Báo cáo tổng kết khoa học đề tài nghiên cứu nâng cao chất lượng di truyền cá trắm cỏ, cá mrigal

BO THUY SAN Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuy San | Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh BAO CAO TONG KET KHOA HOC ĐỀ TÀI Nghiên cứu nâng cao chất lượng di truyền cá Trắm cỏ, cá Mrigal Chủ nhiệm

BO THUY SAN Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuy San |

Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh

BAO CAO TONG KET KHOA HOC ĐỀ TÀI

Nghiên cứu nâng cao chất lượng di truyền cá Trắm cỏ, cá Mrigal

Chủ nhiệm để tài: Phạm Anh Tuấn

Cán bộ tham gia chính: Lê Quang Hưng, Phạm Đức Hùng, Đặng Tuyết Mai

Hồ Kim Diệp, Nguyễn Hữu Ninh

Bắc Ninh, 3 — 2004

họp cấp Bộ, do Dự án phát triển nuôi trồng thuỷ sản nước ngọt (SUFA) hỗ trợ tài Báp cáo này được chuẩn bị trên cơ số kết quả thực hiện đề tài nghiên cứu khoa chỉnh

Chương I Luận cứ, mục tiêu & nội Dung nghiên cưú

1.1 Luận cứ nghiên cứu

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

1.3 Nội dung nghiên cứu

Chương li Tổng quan nghiên cứu

2.1 Hiện trạng chất lượng giống cá Trắm cỏ, Mrigal

2.2 Các giải pháp nâng cao chất lượng cá nuôi

lến dị Isozyme và ADN trong công tác giống cá

2.4 Nghiên cứu bảo quản tỉnh cá

Chương III Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.2 Nghiên cứu biến dị Allozyme

3.3 Nghiên cứu biến dị DNA-RAPD

3.4 Nghiên cứu biến dị mtDNA-RFLP

3.5 Đánh giá so sánh các đàn cá về sinh trưởng, sức sống

3.6 Nghiên cứu bảo quản tinh cá Trắm cỏ, cá Mrigal

Chưởng IV Kết quả nghiên cứu

ién di Allozyme các đàn cá Mrigal

iến dị DNA-RAPD các đàn cá Trắm cỏ, cá Mrigal

1.1Lu

CHUONG I LUẬN CỨ, MỤC TIÊU & NỘI DUNG NGHIÊN CƯÚ

ân cứ nghiên cứu

Cá Trắm cỏ (Cienopharyngodon idelus), ca Mrigal (Cirrhinuss mrigala) là hai loài cá nuôi chiếm vị trí quan trọng trong nuôi trồng thuỷ sản nước ngọt ở nước tạ Theo ước tính sản lượng cáTrắm cỏ, cá Mrigal hiện chiếm khoảng 25% sản lượng cá nuôi nước ngọt toàn quốc (Bộ Thuỷ Sản 2003) Cá Trắm cỏ, cá Mrigal với nhu cầu dinh dưỡng không cao, thức ăn dễ kiếm, tương đối dễ nuôi,

được nuôi phổ biến trong lồng, ao hồ nhỏ, hồ chứa nước, ruộng cấy lúa .Cá được nuôi đơn, hoặc nuôi ghép với mức độ thâm canh khác nhau, từ nuôi quảng canh đến thâm canh Cá Trắm cổ và cá Mrigal là đối tượng nuôi góp phần xoá đói giảm nghèo, đảm bảo an ninh thực phẩm, đặc biệt với người nghèo các tỉnh

Theo Chevey (1938) có phát hiện cá Trắm cổ phân bố tự nhiên ở sông Kỳ

khu vực tỉnh Lạng Sơn, tuy nhiên đàn cá Trắm cổ đang được nuôi phổ biến

E ta hiện nay lại có nguồn gốc nhập nội, cá Trắm cỏ được nhập từ Trung hăm 1958 vào các tỉnh phía Bắc Đầu những năm 1960s cá Trắm cỏ được lân nhân tạo, cá giống Trắm cỏ một phần được thả ra hệ thống sông Hồng rién thành nguồn lợi tự nhiên và phần khác đã được cung cấp cho các trại

ng xây dựng đàn cá bố mẹ, sản xuất giống nhân tạo phục vụ người nuôi cá lãi phóng miền nam cá Trắm cổ được di giống từ các tỉnh phía Bắc vào các ién Trung, Tây nguyên và Nam bộ

Cá Mrigal có nguồn gốc Ấn độ, lần đầu tiên được nhập vào nước ta năm

từ Lào Năm 1986 đàn cá giống Mrigal được sản xuất thành công bằng kỹ sinh sản nhân tạo tại Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản l, cá giống Mrigal

đã được chuyển tới các trại sản xuất cá giống trong toàn quốc phát triển thành

đàn cái bố mẹ sản xuất cá giống phục vụ người nuôi cá

Cùng với sự thành công của kỹ thuật sinh san nhân tạo va gia tang dang

kể số lượng các trại sản xuất cá giống, một số lượng đáng kể cá giống cá Trắm

Cỏ, cá |Mrigal đã được sản xuất phục vụ người nuôi cá trong cả nước Nhìn chung nhu cầu của người nuôi cá về số lượng cá giống cá Trắm cỏ, cá Mrigal đã được đáp ứng Tuy nhiên trong những năm gần đây chất lượng cá giống cá Trắm có,

cá Mrigal được nhiều người ương nuôi cá lo ngại Người ương nuôi cá ở nhiều địa phương phản ánh chất lượng cá Trắm cỏ, cá Mrigal giảm sút, biểu hiện cá có tốc

độ sinh trưởng chậm, tỷ lệ sống thấp khi ương nuôi

Tìm hiểu tình hình sản xuất cá giống các loài cá nuôi nước ngọt nói chung,

cá Trắm cỏ, cá Mrigal nói riêng (Tuấn & Little, 1995, 2000) cho thấy hầu hết các trại sản xuất cá giống ở nước ta sử dụng đàn cá bố mẹ có kích cỡ bé, cho để tái phát Hục nhiều lần trong năm, do cạnh tranh về thị trường các trại sản xuất cá giống chạy đua đẻ sớm, hiện tượng đẻ ép, lạm dụng kích dục tố trong sinh sản nhân |tạo là khá phổ biến Những hiện tượng nói trên đã kéo dài trong nhiều năm

có thể là nguyên nhân dẫn đến làm suy giảm chất lượng đàn cá giống cá Trắm

2

co, ca Mrigal

Chất lượng đàn cá Trắm cỏ, cá Mrigal hiện nuôi ở nước ta giảm sút có thể

phải kể đến do ảnh hưởng của mức độ cận huyết cao ở các đàn cá bố mẹ Các đàn bá bố mẹ hiện đang dùng tại các trại sản xuất cá giống ở nước ta đều có chung một xuất xứ, từ một đàn cá nhập nội ban đầu, với một số cá thể có hạn khi nhập, thêm vào đó trong quá trình sân xuất hầu hết các trại sản xuất cá giống sử dụng ngay các thế hệ con kế tiếp theo để bổ sung, thay thế đàn cá bố mẹ Sinh sản cùng huyết thống, cùng với số cá thể sinh sản hữu ích (Ne) thực tế lại có hạn làm nghèo biến dị di truyền, gia tăng mức độ cận huyết của các đàn cá Trắm

ta Mrigal bố mẹ tại các trại sản xuất cá giống

Nghiên cứu nâng cao chất lượng đàn cá Trắm cỏ, cá Mrigal là việc làm hết sức cần thiết, có ý nghĩa thực tế góp phần nâng cao năng suất và hiệu quả nuôi

cá Để nâng cao chất lượng di truyền đàn cá nuôi có thể thông qua một số giải pháp khác nhau Đó là: () Đánh giả so sánh các quần đàn cá hiện có ở các trại giống nhằm lựa chọn đàn cá có chất lượng tốt, (ii) Nhập nội đàn cá mới, khắc

phục ảnh hưởng của hiệu ứng quần đàn ban đầu (ii) Sinh sản chéo giữa các đàn

cá hy ong thu được đàn cá có chất lượng tốt hơn do tăng biến dị di truyền hoặc xuất hiện ưu thế lai, và (iv) Thực hiện chương trình chọn giống theo các tính trạng mong hmuốn, đặc biệt là chọn giống nâng cao tốc độ sinh trưởng và sức sống

Mỗi giải pháp nâng cao chất lượng giống nói trên đều có những ưu và hạn

chế nhất định, hiệu quả mong đợi của từng giải pháp cũng rất khác nhau, phụ thuộc vào nhiều điều kiện Khi thực hiện, tuỳ từng giải pháp công nghệ sẽ có các yêu cầu khác nhau về điều kiện cơ sở vật chất, nguồn lực và thời gian Để đáp ứng n hu cầu của sản xuất cá giống hiện tại về chất lượng cá giống cá Trắm cỏ,

cá Mrigal việc nghiên cứu đánh giá so sánh nhằm lựa chọn đàn cá có ưu thế hơn

về ch

trong

Ít lượng, nghiên cứu đề xuất cách sử dụng các đàn cá bố mẹ khác nhau việc trao đổi và lai tạo có lẽ là các giải pháp thích hợp, hy vọng trong thời gian ngắn, sớm đáp ứng nhu cầu nâng cao chất lượng đàn cá Trắm cỏ, cá Mrigal

cỏ, cá Mrigal trong tương lai

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu nâng cao chất lượng di truyền cá Trắm cỏ, cá Mrigal thực hiện từ 3/2002 đến12/2003 với các mục tiêu chính sau đây:

Nghiên cứu nhằm lựa chọn đàn cá Trắm cỏ, cá Mrigal có chất lượng, đề xuất cách sử dụng các đàn cá Trắm cỏ, cá Mrigal khác nhau trong trao đổi và lai

tạo nhằm nâng cao chất lượng đàn cá bố mẹ ở các trại giống

ði dung nghiên cứu

Đề tài đã tập trung vào một số nội dung nghiên cưu chủ yếu sau:

Nghiên cứu đánh giá so sánh một số đàn cá Trắm cỏ, cá Mrigal và con lai oài giữa các đàn cá khác nhau về sinh trưởng, sức sống nhằm lựa chọn đàn cá có ưu thế về sinh trưởng

Đánh giá biến dị di truyền (một số biến dị Allozyme và ADN) các dan cá

cỏ, cá Mrigal làm cơ sở khoa học lựa chọn vật liệu ban đầu cho công tác giống cá Trắm cỏ, cá Mrigal

Nâng cao kỹ thuật bảo quản lạnh tính cá Trắm cỏ, cá Mrigal phục vụ cải hất lượng đàn cá Tram cd, ca Mrigal Nghiên cứu tập trung vào nâng cao rình bảo quản lạnh tỉnh cá Trắm cỏ, cá Mrigal sử dụng thiết bị lạnh có

ng trình máy tính điều khiển Tiến hành các nghiên cứu tối ưu thời gian cân , khả năng thay thế chất chống đông DMSO, tỷ lệ tỉnh: trứng khi thụ tinh

ệc bảo quản lạnh tinh được đơn giản, thuận tiện trong điều kiện thực tế sản nghiên cứu bảo quản lạnh tỉnh bằng xử lý tỉnh cá trực tiếp với nitơ lỏng

g sử dụng chương trình máy tính cũng được thí nghiệm

CHƯƠNG II TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

2.1|Hiện trạng chất lượng giống cá Trắm có, Mrigal

Cá Trắm cỏ, cá Mrigal là hai loài cá nước ngọt hiện đang được nuôi phổ

biến ở nhiều vùng trong cả nước Theo kết quả điều tra về tình hình sản xuất giếng cá nước ngọt thuộc 9 tỉnh đồng bằng sông hồng (DFID,1998) cho thấy

20 % người sản xuất và ương cá giống có kinh nghiệm cho rằng chất lượng cá giếng cá Trắm cỏ, cá Mrigal giảm sút, thể hiện chậm lớn, hao hụt nhiều trong

qu Ạ trình ương nuôi Cá Trắm cỏ và cá Mrigal hiện đang nuôi ở nước ta đều có nguồn gốc nhập nội, số lượng và nguồn gốc đàn cá nhập nội không có tư liệu

ch ắc chắn Cả hai đàn cá Trắm cỏ và cá Mrigal đều từ một đàn cá nhập nội bah đầu được phân tán đi khắp các địa phương, như vậy có thể nói hầu hết các đàn cá Trắm cỏ, Mrigal ở các trại sản xuất cá giống là có cùng nguồn gốc

Hầu hết (50-80%) các trại sản xuất cá giống ở đồng bằng sông Hồng đều sử dụng cá do chính trại sản xuất nuôi lớn để làm cá bố mẹ thay thế cho các cá bố mẹ già, hao hụt trong quá trình sản xuất Việc thay đổi, bổ sung cá

m

Cc =œ

5j từ nơi khác đến cho các trại giếng là rất hiếm hoi Cũng từ kết quả nghiên

u (DEID, 1998) cho thấy hầu hết các cán bộ quần lý trại giống còn hạn chế

về hiểu biết về di truyền, kỹ thuât quản lý đàn cá bố mẹ, hiện tượng cho cá bố

m

bi

la

b dé mét vài cặp thu cá con để gây dựng đàn cá bố mẹ hậu bị cũng khá phổ

En Mặt khác xu hướng cho cá để sớm, sử dụng cá bố mẹ cỡ nhỏ, thành thục

h đầu để sân xuất cá giống nhằm có ưu thế cạnh tranh cao trên thi trường buôn bán cá giống cũng khá phổ biến, dẫn đến làm suy giảm chất lượng cá

gi ống cá Trắm cỏ, cá Mrigal

2 Các giải pháp nâng cao chất lượng cá nuôi

Nâng cao chất lượng giống cá nuôi thông qua đánh giá so sánh giữa các

đồn/dòng cá hiện có nhằm lựa chọn đàn/dòng cá có ưu thế nổi trội để thay thế cặc đàn/dòng cá hiện có nhưng chất lượng thấp được tiến hành khá nhiều trên

ca r6 phi (Mair va ctv 1993, Abucay 2000, Tuan va ctv 1998, 2000) Danh gia

sb sánh giữa các quần đàn còn là việc làm cần thiết nhằm đánh giá vật liệu Khởi đầu, lựa chọn vật liệu cho công tác chọn giống theo những tính trạng mong muốn (Trần Mai Thiên và ctv 1987, 1996, Nguyễn Văn Kiểm 2004)

Lai kinh tế cũng là giải pháp có hiệu quả, đưa lại những công thức lai có thể hiện ưu thế lai nổi trội Cá Chép lai giữa cá chép trắng Việt nam và cá chép

vảy hoặc cá chép kính Hungary, giữa cá chép vàng Indonesia và cá chép

Hungary thé hién uu thế lai về sinh trưởng và sức sống (Pham Mạnh Tưởng &

Trần Mai Thiên 1979, Trần Mai Thiên và cv 1987), cá trê lai giữa cá trê vàng

và cá trê phi (Pham Bau va ctv 1996) lớn nhanh hơn cá trê vàng, màu sắc thịt

hấp dẫn hơn cá trê phi đang được nuôi phổ biến ở Việt Nam, Thái Lan

Một số nghiên cứu thăm dò ưu thế lai khi lai giữa các dòng, các dạng

nh cá khác nhau cũng đã được tiến hành Pham Mạnh Tưởng, Trần Mai Thiên b79) đã tiến hành lai 1 số dạng hình cá chép Việt nam, tuy nhiên không thấy

ưu thế lai thể hiện trong các công thức nghiên cứu Tran Mai Thién va ctv

(2000) đã tiến hanh lai 1 sé dong ca r6 phi O niloticus, ưu thế lai đã xuất hiện

khi lai cá rô phi vằn dòng Swansea với cá rô phi GIFT

Trước khi bắt đầu bất cứ một chương trình chọn giống nào thì việc đánh diá vật liệu ban đầu là hết sức cần thiết Các đàn cá được đánh giá theo biến dị dác tính trạng mong muốn thông qua các chỉ số do, đếm và các dấu hiệu ở mức protein và ADN Thông qua đánh giá biến dị có cơ sở khoa học lựa chọn vật liệu ban đầu cho chọn giống và dự đoán khả năng thực hiện thành công của dác chương trình chọn giống trong tương lai

2.3 Biến dị Isozyme và ADN trong công tác giống cá

lsozyme là các dạng khác nhau của enzyme được mã hoá bởi một hoặc hhiều locus (Markert & Moller, 1959) Isozyme có nhiều allen khác nhau trên

cùng một locus gọi là allozyme Trong hơn 30 năm qua, các nghiên cứu di

truyền cá đã sử dụng điện di isozyme phân tích mức độ biến di di truyền của các| đàn cá ở các loài cá khác nhau Nghiên cứu biến dị isozyme phục vụ đắc lực cho công tác giữ giống thuần, bảo tổn nguồn gen, đánh giá lựa chọn vật liệu

ban đầu khi thực hiên chương trình chọn giống Macaranas và ctv (1995) phân tích điện di 30 isozyme trên 8 dòng cá rô phi O nífoficus, trong đó có 4 dòng cá

tự nhiên Châu Phi và 4 dòng cá nuôi ở Châu Á Kết quả phân tích đã xác lập mức độ đa hình của các dòng cá về các isozyme nghiên cứu, mức độ dị hợp tử của các dòng cá, xác định được tương đồng di truyền giữa các dòng cá và dự đoán các công thức sinh sản cho ưu thế lai Kết quả tương tự trong các nghiên cứu phân tích allozyme trên các đàn cá Chép ở Pháp và các đàn cá chép ở

Czech (Desvignes và Durand, 2000) đã xác định tỷ lệ cá thể dị hợp tử ở các

đàn cá nghiên cứu, dự đoán phương án lai tạo giống có hiêu quả

Nghiên cứu biến dị isozyme trên cá Rohu, Mrigal, Catla đã đựơc các nhà

khỏa học Ấn độ tiến hành từ cuối những năm 1980s Padhi và Khuda-Bukhsh

(1989) nghiên cứu LDH, MDH trên cá Rohu, cá Mrigal và cá Catla, cả 3 loài cá

đều thấy xuất hiện một kiểu hình của LDH với 3 band Khi đó với MDH thấy có

sự thay đổi, giao động từ 1-6 band ở cá Catla, 3-4 band ở cá Rohu và 2-5 band

Phân tích isozyme cũng rất có ích, giúp xác lập các chỉ thị di truyền phân

biệt các đàn cá Tuy nhiên do hạn chế về sự phân tách của các protein trong điện di nên phân tích isozyme đôi khi không đủ để phân lập sự khác biệt giữa

các quần đàn, giữa các cá thể Các phương pháp phân tích ADN có tiểm năng

to liớn hơn nhiều không việc đánh giá biến dị di truyền, xác định khác biệt giữa

các quần đàn, giữa các cá thể

Phân tích biến dị ADN ty thể (mtDNA) được chú ý nhiều trong các nghiên

cửu di truyền m†DNA tương đối dễ tách chiết, di truyền tế bào, có nguồn gốc từ củn cái, mức độ biến dị dễ dàng được phát hiện, đặc biệt mức độ cận huyếtổiTong những năm gần đây phân tích mtDNA dành được sự chú ý nhiều hơn, thể hiện ưu thế hơn phân tích isozyme khi đánh giá cấu trúc quần đàn, xác lập sinh sản hữu ích (Ne) và ảnh hưởng trôi đạt di truyền, mất biến dị (Carvalho

& Pitcher ,1995)

Sử dụng phân tích mtDNA-RFLP đánh giá các quần đàn cá Catla,

Rohu, Mrigal thu từ tự nhiên và các trại giống đã được thực hiện (Padhi và Mandal 1995) Kết quả phân tích cho phép đánh giá tính đa hình về 1 số

marker ở các quần đàn cả nghiên cứu Basavaraju và ctv (1997) phát triển và

sử dụng các marker ADN đánh giá biến dị di truyền các quần đàn cá Catla ở các trại cá giống khác nhau Kết quả cho thấy phân tích biến dị ADN là công cụ

có hiệu quả xác định mức độ biến dị di truyền giữa các dòng, quần đàn cá, cho thấy sự khác biệt giữa các đàn cá

Ở nước ta cũng đã có một số công trình nghiên cứu ứng dụng phân tích

allozyme va cac marker ADN trong bảo tồn quỹ gen và nâng cao phẩm giống

động vật thủy sản Trần Mai Thiên và ctv (1987), Phạm Anh Tuan va ctv (1885) nghiên cứu biến dị 1 số isozyme trên các dạng hình cá chép ở Việt

nam Nguyễn Mộng Hùng, Võ Thương Lan và Nguyễn Dương Dũng (2000)

phận tích 1 số marker ADN phục vụ phân biệt 1 số dòng cá Trắm cỏ, cá Mè trắng Trần Mai Thiên và ctv, (2000) bước đầu nghiên cứu 1 số đặc trưng ADN phục vụ xác định giới tính ở tôm càng xanh

Mặc dù các nghiên cứu nói trên số isozyme và marker ADN nghiên cứu

còn hạn chế, số mẫu phân tích chưa nhiều, nhưng các nghiên cứu đã mở ra việc ứng dụng các phân tích di truyền trong công tác giống thủy sản ở nước ta Đối với cá Trắm cỏ, và cá Mrigal thì hầu như các nhà nghiên cứu nước ta chưa

cá những phân tích biến dị allozyme và marker ADN ở 2 loài cá này Việc phân tích biến dị allozyme và 1 số marker ADN trên 2 loài cá này sẽ rất có ý nghĩa trên phương diện bảo tồn giống thuần và phục vụ nâng cao chất lượng giống cá Trắm cỏ, cá Mrigal

2L4 Nghiên cứu bảo quản tỉnh cá

Bảo quản tinh cá được Ứng dụng trong sinh sản nhân tạo, bảo vệ quỹ

en và cải thiện chất lượng giống cá Trên thế giới đã có khá nhiều các nghiên

ứu về bảo quản tinh cá được công bố (Stein & Bayrle1978, Stoss 1983, Rana

4995, Maisse va ctv.1998, Brow va ctv.1999, Gwo 2000, va Lahnteiner 2000)

Witiam và Tiersch (2000) để xuất quy trình bảo quản lạnh tỉnh cá, bao

gồm các bước: thu tỉnh trùng, đánh giá chất lượng tinh trùng, pha loãng tỉnh với extender và chất chống đông, kỹ thuật đóng mẫu, chạy chương trình hạ nhiệt,

khuyển mẫu tinh vào lưu giữ, giải đông và tiến hành thụ tỉnh với trứng Mỗi bước Eủa quy trình đều có ảnh hưởng nhất định tới kết quả bảo quản tỉnh Rao (1989)

va Gwo (2000) cho những yếu tố ảnh hưởng tới kết quả bảo quản lạnh tỉnh cá bao gồm: chất lượng tinh, thành phần extender, tỷ lệ pha loãng, chất chống

đông, nỗng độ chất chống đông, thời gian cân bằng, chương trình hạ nhiệt,

phương pháp giải đông và chất lượng trứng

Tới nay đã có hơn 200 loài cá nước ngọt và 40 loài cá biển được nghiên cứu bảo quản lạnh tỉnh, trong số các loài cá nước ngọt, cá Chép (Cyprinus carplo) là đối tượng được nghiên cứu khá nhiều (Gwo 2000, Gordra và cív,

ph

vớ

út sau đó mới chuyển vào giữ trong nitơ lồng Alsevers (1964) làm lạnh chậm

¡ tốc độ 1,5 - 2°C/phút trong hơi nitơ lỏng cho tới -80°C, tiếp đó chuyển vào giữ trong nitơ lỏng Kết quả tỷ lệ thụ tính trung bình là 16,8% (giao động 0 -

54%) so với đối chứng là 38% (giao động 8,7 - 66%)

Dubin và ctv (1982) bảo quan tinh Tram cd (Ctenophryngodon idella)

dùng 3 extender , dé la 6% glucose, 0,73% NaCl; 0,75 NaHCO, va 0,9 % NaCl

.Tỷ lệ pha loãng vdi 3 extender la 1:1 va 1:3 Chat chéng déng DMSO 10% Tốc độ làm lạnh 1°C/phút tới -20°C sau đó lưu giữ trong nitơ lông Giải đông nhánh ở nhiệt độ phòng, tiến hành thụ tỉnh mỗi mẫu ứng 4000 trứng gieo với số lượng tinh khác nhau: 0,02ml, 0,04ml, 0.2ml,và 1,7ml Kết quả tỷ lệ thụ tính tương ứng là 99%, 32%, 51% và 57%

Kumar (1987) thí nghiệm bảo quản tính cá Rôhu, cá Mrigal và cá Catla trong nitơ lổng, thử nghiệm với 7 extender khác nhau gồm: huyết thanh, dung dich Alsever, dung dich Ringer — Danting, extender M?, dung dịch urê - lòng đỏ trú g và muối citrate - lòng đỏ trứng và 2 loại chất chống đông [a glycerol va DMSO Két qua cho thay extender có muối citrate - lòng đỏ trứng là tốt nhất,

tiếp theo là dung dịch urê - lòng đổ trứng và cuối cùng là extender M° Sau 20

ngày bảo quản tỷ lệ hoạt động của tỉnh cá Rôhu là 50%, cá Mrigal là 10%, còn tính cá Catia hầu như chết hết :

đủ

ch

Horvath và cfv (2003) thử nghiệm với 5 dung dịch pha loãng khác nhau:

fờng Sucrose, Giucose, Fructose, KCI và dung dịch Kurokura 2 và 2 loại chất ống đông (DMSO và Methanol) có cùng nồng độ 10% Tỷ lệ pha loãng 1:9

(tinh: dung dịch bảo quản), với chất chống đông DMSO trước khi làm lạnh được

cân bằng trong thời gian 10 phút, với Methanol sau khi pha loãng đưa ngay vào

làm lạnh Phương pháp làm lạnh bằng hơi nitơ lỏng cách bề mặt nitơ lỏng 3 cm trong thời gian 3 phút, sau đó nhúng trực tiếp vào nitơ lỗng Kết quả cho thấy tỷ

lệ vận động của tinh bảo quản khi sử dụng dung dịch Glucose và Methanol là 63+Ð%, và không sai khác so với đối chứng

Rana va ctv (1990) nghiên cứu ảnh hưởng của dung dịch pha loãng, thời gian cân bằng nhiệt tới khả năng bảo quản tỉnh cá Rôphi (Oreochromis

niloticus L.) Dung dich pha loang là muối Ringer có thay đổi với 10% methanol (duhg dịch 1) và dung dịch muối Ringer của Ginsburg (1963) với 5% methanol

và [15% sữa bột (dung dịch 2) Sau khi pha loãng với 2 dung dịch trên, tinh trùng được đóng vao cong 0,25 ml va can bằng trong thời gian 15, 30, 45, 60 và

90 phut & 20°C Cac cọng mẫu được làm lạnh theo chương trình làm lạnh Kryo-

10 với tốc độ 5°C/phút xuống —50°C, sau đó nhúng trực tiếp vào nitơ long Kết quả cho thấy ảnh hưởng của dung dịch pha loãng và thời gian cân bằng là có ý nghĩa (P< 0,05) Tất cả lô thí nghiệm với các thời gian cân bằng khác nhau, sử

dụng dung dịch pha loãng 1 cho tỷ lệ vận động của tinh trùng sau khi giải đông cao hơn có ý nghĩa so với dung dịch pha loãng 2 Lô dung dịch 1, khi rút ngắn

thời gian cân bằng hoạt lực của tinh bảo quản tăng lên có ý nghĩa (P< 0,05) Ở dung dich 2, thời gian cân bằng 60 và 90 phút sự sống của tinh sau khi bảo quản không thể hồi phục

Horvath va Urbanyi (2000) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các chất chống đông tới khả năng vận động và thụ tỉnh của tỉnh cá Trê phi (Cfarias

g

loại như sau: 5 -11% giycerol, 5 -15% ethylene glycol, methanol, propylene glycol, 10% DMSO (dimethy! sulphoxide) va DMA (dimethyl acetamide) Dung dich pha loãng gồm 6% Fructose với bufer của NaHCO,-CO; Sau khi pha

loãng tinh được.cân bằng 2, 5, 10, 15, 20 và 30phút Kết quả tỷ lệ thụ tỉnh và tỷ

lệ |nở khi sử dụng 10% DMSO va 10% DMA và thời gian cân bằng là 10phút là cao, tỷ lệ vận động trung bình của tỉnh bảo quản là: 44,0% + 9,7% và 22,6% +

18,1% Tỷ lệ thụ tinh ở lô dùng DMSO là 85,1 + 4,2% khi thụ tinh khô và 86,7 + 5j% khi thụ tinh ướt, đối với DMA là 83,9 +8,4% (thụ tỉnh khô) và 83,3 +10,7%

® riepinus, Burchell 1822) Các chất chống đông và nồng độ sử dụng gồm 6

10

(thù tỉnh ướt), khi đó lô đối chứng đạt 93,2 + 2,1% Tỷ lệ nở lô dùng DMSO là 67|1 + 11,9% va DMA là 63,0 + 9,9% và đối chứng đạt 77,3 +12,5% Khi đó với

các chất chống đông: glycerol, etnylene glycol, methanol, propylene glycol đều chb kết quả kém, tinh có ty lệ vận động thấp và không có trứng được thụ tỉnh

Vai glycerol, ty 16 van động đạt được 2,5 + 2,8%, propylene glycol dat 10,7

+8,5%, methanol đạt 6 + 4,4%, ethylene giycol hoàn toàn không có tỉnh vận

động

Ở Việt Nam, nghiên cứu bảo quản tỉnh cá đầu tiên được tiến hành với phương pháp bảo quản đơn giản, tinh dịch còn nguyên được cất giữ ở nhiệt độ thấp (Dương Tuấn, 1978) Bảo quản tinh ca trong nitd lỏng mới được nghiên

cứu trong những năm gần đây Hồ Kim Diệp và ctv (2002) đã nghiên cứu xây

dựng dự thảo quy trình bảo quản tinh cá Chép, Trắm cỏ, Mrigal và cá Bỗng tròng nơ lông Các dung dịch bảo quản sử dụng trong nghiên cứu gồm: Kurokura 2 va 10%DMSO (st dụng để bảo quản tinh cá Chép), Durbin A va

44% DMSO (ca Mrigal), Durbin B va 8% DMSO (ca Tram cd) va Durbin B va

6% DMSO (cá Bỗng) Kết quả đạt được tý lệ thu tinh và tỷ lệ nở trung bình ở cá

Chép là 41,96% và 49,46%; cá Mrigal là 72,99% và 60,77%; cá Trắm cỏ là 79,47% và 29,36%; cá Bỗng đạt 41,86% và 51,44%

Tuy nhiên để nâng cao kết quả bảo quản tinh cá, một số vấn đề cần tiếp tức nghiên cứu, đó là: thử nghiệm các chất chống đông khác nhau, đặc biệt DMSO là chất khá độc việc thay thế bằng chất chống đông ít độc hơn có thể lầm tăng hiệu quả bảo quản tỉnh và tránh độc hại cho người thực hiện bảo quản tỉnh Quy trình bảo quản có thể đơn giản và dễ thực hiện hơn, thông qua nghiên cứu đơn giản 1 số bước trong quy trình như: quá trình cân bằng, phương pháp

oo m lạnh Hầu hết các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về bảo uản lạnh tỉnh cá mới dừng ở đánh giá kết quả bảo quản thông qua tỷ lệ thụ inh và tỷ lệ nở của trứng được thụ tính bằng tinh bảo quản Cần thiết phải có =

2 hững nghiên cứu đánh giá chất lượng cá được sản xuất bằng tỉnh bảo quản ảnh thông qua theo dõi sức sống và sinh trưởng của cá sau khi nở

11

CHƯƠNG Ill VAT LIEU & PHUONG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

Cá Trắm cô sử dụng trong nghiên cứu của đề tài gồm 4 đàn cá: đàn cá thu

từ trại| cá giống Yên Lý (Nghệ An), đàn cá thuộc Để tài lưu giữ nguồn gen và

giéng|thuy san tại Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I (Bắc Ninh), đàn cá thu

từ Trại cá thị xã Sơn La thuộc Công ty giốngThuỷ Sản tỉnh Sơn La, và đàn cá nhập hội năm 2000 từ Trung quốc qua con đường biên giới ở Quảng Ninh Mỗi dan c@ thu 20 - 30 cặp cá, kích cỡ 3 - 5 kg Bốn (04) đàn cá Trắm cỏ nói trên sau đây trong báo cáo được gọi tắt là các đàn cá Trắm có Nghệ An, Viện I, Sơn La và Trung Quốc

Cá Mrigal sử dụng trong nghiên cứu của đề tài gồm 3 đàn cá: đàn cá thu

từ trại cá giống Yên Lý (Nghệ An), đàn cá thuộc Đề tài lưu giữ nguồn gen và giống thuỷ sản tại Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I (Bắc Ninh), và đàn cá thu tỪ Trại cá thị xã Sơn La thuộc Công ty giốngThuỷ Sản tỉnh Sơn La Mỗi đàn

cá thù 20 - 30 cặp cá, kích cỡ từ 1 - 1,5 kg Ba (03) đàn cá Mrigal nói trên sau đây thong báo cáo được gọi tắt là các đàn cá Mrigal Nghệ An, Viện |, va San La

Các đàn cá bố mẹ Trắm cỏ và cá bố mẹ Mrigal được thu thập từ Sơn La, Nghệ An và Trung Quốc về Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I_ (Đình Bảng,

Từ Sơn, Bắc ninh) năm 2000, cá được đánh dấu CWT từng cá thể, để phân biệt

các đàn cá khác nhau, các cá thể cùng đàn cá có cùng kiểu đánh dấu Cá bố mẹ các đàn cá cùng loài được nuôi chung, trong điều kiện môi trường ao nuôi Chế

độ nuôi dưỡng và quản lý cá bố mẹ thực hiện theo Quy trình nuôi võ cá bố mẹ cá

Trắm cỏ, cá Mrigal (Bộ Thuỷ Sản, 2000)

12

vung

3.2 Nghiên cứu biến dị Allozyme

Nghiên cứu đa hình 25 enzyme: ACON, AK, ADH, AO, AAT, ALD, EST, FUM, B6PDH, GPI,G3PDH, HEX, IDH, LDH, MDH, ME, MPI, PGM, SOD, GDH, GPT, NP, PER, CK, aGPD trén 4 đàn cá Trắm cỏ bằng phương pháp điện di trên 3 loại gel: Agarose, tinh bot thuy phan va Acrylamide (Bang 3.1)

Bang 3.1 Cac enzyme phan tích trên các đàn cá Trắm cỏ nghiên cưú

Với mỗi enzyme phân tích 40 mẫu/đàn cá, khí phát hiện đa hình ở enzyme nào thì tập trung nghiên cứu trên enzyme đã phát hiện đa hình , vối số mẫu 56 cá

thể/đàn Mẫu thu từ mô gan, cơ, mắt

Cá nghiên cứu được thu mẫu khi còn sống, mổ lấy gan, cơ, mắt để phân

tích biến dị Allozyme Những mẫu cá chưa có điều kiện phân tích ngay, mẫu được đánh số và bảo quản trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ —842C

Nghiền mẫu

Mẫu được nghiền cùng dung dịch nghiền mẫu, tý lệ dung dịch/trọng lượng

mẫu là 1:2 Thành phần hoá học của dung dịch nghiền mẫu thể hiện ở Bảng 3.2 Nghiền| mẫu bằng que thuỷ tỉnh, trong quá trình nghiền mẫu phải luôn giữ ở nhiệt

- Chạy điện di

Gel agarose:

Sử dụng agarose 1,2% (1,2g agarose trong 100ml dung dich dém), buffer

TC pH = 7,1, TG pH = 8,0 và TBE Kích thước của bản đúc gel la 28 x 20 x 0,3

cm Mỗi ban gel có thể nạp được 32-34 mẫu trong một lần chạy điện di

14

Bang 3.3 Thành phần hoá học của các buffer TC, TG và TBE

Citric acid 3,505g Boric acid 30,9g Glycine 144,0g

EDTA 1000mÍ H;O

Với buffer TC pH = 7,1 không cần phải pha loãng trước khi đúc bản gel hoặc dùng làm dung dịch đệm điện cực Còn với buffer TG stock và TBE stock cần phải pha loãng trước khi sử dụng

Bảng 3.4 Liều lượng pha loãng buffer khi sử dụng

Dùng cho đúc bản gel Đêm điện cực

TG 8.0 50 450 1:9 TBE 23,4 440 1:5

Gel tỉnh bột:

Sử dụng tinh bột thuỷ phân 11,7% (55g tinh bột cho 470ml buffer) để đúc

gel chạy điện di Kích thước bản đúc gel là 19,5 x 17,5 x 1cm Mỗi bản gel được

chia lắm hai, do đó có thể nạp được 40 mẫu cho một lần chạy Sau điện di cắt

ban gel thành 8 bản mỏng, mỗi bản mỏng sẽ dùng để nhuộm một enzyme riêng biệt, Buffer sử dụng là TG pH = 8,0

15

Buffer sử dụng là TC pH = 7,1 Kích thước bản đúc gel 17,5 x 16 x 0,2cm

Với mỗi bản gel acrylamide có thể nạp được 20 mẫu

Trong quá trình chạy điện di, buffer có thể sử dụng hơn một lần để tiết kiệm (dùng 50% lượng buffer cũ và 50% lượng buffer mới rồi trộn đều cho mỗi lần chạy shu đó)

Chế độ dòng điện khi chạy điện di thay đổi theo loại gel sử dụng, chỉ tiết

chế độ dòng điện thể hiện ở Bằng 3.5

Bảng 3.5 Chế độ dòng điện sử dụng khi chạy điện di

lloai gel Hiệu điện thế | Cường độ dòng điện | Công suất | Thời gian

Agarose 150 - 250 18 - 20 2-3 4 -—4h30

- Tinh bột 220 - 250 38 - 40 8-10 5h30 —6 Agrylamide 220 - 300 20 | 4-6 6h30 — 7

-Nhuộm bản gel:

Mỗi enzyme được nhuộm bởi một cơ chất, chất xúc tác và thuốc nhuộm

đặc hiệu Thuốc nhuộm được đổ đều lên bề mặt bản gel, sau đồ đặt vào tủ ấm

37°C, trong điều kiện không có ánh sáng Tuỳ từng loại enzyme mà thời gian biểu hiện các băng vạch trên điện di đồ là khác nhau ,

16

vane

- Phân tích kết quả điện di :

Xử lý số liệu bằng phần mềm TFPGA Tính tần số alen theo công thức của Ayala|(1982)

Trong đó: D là khoảng cách dị truyền

T: Chỉ số tập trung trung bình của tất cả các locus nghiên cứu

Mifisateenses

3.3N ghiên cứu biến dị DNA-RAPD

Phương pháp DNA-RAPD (Random amplified polymorphic DNA) là nhân những đoạn ADN đa hình một cách ngẫu nhiên Phương pháp này sử dụng một đoạn mồi từ 10-20 Nucleotide có trình tự bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với trình ty chuỗi ADN một cách ngẫu nhiên Thông qua phương pháp PCR, những đoạn BDN nằm giữa các mồi sẽ được nhân lên với số lượng rất lớn Tuy theo trình

tự khác nhau của các chuỗi ADN giữa các cá thể hay quần đàn mà các đoạn mồi

sẽ bắt cặp tại những vị trí khác nhau và sẽ nhân lên các đoạn có kích thước khác nhau,| sự khác nhau của các đoạn này được kiểm tra thông qua phương pháp điện di trên gel agarose Các bước phân tích mẫu và phân tích số liệu thể hiện tóm tắt ở Hình 3.1

Hinh 3.1 Sơ đồ các bước phân tích DNA-RAPD ở cá Trắm cô và cá Mrigal

Phân tích biến dị DNA-RAPD trên 4 đàn cá Trắm cỏ: Viện I, Nghệ An, Trung Quốc và Sơn La Phân tích biến dị DNA-RAPD trên 3 đàn cá Mrigal: Viện

!, Nghệ An và Sơn La Mỗi đàn cá thu mẫu nghiên cứu 30 — 35 cá thể Thu mẫu

18

vây để tách chiết ADN, mỗi mẫu dùng 20-30 mg vây Sử dụng dung dịch nghiền mẫu Call Lysis Solution (10 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% SDS pH 8,0) kết hợp

với proleinase K, ủ ở 65°C đến khi mẫu tan hoàn toàn Ủ mẫu với RNase

(10mg/ml) ở 37°C trong khoảng 30 phút để loại ARN Kết tủa protein bằng 7.5 M

Amonium Acetate, kết tủa ADN bằng isopropanol Sau đó rửa ADN bằng cồn

70° Kết tủa ADN được hoà tan trong đệm TE 8.0 và giữ ở điều kiện lạnh Phản ứng PđR được sử dụng với các mổi ngẫu nhiên, đó là OPJ-5, OPJ-7, OPJ-11, OPQ-3; OPQ-14

3.4 Nghiên cứu biến dị mtDNA-RFLP

Phân tích m†DNA-RFLP tiến hành trên 4 đàn cá Trắm cỏ, sử dụng các mồi L-19M,và M-6498M; khi thực hién phan Gng PCR Trinh ty mồi như sau:

- Mồi L-19M:: 5'-ACC CCT GGC TÁC CAA AGC CA-3'

- Mồi M-6498M;: 5-CCT GAA ATG AGG AAC CAG ATG-3’

Chu trình nhiệt của phản ting PCR bat đầu ở 94°C trong 4 phút; 35 chu kỳ: 94°C trong 30 giây, 50°C trong 30 giây, 72°C trong 90 giây, 72°C trong 7 phtt Thanh phan cho mét phan ting PCR gém 10X PCR Buffer, 1.5mM MgCl,, 200uM dNTPs, primer 10mM, 0.04U Taq polymerase, 20ng ADN và ddH,O Sản phẩm PCR kiểm tra trên gel agarose 1%, đệm TAE nhuộm Ethyldium bromide 1%

Để tìm ra các enzyme giới hạn cắt đa hình với cá Trắm cỏ nghiên cứu, đại

diện mẫu của mỗi đàn cá được tách chiết ADN và giải trình tự Phân tích trình tự

nucleptide của các mẫu cá với phần mềm Cutter 2.0 để tìm ra các enzyme giới hạn dắt đa hình Kết quả phân tích đã tìm ra 3 enzymes giới hạn cắt đa hình, đó là: Avall, Nspl và EcoNl

Phản ứng PCR với cặp mồi L-19M,và M-6498M; nhân đoạn ADN đặc

hiệu, sản phẩm PCR được cắt bằng các enzymes giới hạn Thành phần cho một

19

phản ứng cắt enzyme giới hạn gồm 10X Buffer, 10X BSA, 0.05U enzyme va sản

phẩm PCR Sản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn được kiểm tra khi chạy điện di

trên

định

gel agarose 2%, nhuộm ethidium bromide Kích cỡ các đoạn cắt ADN xác

dựa trên mức độ dịch chuyển so với thang marker chuẩn 100bp

Bản phẩm cắt bằng enzyme giới hạn dịch chuyển với khoảng cách khác

nhau khi chạy điện di trên gel agarose Sự đa dạng của các băng vạch mã hoá

theo kỷ tự chữ cái, mỗi chữ cái tương ứng với một haplotype hay một kiểu cắt Số

liệu được mã hoá và xử lý trên phần mềm REAP 4.0 và PHYLIP 2.1A đánh giá sự

sai khác ở độ tin cậy > 95% (P<0,05)

3.5 Đánh giá so sánh các đàn cá về sinh trưởng, sức sống

nuôi

Cá bố mẹ các đàn cá nghiên cứu được nuôi trong ao tại Viện nghiên cứu trồng thuỷ sản I, áp dụng cùng chế độ nuôi vỗ hai giai đoạn với các đàn ca

cá bố mẹ theo Quy trình nuôi vỗ cá bố mẹ cá Trắm cỏ, cá Mrigal (Bộ Thuỷ Sản,

2000)| Cho đẻ thu thế hệ con các đàn cá để đánh giá so sánh trong cùng ngày Mỗi đền cá thu thế hệ con từ ít nhất 5 cặp cá bố mẹ Trứng cá sau khi thy tinh được ấp trong binh Weise, theo dõi tỷ lệ thụ tỉnh, tỷ lệ nở của các công thức thí nghiệm Cá sau khi nở, hết noãn hoàng được ương thành cá hương trong các giai lưới mịn, giai có kích thước 2 x 1 x1 m, với mật độ cá thả 1.000 con/giai, cá trong

1 giail là cùng công thức thí nghiệm, mỗi công thức được ương trong 10-15 giai

Kết thúc giai đoạn cá hương, đếm cá trong từng giai tính tỷ lệ sống, xác định trọng lượng cá ở từng giai

kích

Giai đoạn ương cá hương đến cá giống, cá được nuôi trong các giai lưới có

hước 5 x 4 x 1,5 m, với mật độ 1.000 congiai, mỗi công thức được ương

trong 8-10 giai Khi cá giống đạt kích cỡ 3-5 g/con, tính tỷ lệ sống, trọng lượng cá

ở từng giai thí nghiệm

20

+

á giống các công thức được đánh dấu trước khi đưa nuôi so sánh giai đoạn cá trưởng thành Dùng dấu CWT, đánh dấu từng cá thể, dấu CWT được đánh ởi các vị trí như: trên thân dưới gốc vây lưng bên phải, trên thân dưới gốc

vây lưng bên trái, gốc vây đuôi bên phải, gốc vây đuôi bên trái, mí mắt cá

thuộc các công thức khác nhau dấu được đánh ở những vị trí khác nhau

Nuôi so sánh các đàn cá ở giai đoạn trưởng thành được tiến hành trong các ao đất tại Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản | (Binh bang, Từ sơn, Bắc Ninh) và Trạm nghiên cứu thực nghiệm Mê Linh (Vĩnh phúc) Các ao nuôi có diện tích 15D0 — 2000 m2 Cá các công thức được thả nuôi chung, mỗi thực nghiệm tiến hành trên 3 ao Các ao được quản lý chăm sóc với chế độ thay nước và cho

ăn giống nhau, cá Trắm cổ cho ăn thức ăn xanh, kết hợp với thức ăn viên nổi của

Hãng

Hãng

trưởng

hoạch

Protoco cé 26% đạm, khi đó cá Mrigal chỉ cho ăn thức ăn viên nổi của

frotoco có 26% đạm Hàng tháng kéo lưới thu mẫu kiểm tra tốc độ sinh

và điều chỉnh thức ăn Chế độ cho ăn 1-3 % trọng lượng cá thả Khi thu

¡ kéo lưới và tát cạn thu cá, đếm số cá từng công thức, cân tổng trọng

lượng đàn cá thu, thu mẫu ngẫu nhiên từ mỗi ao nuôi 30 cá thể mỗi đàn cá, dùng

cân điện tử độ chính xác 0,1g và thước đo độ chính xác 0,1 cm để cân đo từng cá thể

[Tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn các số liệu về tỷ lệ sống, trọng lượng

cá ở từng lồ thí nghiệm Phân tích biến dị ANOVA xác định sự khác biệt giữa các

công thức thí nghiệm ở độ tin cậy > 95% (P<0,05) Các số liệu ở dạng tỷ lệ %,

như tỷ lệ sống được chuyển đổi số liệu thành dạng phân bố chuẩn trước khi phân

tích các tham số thống kê (Gomez & Gomez,1984)

3.6N phiên cứu bảo quản tỉnh cá Trắm cỏ, cá Mrigal

Thu tỉnh cá:

21

O a» bố mẹ thành thục, khoẻ mạnh được chọn và tiêm kích dục tố LRHa, và

DOM (Uomperidone) Cá Trắm cỏ tiêm 0,01mgLRHa + 2,78mg DOM 4 ca ca duc; 0 03mg + 8,33mg DOM 4 ca cai Sau khi tiêm 6 - 8 giờ kiểm tra va thu tỉnh

Cá Mrigal tiêm 0,01mgLRHa + 0,62mg DOM/1kg 6 cá đực; 0,03mg + 1,66mg DOM /

K

1lkg ở cá cái Sau khi tiêm 6 - 10 giờ kiểm tra và thu tinh

hi thu tinh, trước hết lấy khăn hoặc vải mềm khô sạch thấm quanh lỗ sinh dục, dùng tay vuốt nhẹ bụng cá cho tỉnh chảy vào cốc chứa mẫu, không nên vuốt

mạnh qua làm tổn thương buồng sẹ, tránh không để tạp chất như phân, máu lẫn

vào D ung cu lay tinh được vô trùng trước khi sử dụng

vạch 1 Ð1), lắc đều và bỏ vài giọt tinh dịch pha loãng ban đầu trong ống hút, sau

đó cẩn|thận nhỏ một giọt vào buồng đếm đã chuẩn bị sẵn: Đếm tỉnh trùng trong

các ô đếm hồng cầu (4 ô ở 4 góc và 1 ô ở giữa, mỗi ô trung bình có 16 ô nhỏ, mỗi

ô nhỏ

hàng,

tó diện tích 1/400mm và độ sâu 1/10mm) Đếm tỉnh trùng theo đầu, từng hết hàng nọ đến hàng kia theo hình chữ chỉ Những tỉnh trùng nằm trên cạnh ô|nhỏ chỉ đếm hai cạnh thường là cạnh trên và cạnh phải

Công thức tính mật độ tỉnh trùng/ml tinh dich:

N x Rx 4000 x 1000

80

Trong dé: D: mật độ tinh trùng (tb/ml)

N: tổng số tinh trùng trong 80 ô đếm R: hệ số pha loãng

2

ân bằng nhiệt: sau khi tinh được pha loãng với exfender và DMSO, lắc

đều để |cân bằng ở nhiệt độ 4 - 6°C trong thời gian 5 phút

óng cọng: trước khi đóng mẫu vào cọng phải kiểm tra hoạt lực tinh, extendbr pha loãng không kích hoạt tỉnh trùng là đạt tiêu chuẩn Dùng pipet hoặc xylanh |hút tinh vào cọng tránh không để có bọt khí Cọng mẫu có thể tích 0,25

,5ml được hàn kín (dùng panh hơ nóng trên đèn cồn kẹp lại), thấm khô buồng làm lạnh của máy Cryogenic CL 863 Khi các cọng mẫu hàn kín

đã được đưa hết vào buồng làm lạnh, bắt đầu chạy chương trình hạ nhiệt do chương trình máy tính điều khiển

Làm lạnh được thực hiện theo chương trình của Steyn và Van Vuren (1987), Magyary va ctv (1996), Urbanyi (1999) với tốc độ hạ nhiệt như sau:

Ram 1: Hạ từ 4°C xuống - 4°C, tốc độ hạ nhiệt 4”C/phút

Ram 2: Ha từ - 4°C xuống - 80°C tốc độ hạ nhiệt 11?C/phút

au khi kết thúc chương trình làm lạnh, mẫu tinh nhanh chóng được chuyển

vào các Canister trong bình nitơ long (-196°C) bao quan dai han

ể nâng cao hiệu quả bảo quản lạnh tinh cá Trắm cỏ, cá Mrigal dé tài đã

tiến hành một số thí nghiệm so sánh:

Bảo quản lạnh tỉnh có thời gian cân bằng nhiệt và không có thời gian cân

bằng nhiệt:

ô thí nghiệm và lô đối chứng được tiến hành đồng thời trên cùng mau tinh,

các quy trình kỹ thuật bảo quân lanh nhu extender, chat chống đồng, chu trình

23

lành giống nhau Khác biệt duy nhất giữa lô thí nghiệm với lô đối chứng là

ở lô thí nghiệm tỉnh bảo quản lạnh không trải qua giai đoạn cân bằng, khi đó ở lô

đối chứng tinh sau khi được pha loãng với extender và chất chống đông được cân

bằng ở nhiệt độ 4-6°C trong thời gian 5 phút

: Nghiên cưu thay thế chất chống đông DMSO khi bảo quản tinh bang sử dụng Giycerol:

Lô thí nghiệm và lô đối chứng được tiến hành đồng thời trên cùng mẫu tinh, các quy trình kỹ thuật báo quản lạnh như: extender, cân bằng nhiệt, chu trình làm lạnh

Lô thí nghiệm và lô đối chứng được tiến hành đồng thời trên cùng mẫu các quy trình kỹ thuật bảo quản lạnh như: extender, chất chống đông, cân bằng nhiệt giống nhau Khác biệt duy nhất giữa lô thí nghiệm với lô đối chứng

là ở

lỗng

lạnh

lô thí nghiệm tỉnh sau khi được cân bằng nhiệt được làm lạnh trong hơi nitơ

B phút sau đó đưa trực tiếp vào nitơ lỏng, khi đó ở lô đối chứng tinh được làm theo chương trình máý tính với tốc độ hạ nhiệt như sau:

Ram 1: Hạ từ 4°C xuống - 4°C, tốc độ hạ nhiệt 4°C/phút

Ram 2: Hạ từ - 4°C xuống - 80°C tốc độ hạ nhiệt 11°C/phút

- Đánh giá chất lượng tỉnh bảo quản:

Cá cái sau khi tiêm kích dục tố, kiểm tra thấy trứng chín đến thời điểm

thích hợp tiến hành thu trứng bằng cách vuốt nhẹ bụng cá Trứng thu từ một cá

cái được cân đều ra các bát hoặc đĩa petri, ứng với mỗi bát cho thụ tỉnh với 1

công thức thí nghiệm khác nhau, mỗi đợt thí nghiêm có một lô đối chứng dùng

tinh |ươi

24

PVC

chóng hụ tỉnh theo phương pháp thụ tỉnh khô Trứng vừa thu xong, nhanh

lấy tinh bảo quản từ bình nitơ ra giải đông Giải đông trong nước ấm 40°C với thời gian 8 - 10 giây (Cognie và civ., 1989) Tính giải đông cho thụ tỉnh ngay

theo tỷ lệ 108 : 1 (tỉnh trùng : trứng) Mỗi lô thí nghiệm có 3 lô lặp lại

Tuỳ nhiệt độ môi trường, theo dõi sự phát triển của phôi để tính tỷ lệ thụ tỉnh, Ở|nhiệt độ 24 - 26°C, sau 4 - 6 giờ bắt đầu đếm trứng thụ tinh ở ca Tram cd Mrigal

%) Téng s6 tring thy tinh (%) Tổng số cá nở

Đề tài đã nghiên cứu so sánh hiệu quả thụ tỉnh thông qua tỷ lệ thụ tỉnh, tỷ

lệ nở, tý lệ dị hình ở cá Mrigal khi thụ tinh sử dụng tỉnh bảo quản với 3 tý lệ tính trùng :

quản |

trứng khác nhau, đó là 10Ê : 1; 10°: 1 và 107: 1

Thí nghiệm so sánh sức sống, sinh trưởng cá con sản xuất bằng tỉnh bảo anh va tinh tươi đã tiến hành trên cá Mrigal ở giai đoạn cá hương Cá bột sản xuất từ tinh bảo quản lạnh và tỉnh tươi (đối chứng) sau khi tiêu hết noãn hoàng được ương với mật độ 1.000con/giai (giai có diện tích 1,3m”), sau 10 ngày

ương đá được chuyển sang giai có diện tích 5mỶ, mỗi công thức 3 - 5 giai Thời

gian ư

cá thô

bng 45 ngày, sau đó kiểm tra và xác định tỷ lệ sống, tốc độ sinh trưởng của

hg qua việc cân, đo và đếm

25

Ond= -+ - x100 Tỷ lệ dị hình = -~ - x 100

Pá trong từng lô thí nghiệm được cân bằng cân điện tử độ chính xác

sử dụng phân tích biến dị ANOVA đánh giá khác biệt về trọng lượng và tỷ của cá ở các lô thí nghiệm

26

CHƯƠNG IV KET QUA NGHIEN CUU

4.1 Biến dị Allozyme các đàn cá Tram có

1-6: Viện l; 7-12:SơnLa; 13-17: Trung Quốc; 18-23: Nghệ An

Hình 4.1 Điện di Peroxidase (PER) ở mô mắt 4 đàn cá Trắm cỏ nghiên cứu

27

1- 5: Viện |; 6-9: SơnLa; 10-14: Trung Quốc; 15-18: Nghệ An

Hinh'4.3 Bién di Lactate Dehydrogenase (LDH) 6 co 4 dan ca Tram cd

28

_ Phổ điện di SOD thé hiện trên điện di đồ với cấu trúc dimer do một locus

gen mã hoá và được kiểm soát bởi hai alen A và B Alen A biểu hiện cho cấu tử điện di|có tốc độ chuyển động nhanh nhất về phía cực dương tương ứng với cá

thể có |kiểu gen đồng hợp AA, alen B biểu hiện cho cấu tử điện di có tốc độ chuyển động chậm nhất, tương ứng với cá thể đồng hợp tử BB Sự tương tác của hai aldn A và B tạo lên một cá thể dị hợp với kiểu gen AB (biểu hiện bằng 3

băng) Sự đa hình SOD thể hiện rất rõ trên mô gan, nhạt hơn trên mô cơ và mắt,

Tiến hành kiểm tra cả 3 mô: gan, cơ, và mắt trên cùng một bản gel điện di thấy các băng điện di của SOD trên mô gan chạy nhanh nhất về phía cực dương, trên mô cơ chạy chậm hơn và trên mô mắt chạy chậm nhất Việc xác định và đặt tên cẩu tử điện di của cac enzyme theo Ferguson (1980) thể hiện ở Bảng 4.1

Bảng 4.1 Tên các locus và alen kiểm soát phổ điện di SOD

Phổ điện di SOD của 52 mẫu từ 4 đàn cá Trắm cổ thể hiện qua Hình 4.5,

Hin 4.6 và Hình 4.7 Hình 4.5 cho thấy sự đa hình diễn ra trên tất cả 16 cá thể nghiên cứu trong đó số cá thể có kiểu gen đồng hợp tử BB xuất hiện ở cả 3 đàn

cá Trắm cỏ: đàn cá Viện I, đàn cá Trung Quốc, đàn cá Nghệ An và ở 2 cá thể đàn| cá Sơn La Kiểu gen dị hợp tử AB chỉ thể hiện trên hai cá thể số 7 và số 8 thuộc đàn cá Sơn La

29

1} 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1-4: Vien} 5-8: SơnLa; 9-12: Trung Quốc; 13-16: Nghệ An

Hình 4.5 Điện di SOD ở gan 4 đàn cá Trắm cỏ nghiên cứu

Ở Hình 4.6 kiểu gen đồng hợp BB vẫn xuất hiện trên tất cả các cá thể

thuộc|đàn cá Trắm cỏ Viện I, đàn cá Trung Quốc và đàn cá Nghệ An, kiểu gen dị hợp ÄB có mặt trên 2 cá thể số 23 và số 24 đàn cá Sơn La Tuy nhiên ở đây

xuất hiện thêm kiểu gen đồng hợp AA trên cá thể số 22 đàn cá Sơn La Phổ điện

di chờ chúng ta thấy rất rõ sự mã hoá của 2 alen A và B trên locus SOD ở cá

Trắm|cô

Ở Hình 4.7 đã thấy xuất hiện kiểu gen dị hợp AB trên cá Tram cd đàn cá Viện | (mẫu số 38) tuy nhiên ở đàn cá Trung Quốc và đàn cá Nghệ An vẫn hoàn

toàn bhi thể hiện kiểu gen đồng hợp BB trên các cá thể nghiên cứu, còn với đàn

ca Sdn La 3/4 cá thể quan sát có kiểu gen dị hợp AB

30

Hình 4.7 Điện di SOD-1 ở 4 đàn cá Trắm cỏ nghiên cứu

31

Qua phân tích thấy rằng alen B xuất hiện ở toàn bộ các cá thể nghiên cứu

với hầu hết kiểu gen đồng hợp BB ở đàn cá Nghệ An (100%) Các cá thể có kiểu

gen dị lợp AB phần lớn tập trung ở đàn cá Sơn La với tỷ lệ 28,57% trên locus SOD-3,|30,36% trên locus SOD-2 và 71,43% trên locus SOD-†7 Kiểu gen đồng hợp AAI xuất hiện ít ở đàn cá Sơn La trên các locus SOD-1 (1,78%), SOD-2 (5,36%) va SOD-3 (3,57%)

4.1.2 Tần số alen và tần số kiểu gen của SƠD

locus cửa 4 đàn cá Trắm cỏ nghiên cứu thể hiện ở Bảng 4.2

Tan số alen được tính toán theo Ayala (1982) từ số kiểu gen quan sát Ở các Bằng 4.2 Tần số alen các locus SOD ở 4 đàn cá Trắm cỏ nghiên cứu

A 0,3750 0,2433 sop-4l S0nta | 56 | p | o@2so | o7ser | 009 | S99

B đều |là 1,0000 đối với ba đàn cá Viện |, Trung Quốc và Nghệ An, trong khi đó tần số|alen B của đàn cá Sơn La là 0,8214 Như vậy trén ca 3 locus nghiên cứu, alen B đều xuất hiện với tần số cao ở cả 4 đàn cá, đặc biệt là đàn cá Trắm cổ Nghệ An với 100% các cá thể có kiểu gen BB

Cùng với việc tính toán tần số alen, chúng tôi tiến hành phân tích tần số

kiểu den thu được từ thực nghiệm để so với tần số kiểu gen theo lý thuyết và

kiểm định z với giả thuyết Hạ: Sự phân bố tần số kiếu gen của các đàn cá tuân theo định luật Hardy-Weinberg

ở Bản

Kết quả phân tích tần số kiểu gen của locus SOD trên cá Trắm cỏ thể hiện

ø 4.3 Kết quả kiểm định +2 cho thấy trên locus SOD-†1 của đàn cá Trắm cỏ

Son La gia tri +„ˆ > z,? chứng tỏ sai khác giữa tần số kiểu gen quan sát và tần số

kiểu den lý thuyết là có ý nghĩa (P<0,05) hay nói cách khác sự phân bố kiểu gen

không tuân theo định luật Hardy-Weinberg Còn trên tất cả các locus của các

đàn œ

theo q

ñ khác đều có giá trị x„Ÿ < z,? nghia là sự phân bố kiểu gen của chúng tuân

tinh luat Hardy-Weinberg

33

Bảng 4.3 Kết quả phân tích tần số kiểu gen của locus SOD trên cá Trắm cổ

Locus | | Danca | N en tên gen “heey gen gen theo x nic ovat

34

yo

4.1.3 Tương đồng và khoảng cách di truyền các đàn cá Trắm có

Đánh giá mức độ biến dị giữa các đàn cá Trắm cỏ căn cứ vào tỷ lệ cá thể

dị hợp tử trung bình và % locus đa hình trên mỗi đàn cá nghiên cứu.Theo phân tích thống kê mô tả từ phần mềm TFPGA chúng tôi thu được các kết quả sau: Tỷ

lệ cá lhể dị hợp tử trung bình trên tất cả các locus từ 4 đàn cá Trắm cỏ là 1,19% với khoảng biến động từ 0,00% (đàn cá Nghệ An) đến 4,36% (đàn cá Sơn La) Tỷ

lệ trung bình của các locus da hình trên mỗi đàn cá là 3,70%, các giá trị có khoảng biến động từ 0,00% (đàn cá Nghệ An), đến 11,11% (đàn cá Sơn La)

Bảng 4.4 Mức độ biến dị di truyền isozyme của 4 đàn cá Tram cỏ nghiên cứu

Đàn cá Số mẫu Số cá thể dị hợp % locus đa

nghiên cứu trung bình (%) hình (p<0,01)

hệ gần gũi về huyết thống của các đàn cá, và có thể đó cũng là kết quả của giao phổi cận huyết đã xảy ra giữa các cá thể cùng đàn cá bố mẹ trong thời gian dài ở các trại giống mà các đàn cá được nuôi giữ

Theo Ne?s (1972) khoảng cách di truyền giữa các đàn ca Tram cỗ được

thể| hiện ở Bảng 4.5 Số liệu ở Bảng 4.5 cho thấy khoảng cách di truyền giữa đàn

cá Sơn La và Nghệ An là xa nhất (0,01), giữa đàn cá Sơn La với đàn cá Viện |, dan cá Trung Quốc cũng khá xa (0,0088; 0,0097), trong khi đó khoảng cách di truyền giữa 3 đàn cá Viện l, Trung Quốc và Nghệ An là rất nhỏ (0,00)

35

Bảng 4.5 Khoảng cách di truyền giữa 4 đàn cá Trắm cỏ nghiên cưú

Kiểm định Exact tests sự sai khác về khoảng cách di truyền giữa các đàn

ca theo Raymond va Rousset (1995) thể hiện ở Bằng 4.6

Bảng 4.6 Các giá trị kiểm định tần xuất p của 4 đàn cá Tram cd

Các giá trị kiểm định tần xuất về khoảng cách di truyền giữa 4 đàn cá

Trắm cỏ cho thấy: giữa 3 đàn cá Viện l, Trung Quốc và Nghệ An đều có giá trị kiểm| định P > 0,05 chứng tỏ sự sai khác về di truyền giữa các đàn cá này là không rõ tệt,

tô s

kho

cá ]

Ngược lại, giữa đàn cá Sơn La với 3 đàn cá còn lại đều có P < 0,05 chứng

ự sai khác về mặt di truyền giữa chúng là có ý nghĩa Từ các số liệu về

Ang cach đi truyền chúng tôi vẽ được sơ đồ thể hiện mối quan hệ giữa 4 đàn rắm cỏ như sau:

36