánh giá hiệu lực của artemether trên chuột nhiễm P.berghei

Mỗi chuột được tiêm vào phúc mạc I x 10Š hồng cầu nhiễm P.berghei

(chủng nhạy hoặc chủng kháng chloroquine) ñb 1l ` sau 24 giờ các lô chuột gây

nhiễm được xét nghiệm máu để tính mật độ trước trước điều trị (lam No) va chuột được uống thuốc điều trị hoặc tá dược, liều dùng tính theo gam trọng lượng chuột Trong nghiên cứu này cần trả lời 2 nội dung sau:

a) So sánh hiệu lực điều trị dạng hỗn dịch của artemether liên quan đến ba thời điểm bảo quản (xem 3 thực nghiệm 1, 2 và 3) trên chuột nhất nhiễm P.berghei chủng nhạy chloroquine

Thực nghiệm 1: Chuột được uống thuốc điều trị hoặc tá được ngay sau khi pha

- Lô chứng chuột uống tá dược (chitngy) x 7 ngay 10 con

- L6 diéu tri artemisinin (ARTqg) 150 mg/kg/24giờ x7ngày 10con

- Lô điều trị artesunate (ASq) : 20 mg/kg/24 giờ x 7 ngày 1Ô con

- Lô điều trị artemether (ATM,), liều 20 mg/kg/24 giờx 7ngày 10 con Thực nghiệm 2: Chuột được uống thuốc điều trị hoặc tá được đa pha để 7 ngày

ở nhiệt độ phòng

- Lô chứng chuột uống tá được (chứng;) x 7ngày 10 con

- Lô điều trị artesunate (AS;), liều 20 mg/kg/24 gid x 7 ngày 10 con

- Lô điều trị artemether (ATM;), liều 20 mg/kg/24 giờx 7ngày 10 con

Thực nghiệm 3: Chuột được uống thuốc điều trị hoặc tá dược đã pha để 14 ngày

ở nhiệt độ phòng

- Lô chứng chuột uống tá dược (chứngx) xX 7ngay 10 con

- Lô điều tri artesunate (AS,,), liều 20 mg/kg/24 giờ x 7 ngày 10 con

- Lô điều trị arternnether (ATM,,), liều 20 mg/kg/24 giờ x 7 ngày 10 con

8

b) Đánh giá sơ bộ hiệu lực điều trị của artemether và artesunatc trên chuột nhiễm P.berghei chủng kháng chloroquine

Thực nghiệm 4: Artemether ngay sau khi pha thuốc thì cho chuột uống

- Lô chứng chuột uống tá được (chứng) trong 7 ngày 10 con

- Lô điều trị artesunate (AS) : 20 mg/kg/24 gid x 7 ngay 10 con

- Lô điều trị artemether (ATM): 20 mg/kg/24 giờ x 7 ngày 10 con 3.3.3 Mẫu nghiên cứu

e_ Tiêu chuẩn chọn mẫu:

Chuột nhất trắng thuần chủng (đòng Swiss) khoẻ mạnh; có trọng lượng 20 gam + 2 gam được nuôi trong cùng một điều kiện và chế độ ăn là loại

bánh tổng hợp do Viện VSDT chế biến và uống nước đã đun sôi để nguội

P.berghei chủng nhạy chloroquine, mức độ nhạy của KST với liều điều trị

la CHL bazo: 5 mg/kg/ngay x 7 ngày thì sạch KST hoàn toàn trong máu P.berghei ching khang chloroquine (K70), mức độ kháng của KST với liều điều trị là CHL bazơ: 70 mg /kg/ngày x 7 ngày vẫn không sạch được ˆ KST trong mau

Thỏ trưởng thành không phân biệt đực hoặc cái, có trọng lượng 2kg + 0,2kg, nuôi trong cùng một điều kiện, chế độ ăn và nước uống như nhau

® Cỡ mẫu:

Xác định độc tính cấp: mỗi đợt thí nghiệm 100 chuột x 3 đợt = 300 chuột Đánh giá độc tính bán cấp: mỗi lô 10 thỏ x 3 lô = 30 thỏ

Đánh giá hiệu lực điều trị: mỗi lô thử nghiệm là 10 chuột (n=10), những

lô điều trị xác định hiệu lực (artemether) sẽ được thử nghiệm lặp lại lần 2

(n=20) Tổng số chuột sử dụng để thực hiện thử nghiệm và tạo kháng

nguyên là 250 con

3.3.4 Theo dõi sau thử nghiệm

Theo dõi tình trạng sức khoẻ của thỏ thực nghiệm như: hiện tượng biếng

ăn, xù lông, ia chảy và các dấu hiệu khác để phân biệt nguyên nhân thỏ ' chết là do độc tính của thuốc hoặc do các yếu tố khác

Theo dõi tình trạng sức khoẻ của chuột thử nghiệm như: hiện tượng biếng

an, xd long, ia chay va các đấu hiệu khác để phân biệt nguyên nhân chuột

3.3.5

chết là do độc tính của thuốc hoặc do ký sinh trùng hoặc do các yếu tố khác

- Theo đõi mật độ ký sinh trùng (KST), mat độ KST được đếm trên 10000

HC tại các thời điểm: trước khi uống thuốc lần đầu (N,), tiép theo tai cdc ngày Ny Nà, N3, va sau d6 Nz, Nz, Ny, Nuys Nyy, Nis Nia, Nay, No3, Nos va Này

Các chỉ số đánh giá

Liều độc LDgy

SGOT; SGPT; Creatinin; Protein; Bilirubin tai ngay Ny, Nj,4, Này

Số lượng HC; Hb;, BC; cong thttc BC tai ngay Ny Nig Nog

Nhịp tim, sóng PQ, ST, QT và phức bộ QRS, tại ngày Nụ, Nig» Nog

Tỷ lệ % điều trị kết quả được xác định là tỷ lệ chuột được điều trị sạch KST trong máu tại ngày thứ 7 sau điều trị, và sau đó không tái phát trong vòng 28 ngày

Giảm ký sinh trùng sau 48 giờ tính từ sau khi bắt đầu điều trị so với mật

độ KST tại N0

Thời gian sạch ký sinh trùng là thời gian tính từ khi chuột được uống thuốc cho tới khi xét nghiệm thấy sạch KST và tiếp tục sạch KST trong 48 giờ tiếp theo

3.4 Phương pháp thống kê xử lý số liệu

Sử dụng Mantel-Haenszel test để so sánh hiệu lực điều trị giữa các phác

đồ thuốc sốt rết

Sử dụng phương pháp fisher exact để so sánh hiệu lực điều trị giữa các

phác đồ thuốc sốt rét khi giá trị kỳ vọng ô nhỏ hơn 5

Sử dụng Student's ¿ test để so sánh giá trị các số liệu phân bố liên tục ( Trọng lượng, mật độ KST, thời gian sạch KST ) giữa các nhóm thử nghiệm

Sử dụng Nonparametric test để so sánh các chỉ số vẻ sinh hoá, huyết học trước, trong và sau thử nghiệm

10

4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của artemether trên chuột nhất

Thử nghiệm thăm dò liều độc tính cấp đã được tiến hành 2 đợt liên tiếp, chọn lựa được liều thuốc cho thử nghiệm cuối cùng để xác định liều LDag

Thử nghiệm thứ 3, chuột nhất trắng gồm 90 con chia 9 lô, mỗi lô 10 con Chuột được nuôi trong cùng một điều kiện đảm bảo thức ăn và nước uống như nhau Thuốc được hoà tan phân tán đều trong gôm arabic 1% với các nồng độ" artemether khác nhau từ liều 400mg/kg, 500mg/kg đến 1500mg/kg Theo dõi các biểu hiện của chuột trong thời gian uống thuốc, ghi số lượng chuột chết sau

24 giờ, 48 giờ và 72 giờ Kết quả xác định LDs; tính theo công thức Lichied- Wilconson

Bang 1: Két qua thir nghiém xdc dinh LD,, cia ATM trén chudt nhat trang

4.2 Kết quả đánh giá độc tính bán của hỗn dịch artemether trên thỏ thực nghiệm

4.2.1, Kết quả về huyết học và hóa sinh trước, trong và sau khi thỏ uống artemether liều 40 mg/kg/ngày, uống liên tục 28 ngày

Bảng 2: Kết quả xét nghiệm huyết học của thỏ ubng ATM liéu 40 mg/kg/ ngay cho

thỏ uống 28 ngày liên tức

"Trước khi Sau 14 ngày Sau 28 ngày |N14so | N28so

CHs uống thuốc uống thuốc uống thuốc | với N0 | với NO

Hồ ong Lo chimg | 4,4640,51] 4,47+0,49 | 4,60.£0,87 | > 0,05 | > 0,05 cau(tr) | Lo uéng ATM | 5,30 + 0,59 | 5,30+0,41 | 5,20 +0,59 | > 0,05 | > 0,05 Bạch | Lôchứng | 5657+875 | 52974916 | 61504959 |>0,05 | > 0,05 ầ -

"| Lô uống ATM | 5733 + 878 | 6301 + 1420 | 5681+ 1129 |> 0,05 | >0,05

Công | Le | Lympho | 770+4,6 | 69,1+4.3 | 738+105|>0,05| >005

thc || Mono | 14405 | 13405 | 15+0,5 |>0,05| >0,05 bach (%) |am| cầu | La Lympho 68,445,8 | 74,6+4,7 | 76,5466 | > 0,1| >0,1 Tính | 233+71 | 1914113 | 228+125 |>0/05| >0,05 0,05 | > 0,05

So sánh với cùng lô ở các thời điểm

không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

— Số lượng bạch cầu và công thức BC giữa 16 uống hỗn dịch artemether và lô chứng tại ngày 0 và ngày 28 sự khác biệt khôn

so sánh với cùng lô ở các thời điểm Nụ, N

không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

Một số chỉ số về hóa sinh trước, trong và sau khi thỏ uống artemether liều 40 mg/kg/ngày, cho thỏ uống liên tục 28 ngày, kết quả xét nghiệm trình bày tại bảng 3

Bảng 3: Kết quả xét nghiệm hóa sinh của thỏ uống ATM liều 40 mgikgí ngày cho

thỏ uống 28 ngày liên tục

số Ô thử nghiệm Trước khi Sau 14ngày | Sau 28 ngày |N14so | N28 so

uống thuốc | uống thuốc uống thuốc | vớiN0 | với N0 SGOT Lô chứng 58,4+3,5 | 52,3+3,7 | 523+5,1 |>0,05 |>0,05

— Lé6 tho udng artemether liéu 40mg /kg/ngày, uống liên tục 28 ngày, tại ngày

28 chỉ số SGPT, SGOT thay đổi có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)

— Lô thỗ uống artemether liều 40mg /kg/ngày, uống liên tục 28 ngày, tại ngày

28 các chỉ số protein, bilirubin, creatinin sự thay đổi không có ý nghĩa thống

kê (p> 0,05)

4.2.2 Kết quả về hóa sinh, huyết học trước, trong và sau khi thd uống artemether liều 20 mg/kg/ngày, cho thỏ uống liên tục 28 ngày

Bang 4: Kết quả xét nghiệm huyết học của thỏ uống ATM liều 20mg/kg/ngayx 28ngay

chỉ số | Lô thử nghiệm Trước khi Sau l4ngày ƒ Sau28ngày |NI4so [| N28so

uống thuốc uống thuốc uống thuốc |vớiN0 | với NO

Hồ ồng Lô chứng 4,94+0,59 | 5,01+0,33 | 4,80+0,44 | >0,05| >0/05 câu(r)' Lôuống ATM | 5,10+0,52 | 4,78 +4 0,38 |.4,80 +0,42 | > 0,05 | >.0,05

Nhận xét:

— Số lượng hồng cầu, huyết sắc tố giữa lô uống artemether và lô chứng tại ngày

0 và ngày 28 sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (> 0,05) So sánh với

cùng lô ở các thời diém No, Nj, va Nog cdc chi số này thay đổi không có ý

nghĩa thống kê (p > 0,05)

— Số lượng bạch cầu và công thức BC giữa lô uống artemether và lô chứng tại

ngày 0 và ngày 28 sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (> 0,05) So sánh

với cùng lô ở các thời điểm Nạ, N,, va N

nghĩa thống kê (p > 0,05)

14

zs các chỉ số này thay đổi không có ý

Một số chỉ số về hóa sinh trước, trong và sau khi thỏ uống artemether

liều 20 mg/kg/ngày, cho thỏ uống liên tục 28 ngày

Bảng-5: Kết quả xét nghiệm sinh hóa của thỏ uống ATM liều 20 mg /kg/ngày x 28 ngày

Các chỉ SỐ nghiệm Lô thử Trước khi | Sau l4ngày | ,Sau28ngày |NI4so |N28so

uống thuốc | uốngthuốc | uống thuốc |vớiN0 |vớiN0

SGOT | Lôchứng | 544+ 12,5 | 57,3+ 11,5 | 55,7+16,3 | >0,05 | >0,05

0) | IôATM |536+154| 594+9/7 | 626+8,7 | >0,05 | >0,05

SGPT Lô chứng "| 66,4+25,1 | 62,4#+27,6 | 65,0+35,3 | >0,05 | >0,05 (4/9 LôATM | 521+2,8 | 58,8+1,8 | 899+2,9 | >0,05 | <0,05 Protein Lô chứng | 63,343,4 |57,2+1,50 | 58,4+£3,2 | >0,05 | >0,05 1) Lô ATM | 60,2+5,1 |58,/26+2,7| 566+5,2 |>0,05 | >0,05 Bilirubin Lôchứng | 38+0,8 | 4,7941,1 | 4,140,8 | >0,05 | >0,05

—_ Lô thỏ uống artemether liều 20mg /kg/ngày, uống liên tục 28 ngày, tại ngày

28 chỉ số SGPT thay đổi có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)

— Lô thỏ uống artemether liều 20mg /kg/ngày, uống liên tục 28 ngày, tại ngày

28 các chỉ số SGOT, protein, biHrubin, creatinin sự thay đổi không có ý nghĩa

thống kê (p > 0,05)

4.2.3 Ảnh hưởng của artemether trên các sóng điện tìm thỏ

Chức phận tim mạch được đánh giá qua các chỉ số điện tim thỏ trên 12 chuyển đạo ở cả lô chứng (uống tả dược) và lô uống hỗn dịch artemether với

liêu 20 và 40 mg/kg/ngày x 28 ngày Điện tim đồ được ghi ở các thời điểm

15

nghiên cứu: trước khi đưa vào thử nghiệm (N,), giữa giai đoạn thử nghiệm (đÑNj)

và sau khi kết thúc thử nghiệm (N,;) Kết quả được trình bày ở bảng 6

Bảng 6: Một số chỉ số điện tim thỏ trước, trong và sau thử nghiệm giữa lô chứng,

lô uống artemether liều 20 mg và 40 mg /kg/ngày x 28 ngày

Giá trị P của liêu 20mg so voi chiing > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

Giá trị P của liêu 40mg $o với chứng >0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

Sau | L6 chitng | 246,7 + 2,37 | 0,06+0,01 | 0,05 + 0,01 | 0,12+0,03 | 0,16+0,005

28 | 16 ATM

ngay 20 mg/kg 223 + 23 | 0,06+0,01 | 0,04 +0,01 | 0,11 +0,01 0,14+0,01 uong | Lô ATM

thuốc | 4o mg/kg 253,4+ 20,4 | 006 +0,01 | 0,05 +0,01 | 011+0,01 0,16+0,01

$o với chứng

Nhận xét: Các chỉ số điện tim thỏ giữa lô uống hỗn dịch artemether liều 20

mg/kg/ngày x 28 ngày và 40 mg/kg/ngày x 28 ngày so với lô chứng ở các thời điểm ngày 0, ngày 14 và ngày 28 sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ( giá

trị > 0,05)

16

4.3 Đánh giá hiệu lực điều trị của hỗn địch artemether trên chuột nhiễm

P.berghei

4.3.1 Hiệu lực điều trị của artemether, artemisinin và artesunate trên chuột nhắt:

nhiễm P.berghei chủng nhay chloroquine

Thực nghiệm 1: Các loại thuốc và tá dược hàng ngày pha xong điều trị ngay bao gồm: Lô chứng (Cy), lô điều trị artemisinin (ARTq) liều 150 mg/kg/ngày x 7 ngày, lô điều trị artesunate (ASạ) liều 20 mg/kg/ngày x 7 ngày và lô điều trị artemether (ATM) liều 20 mg/kg/ngày x 7 ngày (bảng 7)

Bảng 7: Hiệu lực điều trị cửa artemether, artemisinin và artesunate (thuốc sau khi , pha được điều trị ngay) trên chuột nhiễm P.berghei chủng nhạy chloroquine

Lô thử nghiệm

Trọng lượng (gam) T.binh+ SD | 24,6+2,2 | 23,7408 | 25,7418 | 2474155

Giá tri p: T, so vbi Cy; S, sv Cy; M, sv C, 0,3 0,1 0,8

Tỷ lệ HC nhiém KST tai NO (%) | 0,084 0,06 | 0,10+0,39 | 007+ 0,03 | 0,08 + 0,05

Giá trị p: T, 50 v6i Cy S, sv Cy& M, sv C, 0,4 0,3 0,3

Thời gian sạch KST (ngày) 21+03 | 14+03 | 18+04 Giá trịp: S,sv T„y Mạ sv T, * 0,002 0,07

Tỷ lệ % điều trị kết quả 100% 50% 100% Giá trị p: Tạ so với S„; Mẹ sv S, 0,01 * 0,001

Ghi chi: L6 ching va lo điều trị ATM được thử nghiệm lặp lại lần thứ 2 (n=20)

Nhận xét:

— Lô chứng hàng ngày chuột được uống tá được khôn

đến N3 tỷ lệ hồng cầu nhiễm trên 50% và chuột chết 100% tại N7

— Lô điều trị artemisinin, KST giảm nhanh và sạch KST 100%

phát theo đõi đến ngày 28

— Lô điều trị artesunate, KST giảm nhanh và sạch KST 100%

50% khi theo dõi đến ngày 28

g có thuốc, KST tăng từng ngày,

tại N3 và không tái

tại N2 nhưng tái phát

— Lô điều trị hỗn dịch artemether, KST giảm nhanh và sạch KST 100% tại N2 và không tái phát theo dõi đến ngày 28

17

Thực nghiệm 2: Các thuốc điều trị và tá dược được pha và để nhiệt độ phòng 7 ngày trước khi thử nghiệm bao gồm: Lô chứng (C;), lô điều trị artesunate (AS,) liều 20 mg/kg/24 giờ x 7 ngày và lô diéu trị artemether (ATM,) liều 20 mg/kg/24 giờ x 7 ngày (bảng 8)

Bảng 8: Hiệu lực điều trị của artemether và artesunate (thuốc và tá dược đã pha

để nhiệt độ phòng 7 ngày) trên chuột nhiễm P berghei ching nhay chloroquine

— ** Lô điều trị artesunate (thuốc đã pha để 7 ngày) có khả năng ức chế KST phát triển so với chứng (tại N; KST giảm100 lần so với chứng) nhưng không sạch được KST ở tuần đầu điều trị, mật độ KST tăng đần từ ngày thứ 3 và chuột chết đo mật độ

KST tang cao

— Lé diéu tri hén dich artemether (hỗn dịch thuốc đã pha để 7 ngày), KST giảm nhanh

và sạch KST 100% tại N2 và không tái phát theo dõi đến ngày 28

18