Báo cáo nghiệm thu nghiên cứu chế tạo một số sinh phẩm thú y phục vụ chương trình sạch bệnh vật nuôi bằng công nghệ sinh học

, đồng thời để xác định các quyết định kháng nguyên của các mầm bệnh, giải mã các đoạn gen có tính đặc hiệu nhất, nhằm tích luỹ vật liệu ban đầu những công trình chế tạo vacxin tái tổ h

DE TAI NGHIEN CUU KHOA HOC VA PHAT TRIEN CONG NGHE

“ CONG NGHE SINH HOC PHUC VU PHAT TRIEN NONG LAM-NGU- NGHIEP

BEN VUNG, BAO VE MOI TRUONG VA SUC KHOE CON NGUOI”

Co quan chi tri: VIEN THU Y QUOC GIA

Co quan thuc hién:

PHAN VIEN THU Y MIEN TRUNG VIEN CONG NGHE SINH HOC

Chủ nhiệm đề tài: PGS TSKH Phan Thanh Phượng

NÑHữNG NGƯỜI CHủ TRI VA THUC HIỆN CHÍNH TRONG CáC ĐỀ MỤC CỦA ĐỀ Tài KHCN 02-03

I-NGHIÊN CỨU ĐỘ DÀI MIỄN DỊCH, VACXIN NHŨ HOÁ

, _GUMBORO VN-97

VÀ KIỂM NGHIỆM QUỐC GIA

: Người chủ trì: PGS.TSKH Phan Thanh Phượng,Viện thú y Q gia

“ Dong chu tri: GS.TSKH Dadi Duy Ban &Th.S Pham Cong Hoat,

Vién Cong nghé Sinh Hoc

" Những người thực hiện chính:Lê thị Kim xuyến,ViệnC.N S.H

Bs Đặng vũ Hoàng,KTV.Lê thị Soa Viện thú y

Il- NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ

ĐỂ ĐỊNH TYP P.MULTOCIDA

Người chủ trì: ˆ PGS.TSKH Phan Thanh Phượng ,Viện thú y O gia

Đồng chủ trì: TS.7rương văn Dung, Viện thú y quốc gia

TS.Đỉnh Duy Kháng,Viện Công Nghệ Sinh học

Những người thực hiện chính:7h.S.Hoàng Xuân Nghỉnh Viện thú y

BS.Lê văn Phan ,Viện CNSH

Ill HOÀN THIỆN VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ CHẨN ĐOÁN

NHANH VA DIEU TRA DICH TE

BENH DO MYCOPLASMA GALLISEPTICUM Người chủ trì: 7S Lé Minh Sắt,Viện chăn nuôi Quốc gia

Đồng chủ trì : TS.Lê thị Thuý,TS.Võ Văn Sự, Viện chăn nuôi

Người thực hiện chính : BS.Nhit van Thu, Viện chăn nuôi QG

_W HOAN THIEN QUY TRINH CHAN DOAN NHANH VA NHAY BENH

BUNG TAM (NUCLEAR POLYHEDRRA VIRUS )

5 Người chủ trì: 7S.Vguyễn Văn Cường ,Viện công nghệ sinh học

oe Newoi thuc hiện chính : Nguyên thị Diệu Thuý, Viện CNSH

V- HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH GUMBORO _ BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ - PCR

Người chủ trì: PGS.TSKH Phan Thanh Phượng,Viện Thú y Q.G

Đồng chủ trì : Tb.S Phạm Công Hoạt,Viện CNSH

Những người thực chính:Wguyễn Bich Nga,Th.S.Lé thị Kim xuyén,

Hoàng Minh Châu,Lê Trung Dũng

VI KẾT QUẢ PHÂN LẬP XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH VẬT

HOÁ HỌC VÀ ĐỊNH TYP HUYẾT THANH HỌC

CAC CHUNG PASTEURELLA SP Ở TRÂU BÒ KHOẺ VÀ

P MULTOCIDA GAY BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG

Người chủ trì: 7S Nguyễn Ngọc Nhiên - Viện Thú y quốc gia

TS Cù Hữu Phú, Viện Thú y quốc gia ¬ Th.S Hoàng Xuân Nghĩnh, Viện Thú y quốc gia

1 DAT VẤN ĐỀ:

Hiện nay trên thế giới có hai công nghệ sản xuất vacxin được tập trung phát triển chủ yếu Đó là công nghệ lên men sục khí và công nghệnuôi cấy vi rút trên môi trường tế bào trong hệ thống chai lăn hoặc trên hệ thống cytodex-

“microcarrier, Hai công nghệ này tiến hành khá phổ biến trong nhiều nước và đã

gặt hái nhiều thành tựu đáng kể

Song song với công nghệ trên còn có công nghệ gen chế tạo vacxin tái tổ

s hợp.: Trong thú y, vacxin tái tổ hợp đầu tiên được sản xuất tại CH LB Đức từ những năm 1982-1983 để phòng chống bệnh lở mồm long móng Đến nay một

số vacxin khác cũng được phát triển trong một số cơ sở Tuy nhiên, việc ứng dụng vacxin này cũng còn hạn chế do nhiều nguyên nhân khác nhau, nhưng có một nguyên nhân quan trọng đối với người tiêu đùng là giá thành vacxin tái tổ hợp còn cao Hơn nữa, để chế tạo vacxin này ngoài những chuyên gia có trình

độ, còn cần có những thiết bị khá đắt tiền và đồng bộ, với điều kiện như ở nước

ta không dễ gì trang bị được Do đó để tài này chỉ tập trung chủ yếu nghiên cứu chế tạo một số vacxin mới với hai công nghệ nói trên:Công nghệ lên men sục khí và công nghệ nuôi cấy virút trên môi trường tế bào

Như ta biết, cũng là công nghệ lên men sục khí, cũng là công nghệ nuôi cấy virút trên môi trường tế bào, nhưng mỗi một kháng nguyên đòi hỏi một chế

độ nuôi cấy khác nhau, chế độ lên men khác nhau, chế độ vô hoạt khác nhau , quy trình sử dụng khác nhau Vì vậy, để chế tạo một vacxin mới cần phải tiêu

chuẩn hoá mọi chỉ tiêu, để làm sao vacxin có hiệu lực cao nhất và kinh tế nhất

Công việc này đòi hỏi trí tuệ và lao động nghiêm túc

Một điều quan trọng mà trong đẻ tài này đặt thành một trong những nhiệm vụ hàng đầu là các nghiên cứu không dừng lại trong bốn bức tường phòng thí nghiệm, mà phải phấn đấu làm sao đưa các kết quả nghiên cứu ứng

dung được trong sản xuất Đặc biệt là các vacxin nghiên cứu thành công không những chỉ sản xuất được ở mức trong phòng thí nghiệm, mà còn sản xuất được trên đây chuyên công nghiệp và đưa được sản phẩm đến tận tay người tiêu dùng , Trong những năm gần đây khi Công nghệ sinh học phát triển mạnh,

"các kỹ thuật sinh học phân tử như : DNA fingerprinting, rRNA-

Ribotyping „ cùng với các kỹ thuật Western blot, ELISA, được sử

- -đựng khá rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới, cũng như ở nhiều nước trong

tà khu vực để định typ nhiều kháng nguyên vi khuẩn, virut , đồng thời để

xác định các quyết định kháng nguyên của các mầm bệnh, giải mã các đoạn gen có tính đặc hiệu nhất, nhằm tích luỹ vật liệu ban đầu những công trình chế tạo vacxin tái tổ hợp kế tiếp, và cho việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu nhằm chẩn đoán nhanh và chính xác, mà những kết quả đó bằng các

phương pháp chẩn đoán thông thường chưa bao giờ đạt được

Để nghiên cứu tụ huyết trùng ( THT )bằng kỹ thuật sinh học phân tử các tác giả đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu như : HB1 và HB2 (Townsend K.M.,etal., 1998 ), HS2, HS2 (Brickell S K et al , 1998 ), TOX-1va TOX-2(Lichtensteiner C A et al., 1996) Với các cặp méi đặc hiệu bằng

kỹ thuật PCR có thể xác định chính xác serotyp gây bệnh, chẩn đoán chính

xác mầm gây bệnh PCR là một phương pháp chẩn đoán nhanh, nhậy, có thể phát hiện ADN mầm bệnh với một lượng rất nhỏ vào khoảng 10 pg (Nacimento va cs , 1991-1993;Zhao va Yamamoto, 1993 ;Kempf vacs ,

1994, )

Hiện nay ở nước ta các phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm gia súc , gia cầm thường tiến hành trên những phương pháp truyền thống Việc triển khai các kỹ thuật định typ kháng nguyên và kỹ thuật chẩn đoán bằng các kỹ thuật sinh học phân tử còn gặp nhiều khó khăn về thiết bị

cũng như về kiến thức Do đó trong đề tài này chúng tôi tập trung thiết lập các quy trình định typ, quy trình chẩn đoán bệnh dựa vào các kỹ thuật PCR, ELISA, Western blot, que nhúng (immuno- sensor ), một mặt nhằm làm quen với các kỹ thuật mới, đồng thời có dịp để nâng cao trình độ đội ngũ cán bộ nghiên cứu tham gia trong đề tài này

# Trong giai đoạn 1 của để tài này đã hoàn thành một số dé mục và

- đây là giai đoạn 2 là giai đoạn hoàn thiện một số nội dung của giai đoạn

ˆ, trước, đồng thời triển khai một số nội dung có triển vọng được Ban chỉ dao

Chương trình KHCN-02 thông qua và được Hội đồng khoa học Bộ KHCN

& MT thẩm định cho phép

Thực tế cho thấy, một trong các bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn lao

_ cho nên chăn nuôi gia súc gia cầm, đó là bệnh tụ huyết trùng (THT) Có

nhiều nguyên nhân làm cho dịch bệnh THT vẫn xảy ra, theo kinh nghiệm của nhiều địa phương phản ảnh, có thể là do chủng chế vacxin và chủng gây bệnh tại địa phương không có tính tương đồng kháng nguyên với nhau Đây chính là mục tiêu của đề tài này cần giải quyết, tức là tiến hành phân lập và định typ các chủng THT gây bệnh ở các địa phương trong cả nước,

tiến tới xây dựng được bản đồ dịch tễ bệnh THT, nhằm nâng cao hiệu quả

phòng chống bệnh

Trong chăn nuôi gia cầm, bệnh do M gallisepticum gây ra cũng là một bệnh xảy ra triển miên trong đàn gà công nghiệp và gây thiệt hại không nhỏ cho chăn nuôi gia cầm, cần có quy trình chẩn đoán nhanh, nhậy

và chính xác, nhằm để xuất được biện pháp phòng chống thích đáng và hiệu quả cao

Ngoài bệnh do M gallisepticum, bệnh Gumboro cũng là một bệnh làm giảm sức đề kháng của đàn gà thấp hẳn Nếu không tạo một miễn dịch

, khép, kín phòng chống bệnh Gumboro, thì các bệnh truyền nhiễm khác sẽ

“ đen lỗi vào đàn gà nuôi, làm giảm sức đề kháng của vật chủ và không hy vọng phòng chống được các bệnh khác, vì như ta biết, virut Gumboro tấn công vào sào huyệt sản sinh ra kháng thể, đó là túi fabricius Do đó việc -_ ohẩn đoán nhanh, nhậy và chính xác bệnh Gumboro là một yêu cầu bức

ve xúc Đồng thời, ngoài vacxin nhược độc, cần có một vacxin nhũ hoá phòng

“ chống bệnh Gumboro, để tạo được một miễn dịch khép kín cho gà con lẫn

-”, BÀ mẹ

Trong những năm gần đây, việc nuôi tầm để sản xuất tơ cũng được Nhà nước quan tâm Ngoài phục vụ cho tiêu dùng trong nước, việc xuất khẩu lụa tơ tầm cũng là một nguồn tăng thu nhập ngoại tệ lớn cho nước ta, hiện nay đạt 9 triệu USD/năm., dự kiến đến năm 2005 đạt 25 triệu

_ USD/năm Tuy nhiên, việc nuôi tầm hiện nay cũng gặp một số khó khăn, đặc biệt là một số bệnh virut gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi tằm tơ ở

nước ta Theo tài liệu của Liên Hiệp Quốc bệnh virut chiém70-80% téng

số thiệt hại do các bệnh khác ở tằm gây ra Ở Việt nam bệnh bủng tằm gây

thiệt hại tới 89% số tằm tuổi 5 Do đó đề tài này tập trung nghiên cứu xây

dựng quy trình chẩn đoán nhanh, nhậy và chính xác bệnh bủng tằm bằng

kỹ thuật sinh học phân tử, để kịp thời khống chế được bệnh này ở mức cao nhất

Xuất phát từ yêu cầu của thực tế, mục tiêu của đề tài này gồm có những điểm sau đây :

II MỤC TIỂU NGHIÊN CỨU:

1 Hoàn thiện công nghệ chế tạo vacxin : Công nghệ lên men sục khí và công nghệ nuôi cấyvirut trên môi trường tế bào để chế được một số

vạcxin mới, chưa sản xuất tại Việt nam

2 Thiết lập và hoàn thiện phương pháp chẩn đoán nhanh và định typ vi khuẩn bằng các kỹ thuật sinh học phân tử như: Cảm biến miễn dịch (mmuno- _ sensor), ELISA, PCR, Western blot cho c4c bénh tụ huyét tring, Gumboro Mycoplasma va bénh bing tam

-_>-1II:NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

s 1 Nghiên cứu phân lập và xác định serotyp vi khuẩn P multocida bang các phương pháp sinh học phân tử

2 Nghiên cứu độ dài miễn dịch và kiểm nghiệm Quốc gia vacxin nhũ hoá Gumboro VN-97,

3 Nghiên cứu thiết lập và hoàn thiện phương pháp chẩn đoán nhanh và

nhậy bằng cảm biến miễn dịch (Immuno-sensor), PCR và ELISA cho

các bệnh Gumboro, Mycoplasma và bệnh bủng tằm

IV NGUYEN VAT LIEU VA PHUONG PHAP CHU YEU:

4.1 CAC CHUNG VI SINH VAT:

- P multocida: Ching chuẩn P52 và chủng IR ( serotyp B ), chủng P- 99(serotyp AD), chủng P 483 (serotyp A), chủng P43 (serotyp D), chủng 41(serotyp A), ching PBu-1, ching PB-2 (serotyp B)

- Chung Mycoplasma gallisepticum

- Ching virut gay bénh bing tam

- _ Chủng cường độc Gumboro CVL 52/70

- Chung vacxin Gumboro VN-97

, 42 ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM:

-_ Gồm có trâu bò, lợn, gà ở một số tỉnh miền Trung và miền Bắc

- Tầm 6 mot số cơ sở nuôi tằm ở Mai lĩnh và Gia quất

4.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU:

- _ Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật thường quy

- Các kỹ thuật sinh vật học phân tử như: Kỹ thuật ELISA, PCR, Western blot, cảm biến miễn dịch ( que nhúng)

Dưới đáy xin trình bày một số phương pháp mới được ứng dụng ở nước

ta:

Phương pháp Western blot (miễn dịch thấm)

+Dung dịch dùng cho Western blot (miễn dịch thấm):

- Đệm chuyển protein sang màng 10X:

Tris30 g Glycine 144, 13

1g gelatin trong 50 mITTBS 1X

- Dung dich gelatin 1% (pha từ dung dịch gelatin 2% trước khi sử dụng): Ngâm dung dịch gelatin 2% vào bể cách thủy 37°C cho tan rồi trộn với đệm

_ TTBS 1X theo tỷ lệ 1:1,

- Dung địch 5% BSA:

2, 5 g BSA trong 50 ml TBS 1X

- Dung dịch hiện mầu:

5 ml metanol để trên đá+15 mg chất hiện mầu (Bio-Rad)

25 ml TBS 1X +15ul H,O, 30%

Trộn 2 thành phân vào với nhau trước khi hiện màu

Tién hanh kj thuat Western blot

- Dién di dé phan tach protein trên gel polyacrylamid 12, 5%

- Chuyén protein sang mang PVDF (Millipore) bằng việc sử dụng bộ chuyển của hãng Bio-Rad với đệm chuyển 1X ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian

2 giờ

Nhuộm màng tạm thời để đánh dấu chỉ thị phân tử bằng dụng dịch Ponceau Dùng bút chì mềm (loại 4B) để đánh dấu chỉ thị phân tử trên màng, sau đó

rửa màng 2 lần bằng nước khử ion

- Màng được lắc trong dung dịch 5% BSA ít nhất 1 giờ dé che chan phần không gắn protein

Rửa màng 3 lần trong điều kiện lắc với đệm TTBS 1X, mỗi lần 5 phút

Sau đó màng được nhuộm với kháng thé khang RIP tai tổ hợp đã pha loãng

' theo tỷ lệ 1/500 trong dung dich gelatin 1%, lắc ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 2 giờ

Tiếp tục rửa màng 3 lần bằng đệm TTBS 1X

Màng được nhuộm tiếp với cộng hợp kháng thỏ gắn HRP của hãng Bio-Rad, pha loãng theo tỷ lệ 1/1000 trong dung dịch gelatin 1%, lắc ở nhiệt độ phòng thí nghiệm 2 giờ

Rửa màng 2 lần trong điều kiện lắc với đệm TTBS 1X và 2 lần với đệm TBS

Bổ sung nước vừa đủ 1 lít, chỉnh pH tới 7, 3

- Dung dịch tẩy rửa (PBST):

PBS với 0, 05 % Tween 20

- Dung dịch pha loãng:

Dung dịch PBST với 1% bột sữa tách bơ (skim milk)

- Dung dịch đệm Acetate/axit Citric

1, 26 g axit citric

1, 135 g Na,HPO,

Bổ sung nước tới 100 ml (pH 4, 0)

Phương pháp ELISA

1 Pha loãng kháng thể 1 kháng virus Gumboro trong đệm gắn bản

(coating) dé c6 néng d6 2 ug/ml Dé 50 kÍ ở kháng thể đã pha loãng này vào

mỗi giếng của tấm nhựa ELISA và để qua đêm ở nhiệt độ 4°C

2 Rửa 3 lần với đệm tẩy rửa

+ Che chắn phần không gắn kháng thể bằng 150 pl dung dich pha loang

trong 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng

3 Pha loãng các mẫu túi Fabricius và bổ sung 50Hl vào các giếng làm

" một mẫu đối chứng dương và một mẫu đối chứng âm, ủ 37°C trong một giờ

4 Rửa 3 lần với đệm tẩy rửa

ˆ5 Bổ sung kháng thể 2 kháng virus Gumboro đã loãng vào các giếng, ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ

6 Rửa 3 lần với đệm tẩy rửa

7 Bổ sung cộng hợp kháng kháng thể 2 có gắn enzyme đã pha loãng, ủ ở

nhiệt độ phòng/1 giờ

8 Rửa 3 lần với đệm tẩy rửa

9, Bổ sung dung dịch cơ chất và ủ ở nhiệt độ phòng cho hiện màu trong khoảng 10-30 phút

10 Các mẫu đối chứng: đối chứng dương tính, đối chứng âm tính, đối chứng cộng hợp và đối chứng cơ chất cũng phải được tiến hành đồng thời

Dung dịch đệm cho Taq-

Kỹ thuật PCR để phát hiện đoạn ADN đặc hiệu của P multocida typ

B gây bại huyết xuất huyết: PCR được tiến hành với cặp mồi đặc hiệu theo Townsend va céng sự [13] như sau:

HBI: 5' - ATCCGCTAACACACTCTC - 3"

HB2: 5’ - AGGCTCGTTTGGATTATGAAG -3’

Phản ứng chuỗi được thực hiện theo chương trình: Biến tính 3 phút ở 95

ĐC, sau đó chạy 35 chu kỳ (95 °C 50 giây, 55 °C 50 giây, 72 °C 1 phút 25 giây),

giữ ở nhiệt độ 72 °C 8 phút, sau đó chuyển sang giữ ở 4 °C

PCR để phát hiện đoạn ADN đặc hiệu của các typ tụ huyết trùng gây bại

huyết xuất huyết còn được tiến hành theo Brickell và cộng sự [2] với cặp môi

sau:

HS1: 5’°-CGA AAG AAA CCC AAG GCG AA- 3’

HS2; 5’-ACA ATC GAA TAA CCG TGA GAC- 3’

Phản ứng được thực hiện tương tự như đối véi cap méi HB1, HB2, tuy nhiên nhiệt độ bắt cặp của mồi vào sợi khuôn được nâng lén 60 °C

Phat hién gen m& héa toxin A được thực hiện theo Lichtensteiner và cộng

„ ›- sự [6] với cặp mồi đặc hiệu sau:

'TOXI: 5'-CTT AGA TGA GCG ACA AGG 3' TOX2: 5'-GAA TGC CAC ACC TCT ATA G -3' Phản ứng được thực hiện tương tự như đối với cặp mồi HB1, HB2, nhưng

số chu kỳ được nâng từ 35 lên 40

Sản phần PCR (5 pl) dugc kiém tra bang dién di trén gel agarose 1 %

Hình ảnh điện di được ghi lại nhờ máy Gel Doc của Pharmacia

13

KET QUA NGHIEN CUU

NGHIÊN Cứu XáC ĐỊNH ĐỘ Dài MIỄN DỊCH Và KIỂM NGHIỆM QUỐC Gia VACXIN NH HO@ GUMBORO VN97

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

Đã sử dụng 2 phương pháp nghiên cứu AGP và SN để nghiên cứu biến động hiệu giá kháng thể ( HGKT ) ở đàn gà thí nghiệm

3 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU:

3.1 XÁC ĐỊNH ĐỘ DÀI MIỄN DỊCH CỦA VACXIN VN - 97 VÀ

VACXIN GUMBORIFFA:

3.1.1 BO TRI THI NGHIEM

Để xác định độ đài miễn dịch của vacxin nhũ hoá Gumboro ,viết tắt là :vacxin VN-97, đã tiến hành sử dụng gà con một ngày tuổi, được tiêm chủng bằng vacxin nhược độc phòng bệnh Gumboro vào các lứa tuổi:1,7/21 và 28 ngày Đến 18 tuần tuổi đàn gà được chia thành 2 nhóm:

.Nhóm ï: Gà được tiêm vacxin VN - 97

Nhóm 2: — Gà được tiêm vacxin Gumboriffa

Cứ 1 tháng lấy máu xét nghiệm hiệu giá kháng thể kháng Gumboro 1 lần tiến hành liên tục trong vòng 9 tháng

: Kết quả xác định hiệu giá kháng thể AGP và SN ở gà sau khi tiêm vacxin VN - , Ø7 và Gumboriffa qua 9 tháng theo dõi được trình bày sau đây:

`8.1.2 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỘNG HGKT - AGP

‘Phan tích bảng 1 cho thấy : tỷ lệ gà đạt HGKT - AGP trên ngưỡng bảo

hộ (1/8) là khá cao Từ tháng thứ nhất đến tháng thứ năm đạt 100%, đến tháng thứ 6 giảm chút ít 94,28%, đến tháng thứ 7 tỷ lệ này vẫn còn cao - 85,71% và tháng thứ 8 - 71,43%, chỉ đến tháng thứ 9 tỷ lệ này giảm xuống còn 42,85%

Cũng cùng một qui luật biến động như vậy ở gà được tiêm vacxin Gumboriffa Từ tháng thứ nhất đến tháng thứ 5 tỉ lệ số các thể có HGKT- AGP dat 100% Tháng thứ 6 - 94,26%, tháng thứ 7 - 91,45%, tháng thứ 8 - 85,71% Đến tháng thứ 9, tỉ lệ này giảm xuống đến 45,71%

3.1.3 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỘNG HGKT - SN

Phân tích bảng 2 cho thấy, tỷ lệ cá thể đạt HGKT - SN từ ngưỡng bảo hộ 1/640 trở lên ở nhóm được tiêm vacxin VN-97 , cũng như tiêm vacxin Gumboriffa đều đạt 100% từ tháng thứ nhất đến tháng thứ 9 sau tiêm vacxin

Kết quả đạt được cho thấy: độ dài miễn dịch của 2 loại vacxin ở tháng thứ 8

sau khi tiêm vacxin là chấc chắn Ở tháng thứ 9, HGKT- AGP có chiều hướng

giảm xuống, nhưng HGKT - SN vẫn còn cao, do đó có thể nhận định rằng:

Độ dài miễn dịch của vacxin VN - 97 cũng như vacxin Gumboriffa là 9 tháng

Kết quả trên cho thấy :Vacxin VN-97 có độ dài miễn dịch không thua kém

vacxin ngoại nhập

15

Bảng 1: Biến động hiệu giá kháng thếAGP trong huyết thanh gà mẹ được tiêm vacxin nhũ dậu qua các tháng khác:

A |7 1428| 5 |1428 | 60 |1714| 7 | 200 | 12 |3429] 0 0 30 | 8571 M|Ị3| 5 |1428| 5 |1428| 3 | 8465 | 30 | 865 | 12 |34422| 7 | 200 | 0 0 25 | 71.43

6 4 | 1142} 9 | 25.71] 10 | 2857} 11 | 3142] 1 29 | 33 | 94.28

7 29 | 4 |1142 | 10 |2857 | 13 |3714| 7 | 200 | 0 0 32 | 91.43 8| 1 |29 |2 | 57 | 10 |2857| 7 |200 | 11 |31422| 2 | 57 | 0 0 30 | 85.71 9| 2 | 57 |50|1428| 8 |2285| 4 |1142| 4 |1142| 0 0 0 0 19 | 5471

A: Loai vacxin ,B: Tháng theo dõi

Bảng 2: Biến động kháng thể trung hoà ( SN) trong huyết thanh của gà mẹ được tiêm vacxir: nhũ dầu qua các tháng

17

3.2 KIEM NGHIEM QUOC GIA:

Sau khi nghiệm thu quốc gia đạt xuất sắc, được Chương trình Công nghệ Sinh học cho,phép , kết quả nghiên cứu của đề tài này được báo cáo tại Hội nghị thú y thế giới tổ chức tại Lyon - Pháp vào tháng 9/1999 và được Hội nghị đánh

.- g]á cao,

; “Do những kết quả đạt được nói trên vacxin nhũ dầu VN-97 phòng chống „bệnh Gumboro được phép tiến hành kiểm nghiệm quốc gia

` _ Vacxin nhũ dầu Gumboro VN-97 đã được Trung tâm kiểm nghiệm quốc gia

- tiến hành kiểm nghiệm đạt kết quả như sau:

Thuần khiết: Đạt tiêu chuẩn

An toàn: Đạt tiêu chuẩn

Hiệu lực: — Đạt tiêu chuẩn

3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH SỬDỰNG VACXIN GUMBORO VN-97:

Để đa dạng hoá lịch sử đụng vacxin VN-97 cho người chăn nuôi tự chọn phương ấn tối ưu nhất cho cơ sở chăn nuôi gà theo hướng thịt hoặc theo hướng trứng của mình,đã tiến hành thực nghiệm đáp ứng miễn dịch chủ động ở gà con

1 ngày tuổi

Theo Weyth.P.J.;Chettle N.J và CS.(1990 ) cho biết:gà con một ngày tuổi mặc dù có kháng thể thụ động kháng Gumboro,vẫn được chủng bằng vacxin nhũ dầu Gumboro,sau 4 tuần tuổi gà này được công cường độc,tỷ lệ bảo hộ đạt

85% và khi công cường độc vào 7 tuần tuổi,tỷ lệ bảo hộ đạt 90%.Tác giả còn nhấn mạnh:có thể chỉ đùng vacxin nhũ dầu Gumboro ,mà không cần kết hợp với

vacxin nhược độc để phòng chống bệnh Gumboro.Kết quả tương tự cũng được nhiều tác giả công bố ( Whifil C.E.;Haddad E.E 1995:Tsukamoto K.,Tanimura N.;Kakita S ,1995;Cargill VN Co.Lt.,1998 ).Nhiing két qua trén

` mở Ta một hướng mới cho việc sử dụng vacxin nhũ đầu Gumboro.Do đó chúng 'tôi đã tiến hành khảo sát một số nội dung sau đây:

3.3.1 - KHAO SÁT ĐÁP UNG MIEN DICH CHỦ ĐỘNG Ở GÀ CON 1 NGÀY TUỔI:

Thực nghiệm được tiến hành trên 240 gà con một ngày tuổi, chọn ngẫu : : nhiên trên đàn gà nuôi tại Trung tâm NC gia câm Thuy phương,được chia đồng

-` +: đếu thành 3 nhóm :

, -Nhóm 1-8O con được tiêm vacxin VN-97

-Nhóm 2-80 con được tiêm vacxin Gumboriffa

-Nhóm 3-80 con không tiêm vacxin

Kết quả được trình bày tại bảng 3 cho thấy:ở gà nhóm I cũng như ở _ nhóm 2 hiệu giá kháng thể ( HGKT ) đều biến động theo một quy luật giống nhau.Sau 7 và 14 ngày sau khi nở,ở gà con có kháng thể thụ động từ mẹ truyền sang,nên tỷ lệ HGKT trên ngưỡng bảo hộ đạt khá cao 60-75%,đến 21 ngày tuổi HGKT này giảm theo quy luật tự nhiên,tuy nhiên,trong thực nghiệm này có lẽ

do có kháng thể chủ động „nên tỷ lệ giảm không mạnh,vẫn dat 55%.Tai thoi điểm này nhóm đối chứng chỉ đạt 40% (bảng 3)

Đến 28 ngày tuổi ,lúc này chắc chắn chỉ còn kháng thể chủ động,HGKT

trên ngưỡng bảo hộ ở 2 nhóm gà thực nghiệm đạt khá cao: 90% Trong lúc đó ở nhóm đối chứng tỷ lệ này chỉ đạt 20%

19

Bang 3: Biến động hiệu giá kháng thể qua các thời gian khảo sát khác nhau

ở gà được tiêm vaccine nhũ hoá Gumboro vào Ï ngày tuổi,

Hiệu giá kháng thể trung hoà Tỷ lệ trên

vaccine

28 |20|16| 80 | 4 |200 10010 0 | 20,0

Kết quả này chứng tỏ gà một ngày tuổi được tiêm vacxin nhữ đầu VN-97

_ đã tạo được miễn dịch chắc chắn.Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của các

tác giả vừa dẫn trên đây.Dựa vào kết quả đạt được đã xây dựng được 2 lịch sử

dụng vacxin VN-97 như sau:

-Gà con 1 ngày tuổi được chủng vacxin nhũ dầu VN-97

~Tái chủng vào 28 ngày tuổi bằng vacxin nhũ đầu VN-97

-Tái chủng cho gà hậu bị vào 18 tuần tuổi bằng vacxin nhũ đầu VN-97

3.3.2 -KHAO SAT DAP UNG MIEN DỊCH CHỦ ĐỘNG Ở GÀ CON NỞ TỪ TRỨNG

ĐƯỢC TIÊM VACXIN VN-97 VÀO 18 NGÀY ẤP

Kết quả thực nghiệm trên cho thấy :ở gà con 1 ngày tuổi được tiêm vacxin nhũ dầu đã tạo được miễn dịch chủ động vào 28 ngày tuổi với HGKT trên ngưỡng bảo hộ đạt khá cao ( 90% ) Tuy nhiên,việc tiêm phòng gà con một ngày tuổi trên thực tế rất khó thực hiện ,cần có biện pháp gây miễn dịch từ trứng,do đó chúng tôi tiến hành khảo sát đáp ứng miễn dịch chủ động khi gây

miễn dịch cho trứng

Thực nghiệm được tiến hành trên 120 trứng cố phôi chia làm 2 đợt theo

dõi.Trước khi xác định hiệu giá kháng thể ở gà con ,đã tiến hành kiểm tra chất

lượng gà con nở ra,do vào 18 ngày ấp đã tiêm vacxin VN-97 cho phôi,liệu vacxin có gây bệnh lí gì cho gà con mới nở ra hay không ?

21

: 3.3.3 4.2.1 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG GÀ CON MỚI NỞ:

Kết quả trình bày trong bảng 4 cho thấy:sau khi tiêm vacxin nhũ dầu VN-

97 với liều 0,]ml cho phôi 18 ngày ấp, tỷ lệ gà con nở của cả 2 đợt đều đạt 100%.Tỷ lệ gà loại 1,tức là gà nở ra không bị khuyết tật như chân khèo,hở rốn,ở

" dot 1 đạt 96,67%,còn đợt 2 đạt 100%.Như vậy tỷ lệ nở và tỷ lệ gà loại 1 đạt khá

cà cao.Chứng tÖ việc tiêm vacxin cho phôi vào 18 ngày ấp hầu như không gây

ẹ bệnh lý gì cho gà con nở ra

Bảng4: Tỷ lệ và chất lượng gà con nở ra qua 2 đợt ấp (phôi 18 ngày ấp được tiêm vaccine VN - 97)

Đơt # 18 ngàyâp | Liều tiêm | Sốgànở | Tỷlệgà | tậtkhèo Tỷ lệ gà

vaccine (con)

Dot thi ai tiem| 1/320 1/640 1/1280 | 1/2560 | Tỷ lệcá | 1/320 1/640 |.1/1280 Tỷ lệ cá

nÌI%|Ìn |% | n |% |n|%| ngưỡng |n | % |n |% |n|%| 0n | % | ngưỡng

7 5,0} 25,0| 11,0] 55,0! 4,0 }20,.0| 0 | 0} 750 | 5 |25|10]50|5|25|010| 75,0

14 8 | 40,0} 11,0] 55,0} 1,0 | 5,0 | 0 60,0 | 8,0 |40,0| 12,0) 60,0} 0 0/0] 600 Dot] (21 12 | 60,0| 8,0 |40,0) 0 | 0 10 40,0 |13,0| 65 |7.0|350|0|0101L0| 35,0

28 5 110,0| 6,0 |30/0| 10 |200|2/140| 900 |16|80|40|20|01001L01 200

7 5 | 25,0] 11,0 | 55,0] 4,0 | 20,.0| 0; 0 75,0 5 25 13 | 65 | 2 |101010 75,0

14 8 | 40,0 | 12,0 | 60,0} 0 0 |010 60,0 8,0 | 40,0 | 12,0] 60,0; 0 | 0 | 0} 0 60,0 Dot 2

28 2 | 10,0} 3,0 | 15,0 | 12,0] 60,0) 3 | 15 90,0 17 | 85,0; 3,0 | 150} 0 | 0 | 0} 0 15,0

_ 3.3.4 -KHAO SAT BIẾN ĐỘNG HIỆU GIA KHANG THE TRUNG HOA-(HGKT-SN ):

Kết quả thực nghiệm này cho thấy : Quy luật biến động HGKT ở gà sau khi nở của cả hai đợt hầu như giống nhau Vào 7 ngày tuổi tỷ lệ HGKT-

SN trên ngưỡng bảo hộ đạt 75%.Chứng tỏ lúc này hàm lượng kháng thể thụ

, dong từ mẹ truyền sang lòng đỏ phôi khá cao.Đến 14 ngày tuổi tỷ lệ này có

giam,nhung vẫn còn cao ,dat 60%.Vao 21 ngay tuéi HGKT - SN bát đầu

- giảm Chỉ số này giảm theo một quy luật tự nhiên như đã khảo sát trong

` nhiều thực ñghiệm trước đây Vào thời điểm 28 ngày tuổi,sự khác biệt: giữa

gà nở ra từ phôi có tiêm vacxin với không tiêm vacxin rất rõ ràng ở cả 2 đợt: HGKT-SN trên ngưỡng bảo hộ đạt 90% so với 20% -dot 1 ;va 90% so với 15% -đợt 2.Rõ ràng rằng lúc này chỉ có kháng thể chủ động được hình thành

ỏ gà con,nên chỉ số này đạt cao như vậy.Chứng tổ vacxin nhũ dầu VN-97 đã tạo được một miễn dịch chủ động ở gà con khi tiêm chủng cho phôi vào 18 ngày ấp, kết quả này hầu như không khác gì khi gây miễn dịch chủ động

cho gà con một ngày tuổi

Kết quả trên đây mở ra một triển vọng lớn cho việc tiêm phòng các

bệnh qua trứng (in Ovo )không những giảm công tiêm phòng mà còn tránh được stress cho gà con một ngày tuổi

Nhiều nước đã dùng robot tự động thực hiện công việc này.Ở Mỹ viéc tiêm phòng qua trứng để phòng chống bệnh Marek đã thực hiện được trên 80% tổng đàn.Các tác giả còn cho biết:Việc tiêm phòng qua trứng vào

18 ngày ấp đã tạo được miễn dịch chủ động phòng chống được nhiều bệnh khác nhau,trong đó có bệnh Gumboro ( Giambrone J.;DormitoroT.;Brown T.;Schwartz.M.,1999).Năng suất tiêm đạt được khá cao, cứ l giờ tiêm được 40.000 quả trứng có phôi và 100% số phôi đã chắc chấn nhận được vacxin.Do đó mỗi lò ấp hằng năm đã tiết kiệm được 100.000USD

Tiến bộ kỹ thuật này hy vọng sẽ ứng dụng được ở nước ta

4 ÚNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT:

Đã chế 15 lô vacxin VN-97 và ứng dụng được 150 000 liều tại một số

° cơ sở chăn nuôi gà phía Bắc theo các lịch sử đụng nói trên.Kết quả đã bảo vệ _„ được các đàn gà đó khỏi bệnh Gumboro Vacxin tổ ra an toàn tuyệt đối,được -_ người sử đụng ủng hộ

- "8 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ:

5.1 KẾT LUẬN

1-Độ dài miễn dịch của vacxin VN-97 là 9 tháng ,không thua kém vacxin ngoại nhập

2-Đã tiến hành kiểm nghiệm Quốc gia đạt yêu cầu

3-Có thể gây miễn dịch chủ động cho gà con 1 ngày tuổi hoặc cho phôi gà 18 ngày ấp bằng vacxin nhũ dầu phòng bệnh Gumboro với HGKT

trên ngưỡng bảo hộ đạt 90% ở gà 28 ngày tuổi

3-Đã xây dựng được 2 quy trình ứng dụng vacxin VN-97 trong sản xuất có kết quả tốt

5.2 DE NGHI

- Đề nghị Hội đồng khoa học xét duyệt cho phép vacxin VN-97 được triển khai Dự án P và đưa thành tiến bộ kỹ thuật trong sản xuất

Summary Study on Immune Duration of the Oil Adjuvant Vaccine VN-97

against Gumboro Disease

- The oil adjuvant vaccine branded vaccine VN-97 against Gumboro disease, which has been developed is up to standard in terms of sterility,

25

: ‘safety and potency The immunity formed by this vaccine isn’t less than that

‘formed by vaccine Gumboriffa The immune duration of the vaccine VN-97

is 9 months

- Administration oil adjuvant Gumboro vaccine to a developing chick

“in egg (In Ovo ) has proven to be a effective and labor saving method to

‘ - vaccinate baby chicks against Gumboro Disease

“The quality of vaccine VN-97 has been passed the National

‘Inspection It can be used en mass in large scale

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Văn Quang và cs Hàm lượng kháng thể

trung hoà kháng Gumboro được xác định bằng phản ứng trung hoà virut Tạp chí KHKT thú y — Tập 1-1994, số 4, trang 9-12

2 Trần Thị Tố Liên Kháng nguyên Gumboro để chẩn đoán bằng phản

ứng khuếch tán trên thạch Luận án PTS khoa học nông nghiệp, Hà Nội

1995

3 Lê Văn Năm, Nguyễn Văn Việt, Nguyễn Tiến Dũng Kết quả chẩn

đoán Bệnh gumboro ở trại gà Tạp chí KHKT Nông nghiệp 1987, 3,19

— 2I

4 Trần Văn Tuyến Khảo sát hàm lượng kháng thể ở gà sinh sản sau khi

tiêm vacxin nhũ dầu và hệ số tương quan trruyền kháng thể Gumboro cho gả Ingay tuổi Luận án thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Hà nội 1995

5 Nguyễn Văn Việt Tình hình nhiễm bệnh Gumbro ở gà công nghiệp tại Trung tâm nghiên cứu gia cảm Thuy Phương từ 1990 - 1993 và xác định lịch sử dụng vacxin phòng bệnh thích hợp Luận án thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Hà Nội 1995

6 Allan W.H., J.T Faragher and G.A Cullen, 1972 Immunosupression

by, the infectious bursalagent in chickens immunized against Newcastle Disease Vet REc 90: 511-512

7 Castello L.M A, Martinez B.L., Hernandez R 1987 Compararision of the agar -gel presipitation, virus neutralization and Enzyme Linked -.-Immunosorbent Assay in the determination of antibodies to _ infectious bursal disease virus Veterina, Mexico, N° 18: 4, 317-323

| 82 Baxendale W and Lutticken, D 1981 The results of field trials with «+ inactivated Gumboro vaccine Dev Biol Stand D, V 51,21

9 ‘Hafez HM, 1991 Infectious bursal diseases (Gumboro disease) State veterinary Laboratory Stugart — Germany

10.Hirchner S.B 1976 Immunisation of dult hens against infectious bursal disease virus - Avian Dis 20: 611 — 613

ll Lusio B and S.B Hitchner, 1979 Infectious bursal disease emulsified vaccine: Effect upon neutralizine antibody levels in the dam and supsequent of the protecion of the progeny Avain Disease 23: 466-478

12.Lucker P.D and Y M Saif, 1991 Infectious bursal idsease In disease

of Poultrym 9° Edition IOWA USA P 643-663

13.Wyeth,-P];Chettle,-NJ.Use of infectious bursal disease vaccines in day-old chickens with maternally derived antibodies Veterinary Record, 1990,160:23.577-578;8 ref

14.Whitfill CE;Haddad E.E et al Determination of optimum formulation of anovel infectious bursal disease virus (IBDV) vaccine constructed by mixing bursal disease antibody with FBDV ,Avian Dis ( USA), Oct.Dec.1995,V.39 (4 ) p.p.687-699

15.Tsukamoto K.,Tanimura N.,Kakita S et al.,Efficacy of three live vaccines against highly virulent infectious bursal disease virus in chickens with or without maternal antibodies.,Avian Dis ( USA ) Apr.-Jun,1995,v.39( 2 ),PP.218-229

27

, ,

_ 16.Giambrone J.;Dormitorro T.;Brown T.;Schwartz,Vaccinating eggs ?

In Ovo Administration of IBDV Vaccines in Broiler Hatching Eggs.;Highlights of Agricultural Research.; Vol.46,N-4 Winter 1999

+

NGHIÊN Cứu ứỨNG DỤNG CáC KỸ THUẬT SINH HỌC

_ “PHAN Tủ ĐỂ DINH TYP TG Hay ET TRONG Pasteurella multosida

1 DAT VAN DE

Cho tới nay bệnh tụ huyết trùng vẫn là bệnh gây chết chủ yếu cho gia _súc gia cầm,Một trong những biện pháp phòng chống hữu hiệu là điều tra

dịch tễ một cách toàn điện và chính xác Việc điều tra dịch tế của tụ huyết

trùng đã được tiến hành ở nhiều nơi trong cả nước, nhưng chưa có hệ thống, đặc biệt việc định typ chưa được tiến hành ở mức độ phân tử, do đó chưa xây dựng được bản đề dịch tễ của bệnh tụ huyết trùng một cách có hệ thống và

có độ tin cậy cao Khác với các bệnh khác, nhiều chủng tụ huyết trùng gây bệnh gia súc, gia cầm thường có miễn dịch chéo Cùng một serotyp, nhưng

có thể gây bệnh cho nhiều loài động vật khác nhau Ví dụ serotyp B gây bệnh cho trâu bò , lại cũng gây bệnh cho lợn; serotyp A gây bệnh cho lợn lại cũng gây bệnh cho gia cầm Vậy các serrotyp A và B đó có gì khác và có gì

giống nhau Những điều này chỉ có sinh học phân tử mới giải quyết được Vì

vậy chúng tôi đã nghiên cứu ứng dụng công nghệ ADN để định typ tụ huyết trùng nhằm làm cơ sở cho việc chẩn đoán cũng như làm cơ sở cho việc chế

tạo vắc xin trong tương lai

_ 2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP

- 2.1 CAC CHUNG P MULTOCIDA:

Bao gồm các chủng chuẩn IR, 41, 43,1, 99, 483 và 8936 do Viện thú y Quốc gia cung cấp Mẫu tụ huyết trùng phân lập từ trâu, bò chết ở miền

: Trung và miền Bắc Việt nam Sau khi phân lập và xác định sơ bộ, chọn ra 17

° chủng phân lập ở miền Trung và 11 chủng phân lập ở miền Bắc để tiếp tục

" “nghiên cứu

2.2 CHẾ KHÁNG HUYẾT THANH TỐI MIỄN DỊCH:

Str dung cdc chiing P multocida chudn Quéc gia (IR, 99, 483 va 43) gây miễn dịch cho thỏ theo phương pháp thường qui để sản xuất kháng huyết

thanh tối miễn địch Kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết

hồng cầu gián tiếp Khi hiệu giá đạt yêu cầu thì giết thỏ, tách huyết thanh và bảo quản ở - 20 °C để dùng lâu dài

2.3 ĐIỆN DI BIẾN TÍNH TRÊN GEL POLYACRYLAMIODE VÀ KỸ

THUAT WESTERN BLOT:

Vi khuẩn được nuôi trong môi trường thạch huyết thanh ở nhiệt độ 37

®C trong khoảng thời gian là 18-24 giờ Bổ sung vào mỗi hộp Petri 3 mÌ nước muối sinh lý, dùng que gạt thuỷ tính hoà các khuẩn lạc thành huyễn dịch vi khuẩn thuần nhất rồi thu vào ống li tâm nhựa Eppendof Li tam 6000 v/phút,

10 phút Loại bỏ dịch nổi Rửa cặn vi khuẩn 1 lần nước muối sinh lý Sau đó cặn vi khuẩn được hoà lại trong 1 ml nước muối sinh lý Chỉnh nồng độ vi

khuẩn để có OD so bằng 1 Lấy 300 Hl huyễn địch vi khuẩn trộn với 300

dung địch biến tính protein, dun sôi 5 phút Nạp 20 ul huyền dịch vị khuẩn

đã biến tính vào mỗi giếng của gel polyacrylamide 12,5% Tiến hành điện di trong, thời gian khoảng 50 phút, cường độ dòng là 30 mA ở nhiệt độ phòng

29

_ thí nghiệm, với bộ điện đi protein của Hãng Daichi (Nhật bản)

Sau khi điện di, protein đã phân tách được chuyển sang mang PVDF

(Millipore) véi b6 chuyén protein cha Hang Bio Rad Qué trình chuyển được

tiến hành ở nhiệt độ 4 °C và hiệu điện thế là 100 V trong khoảng thời gian 2

" giờ Sau khi chuyển protein của vi khuẩn sang màng, màng được che chắn

.° bằng dung địch BSA 5%, sau đó nhuộm với kháng huyết thanh kháng P

" mmultocida được sản xuất trên thỏ ở độ pha loãng 1/500 Sau khi rửa, màng

l " được tiếp tục nhuộm với cộng hợp kháng IgG thỏ gắn peroxidaza (Bio : Rad) với độ pha loãng 1/1000 Hiện màu được thực hiện nhờ chất hiện màu của Hãng Bio-Rad Các vệt protein quan trọng phản ứng với kháng thể được tính toán trọng lượng phân tử dựa trên trọng lượng của protein chỉ thị

2.4 TACH CHIET ADN TU VI KHUAN P M ULTOCIDA:

Vi khuẩn được nuôi trong môi trường thạch huyết thanh ở nhiệt độ 37

°C trong khoảng thời gian là 18-24 giờ Bổ sung vào mỗi hộp Petri 3 mÌ nước muối sinh lý, dùng que gạt thuỷ tỉnh hoà các khuẩn lạc thành huyền địch vi khuẩn thuần nhất rồi thu vào ống li tâm nhựa Eppendof Li tam 6000 v/phút,

10 phút Loại bỏ dịch nổi Cặn vi khuẩn được hoà lai trong 567 pl dém TE,

bé sung 30 ul SDS 10%, tron đều rồi bổ sung 3 HÌ proteinase K (20 mg/ml),

ủ ở nhiệt d6 37 °C 1 gid B6 sung 100 wl NaCl 5M tron déu réi bé sung 80

HÌ CTAB/NaCI sau đó ủ ở nhiệt độ 65 °C 10 phút Chiết 1 lần bằng chloroform: isoamylalcohol (24:1), 1 lan bằng phenol/ chloroform/ isoamylalcohol (25:24:1) rồi lại tiếp tục chiết lân cuối bằng

chioroform:isoamylalcohol (24:1) Thu dịch nổi, bổ sung dung dich 3M Natri acetate pH5,2 tỷ lệ 1/10 và 2,5 lần thể tích cồn tuyệt đối Để ADN kết tủa ở -20 °C ít nhất 1 giờ Li tâm 14.000 vòng/phút, 20 phút, 4°C Rửa ADN bằng cồn 70 % Làm khô và hoà tan ADN trong dém TE Nông độ ADN

_ được xác định nhờ máy quang phé (Hewlett Packard, Mỹ) và kiểm tra trên

- øel agarose 1%

2.5 KỸ THUẬT PCR ĐỀ PHÁT HIỆN DOAN ADN ĐẶC HIỆU CỦA P MULTOCIDA TYP B GAY BAI HUYET XUAT HUYET:

PCR duoc tién hanh trong thé tich phan tng 1A 25 pl nho Taq

! polymerase của Trung tâm CNSH, Đại học Quốc gia Hà nội, sử dụng 100 ng

" ADN làm sợi khuôn và cặp mồi đặc hiệu theo Townsend và cộng sự như

PCR để phát hiện đoạn ADN đặc hiệu của các typ tụ huyết trùng gây bại huyết xuất huyết còn được tiến hành theo Brickell và cộng sự [2] với cặp mồi sau:

HS1: 5'-CGA AAG AAA CCC AAGGCG AA- 3' HS2: 5’-ACA ATC GAA TAA CCG TGA GAC- 3?

Phản ứng được thực hiện tương tự như đối với cặp mồi HBI, HB2, tuy

nhiên nhiệt độ bắt cặp của mồi vào sợi khuôn được nâng lên 60 °C

Phát hiện gen mã hóa toxin A được thực hiện theo Lichtensteiner và cộng sự [6] với cặp mồi đặc hiệu sau:

TOX1: 5’-CTT AGA TGA GCG ACA AGG 3?

TOX2: 5’-GAA TGC CAC ACC TCT ATA G -3'

31

Phan ứng được thực hiện tương tự như đối với cặp mổi HBI, HB2,

- nhưng số chu kỳ được nâng từ 35 lên 40

Sản phần PCR (4 HI) được kiểm tra bằng điện đi trên gel agarose 1 %

Hinh ảnh điện di được ghi lại nhờ máy Gel Doc cilia Pharmacia

8 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

ee ADN da được tách chiết từ 7 chủng P muiocida quốc gia bao gồm

41, IR, 43, 99, 483 và 8936 cùng với 17 chủng phân lập tại miền Trung (P1

| dén P17) và 11 chủng phân lập tại miền Bắc (trong khuôn khổ của bài báo

này chúng tôi chỉ đưa ảnh điện di của 9 chủng phân lập ở miền Trung và 9

chủng phân lập ở miền Bác) Sử dụng 100 ng cho phản ứng PCR Để xác

định typ B gây bại huyết xuất huyết, chúng tôi đã dùng cặp mồi HBI và HB2

theo Townsend và cộng sự Với cặp mồi này, sản phẩm PCR đặc hiệu cho

typ B gây bại huyết xuất huyết có chiều đài 620 cặp bazơ (Hình 1)

B

624

Hình ï: Xác định các chúng vì khuẩn Pasteurella multocida typ B gdy bai

huyết xuất huyết phản lập từ trâu bò ở miền Trung và miền Bắc bằng kỹ thuật PCR với

cặp môi đặc hiệu HB1, HB2 Với cặp môi này, sản phẩm PCR đặc hiệu có độ dài 620

cặp basơ (được biểu thị bằng mũi tên) Ảnh A: 1-7: Các chủng chuẩn quốc gia (41, 1,,

IR, 43, 99, 483, 8936) M: Chỉ thị phân tử (ADNA cắt bằng Hind III va EcoR 1) 8-16:

_ Các chẳng phân lập tại các vụ dịch gây chết trâu bò xảy ra ở một số tỉnh miễn Trung

từ PI đến P9) Ảnh B: 1-7: Các chẳng chuẩn quốc gia (41, 1,, IR, 43, 99, 483, 8936) M: Chỉ thị phản tỉ (ADNA cắt bang Hind HI va EcoR 1) 8-16: Các chúng phân lập tại các vụ dịch gây chết trâu bò xảy ra ở một số tính miền Bắc

Kết quả cho thấy, trong số 7 mẫu chuẩn quốc gia chỉ có mẫu IR (typ

_ B Iran) là có hình ảnh PCR đặc hiệu cho typ B gây bại huyết xuất huyết

“ „ Ngược lại, trong số 17 mẫu phân lập từ trâu bò tại các vụ dịch ở miền Trung

“Soya LL mau phân lập ở miền Bắc thi chỉ có mẫu P6 là không có hình ảnh PCR

đặc hiệu cho typ B gây bại huyết xuất huyết, tất cả các mẫu còn lại đều cho hình ảnh rất đặc hiệu giống typ B Iran Kết quả đã được chúng tôi khẳng định lại với cặp mồi HSI và HS2 theo công bố của Brickell và cộng sự Với cặp mồi này, sản phẩm PCR đặc hiệu đối với typ B gây bại huyết xuất huyết

- có chiều đài 334 cặp bazơ (Hình 2) PCR với cặp mồi HSI và HS2 cho kết quả hoàn toàn trùng lặp với kết quả khi chạy PCR với cặp mồi HBI và HB2

Như vậy có thể kết luận: trong số 17 mẫu vi khuẩn P muiltocida phân lập ở miền Trung và I1 mẫu vi khuẩn phân lập tại miễn Bắc chỉ có mẫu P6 phân

lập ở miền Trung là không có hình ảnh PCR đặc hiệu của typ B gây bại huyết xuất huyết, tất cả các mẫu còn lại đều có hình ảnh rất đặc trưng của typ B gây bại huyết xuất huyết giống như typ B Iran Cần lưu ý rằng chỉ có mẫu P6

là phân lập từ đường hô hấp trên của Trâu, bò khoẻ mạnh, còn các mẫu còn lại được phân lập từ Trâu, bò chết đo bệnh Tụ huyết trùng với hình ảnh Bại huyết Xuất huyết đặc trưng

33

nen re ee

' Hinh 2: Vi khudn Pasteurella multocida typ B gay bại huyết xuất huyết phân lập

._ từ trâu bò ở miễn Trung và miễn Bắc được khẳng định lại bằng kỹ thuật PCR với cặp môi

đặc hiệu HSI, HS2 Với cặp mổi này, sản phẩm PCR đặc hiệu có độ dài 334 cặp bazơ (được biểu thị bằng mối tên) ảnh A: 1-7: Các chủng chuẩn quốc gia (41, I2, IR, 43, 99,

483, 8936) .M: Chỉ thị phân tử (ADN2 cắt bang Hind III va EcoR J) 8-15: Các chủng phân lập tại các vụ dịch gây chết trâu bò xảy ra ở một số tỉnh miền Trung (từ P1 đến P§) ảnh B: 1-7: Các chủng chuẩn quốc gia (41, I2, IR, 43, 99, 483, 8936) M: Chỉ thị phân tử (ADNA cat bang Hind III va EcoR I) 8-16: Các chủng phân lập tại các vụ dịch gây chết

trâu bò xảy ra ở một số tỉnh miền Bắc

Theo một số tài liệu thì các chủng vi khuẩn P mwitocida thuộc typ A

và D có gen độc tố toxin A thường gây ra bệnh viêm teo mũi ở lợn, tuy nhiên các chủng không có gen độc tố lại không gây bệnh [1,6,7] Vì vậy việc phân biệt được các chủng có độc tố toxin A trong số các chủng phân lập, đặc biệt

là các chủng phân lập từ các bệnh phẩm ngoáy mũi gia súc có ý nghĩa quan trong trọng việc đánh giá căn nguyên cũng như giám sát về mặt dịch tễ học của vi khuẩn P mulocida Chúng tôi cũng sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu TOX1 và TOX2 [6] để tách biệt các typ A và D không có gen độc tố toxin A ra khỏi các typ A và D không có gen độc tố (hình 3)

Sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 846 cặp bazơ là đoạn ADN thuộc gen mã hóa cho độc tố toxin A Kết quả cho thấy, trong số 7

34

‘ching chuẩn quốc gia và 17 chủng phân lập ở miền Trung và 11 chủng phân

- lập ở miền Bắc Việt nam thì chỉ có chủng quốc gia 99 là có gen độc tố toxin

A Như vậy tất cả các chủng phân lập đêu không có gen độc tố toxin A Điều này cũng phù hợp với kết quả của PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho typ B _8ây bại huyết xuất huyết Theo như kết quả đã phân tích ở trên thi trong số : 28 mẫu phân lập có tới 27 mẫu thuộc typ B gây bại huyết xuất huyết (loại trừ mẫu P6 phân lập ở miền Trung) Typ B không có gen toxin A vì vậy 27 mẫu

phân lập thuộc typ B gây bại huyết xuất huyết cho kết quả PCR âm tính với

cặp mồi đặc hiệu đối với gen toxin A là đương nhiên Mẫu P6 tuy không thuộc typ B gây bại huyết xuất huyết nhưng vẫn cho kết quả âm tính khi tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu TOXI, TOX2 Như vậy có khả năng mẫu P6 thuộc typ A hoặc D không có gen độc tố toxin A Điều này đã được làm sáng

tô bằng kỹ thuật Westem blot với các kháng huyết thanh đặc hiệu [4]

Hình3: Kỹ thuật PCR với cặp mỗi đặc hiệu (TOXI, TOX2) phát hiện gen độc tố

toxin A cla P multocida gay bénh đường hô hấp và viêm teo mũi lợn Với cặp mồi này, sản phẩm PCR đặc hiệu có độ dài 846 cặp bazơ Ảnh A: 1-7: Các chủng chuẩn quốc gia (41, I,, TR, 43, 99, 483, 8936) M: Chỉ thị phân tử (ADNA cất bang Hind III va EcoR I) 8-16: Các chủng phân lập tại các vụ dịch gây chết trâu bò xảy ra ở một số tỉnh miền

Trung (từ PI đến P9) Ảnh B: 1-7: Các chủng chuẩn quốc gia (41, L, IR, 43, 99, 483,

8936) M: Chi thi phan tt (ADNA cat bing Hind TH và EcoR T) 8-16: Các chủng phan lập

35

‘tai các vụ dịch gây chết trâu bò xảy ra ở một số tỉnh miền Bắc Tất cả các mẫu phân lập

đều không chứa gen độc tố, chỉ có mẫu chuẩn quốc gia số 5 (mẫu 99) là có mang gen độc

tố toxin A Điều này phù hợp với kết quả ở hình1 và hình 2 vì chủng gây chết trâu bò ở miền Trung (loại trừ mẫu P6) và miền Bắc đêu do vi khuẩn typ B gây bại huyết xuất huyết

mà gen độc tố toxin A chỉ có ở các typ D va A

- Chúng tôi chọn 5 chủng P muirocida chuẩn Quốc gia bao gồm IR, 41, _ 43 , 99, và 483 cùng với 4 chủng phân lập tại miễn Trung đã được định typ bằng PCR (PS, P6, P7 va P8) dé nghiên cứu Sau khi phân tách protein của

_ mỗi chủng vi khuẩn bằng điện di biến tính trên gel polyacrylamide 12,5% và

chuyển sang màng PVDF, chúng tôi cho các thành phần protein của chúng phân ứng của với kháng huyết thanh đã sản xuất Kết quả cho thấy, thành phần kháng nguyên phản ứng một cách đặc hiệu và mạnh nhất với kháng thể

- có trọng lượng phân tử khoảng 15 kDa (hình I, 2 và 3) Đây có thể coi là thành phần kháng nguyên đặc hiệu typ của tụ huyết trùng Khi sử dụng kỹ thuật Westem blot với kháng huyết thanh kháng chủng IR (typ B Iran), thì trong số các mẫu chuẩn Quốc gia chỉ ở chủng IR là có thành phần kháng nguyên này phản ứng mạnh và đặc hiệu với kháng thể ở các chủng chuẩn khác cho kết quả hoàn toàn âm tính ở các mẫu phân lập, các chủng P5, P7,

P8 cho kết quả giống với chủng IR Như vậy một lần nữa có thể khẳng định

các mẫu phân lập P5, P7, P8 giống với typ B Iran Riêng ở mẫu P6, thành

kDa

T78.0

-66.3 -43.3 -30.0 -16.9 -12.3

’ Hinh 4: Westem blot với kháng huyết thanh kháng Pasteurella multocida chủng chuẩn quốc gia IR (typ B Iran) Két quả cho thấy, thành phần kháng nguyên đặc hiệu của các chúng IR, P5, P7 và P§ phản ứng với kháng huyết thanh (được biểu thị bằng mũi tên) Ở các chủng còn lại, phản ứng không xảy ra 1, 2, 3, 4, 5: Các chủng chuẩn Quốc gia IR, 41,

43, 99, 483 M: Chi thi phan tir 6, 7, 8, 9: Các chủng phân lập P5, Pó, P7, P§

KDa

-78.0 -66.3 -30.0

-16.9 -12.3

Hình 5: Westem blot vdi khang huyét thanh khang Pasteurella multocida ching chuẩn Quốc gia 99 (typ AD) Két qua cho thấy, thành phân kháng nguyên đặc hiệu của các chủng chuẩn Quốc gia 99, 483 và chủng phân lập P6 phản ứng với kháng huyết thanh (được biểu thị bằng mũi tên) Ở các chủng còn lại, phản ứng không xảy ra 1, 2, 3,

4, 5: Các chủng chuẩn Quốc gia IR, 41, 43, 99, 483 M: Chỉ thị phân tử 6, 7, §, 9: Các

chủng phân lập P5, P6, P7, P8

Phần kháng nguyên đặc hiệu typ không phản ứng với kháng huyết thanh kháng typ B Iran Kết quả này trùng lặp với kết quả của kỹ thuật PCR Vậy chủng P6 không thuộc typ B thì thuộc typ nào? Western blot với kháng huyết thanh kháng chủng 99 cho kết quả rất lý thú

Thành phần kháng nguyên đặc hiệu typ của các chủng chẩn Quốc gia

37

‘99, 483 và chủng phân lập P6 phản ứng đặc hiệu với kháng huyết thanh

kháng chủng chuẩn Quốc gia 99, Chuẩn Quốc gia 99 thuộc typ AD, như vậy

` chủng P6 có thể thuộc typ A, typ D hoặc typ AD Kết luận đã được kháng định bằng kỹ thuật Western blot với kháng huyết thanh kháng chủng chuẩn quốc tế 483 (typ A) Kết quả ở hình 3 cho thấy, thành phần kháng nguyên : : dac hiéu typ cia chủng 99 va 483 phan ứng với kháng huyết thanh kháng

i - chủng 483 Vậy chủng phân lập P6 phải thuộc typD

Hình6: Western blot với kháng huyết thanh kháng Pasteurella multocida ching chudn Quéc gia 483 (typ A) Két quả cho thấy, thành phân kháng nguyên đặc hiệu của

các chủng chuẩn Quốc gia 99, 483 phản ứng với kháng huyết thanh (được biểu thị bằng

mũi tên) Ở chủng phân lập P6 và các chủng còn lại, phản ứng không xây ra Như vậy chủng phân lập P6 phải thuộc typ D 1, 2, 3, 4, 5: Các chủng chuẩn Quốc gia IR, 41, 43,

99, 483 M: Chi thị phân tử 6, 7, 8, 9: Các chủng phân lập P5, P6, P7, P8

38