Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển quảng trị

4 1.3.Một số nghiên cứu trong nước và trên thế giới về các chất có hoạt tính sinh học thu nhận được từ vi sinh vật liên kết hải miên: .... Tiềm năng chưa khai thác này làm tăng mối quan

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh

vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị

Giáo viên hướng dẫn 1 : T.S Vũ Thị Thu Huyền Giáo viên hướng dẫn 2 : Th.s Trần Thị Kim Dung

Sinh viên thực hiện : Phạm Vũ Vương

Lớp : 13-01

Hà Nội, 05-2017

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

**********

LỜI CAM ĐOAN

Tên tôi là: Phạm Vũ Vương

Sinh viên lớp: 13-01

Mã SV: 13A31010069

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả thu được là do bản thân tôi trực tiếp theo dõi, thu thập với một thái độ hoàn toàn khách quan trung thực , các tài liệu đã trích dẫn của các tác giả đều được liệt kê đầy đủ, không sao chép bất cứ tài liệu nào mà không có trích dẫn

Hà Nội, ngày12tháng 05năm 2017

Sinh viên Phạm Vũ Vương

Để hoàn thành khóa luận này, em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến T.s Vũ Thị Thu Huyền và Th.s Trần Thị Kim Dung đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết Luận văn tốt nghiệp

Em chân thành cảm ơn các quý Thầy, Cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm

em học tập Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quí báu để

em bước vào đời một cách vững chắc và tự tin

Em cũng xin cảm ơn các Cô, các Chị làm việc tại phòng Công Nghệ Sinh Học

- Viện Hoá Sinh Biển và Viện Nghiên Cứu Khoa Học Miền Trung đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để em thực tập tại đây Em kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trongphòng Công Nghệ Sinh Học - Viện Hoá Sinh Biển và Viện Nghiên Cứu Khoa Học Miền Trung luôn dồi dào sức khỏe,

đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc

Cuối cùng, emxin bày tỏ lòng biết ơn đến bạn bè và gia đình đã hết lòng động viên giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn

Mục Lục

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về hải miên: 3

1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên: 4

1.3.Một số nghiên cứu trong nước và trên thế giới về các chất có hoạt tính sinh học thu nhận được từ vi sinh vật liên kết hải miên: 8

1.4.Tình hình nghiên cứu vi sinh vật liên kết với hải miên ở Việt Nam: 10

1.5 Vai trò polyketide synthase: 12

1.6 Vector tách dòng pCR2.1 invitrogen 15

PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu 18

2.1.1 Vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị đã được phân lập 18 2.1.2 Các thiết bị và sinh phẩm 18

2.1.3 Trang thiết bị 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu: 21

2.2.1 Phương pháp tách DNA tổng vi sinh vật liên kết hải miên: 21

2.2.2 Phương pháp xác định nồng độ bằng quang phổ kế : 23

2.2.5 Tách chiết plasmid: 28

2.2.6 Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose (thôi gel): 31

2.2.7 Tinh sạch vector tái tổ hợp: 33

2.2.8 Xác định trình tự gen bằng máy tự động: 34

PHẦN 3: KẾT QUẢ 36

3.1 Kết quả tách DNA tổng số: 36

3.2 Kết quả khuếch đại gen (PCR) 37

3.3 Kết quả thu nhận gen polyketide synthase từ gel agarose (thôi gel) 39

3.4 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợpvào tế bào khả biến 40

3.5 Kết quả tách plasmid 41

3.6 Kết quả giải trình tự 42

PHẦN 4: KẾT LUẬN 47

PHẦN 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

Amp Ampicillin

DNA Deoxyribonucleotid Acid

DEPC Diethylpyrocarbonat

dNTP Deoxyribonucleotid 5’-triphosphates EtBr Ethidium bromide

EDTA Ethylen diamine tetraacetic acid

NRPS Non ribosomal peptide synthases

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleotid Acid

Hình 1.1.Mẫu hải miên thu nhận từ biển Quảng Trị Việt Nam 3

Hình 1.2.Phản ứng tổng hợp polyketide được và sinh tổng hợp tiền chất doxorubicin, є-rhodomycinone 14

Hình 1.3.Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vector pCR®2.1 17

Hình 2.1 Trình tự cắt của enzyme giới hạn EcoR I 30

Hình 3.1.Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số vi sinh vật liên kết hải miên 36

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩmPCR trên gel agarose 1 % 39

Hình 3.3.Kết quả điện di sản phẩm PCR đã tinh sạch sau thôi gel 40

Hình 3.4.Hình ảnh đĩa nuôi cấy sau biến nạp 41

Hình 3.5.Điện di đồ sản phẩm tách plasmid 42

Hình 3.6.Hình ảnh so sánh trình tự nucleotide gen PKS thu được trên genbank 45

Hình 3.7.So sánh trình tự acid amin đã dịch mã từ trinh tự nucleotide với các trình tự acid amin đã công bố trên genbank 46

Bảng 1.Các enzymes biển được phát hiện từ các nguồn metagenomics: 6

Bảng 2 : Thành phần và các vị trí vector tách dòng pCR®2.1: 16

Bảng 3 Thành phần phản ứng PCR: 38

Bảng 4.Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 38

Bảng 5 Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt: 43

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề:

Việt Nam nằm trong khu vực Thái Bình Dương, nơi có nguồn đa dạng sinh học vô cùng phong phú.Một vài năm trước đây nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên biển ở Việt Nam còn rất mới, nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất từ nguồn sinh vật biển nhằm phục vụ sản xuất thực phẩm chức năng hoặc dùng làm nguyên liệu nghiên cứu thuốc đang ở giai đoạn đầu Sinh vật biển là nguồn nguyên liệu lý tưởng cung cấp các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng sinh, chống sốt rét, chống ung thư, kìm hãm HIV, điều biến… cung cấp nhiều loại thuốc mới, các chế phẩm có giá trị cao phục vụ nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm trong nước và xuất khẩu

Đại dương chứa trên 500.000 loài động vật không xương sống và cá loài rong, tảo.Môi trường biển là một kho tàng các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học mà nhiều chất cho thấy những đặc điểm cấu trúc chưa hề gặp ở các hợp chất thiên nhiên trên cạn.Một số loài tạo hợp chất sinh học từ nguồn thức

ăn, trong khi một số khác tự tổng hợp mới, một số chất do vi sinh vật liên kết sinh ra, một số khác đòi hỏi phải có sự kết hợp giữa vật chủ và vi sinh vật Cấu trúc, tính chất các hợp chất của mẫu có thể bị tác động bởi vùng phân bố mẫu hoặcbởi các yếu tố địa lý và mùa vụ

Hải miên được biết là nguồn giàu các sản phẩm tự nhiên giá trị như polyketides, nonribosomal peptids và alkaloids Các nhà khoa học tin rằng rất nhiều sản phẩm của hải miên thực tế là do vi sinh vật liên kết hải miên sinh

ra Vùng biển Quảng Trị là nơi phát hiện và đánh giá là khu vực hải miên sinh nhiều hoạt chất thiên nhiên và phong phú Bởi vậy, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết

hải miên vùng biển Quảng Trị.” nhằm xác định vi sinh vật liên kết hải miên

là một nguồn thu polyketide synthase hiệu quả và có ứng dụng trong thực tế

2 Mục tiêu

Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị thành công và tìm hiểu các ứng dụng của polyketide synthasetrong nghiên cứu và sản xuất

3 Nội dung nghiên cứu

Tách dòng gen mã hóa polyketide synthase thu nhận từ vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về hải miên:

Hải miên (hay còn gọi là bọt biển hoặc sea sponge) là những động vật rất đơn giản sống ở sàn đại dương Chúng gắn thường xuyên vào một nơi nào

đó, và di chuyển nước qua cơ thể chúng, lọc ra những sinh vật nhỏ li ti để làm thực phẩm Những chỗ nước đi qua là một cấu trúc lỗ sàng và là những gì làm cho cơ thể chúng hữu ích

Bên trong nhiều loài hải miên là nơi cư trú của cả cộng đồng vi sinh vật bao gồm vi khuẩn cổ, vi khuẩn, nấm và virus Sinh khối vi sinh vật có thể chiếm tới 35% khối lượng hải miên Những loại hải miên này được phân loại như là hải miên có hàm lượng vi sinh vật cao và nồng độ vi sinh vật trong mô loại hải miên này khoảng 108 – 1010 tế bào/1g, nồng độ này cao hơn 2 – 4 lần

vi sinh vật cùng loại tìm thấy trong mẫu nước biển Đối với loại hải miên có hàm lượng vi sinh vật thấp nồng độ vi sinh vật trong mô loại hải miên này vào khoảng 105 – 106 tế bào/1g; tương đương với lượng vi sinh vật tìm thấy trong mẫu nước biển

Hình 1.1: Mẫu hải miên thu nhận từ biển Quảng

Trị Việt Nam

Hải miên có vai trò quan trọng trong chu trình dinh dưỡng của các hệ thống rạn san hô Các nhà khoa học tin rằng chúng có thể là những nhân tố quan trọng làm thay đổi chất lượng nước theo hướng xấu hoặc tốt Các nhà khoa học phân tích hải miên thở nhanh như thế nào và lượng nitrogen chúng thải ra trong quá trình này Hải miên thu thập vi sinh vật trong khi lọc nước quanh chúng, những vi sinh vật này được tin tưởng rằng có thể làm rất nhiều việc Các vi khuẩn này có thể có khả tăng tạo ra các dạng nitrogen từ khí nitơ trong nước có thể làm chất dinh dưỡng cho hải miên Chúng cũng có thể có khả năng chuyển hóa ammonium khi hải miên thở thành khí nitơ, sau đó giải phóng vào khí quyển.Quá trình này sẽ làm giảm hàm lượng nitrogen dư thừa trong các rạn san hô, cũng ngăn cản những thay đổi có hại của hệ sinh thái.Các nhà khoa học tin rằng việc chuyển hóa khí nitơ thành nitrogen có ích cũng có lợi cho việc sống sót của các cơ thể khác trong biển

Hải miên biển được đánh giá là mỏ vàng trong những năm gần đây về

sự đa dạng của các chất trao đổi thứ cấp của chúng Tác dụng sinh học của các chất trao đổi mới từ hải miên được báo cáo trong hàng trăm bài báo khoa học hải miên trong tương lai có tiềm năng cung cấp thuốc chống các bệnh quan trọng như ung thư, một số bệnh do virus, sốt rét và viêm nhiễm Hải miên sản sinh ra rất nhiều các hợp chất hóa học với khung cacbon khác nhau,

và chúng cản trở phát sinh bệnh tại các thời điểm khác nhau Việc một bệnh nào đó có thể bị chống lại ở các thời điểm khác nhau làm tăng khả năng phát triển các loại thuốc chọn lọc cho các đích đặc hiệu

1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên:

Người ta tính được rằng vi khuẩn biển cực kỳ nhiều, đạt mật độ đến

106/ml nước biển, và là sinh khối biển và các chất trao đổi nhiều nhất Môi trường biển, gồm cả lớp dưới bề mặt, người ta tin là chứa khoảng 3,67x1030 vi

sinh vật và với gần 71% bề mặt trái đất của 361 triệu km2 được bao phủ bởi đại dương, môi trường này là khu vực rộng lớn tiềm năng của đa dạng vi sinh vật và công nghệ sinh học có thể khai thác hay “công nghệ sinh học xanh” Tiềm năng chưa khai thác này làm tăng mối quan tâm nghiên cứu vi sinh vật biển, với mục đích không những cung cấp cho chúng ta nhiều thông tin hơn

về vai trò chính của chúng trong mạng lưới thức ăn biển và chu trình hóa địa sinh (biogeochemical) trong hệ sinh thái biển, mà còn khai thác khả năng của chúng để sản xuất các enzymes mới và các chất trao đổi/các hợp chất có tiềm năng ứng dụng công nghệ sinh học Môi trường biển rất đa dạng và vi sinh vật biển phơi nhiễm áp suất, nhiệt độ, độ mặn, dinh dưỡng cực đoan Những enzymes tách chiết từ những vi sinh vật trong những môi trường như thế rõ ràng có những tính chất sinh lý và sinh hóa đa dạng cho phép quần thể vi sinh vật thích nghi và phát triển mạnh trong các điều kiện đó Như vậy có thể khai thác các enzymes do vi sinh vật biển tổng hợp có các hoạt tính xúc tác sinh học khác thường có khả năng hoạt động dưới các điều kiện cực đoan

Với các chất xúc tác sinh học, một loạt các hydrolytic enzymes được tách dòng gần đây từ DNA metagenomic vi khuẩn nước biển antarctic, trong khi lipase mới có hoạt tính ở nhiệt độ thấp được tách từ thư viện metagenomic

vi khuẩn của bùn biển Baltic Báo cáo gần đây về việc xác định enzymes mới khi tách dòng 2 gen alkane hydrolase từ thư viện metagenomic từ bùn sâu trong Pacific và 2 gen này biểu hiện thành công, có hoạt tính trong chủng Pseudomonas fluorescens (Kenedy et al., 2008) Jeon và cs (2011) đã nhận dạng một số gen mã hóa cho lipolytic enzymes từ các mẫu môi trường biển khác nhau, đã biểu hiện và tinh sạch các enzymes này trong hệ E.coli Từ các metagenomes mẫu bùn sâu dưới biển, đã nhận dạng và mô tả đặc điểm của esterases mới (Baharum et al., 2010)

Hoạt tính Môi trường Hoạt tính Môi trường

Esterase Trầm tích sâu dưới biển

Vịnh biển Nước biển bề mặt Trầm tích biển Bắc cực Trầm tích biển Nam TQ

Lipase Vùng thủy triều nông

Trầm tích sâu dưới biển Trầm tích biển Baltic

Chitinase Cửa sông

Môi trường biển rất đa dạng và vi sinh vật biển phơi nhiễm áp suất, nhiệt độ,

độ mặn, dinh dưỡng cực đoan Những enzymes tách chiết từ những vi sinh vật trong những môi trường như thế rõ ràng có những tính chất sinh lý và sinh hóa đa dạng cho phép quần thể vi sinh vật thích nghi và phát triển mạnh trong các điều kiện đó Như vậy có thể khai thác các enzymes do vi sinh vật biển tổng hợp có các hoạt tính xúc tác sinh học khác thường, có khả năng hoạt động dưới các điều kiện cực đoan Rất nhiều hải miên có cộng đồng vi sinh vật cực kỳ đa dạng trong mô của chúng Những nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên cho thấy vi sinh vật có thể chiếm đến 50% thể tích hải miên, và

con số này lớn hơn 2-3 lần so với lượng vi khuẩn trong nước biển (Wang 2006), và cộng đồng này đặc hiệu cho hải miên Rất nhiều sản phẩm của hải miên được cho là thực tế do vi khuẩn liên kết sinh ra và rất nhiều báo cáo đã chứng minh giả thuyết này Việc phân lập, nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện đặc biệt thường khó khăn, đặc biệt là vi sinh vật liên kết với các cơ thể khác bởi mối tương tác giữa chúng khá phức tạp

Trong những năm gần đây, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử không phụ thuộc nuôi cấy rất nhiều nghiên cứu đã khảo sát tính đa dạng của vi sinh vật cộng sinh hải miên ở các hệ sinh thái biển khác nhau và một số tác giả thấy rằng vi khuẩn liên kết hải miên bền vững theo không gian và thời gian Nhưng một số tác giả khác lại thay đổi giả tthuyết này Ví dụ, mặc dù

Cymbastela concentrica có cộng đồng vi sinh vật ít thay đổi giữa các khoảng

cách địa lý nhỏ, nhưng cộng đồng vi sinh vật của Cymbastela concentrica vùng ôn kết khác với cộng đồng vi sinh vật trong Cymbastela concentrica ttừ nước vùng nhiệt đới của Australia (Hill et al., 2006; Ouyang et al., 2009)

Dựa trên những nghiên cứu cộng đồng vi sinh vật bằng các phương pháp như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE), 16S rRNA gene

sequencing and Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), người ta nhận

thấy cộng đồng vi khuẩn liên kết với hải miên có tới hơn 25 phyla, trong đó

có Proteobacteria, Nitrospira, Cyanobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria,

Chloroflexi, Planctomycetes, Acidobacteria, Poribacteria và

Verrucomicrobia, ngoài các thành viên của domain Archaea Các quần thể vi sinh vật khác sống trong hải miên là fungi và microalgae Rất ít biết về virus trong hải miên, mặc dù các hạt giống như virus được phát hiện trong nhân tế

bào của Aplysina (Verongia) cavernicola Có 2 con đường để hải miên tạo

nên vi khuẩn liên kết, một là hấp thu vi khuẩn đặc hiệu từ nước xung quanh khi nước đi qua hải miên trong quá trình ăn lọc và hai là truyền thẳng vi

khuẩn liên kết thông qua giao tử (gametes) của hải miên bằng cách đưa cả vi

khuẩn vào noãn bào (oocytes) hoặc ấu trùng (larvae) (Wang et al., 2006; Li et

al., 2007)

1.3 Một số nghiên cứu trong nước và trên thế giới về các chất có hoạt tính sinh học thu nhận được từ vi sinh vật liên kết hải miên:

Nhiều tác giả đã phát hiện các nhóm gen polyketid synthase trong vi

sinh vật liên đới hải miên bằng những phân tích metagenomics (Piel et al., 2004; Schirmer et al., 2005; Kim et al., 2006; Kenedy et al., 2008) Nghiên

cứu về hai chất Non-ribosome synthetases peptide (NRSP) và Polyketide

synthetases (PKS) là multimodularenzym tham gia vào tổng hợp các

oligopedtide và các chất chuyển hoá thứ cấp polyketide sản xuất bởi vi sinh vật như vi khuẩn và nấm Polyketide synthases (PKS) và Non ribosomanl

peptide synthetases (NRPS) tham gia vào sản xuất rất nhiều các sản phẩm tự nhiên NRPS liên quan dến tạo ra một số thuốc chống khối u , ức chế miễn dịch, kháng khuẩn , kháng nấm kháng virus quan trọng nhất hiện nay và hàng

trăm sản phẩm tự nhiên , gồm các chất giảm cholesterol lovastatin là từ PKS

(Brakhage, 2013)

Michael và đồng nghiệp năm 2007 cũng đã nghiên cứu về sự liên kết của vi sinh vật với hải miên biển Nghiên cứu của nhóm tác giả cho thấy hải miên biển thường chứa các cộng đồng vi khuẩn đa dạng và phong phú, bao gồm cả vi khuẩn, vi khuẩn cổ, vi tảo và nấm Trong một số trường hợp, vi sinh vật chiếm 40% khối lượng của hải miên và có đóng góp quan trọng vào quá trình trao đổi chất thứ cấp của hải miên (ví dụ : thông qua quang hợp hay

cố định ) Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng hải miên là một trong những nhà sản xuất các chất chuyển hoá hoạt tính sinh học nhiều nhất thế giới và trong một

số trường hợp, các hợp chất này là do các vi khuẩn tạo ra chứ không phải hải

miên Nhóm nghiên cứu đã xem xét và sứ dụng một số phương pháp tiếp cận như nuôi cấy phân tách tế bào và phương pháp metagenomics để nghiên cứu

về vi sinh vật liên kết với hải miên

Từ hai loài hải miên biển Mycale mytilorum và Tendania anhelens đã phân lập được 10 chủng Streptomyces, trong đó có 4 chủng có hoạt tính đối kháng Aeromonas hydrophyla và Vibrio sp Các hợp chất kháng khuẩn có bản chất là polyene (Dharmaraj et el., 2009).Yung và cộng sự (2010) đã sử dụng

metagenomics có chức năng sàng lọc các protein kháng khuẩn mới từ vi sinh

vật liên kết hải miên Cymbastela concentrica và đã chọn được 2 clones có hoạt tính kháng S aureus 2, Alteramonas sp CCSH174 và K pneumoniae Dòng CcAb1 có hoạt tính đối kháng Staphylococcus aureus và Alteramonas

sp ch ủng CCSH174 ( vòng kháng khuẩn 0,5cm và 0,6cm tương ứng) Dòng CcAb1 và CcAb2 đều thuộc lớp Gammaproteobacteria Các tác giả cũng

nhận diện được các enzym thuỷ phân mới từ cộng đồng vi sinh vật liên kết hải

miên và phần lớn chúng thuộc Alpha- và Gammaproteobacteria phần lớn các

chất kháng khuẩn được nhận dạng bởi chọn lọc metagenomic là những phân

tử nhỏ, ví dụ như palmitoylputrescine, violacein, turbomycin A và B,

indirubin và indigo kết quả nhận được cho rằng có thể các hydrolases như là

những nguồn thay thế có hoạt tính kháng khuẩn từ vi sinh vật liên kết hải miên.Đến năm 2013, Grasa và cộng sự đã có một số nghiên cứu về vi sinh vật liên kết với hải miên Kết quả nghiên cứu cho thấy vi sinh vật liên kết hải miên đóng vai trò chủ yếu trong việc bảo vệ vật chủ chống lại các loài ăn thịt

do chúng sản sinh các chất trao đổi thứ cấp có hoạt tính sinh học Các sản phẩm sinh học này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế miễn dịch và cũng có hoạt tính để chữa các bệnh tim, hô hấp và tiêu hoá

Những năm trở lại đây, vi sinh vật liên kết với hải miên ngày càng nhận được nhiều chú ý vì những đóng góp đáng kể của chúng để thu sinh khối, chu

trình sinh địa và tiềm năng trong công nghệ sinh học Tuy nhiên, sự hiểu biết của chúng ta về các vi sinh vật liên kết hải miên bị giới hạn trong một vài loài hải miên và tại một số khu vực địa lý nhất định Năm 2015, Jasmin và các cộng sự đã có báo cáo lần đầu tiên sự đa dạng vi sinh vật sống chung của hai

loài hải miên là Cinachira hang và Haliclona pigmentifera ở các nước xung

quanh hệ sinh thái rạn san hô của vịnh Mannar nằm dọc theo bờ biển phía đông nam Ấn Độ 25 chủng vi sinh vật trong thư viện gen 16S rRNA của

những hải miên đã được nhóm lại thành 8 phyla riêng biệt, trong đó có 4

phyla liên kết bên trong lõi của hải miên ɣ-Proteobacteria, Chloroflexi,

Plantomycetes và Deferribacter là các nhóm nòng cốt trong C cavernosa các nhà khoa học quan sát thấy sự đa dạng OTU lớn hơn ở C cavernosa ( H ˡ 2,07) so với H Pigmentifera ( H ˡ 1,97) phân tích UniFrac khẳng định sự

khác biệt trong tính đa dạng vi khuẩn giửa các loài hải miên khác nhau và ở những vùng sinh sống khác nhau

Chức năng liên đới của vi khuẩn liên kết với hải miên gồm thu dinh dưỡng, ổn định khung hải miên, xử lý (processing) chất thải trao đổi chất và sản sinh các chất trao đổi thứ cấp Có giả thuyết là các vi sinh vật biển liên kết với hải miên là các nhà sản xuất gốc các hợp chất hoạt tính sinh học Bằng chứng thí nghiệm đầu tiên ủng hộ giả thuyết này là của Faulkner và cs, xác định vị trí của các sản phẩm tự nhiên trong vi sinh vật liên kết hải

miênTheonella swinhoei Với mục đích này, quần thể tế bào được tách bằng

ly tâm và nghiên cứu bằng hóa học Bằng cách đó đã có thể định vị được cytotoxic macrolide swinholide A và peptide theopalauamide trong vi khuẩn đơn bào dị dưỡng và vi khuẩn sợi dị dưỡng, tương ứng (Thomas et al., 2010;

Penesian et al., 2011)

1.4 Tình hình nghiên cứu vi sinh vật liên kết với hải miên ở Việt Nam:

Trong những năm gần đây, Việt Nam đã xúc tiến một số chương trình nghiên cứu và giám sát đa dạng sinh học động vật biển, đặc biệt là sự hợp tác lâu năm với Viện hàn lâm khoa học Nga và các chuyến đi biển dài ngày của tàu Oparin nhằm thu thập các mẫu vật tại vùng biển ở Việt Nam Viện Công nghệ sinh học đã có báo cáo phân lập định danh vi sinh vật từ các mẫu nước biển và nghiên cứu khả năng phân huỷ hydratcacbon, khả năng sinh các chất

có hoạt tính bề mặt nhằm ứng dụng trong các ngành công nghiệp và xử lý môi trường, hoạt tính ức chế E.Coli, Staphylococcus aureus, F Oxisporum của vi khuẩn phân lập từ bùn biển (Lại Thuý Hiền và cs., 2003 ;Thi Tuyen Do et al., 2012) Từ các mẫu nước biển của các thành phố Quảng Ninh, Nha Trang, Cửa Lò, Vũng Tàu đã phân lập và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh protease cao (Quyền Đình Thi et al.,2007) Đỗ Mạnh Hào và Phạm Thế Thư (2010) đã nghiên cứu vi sinh vật học của các mẫu nước và trầm tích vùng ven biển Hải Phòng và đã phân lập được 65 chủng vi khuẩn điển hình thuộc 31 loài, 16 chi, 8 họ và 2 bộ một số đề tài nghiên cứu có định hướng ứng dụng vi sinh vật biển như: ‘Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp các chất kháng sinh từ một số vùng biển của Việt Nam’ của Viện Công nghệ sinh học từ 2006-2008 đã đánh giá tính đa dạng và lựa chọn các vi sinh vật biển có hoạt tính kháng sinh từ vùng đất ngập mặn ven bờ biển Việt Nam và tìm hiểu khả năng ứng dụng trong nuôi trồng thuỷ sản, bảo vệ môi trường, y dược đề tài KC.09.09/06-10: ‘Nghiên cứu sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học theo định hướng kháng sinh, gây độc

tế bào và chống oxy hoá từ sinh vật biển nhằm tạo các sản phẩm có giá trị dược dụng’ từ 2007-2008 của Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên nhằm xây dựng danh mục sinh vật biển có kháng sinh, gây độc tế bào, chống oxy hoá và quy trình công nghệ tách chiết các chất có hoạt tính sinh học và tạo ra một số sản phẩm có giá trị dược dụng

Bên cạnh đó, nhửng nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính sinh học từ động vật biển như hải miên, san hô mềm cũng được tiến hành ở một

số cơ sở nghiên cứu Từ hải miên Spongia sp của Việt Nam đã tách chiết được sesquiterpene quinones với hoạt tính chống oxy hoá ( Utkina & Denisenko 2011), C29-Sterols từ hải miên Ianthella sp Có đặc tính chống ung thư (Nguyen Huu Tung et al., 2009) Cembranoid diterpene mới được phân lập từ san hô mềm kích thích sự biệt hoá của dòng tế bào MC3T3-E1 (Nguyen Xuan Cuong et el., 2008) từ hải miên biển Việt Nam Xestospongia testudinaria đã phân lập được 3 C29 sterol mới, xác định cấu trúc và khả năng

ức chế sự bám dính của Pseudoalteromonas spp Và Polaribacter sp (Xuan Cuong Nguyen et al., 2013) Viện Hoá sinh biển có hợp tác với các nước khác trong lĩnh vực nghiên cứu về biển như: « Nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất

có hoạt tính sinh học cao từ các đối tượng san hô mềm và hải miên thu thập tại Quảng Ninh và Hạ Long, Việt Nam » với KORDI Hàn Quốc Nghiên cứu thành phần hoá học của một số loài hải miên và vi sinh vật cộng sinh thuộc biển Việt Nam với đối tác phía Pháp là Bảo Tàng lịch sử thiên nhiên quốc gia Pháp, Paris.Các nghiên cứu về vi sinh vật liên kết hải miên tại Việt Nam còn hạn chế và việc nghiên cứu các nhóm gen sinh các hợp chất sinh học có giá trị trong hệ vi sinh vật liên kết hải miên ở trong nước còn đang trong giai đoạn bắt đầu

1.5 Vai trò polyketide synthase:

Polyketide là một họ các chất chuyển hóa bậc hai được hình thành bởi sự xúc tác của enzyme polyketide synthase (PKSs).Khung cacbon của polyketide được khử và biến đổi bởi những domain khác nhau trong PKSs cùng với các enzyme ketoreductase, dehydratase và enoylreductase Có 3 loại PKSs khác nhau đã được biết cho đến ngày nay: PKSs loại I là những enzyme đa chức

năng PKSs loại II là phức hợp của nhiều enzyme, cựng tạo nên cấu trúc của chuỗi polyketide và PKSs loại III

Polyketide synthases (PKS) và Non ribosomal peptide synthases (NRPS) tham gia vào sản xuất rất nhiều các sản phẩm tự nhiên NRPS dính đến tạo một số thuốc chống khối u, ức chế miễn dịch, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus quan trọng nhất hiện nay có và hàng trăm các sản phẩm tự nhiên, gồm hợp chất giảm cholesterol lovastatin là từ PKS (Brakhage, 2013)

Polyketides là một nhóm lớn các sản phẩm tự nhiên có cấu trúc đa dạng thể hiện một loạt các hoạt động sinh học và dược học như kháng khuẩn, kháng nấm, chống cholesterol, chống ung thư, chống ung thư và các tính chất

ức chế miễn dịch Mặc dù cấu trúc đa dạng, tất cả các polyketides được lắp ráp bởi các vòng lặp tiếp nối các ngưng tụ Claisen tiếp nối giữa một dẫn xuất malonate thioesterified và một thioester acyl Các enzyme xúc tác cho sự ngưng tụ này được gọi là các phản ứng tổng hợp polyketide (PKSs)

Đã có rất nhiều đánh giá về các enzyme liên quan đến từng loại PKS và hiện nay phần lớn trên thế giới đều đang sử dụng các biện pháp thu nhận các dòng gen mã hoá polyketide synthase từ vi sinh vật cũng như áp dụng các biện pháp sinh học trong việc tổng hợp polyketide synthase

Có thể tìm thấy trong hải miên D dissoluta và Theonella swinhoei các hợp

chất chống ung thư discodermolide, onnamide, và theopederin Ngoài ra, vi

khuẩn Salinispora phân lập từ hải miên P clavata được nhận dạng là nguồn

kháng sinh rifamycin, được sản xuất bởi hệ PKS

Hình1.2: Phản ứng tổng h

doxorubicin, є-rhodomycinone

Bằng những phân tích metagenomics, nhi

nhóm gen polyketid synthase trong vi sinh v

2004; Schirmer et al., 2005; Kim

cs (2010) đã sử dụng metagenomics ch

khuẩn mới từ vi sinh vậ

được 2 clones có hoạt tính kháng

2005; Kim et al., 2006; Kenedy et al., 2008) Yung và

ng metagenomics chức năng để sàng lọc các protein kháng

vi sinh vật liên kết hải miên Cymbastela concentrica

ứng) Dòng CcAb1 và CcAb2 đều thuộc lớp Gammaproteobacteria Các tác giả cũng nhận diện được các enzyme thủy phân mới từ cộng đồng vi sinh vật liên kết hải miên và phần lớn chúng thuộc Alpha- và Gammaproteaobacteria Phần lớn các chất kháng khuẩn được nhận dạng bởi chọn lọc metagenomic là những phân tử nhỏ, ví dụ như palmitoylputrescine, violacein, turbomycin A

và B, và indirubin và indigo Kết quả nhận được cho rằng có thể các hydrolases như là những nguồn thay thế có hoạt tính kháng khuẩn từ vi sinh vật liên kết hải miên

1.6.Vector tách dòng pCR2.1 invitrogen

Để tách dòng một đoạn DNA, đoạn đó cần phải được đính vào vector tách dòng Có nhiều loại vector: plasmid, phage, cosmid, YAC Người ta chọn sử dụng vector dựa vào kích thước của đoạn DNA cần tạo dòng và mục đích tạo dòng Trong số các loại vector hiện nay thì plasmid được sử dụng rộng rãi nhất Về chức năng, người ta chia vector thành hai loại lớn là vector tạo dòng (cloning vector) và vector biểu hiện (expression vector)

Trong phạm vi đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pCR® 2.1 để tách dòng gen mã hoá PKS thu nhận được từ vi sinh vật liên kết hải miên

đã được cắt mở vòng do có hai đầu dính, mỗi đầu có một base Thimin.Vector

pCR ® 2.1 có kích thước 3,9kb, được thiết kế có gắn một operon chuyển hoá đường lactoza là operon-lac Tại vùng ranh giới giữa promoter của operon này

là gen cấu trúc mã hoá cho β-galactosidase có vùng đa cắt với 17 vị trí cắt cho

các enzyme giới hạn: EcoRI, Hind III, Nsi I.KpnI, SacI, BamHI, SpeI, BstX I,

Eco R V, NotI, AvaI, PaeR7 I, Xho I, Xba I, Apa I Trong đó EcoR I và BstX I

có hai vị trí cắt các enzyme còn lại chỉ có một vị trí cắt Với vị trí vùng cắt

gắn đa vị như vậy, sản phẩm β-galactosidase có thể được tạo ra(nếu vector

không được gắn đoạn ngoại lai) hoặc không được tạo ra(nếu vector gắn đoạn ngoại lai) Dựa vào dấu chuẩn đó, người ta có thể lựa chọn tế bào mang vector tái tổ hợp với tần suất cao Ngoài ra, vector pCR®2.1 có chứa gen kháng kháng sinh là Ampicillin và Kanamycin với nồng độ ức chế tối thiểu

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vector pCR®2.1

PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1.Vi sinh vật liên kết hải miên vùng biển Quảng Trị đãđược phân lập 2.1.2 Các thiết bị và sinh phẩm:

- Bộ sinh phẩm TA cloning Kit (Invitrogen) dùng cho mục đích tạo dòng gen

Trong bộ kit gồm các thành phần vectơ pCR ®

2.1 (đã mở vòng có đầu dính là

Timin), enzyme T4 ligaza, đệm ligaza 10X, tế bào E coli chủng InVαF ’ Bộ sinh phẩm Kit Pure LinkTM (Fermentas)dùng để tinh sạch plasmid Kit thôi gel Qiagen sinh phẩm BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) dùng để giải trình tự gen

Ethidium bromide, tryptone, agar, X-gal, Ampicilin, cao nấm men (yeast extract), chloroform, agarose, TAE, isoamylalcohol, EDTA, ethanol, các

enzym giới hạn (EcoRI, BamHI, XhoI) Các hoá chất này hầu hết do hãng

Invitrogen, Fermentas, Applies Biosystem cung cấp

+ Dung dịch chloroform: isomaylalcohol ( 24:1 )

+ Dung dịch TE (10mM Tris-HCl pH 8,0; 1 mM EDTA )

+ Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (LB, g/l ) :

Yeast extract: 10g

Trypton : 10g

NaCl : 10g

pH 7,4 ( chỉnh OH 5N) Đối với môi trường thạch cần bổ sung 2% agarose

+ Dung dịch dùng cho điện di :

Dung dịch đệm điện di TAE 1X: Lấy từ dung dịch gốc TAE 50X:

Axit acetic glacial 28,6 ml

0,5 M EDTA pH 8,0 50 ml

Nước khử ion vừa đủ 500 ml

Gel Agarose 1%: Cân 1 gram agarose, bổ sung 100 ml đệm TAE 1X Đun tan agarose trong lò vi sóng khoảng 2-3 phút.Để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50oC rồi đổ ra khay điện di đã có lược tạo giếng tra mẫu

+ Ethidium bromide( EtBr ) dung dịch gốc: 10mg/ml Hòa 1 gam EtBr vớià 100ml H2O Quấy bằng máy khuấy từ cho tan đều Giữ trong lọ ở nhiệt độ phòng Khi dùng pha 20 µl dung dịch gốc trong 100 ml đệm TAE 1X

+ Đệm tra mẫu ( Loading buffer) 5X:

Tris-HCl 1 M pH 8,0 1 ml

EDTA 0,5 M pH 8,0 0,2 ml

Bromphenol Blue 1% 2 ml

+ Bộ kittách metagenomic DNA

Máy khuấy từ ( RotoLab, OSI)

Máy ly tâm ( Microcentrifuge-Sorvall, Mỹ)

Tủ lạnh sâu -20oC,-75oC ( Sanyo, Nhật Bản)

Máy khuấy trộn Vortex ( RotoLab, OSI)

Máy hút chân không ( Speed Vac Sc 110-Savant)

Máy quang phổ ( Shimadzu, Nhật Bản)

Máy soi chụp ảnh gel ( Bio-Rad)

Cân phân tích 10-4 g ( Mettler Toledo)

Bộ nguồn điện di ( Bio-Rad)

Tủ cấy vô trùng ( Sanyo)

Pipettman các loại ( Gilson)

Nồi khử trùng ( Nhật Bản)

Cân điện 10-2 g ( Mettler Toledo)

Máy ly tâm lạnh ( Sorvall Biofuge Fresco)

Bộ điện di ( Advance Tech, Nhật Bản)

Máy xác định trình tự tự động (ABI 3100, Applied Biosystems, Mỹ)

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Phương pháp tách DNA tổng vi sinh vật liên kết hải miên:

Ph ương pháp xử lý mẫu Hải miên

Thu nhận mẫu hải miên bằng phương pháp Scuba, tại biển Quảng trị

Mẫu Hải miên mang lên ngay lập tức được đựng trong hộp vô trùng có chứa cồn tuyệt đối, giữ lạnh và đưa về phòng thí nghiệm

- Lấy 5g hải miên, rửa qua nước muối sinh lý 0,9% Cắt nhỏ hải miên

- Nghiền trong nước muối sinh lý 0,9%

- Vortex nhẹ 10 phút

- Lọc lấy dịch

- Ly tâm 250xg 3 phút, loại cặn thu dịch

- Ly tâm dịch 1500 x g/3p loại dịch thu cặn

Tách DNA t ổng số theo kit:

- Cân 200-300 mg cặn vào một ống hình nón 50ml và thêm 10 ml đệm chiết với Tween 20 Trộn bằng vortexing ở tốc độ tối đa trong 1 phút để phân tán

và phân rã cặn

-Ly tâm ở tốc độ 1.600 x g trong 4 phút.Đổ chất lỏng vào một ống falconmới.Giữ lại cặn.(Thêm 20 ml dung dịch đệmchiết còn lại với Tween 20 (mỗi lần chiết) vào cặnvà trộn bằng cách vortexing ở tốc độ tối đa trong 1 phút ): Thực hiện lại bước này 2 lần

Thu dịch toàn bộ dịch sau mỗi lần chiết vào ống falcon mới

- Đổ trên bề mặt thu thập được (50 ml) qua bốn lớp lọc Miracloth (Calbiochem)

- Lọc sơ bộ mẫu qua màng lọc Millipore 1.2-µm

- Đi qua bộ lọc được thu thập thông qua màng lọc 0,45 µm (Bộ máy lọc thích hợp để bẫy khối lượng vi khuẩn trên bộ lọc).Giữ màng lọc

- Dùng kẹp và kéo cắt ethanol 70%, lấy màng ra khỏibộ lọc, cắt màng trong một nửa, và đặt mỗi nửa (tròn bên xuống) dọc theo phía (gần đáy) của ống tĩnh mạch vô trùng 50 ml Phần trên bề mặt của bộ lọc cần phải đối mặt với trung của ống

- Chuẩn bị bộ lọc đệm lọc bằng cách thêm 1,5 µl Tween 20 đến 1,5 ml của đệm lọc rửa ngay trước khi sử dụng Thêm 1,5 ml đệm lọc rửa chứa chứa 0,1%Tween 20 đến phần lọc trong ống

- Vortex ống ở tốc độ thấp để thiết lập lại các mảnh lọc, sau đó tăngđể tốc độ cao nhất trong khoảng 2 phút để rửa sạch các vi khuẩn bị mắc kẹt trênmàng

- Chuyển tế bào huyền dịch đến một ống ly tâm sạch, sau đó ly tâm ống

ở 14.000 x g trong 2 phút Vứt bỏ lớp trên

- Thêm 300 µl TE, sau đó thêm 2 µl Ready-LyseLysozyme Solution và

1 µl RNase A tạo tế bào huyền phù Trộn, và ly tâm.Ủ ở 37 °C trong 30 phút

- Thêm 300 µl dung dịch Meta-Lysis (2X) và 1 µl Proteinase K vào ống Trộn bởi vortexing.Ủ ở 65 ° C trong 15 phút

- Làm mát đến nhiệt độ phòng, sau đó đặt trên đá trong 3-5 phút