Nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh chloramphenicol bằng phương pháp hóa miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng khối phổ tt

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh chloramphenicol bằng phương pháp hóa miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng khối phổ” nhằm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN ĐỨC THỊNH

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CHLORAMPHENICOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA MIỄN DỊCH KẾT HỢP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ

Công trình được hoàn thành tại:

Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học:

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Tổng hợp Quốc gia Tp.HCM

2 Thư viện trường Đại học Khoa học Tự Nhiên-HCM

MỞ ĐẦU

Chloramphenicol (CAP) là một kháng sinh thuộc nhóm 2A, có thể gây bệnh suy tủy, là tác nhân có thể dẫn đến ung thư trên người Hiện nay hầu hết các quốc gia trên thế giới đều xếp CAP là loại kháng sinh không cho phép

có mặt trong thực phẩm ở bất kỳ hàm lượng nào

Hiện nay CAP còn tồn dư trong các loại thực phẩm khác nhau như cá, thịt, tôm, mật ong, thức ăn chăn nuôi… Nó không những có trong các sản phẩm sử dụng trong nước, mà còn hiện diện trong cả các sản phẩm xuất khẩu, làm ảnh hưởng đến quá trình xuất khẩu các mặt hàng nông, lâm sản, đặc biệt

là các mặt hàng hải sản và mật ong

Việc xác định CAP bằng kỹ thuật sắc ký ghép khối phổ gặp nhiều khó khăn và cho kết quả thiếu chính xác trên các nền mẫu có chứa nhiều tạp chất như thức ăn chăn nuôi hay chứa hàm lượng đường cao như mật ong

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh chloramphenicol bằng phương pháp hóa miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng khối phổ” nhằm mục tiêu sau: (1) Chế tạo

cột sắc ký ái lực miễn dịch chuyên biệt CAP (IAC-CAP) dùng cho bước tách chiết CAP từ mẫu thử; (2) Đánh giá qui trình phân tích CAP bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ sử dụng cột IAC-CAP trong quá trình xử lý mẫu Kết quả thu được của luận án là tiền đề có thể sử dụng cột IAC-CAP trong công tác giám sát vệ sinh an toàn thực phẩm và kiểm tra chất lượng thực phẩm xuất nhập khẩu

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chlorramphenicol (CAP)

1.1.1 Tổng quan về kháng sinh CAP

CAP được sinh từ vi khuẩn Streptomyces venezuelae CAP có tác dụng điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra như Mycoplasmas, Leptospira, Spirochaetes, Rickettsiae, Chlamydiae, Treponema pallidum, Borrelia, Pseudomonas pseudomallei, Actinomyces, Haemophilus influenza, Streptococus pneumonia, Neisseria meningitides

1.1.2 Độc tính của CAP

CAP có liên quan tới bệnh suy tủy xương và là tác nhân có thể gây ra một

số bệnh như ung thư (FAO, WHO, IARC) CAP được xếp loại tác nhân gây ung thư với con người thuộc nhóm 2A

1.2 Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm

1.2.1 Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi

Tại Việt nam 100% các cơ sở chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản cho thấy đều có sử dụng kháng sinh trong đó có nhiều kháng sinh cấm (CAP, nitrofuran)

1.2.2 Tình hình tồn dư kháng sinh trong thực phẩm

Nhiều mẫu thực phẩm trong nước và xuất khẩu có chứa tồn dư kháng sinh thuộc các nhóm tetracycline, sulfonamide, quinolone và các kháng sinh cấm như nitrofuran CAP

1.2.3 Ảnh hưởng đối với sức khỏe người sử dụng

Tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có thể là tác nhân gây ung thư, gây đột biến gen, gây ra các bệnh về máu trên người sử dụng Gây hiện tượng kháng thuốc ở các chủng vi sinh vật gây bệnh và ô nhiễm môi trường

1.2.4 Qui định về tồn dư kháng sinh trong thực phẩm

Kháng sinh tồn dư trong thực phẩm được các cơ quan kiểm tra thực phẩm chia làm 02 nhóm A và B Nhóm A là những kháng sinh không được phép

có mặt trong thực phẩm ở bất kỳ hàm lượng nào (zero tolerance), nhóm B là những kháng sinh được phép có mặt trong thực phẩm nhưng không được quá giới hạn qui định (MRL)

Chloraphenicol là kháng sinh không được phép có trong thực phẩm ở bất

kỳ hàm lượng nào

1.2.5 Kiểm soát tồn dư kháng sinh trong thực phẩm

Kiểm soát dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, trong chăn nuôi bằng các phương pháp phân tích có độ tin cậy cao

1.3 Các phương pháp xác định tồn dư kháng sinh trong thực phẩm

1.3.1 Xử lý mẫu

Quá trình xử lý mẫu có hai giai đoạn: chiết kháng sinh ra khỏi nền mẫu và loại bỏ tạp chất nền

1.3.2 Xác nhận sự hiện diện của kháng sinh

Kháng sinh được xác định bằng 02 nhóm phương pháp: phương pháp sàng lọc như ức chế vi sinh vật, miễn dịch gắn enzyme (ELISA), sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký khí, sắc ký lỏng; phương pháp xác nhận (phương pháp tiêu chuẩn) là phương pháp sắc ký ghép khối phổ

1.4 Phương pháp xác định tồn dư CAP trong thực phẩm

14.1 Tách chiết và làm sạch mẫu

Quá trình tách CAP từ mẫu thường được thực hiện với dung môi ethyl acetate, hoặc dung dịch muối loãng và acetonitrile, chất béo được loại bỏ

bằng cách rửa với n-hexan và làm sạch bằng cột tách pha rắn Các cột tách

pha rắn thường được sử dụng bao gồm cột pha ngược, hay sự kết hợp của các cột pha đảo với các cột pha thường và trao đổi cation

1.4.2 Xác nhận sự hiện diện của CAP

Phương pháp sàng lọc như: dựa trên sự ức chế vi khuẩn, hóa miễn dịch, hoặc xác định trực tiếp CAP bằng phương pháp điện hóa, sắc ký khí hay sắc

ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp xác nhận là phương pháp cung cấp rõ ràng tiêu chuẩn nhận dạng và định lượng của chất phân tích Để xác nhận CAP, phương pháp sắc

ký kết hợp với khối phổ (MS) là phù hợp Phương pháp sắc ký lỏng ghép

khối phổ để xác định CAP thường sử dụng mảnh ion mẹ với m/z 321 và hai mảnh ion con là mảnh m/z 257 và m/z 152

1 4.3 Một số tồn tại của phương pháp phân tích CAP bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ

Các mẫu mật ong, thức ăn chăn nuôi khi xác định CAP gặp khó khăn khi xác định CAP do hiệu ứng của nền mẫu Các hiệu ứng nền này gây hiện tượng suy giảm ion rất nhiều làm sai lệch kết quả phân tích xác định Giới hạn phát hiện trên các nền mẫu này thường cao, không đạt tiêu chuẩn qui định Vì vậy phải làm giàu nhiều lần do đó gia tăng hàm lượng tạp chất trong dịch mẫu xử lý dẫn đến làm giảm khả năng hoạt động của thiết bị phân tích (LC-MS/MS)

1.5 Chế tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch dùng cho bước làm sạch CAP

Để loại bỏ được hầu hết các tác nhân gây nhiễu được chiết cùng với CAP

từ mẫu, phải tăng tính chọn lọc của bước làm sạch CAP Cột sắc ký ái lực miễn dịch chuyên biệt (IAC – CAP) có thể giúp đạt được mục đích này

Để chế tạo cột IAC - CAP việc đầu tiên là tạo kháng thể đặc hiệu với CAP Gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm bằng kháng nguyên có tính sinh miễn dịch của CAP để tạo kháng thể kháng CAP Sau đó thu kháng thể

và tinh chế Kháng thể kháng CAP tinh chế được gắn lên pha rắn để tạo cột

Để chế tạo cột IAC - CAP việc đầu tiên là tạo kháng thể đặc hiệu với CAP Gây miễn dịch cho động vật thí nghiệm bằng kháng nguyên có tính sinh miễn dịch của CAP để tạo kháng thể kháng CAP Sau đó thu kháng thể

và tinh chế Kháng thể kháng CAP tinh chế được gắn lên pha rắn để tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch CAP (IAC – CAP)

1.5.1 Tạo kháng nguyên cộng hợp CAP - Protein có tính sinh miễn dịch Chloramphenicl trọng lượng phân tử thấp (<1000 Da) không có khả năng gây đáp ứng miễn dịch (hapten) Cộng hợp CAP succinate với BSA thành cộng hợp CAP – BSA

1.5.2 Tạo kháng thể kháng chuyên biệt CAP

Kháng thể kháng CAP được tạo bằng tiêm hỗn hợp cộng hợp CAP – BSA

và tá chất Freund với nhiều mũi tiêm trên lưng thỏ Các mũi tiêm tiếp theo được thực hiện cách nhau một tháng

1.5.3 Tinh chế kháng thể

Kháng thể đa dòng kháng thu được từ huyết thanh có thể được tinh chế bằng các phương pháp: tinh chế phân đoạn bằng cách tủa với amonium sulfate, tinh chế ái lực bằng các protein vỏ vi khuẩn hay lectin,

1.5.4 Các bước trong qui trình tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch

Cột sắc ký ái lực (IAC) được chế tạo qua 02 bước: chọn lựa pha rắn thường là các gel agaroseose, cellulose hay siliga; cố định kháng thể lên pha rắn bằng các liên kết đồng trị

1.5.5 Các thông số đánh giá chất lượng của cột sắc ký ái lực miễn dịch Cột sắc ký ái lực (IAC) được đánh giá qua các thông số: mật độ gắn, dung lượng cột, độ thu hồi, điều kiện dung ly, độ chọn lọc, khả năng chéo 1.5.6 Các thông số đánh giá qui trình phân tích bằng sắc ký khối phổ

Qui trình phân tích CAP băng sắc ký lỏng khối phổ được đánh giá qua các thông số: số lượng ion, độ chọn lọc, độ biến thiên thời gian lưu, hiệu suất thu hồi, tỷ lệ ion, giới hạn phát hiện

1.6 Tình hình nghiên cứu cột IAC – CAP trong và ngoài nước

Hiện nay trong nước cũng như thế giới chưa có nghiên cứu nào cho việc kết hợp cột IAC với sắc ký lỏng khối phổ trong phân tích kháng sinh CAP

Chương 2- VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 3 Mẫu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu gồm 03 chủng loai là mẫu cá, mật ong và thức ăn chăn nuôi Mẫu cá mật ong được mua tại siêu thị, còn mẫu thức ăn chăn nuôi được mua từ của hàng thức ăn chăn nuôi

2.4 Dung dịch chuẩn – Thuốc thử

Dung dịch chuẩn, thuốc thử được chuẩn bị tại phòng thí nghiệm

2.5 Động vật thí nghiệm

Thỏ dùng gây miễn dịch với kháng nguyên CAP – BSA có trọng lượng khoảng 2 kg, được theo dõi 1 tháng trước khi gây miễn dịch

2.6 Chế tạo cột IAC - CAP

2.6.1 Chế tạo kháng nguyên CAP – BSA

Chế tạo kháng nguyên CAP- BAS từ CAP succinate và BSA với tác nhân trung gian là EDC

2.6.2 Kiểm tra sự hiện diện của CAP trong CAP – BSA

Sự hiện diện của CAP trong CAP- BSA được kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp

2.6.3 Kiểm tra lượng BSA trong CAP – BSA

Hàm lượng BSA trong cộng hợp IAC - CAP được xác định bằng phương pháp Bradford

2.6.4 Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ bằng CAP - BSA

Thỏ được gây miễn dịch bằng kháng nguyên CAP- BSA kết hợp với tá chất Freund

2.6.5 Xác định sự hiện diện của kháng thể kháng BSA

Kháng thể thỏ kháng BSA được xác định bằng kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch

2.6.6 Xác định sự hiện diện của kháng thể kháng CAP

Kháng thể kháng CAP được xác định bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp 2.6.7 Tinh chế kháng thể trong huyết thanh thỏ bằng muối ammonium sulfate bão hòa

Huyết thanh thỏ thu được từ quá trình gây miễn dịch với CAP- BSA được tinh chế bằng ammonium sulfate để loại bỏ các protein không đặc hiệu 2.6.8 Loại muối khỏi hỗn hợp kháng thể bằng màng thẩm tích

Kháng thể sau khi tủa bằng amonium sulfate được loại bỏ muối amonium sulfate bằng màng thẩm tích

2.6.9 Kiểm tra độ sạch của hỗn hợp kháng thể

Độ sạch của kháng thể sau khi tinh chế được đánh giá bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide kết hợp với sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE)

2.6.10 Loại bỏ kháng thể kháng BSA trong hỗn hợp kháng thể

Kháng thể kháng BSA trong hỗn hợp kháng thể được loại bỏ bằng cột sắc

ký ái lực miễn dịch gắn BSA

2.6.11 Kiểm tra sự hiện diện của kháng thể kháng BSA

Hỗn hợp kháng thể sau khi đã được loại bỏ kháng thể kháng BSA được kiểm tra bằng kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch

2.6.12 Kiểm tra khả năng tương tác CAP của kháng thể

Khả năng tương tác với CAP của kháng thể thỏ sau tinh chế được xác định bằng kỹ thuật LC MS/MS

2.6.13 Cộng hợp kháng thể kháng CAP vào gel Sepharose CL-4B-CNBr Kháng thể thỏ kháng CAP được gắn vào gel Sepharose-CNBr qua nhóm amin bậc một trên phân tử kháng thể

2.6.14 Tạo cột sắc ký ái lực miễn dịch chuyên biệt CAP (IAC-CAP) Cột IAC – CAP được tạo bằng cách nén gel Sepharose đã gắn kháng thể kháng CAP vào cột sắc ký rỗng

2.7 Đánh giá chất lượng cột IAC – CAP

2.7.1 Đánh giá khả năng tương tác CAP

Cột IAC – CAP được đánh giá khả năng tương tác với CAP qua các thông số: hiệu suất thu hồi, dung lượng cột và khả năng tương tác với các kháng sinh nhóm amphenicol khác

2.7.2 Đánh giá hiệu quả loại bỏ hiệu ứng nền

Hiệu quả loại bỏ hiệu ứng nền (matrix effect) được đánh giá trên dịch nền mẫu sau khi qua cột IAC - CAP bổ sung thêm chuẩn CAP Các thông số đánh

giá bao gồm: độ chọn lọc, độ tuyến tính, độ biến thiên tỷ lệ ion, hệ số thu hồi, độ biến thiên thời gian lưu và giới hạn phát hiện

2.8 Đánh giá qui trình phân tích CAP sử dụng cột IAC – CAP

Qui trình phân tích CAP sử dụng cột IAC – CAP trong xử lý mẫu được đánh giá bằng các mẩu thử bổ sung chuẩn CAP Các mẫu này được xử lý bằng cột IAC – CAP Các thông số đánh giá: khoảng tuyến tính, độ chọn lọc, biến thiên tỷ lệ ion, hệ số thu hồi, độ biến thiên thời gian lưu, giới hạn phát hiện

2.9 So sánh qua trình phân tích CAP sử dụng cột IAC – CAP với MIP – CAP

So sánh giữa cột IAC – CAP với cột MIP – CAP trong việc xử lý mẫu phân tích CAP bằng LC MS/MS Các thông số so sánh: biến thiên tỷ lệ ion,

hệ số thu hồi, độ biến thiên thời gian lưu

2.10 Qui trình xử lý mẫu

2.10.1 Qui trình xử lý mẫu bằng cột IAC – CAP

2.10.2 Qui trình xử lý mẫu bằng cột MIP – CAP

2.11 Phương pháp phân tích CAP bằng khối phổ

2.11.1 Phân tích bằng khối phổ một lần LC/MS

2.11.2 Phân tích bằng khối phổ hai lần LC-MS/MS

2.12 Sơ đồ nghiên cứu

2.13 Nơi thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại Viện Y tế Công cộng Tp.HCM

Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Chế tạo cột IAC - CAP

3.1.1 Tạo cộng hợp CAP – BSA

Trong quá trình tạo cộng hợp chúng tôi nhận thấy không xảy ra phản ứng kết tụ (aggregate) giữa các protein (BSA)

Hình 3.1 Sự hiện diện của CAP trong CAP - BSA trên ELISA

Kết quả kiểm tra trên ELISA cho thấy cộng hợp CAP - BSA có mật độ quang giảm dần theo độ pha loãng của cộng hợp từ 101 đến 104 Như vậy có

sự hiện diện của CAP trong sản phẩm cộng hợp CAP - BSA (Hình 3.1) Kết quả kiểm tra lượng hàm lượng BSA trong cộng hợp cho thấy hiệu suất của quá trình cộng hợp từ 74,1% - 84,0 % (Bảng 3.1)

Bảng 3.1 Hiệu suất cộng hợp của BSA với CAP

Loạt Lượng BSA

ban đầu (mg)

Tổng lượng BSA trong cộng hợp (mg)

Sau khi kiểm tra sử dụng cộng hợp CAP- BSA3 để gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ thí nghiệm

3.1.2 Tạo kháng huyết thanh thỏ kháng CAP

Hình 3.3 Phản ứng khuếch tán kép trên thạch giữa BSA và huyết thanh thỏ

Thỏ sau khi được gây miễn dịch bằng CAP – BSA, đầu tiên được kiểm tra khả năng đáp ứng miễn dịch với BSA bằng kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch Kết quả kiểm tra cho thất toàn bộ các thỏ đều có đáp ứng miễn dịch (Hình 3.3)

Hình 3.4 Đáp ứng miễn dịch đối với CAP qua các lần tiêm

Sau các mũi tiêm nhắc lại tiếp tục kiểm tra đáp ứng miễn dịch với CAP bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp Kết quả cho thấy khả năng bắt kháng nguyên CAP của kháng thể đạt cực đại sau mũi tiêm thứ 5 và bắt đầu giảm dần ở mũi tiêm thứ 6 (Hình 3.4)

Sau mũi tiêm thứ 6 toàn bộ các thỏ được lấy máu và tách huyết thanh 3.1.3 Tinh chế kháng huyết thanh thỏ kháng CAP

Huyết thanh được loại bỏ các protein không đặc hiệu bằng tủa phân đoạn với dung dịch muối amoni sulphat bão hòa, sau đó tiếp tục loại kháng thể kháng BSA bằng cột sắc lý ái lực miễn dịch gắn BSA

Kết quả điện di SDS - PAGE cho thấy so với huyết thanh ban đầu (cột 1) huyết thanh sau tủa phân đoạn với dung dịch muối amoni sulphat bão hòa (cột 2) đã loại bỏ hầu hết albumin và các protein tạp chỉ còn lại kháng thể (IgG) (Hình 3.5)

Hình 3.5 Kiểm tra độ sạch bằng SDS-PAGE

Sau khi loại bỏ các protein tạp, hỗn hợp kháng thể (kháng thể kháng CAP

và kháng thể kháng BSA) tiếp tục được loại bỏ kháng thể kháng BSA bằng cột sắc ký ái lực gắn BSA Kết quả loại kháng thể kháng BSA được kiểm tra bằng kỹ thuật khuếch tán kép trên thạch Kết quả kiểm tra cho thấy đã loại