Phân lập, định danh và xác định tỷ lệ, độ nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn kị khí trên các mẫu bệnh phẩm

Từ những năm 60 của thế kỷ 20 trở đi, trong cùng một khoảng thời gian, các nhà vi sinh vật đã phát triển nhiều kỹ thuật nuôi cấy, phân lập, định danh và thử nghiệm mức độ nhạy cảm với kh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

HỌC VIÊN THỰC HIỆN : NGUYỄN THỊ THỦY

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS TRỊNH THỊ THU HẰNG

Hà Nội, 10/2016

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của thầy cô, các anh chị, các em và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:

Ban Lãnh đạo, Phòng sau đại học, Bộ môn - Công nghệ sinh học - Viện đại học Mở Hà Nội, khoa Vi Sinh - Bệnh viện Việt Đức, Bệnh viện Đa Khoa Đức Giang

TS Trịnh Thị Thu Hằng - Viện đại học Mở Hà Nội, cô đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt tôi hoàn thành luận văn

PGS.TS Trương Quốc Phong - Trưởng phòng Thí nghiệm Proteomics - Trung tâm nghiên cứu và phát triển CNSH, Viện Công Nghệ sinh học, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội, thầy đã dậy bảo, giúp đỡ tôi rất nhiều để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Trưởng khoa Ths Nguyễn Thị Vân và toàn thể anh chị em khoa Vi Sinh Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Đức Giang Các anh chị luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình làm việc, học tập và thu thập số liệu để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các GS, PGS, TS trong hội đồng chấm luận văn đã cho tôi nhiều ý kiến xác đáng và quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Cuối cùng cho tôi gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè luôn ở cạnh tôi, giúp đỡ động viên tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Nguyễn Thị Thủy

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của tôi, tất cả các số liệu kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong đề tài nào khác

Tác giả

Nguyễn Thị Thủy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẲT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Lịch sử phát triển của ngành vi khuẩn học kị khí 3

1.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn kị khí 5

1.2.1 Khái niệm về vi khuẩn kị khí 5

1.2.2 Phân loại vi khuẩn kị khí theo mức độ nhạy cảm với oxy 5

1.2.3 Vị trí tồn tại của vi khuẩn kị khí 6

1.2.4 Một số đặc điểm của vi khuẩn kị khí gây bệnh ở người 7

1.3 Tình hình nhiễm khuẩn do vi khuẩn kị khí ở người 8

1.4 Một số bệnh cảnh do vi khuẩn kị khí gây nên ở người 10

1.5 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn kị khí trên thế giới và Việt Nam 15

1.5.1 Trên thế giới 15

1.5.2 Tại Việt Nam 16

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Vật liệu 20

2.2.1 Môi trường 20

2.2.2 Hóa chất 20

2.2.3 Thiết bị 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phương pháp lấy và lưu trữ mẫu 21

2.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn kị khí bằng kít định danh ID 32A 22

2.3.4 Định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rARN 24

2.3.5 Phương pháp thử nghiệm kháng sinh đồ với vi khuẩn kị khí 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn kị khí 32

3.1.1 Tỷ lệ VKKK trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng 32

3.1.2 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn kị khí theo loại bệnh phẩm 33

3.2 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn kị khí phân lập được 34

3.2.1 Kết quả định danh bằng kiểu hình 34

3.2.2 Kết quả phương pháp định danh kiểu gen 35

3.3 Kết quả nhạy cảm kháng sinh của các chủng VKKK phân lập được 43

3.3.1 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng VKKK gram âm 43

3.3.3 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng VKKK gram dương 46

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẲT

Viện chuẩn thức Hoa Kỳ về lâm sàng và xét nghiệm MALDI-TOF MS Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Số lượng, tỉ lệ và vị trí tồn tại của vi khuẩn kị khí 7

Bảng 1.2: Tỉ lệ các hình thái nhiễm trùng phân lập được vi khuẩn kị khí [15] 9

Bảng 2.1: Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 26

Bảng 2.2: Tiêu chuẩn diễn giải kết quả đường kính vùng ức chế đối với 29

B fragilis và các chủng vi khuẩn kị khí mọc chậm [12] 29

Bảng 2.3: Tiêu chuẩn diễn giải kết quả đường kính vùng ức chế đối với 29

Bảng 2.4: Tiêu chuẩn diễn giải kết quả đường kính vùng ức chế đối với các chủng vi khuẩn kị khí mọc nhanh [12] 30

Bảng 2.5: Tiêu chuẩn diễn giải kết quả MIC của các chủng vi khuẩn kị khí [12] 30

Bảng 3.1: Tỷ lệ phân lập VKKK trên các loại bệnh phẩm 32

Bảng 3.2: Phân lập các VKKK theo loại bệnh phẩm 33

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Xác định khả năng nhạy cảm kháng sinh bằng phương pháp khoanh giấy

kháng sinh 27

Hình 2.2 Xác định khả năng nhạy cảm kháng sinh bằng phương pháp etest 28

Hình 3.1 Kết quả định danh bằng kiểu hình các vi khuẩn kị khí 34

Hình 3.2 Kết quả tách ADN tổng số của 5 chủng VKKK 36

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR 36

Hình 3.4 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng VKKK gram âm 43

Hình 3.5 Mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh của Bacteroides fragilis 44

Hình 3.6 Mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh của Prevotella intermedia 45

Hình 3.7 Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng VKKK gram dương 46

Hình 3.8 Mức độ nhạy cảm với một số kháng sinh của Clostridium perfringens 47

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn kị khí là nguyên nhân quan trọng gây ra nhiều loại nhiễm khuẩn ở người trong những năm gần đây Chúng gây nhiễm trùng ở các cơ quan trên cơ thể người như: nhiễm trùng huyết, nhiễm trùng liên quan đến ung thư, áp xe não, gan, phổi, lách, thận, cơ quan sinh dục, nhiễm trùng da, cơ, mô mềm

Các hình thức nhiễm khuẩn ở người ít khi đơn độc mà thường là nhiễm khuẩn hỗn hợp giữa vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kị khí Nhiễm trùng do vi khuẩn

kị khí là một câu hỏi luôn được đặt ra khi xem xét tất cả các hình thái nhiễm khuẩn

đó các xét nghiệm tìm vi khuẩn kị khí nói chung là phức tạp, tốn kém, đòi hỏi

Việc thử nghiệm kháng sinh với vi khuẩn kị khí gây nhiễm trùng là một việc làm cần thiết ngay sau khi định danh được vi khuẩn kị khí gây bệnh Tuy nhiên, với

vi khuẩn kị khí gây bệnh để có được kết quả kháng sinh đồ cũng cần thời gian từ 2 đến 4 ngày sau khi có kết quả định danh Mức độ gia tăng đề kháng kháng sinh ngày càng nghiêm trọng, trong 3 năm gần đây không có kháng sinh mới nào được FDA (Cục an toàn thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ) chấp nhận, mà tốc độ đa kháng kháng sinh tăng hàng ngày

Xuất phát từ những thực tiễn trên, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài :

“Phân lập, định danh và xác định tỷ lệ, độ nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn kị

1 Phân l ập, xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn kị khí trong các mẫu bệnh phẩm

lâm sàng

2 Định danh các chủng vi khuẩn kị khí phân lập được

3 Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của các loại vi khuẩn kị khí phân

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Lịch sử phát triển của ngành vi khuẩn học kị khí

Các nhiễm trùng do vi khuẩn kị khí đã được biết đến từ thời Hy Lạp cổ đại Năm 460 trước Công nguyên Hippocrates đã nhắc đến bệnh uốn ván với những triệu chứng lâm sàng điển hình và tỷ lệ tử vong cao Tuy nhiên, thời đó người ta chưa biết đến vi khuẩn kị khí chính là tác nhân gây bệnh này Mãi đến năm 1861 Pasteur lần đầu tiên đã phát hiện ra các "animalcules" - theo miêu tả thì đó là những

"động vật" rất bé chỉ nhìn thấy dưới kính hiển vi, có thể phát triển trong môi trường không có oxy Đó là những vi sinh vật hình que, có thể lên men axit butyric trong môi trường không có oxy và bị chết khi gặp không khí Năm 1863 Pasteur gọi đó là các "anaerobies"- các vi khuẩn kị khí [29] Phát hiện của Pasteur đã là sự khởi đầu cho các nghiên cứu khác của các nhà vi sinh vật Pháp cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 Năm 1893 Veillon đã phân lập được cầu khuẩn Gram âm kị khí [38] Năm 1897 và

1898 Veillon và Zuber đã miêu tả một số bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn kị khí gây

ra như B fragilis là tác nhân gây viêm ruột thừa, Clostridium gây ngộ độc thức ăn,

hoại thư sinh hơi và uốn ván đã trở nên quen thuộc với các thầy thuốc lâm sàng và

các bệnh này thường có các triệu chứng rất điển hình Clostridium tetani đã được Fluegge miêu tả năm 1886 và Kitasato phân lập năm 1890 Clostridium perfringens

được Welch và Nutall phát hiện năm 1896 (còn có tên là Bacillus welchii) Năm

1898 Veillon và Zuber đổi tên thành Bacillus perfringens, ngày nay gọi là

Clostridium perfringens Vi khuẩn Clostridium botulinum được Ermengens miêu tả

lần đầu tiên vào năm 1896 [17, 18] Trong khi đó các vi khuẩn kị khí không có nha bào vẫn rất ít được biết đến vì việc nuôi cấy chúng đòi hỏi các kỹ thuật phức tạp hơn

Từ những năm 60 của thế kỷ 20 trở đi, trong cùng một khoảng thời gian, các nhà vi sinh vật đã phát triển nhiều kỹ thuật nuôi cấy, phân lập, định danh và thử nghiệm mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn kị khí, mở ra một kỷ nguyên mới trong lĩnh vực này Đó cũng chính là tiền để cho một loạt nghiên cứu lâm sàng

về các bệnh nhiễm trùng vi khuẩn kị khí

Cho đến giữa thế kỷ 20, các nhiễm khuẩn vi khuẩn kị khí được hiểu là những

nhiễm trùng kinh điển do độc tố của các Clostridium là loài vi khuẩn có nha bào gây

ra và có những triệu chứng điển hình nguy hiểm đến tính mạng bệnh nhân Ở nhiễm trùng loại này, chẩn đoán bệnh thường chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng, đó là

hoại thư sinh hơi do C perfringens, uốn ván do C tetani, ngộ độc thức ăn do C

botulinum gây ra Giai đoạn này vai trò gây bệnh của vi khuẩn kị khí không có nha bào trong nhiều bệnh nhiễm trùng đã không được đánh giá đầy đủ Từ những năm

60 trở lại đây, những tiến bộ trong các kỹ thuật nuôi cấy, phân lập, định danh và thử nghiệm mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn kị khí đã tạo điều kiện cho nhiều phòng xét nghiệm vi sinh đưa xét nghiệm tìm vi khuẩn kị khí vào thường quy

và cũng từ đó vai trò gây bệnh quan trọng của các vi khuẩn kị khí không có nha bào trong các nhiễm khuẩn đã được khẳng định tại các nước phát triển

Những thập kỷ gần đây, tại Việt Nam cũng như ở các nước đang phát triển nói chung, nhờ tiến bộ của khoa học kỹ thuật đã đưa quy trình kỹ thuật vào việc nuôi cấy, phân lập, định danh và thử mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn

kị khí áp dụng trong các phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng nhưng kết quả còn nhiều hạn chế, hiện còn gặp nhiều khó khăn, chưa trở thành thường quy, thường bị

bỏ sót Vi khuẩn kị khí vì vậy vẫn chưa có được vị trí xứng đáng Trong các bệnh viện của khu vực Hà Nội thì có bệnh viện Việt Đức, bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Truyền nhiễm trung ương đã nuôi cấy vi khuẩn kị khí nhưng vẫn chưa có nghiên cứu nào làm với lượng mẫu lớn được công bố về tỉ lệ mọc vi khuẩn kị khí trong các bệnh phẩm của người bệnh có nhiễm trùng hay mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn kị khí Nguyên nhân của tình trạng này là do chúng ta còn thiếu hiểu biết về các vi khuẩn kị khí, điều kiện kỹ thuật của các phòng xét nghiệm còn nhiều thiếu thốn Trong khi đó các xét nghiệm tìm vi khuẩn kị khí nói chung là phức tạp, quy trình nuôi cấy vi khuẩn kị khí đòi hỏi rất khắt khe, cũng như các trang thiết bị nuôi cấy vi khuẩn kị khí đòi hỏi rất phức tạp tốn kém, cần nhiều thời gian và kinh nghiệm

1.2 Đặc điểm chung của vi khuẩn kị khí

Vi khuẩn kị khí là các loại vi khuẩn được mô tả là mọc chậm trên các môi trường giàu chất dinh dưỡng và không mọc được trong điều kiện có oxy Tùy theo từng tác giả có cách chia vi khuẩn kị khí thành nhiều loại

1.2.1 Khái niệm về vi khuẩn kị khí

Có nhiều định nghĩa khác nhau về vi khuẩn kị khí

- Smith cho rằng vi khuẩn kị khí là các vi khuẩn có 3 tính chất [33]:

+ Mọc tốt hơn trong môi trường không có oxy

+ Không thể nuôi cấy được với số lượng vi khuẩn ban đầu ít (inocula) nếu môi trường nuôi cấy không có điện thế oxy hóa khử (Eh) thấp

+ Sẽ chết khi tiếp xúc với không khí

- Rosenblatt định nghĩa vi khuẩn kị khí là các vi khuẩn có 2 tính chất [30]: + Chỉ tồn tại và phát triển trong môi trường thiếu oxy tương đối hoặc không

có oxy

+ Không mọc trên môi trường thạch ở khí quyển bình thường hoặc khí quyển

1.2.2 Phân loại vi khuẩn kị khí theo mức độ nhạy cảm với oxy

Theo các đinh nghĩa nêu ở trên, các chủng vi khuẩn kị khí khác nhau có khả năng chịu tác động của oxy khác nhau Dựa vào đó người ta chia các vi khuẩn thành

các nhóm sau [32]:

Vi khuẩn kị khí nghiêm ngặt: Những vi khuẩn của nhóm này không mọc trên môi trường thạch nếu nồng độ oxy của môi trường nuôi cấy lớn hơn 0,5% Chúng thường chết sau khi tiếp xúc với không khí chỉ 10 phút Những vi khuẩn nhóm này thường rất khó nuôi cấy, dù áp dụng các phương pháp rất hiện đại

Vi khuẩn kị khí nhạy cảm vừa phải với oxy (Capnophile): Những vi khuẩn này có thể mọc trên môi trường thạch có khí trường 2-8% oxy Chúng vẫn có thể sống sau khi tiếp xúc với không khí trong khoảng thời gian trên 10 phút đến 60 phút, thậm chí 90 phút (tùy theo chủng)

Vi khuẩn kị khí chịu oxy (aerotolerant): Các vi khuẩn nhóm này sau khi đã

được nuôi cấy trong môi trường kị khí lần đầu từ bệnh phẩm, đã mọc thành khuẩn lạc trên mặt thạch, nếu cho tiếp xúc với không khí nhiều giờ vẫn sống được

Vi khuẩn nhóm microaerophilic: Những vi khuẩn này có thể mọc trong khí

(ví dụ: Campylobacter, HP), khí trường đòi hỏi 5% oxy

Vi khuẩn kị khí tùy tiện: Những vi khuẩn này có thể sống được cả trong môi trường kị khí và môi trường hiếu khí Các vi khuẩn đường ruột họ

Enterebacteriaceae thuộc nhóm này

1.2.3 Vị trí tồn tại của vi khuẩn kị khí

Trong thiên nhiên tồn tại nhiều loài vi khuẩn kị khí không gây bệnh Điển

hình là các giống vi khuẩn kị khí có khả năng khử sulfat Desulfovibrio và

Desulfotomaculum

Một số Clostridium có mặt ở cả trong bụi đất và đại tràng của người và động vật C tetani và các Clostridium gây hoại thư sinh hơi (điển hình là C peifringens) thuộc nhóm này C botulinum lại chỉ tổn tại trong bụi đất, không có trong đại tràng

người bình thường

Trong khi đó các vi khuẩn kị khí không có nha bào, bao gồm các trực khuẩn, các cầu khuẩn Gram âm và Gram dương, lại chỉ tồn tại trên niêm mạc, da người và

da động vật Chúng không tồn tại và phát triển được trong môi trường thiên nhiên

Tỷ lệ vi khuẩn kị khí/vi khuẩn hiếu khí trong đại tràng (phân) là 1000/1, trên niêm mạc miệng và họng ít nhất là 3/1 và trên da là 10/1 Sao trên da lại nhiều vk kị khí thế Trong phân người có khoảng vài trăm loại vi khuẩn mà đa số trong đó là vi

khí có mặt gần như thường xuyên trên niêm mạc đường sinh dục của cả nam và nữ

Sự có mặt của vi khuẩn kị khí ở âm đạo và tử cung có liên quan đến chu kỳ kinh nguyệt [31]

Bảng 1.1: Số lượng, tỉ lệ và vị trí tồn tại của vi khuẩn kị khí

1.2.4 Một số đặc điểm của vi khuẩn kị khí gây bệnh ở người

Trong số vài trăm loài vi khuẩn kị khí có mặt ở người và trong tự nhiên người ta đã tìm thấy khoảng trên dưới 100 loài vi khuẩn kị khí có mặt trong các bệnh phẩm nhiễm trùng ở người Như vậy so với số loài vi khuẩn hiếu khí gây bệnh thì số loài vi khuẩn kị khí gây bệnh nhiều gấp nhiều lần Điều này gây rất nhiều khó khăn cho việc phân lập và tuyển chọn chúng

Điều kiện để vi khuẩn kị khí có thể gây bệnh được là phải có tình trạng giảm hiệu thế oxy hoá-khử kí hiệu là EH hay không có ôxy EH máu phụ thuộc vào độ bão hoà oxycủa hegmolopin hồng cầu và với mức độ ít quan trọng hơn là nồng độ oxy hoà tan trong huyết thanh EH của hầu hết tổ chức trong cơ thể từ +0,126V đến +0,246V, phụ thuộc vào mức độ cung cấp máu và nơi đo gần vùng có nồng độ oxy cao như động mạch hay tĩnh mạch Với trị số EH như trên vi khuẩn không hoạt động gây bệnh được

Trong phòng thí nghiệm, phần lớn các vi khuẩn kị khí chỉ hoạt động được

khi EH thấp -0,5V mà nồng độ oxy lại cao Y học đã biết Clostridium tetani dạng

không có nha bào thì EH phải là +0,1V, còn có nha bào thì EH phải là -0,1V mới phát triển được

Do đặc tính sinh học để tồn tại và phát triển của vi khuẩn kị khí như trên nên trong bệnh lí ở người chỉ khi nào có thương tổn làm giảm hay ngừng tuần hoàn đến các tổ chức như phẫu thuật, chấn thương, xơ gan động mạch hay do tác động của nội độc tố vi khuẩn Gram âm (L.P.S), do viêm tắc động tĩnh mạch, do ung thư chèn

ép, cản trở lưu huyết tại chỗ Ngoài ra, phần lớn còn cần sự phối hợp của các vi khuẩn ái khí gây bệnh cũng như nhiều loại vi khuẩn kị khí với nhau

1.3 Tình hình nhiễm khuẩn do vi khuẩn kị khí ở người

Xác định vi khuẩn kị khí trong một bệnh cảnh nhiễm trùng là rất quan trọng

vì các vi khuẩn kị khí sống bình thường trong cơ thể người với số lượng rất lớn, ít nhất là bằng hoặc gấp 1.000 lần vi khuẩn hiếu khí, tuy vậy, chỉ có một số ít trong số

đó có thể gây bệnh Ví dụ: như trong nhóm Bacteroid thì Bacteroid fragilis là có khả năng gây bệnh nhất vì có bỏ bọc polysaccharid Do đó khi phân lập được

Bacteroid fragilis thì vai trò gây bệnh hoặc phối hợp gây bệnh là chắc chắn nhưng

nếu phân lập được Bacteroid vulgatus thường có mặt trong các bệnh cảnh nhiễm

trùng có nguồn gốc từ phân thì vai trò thực sự gây bệnh chỉ là rất hạn hữu

Bảng 1.2: Tỉ lệ các hình thái nhiễm trùng phân lập được vi khuẩn kị khí [15]

Những dấu hiệu và bệnh cảnh lâm sàng gợi ý là có khả năng có mặt vi khuẩn

kị khí như:

- Có mùi thối đặc biệt (mủ màng phổi, áp xe các loại)

- Khu trú trong niêm mạc, dưới niêm mạc (nhiễm trùng trong miệng hay lợi, răng)

- Có dấu hiệu hoại tử đặc biệt có hơi (nhiễm trùng các cơ lớn, ngoài da có các nội hoại tử)

- Có giả mạc (viêm ruột già có giả mạc)

- Viêm nội tâm mạc mà nuôi cấy đúng kỹ thuật thích hợp với vi khuẩn hiếu khí vẫn âm tính

- Nhiễm trùng trên cơ sở thuận lợi do ung thư mà có hoại tử tổ chức

- Nhiễm trùng sau khi dùng kháng sinh nhóm aminoglycosid

- Có viêm tắc tĩnh mạch do nhiễm khuẩn

- Nhiễm trùng sau khi bị súc vật cắn

- Nhiễm trùng các khoang mặt có các chất tiết dạng các hạt sulfur

- Vi khuẩn huyết có vàng da

1.4 Một số bệnh cảnh do vi khuẩn kị khí gây nên ở người

Các vi khu ẩn kị khí gây ngộ độc thức ăn: Clostridium botulium, chúng có trong thức ăn do quá trình sản xuất và bảo quản không đảm bảo vệ sinh

Những vết thương có tình trạng thiếu ôxy do: Miệng vết thương bị bịt kín, tổ chức bị hoại tử nhiều, thiếu máu, có dị vật ở vết thương, có vi khuẩn gây mủ khác kèm theo tạo thuận lợi cho nha bào uốn ván phát triển gây bệnh

Uốn ván là một bệnh truyền nhiễm cấp tính gây nên bởi trực khuẩn

Clostridium tetani và ngoại độc tố hướng thần kinh của nó Bệnh lây qua da và niêm mạc tổn thương Đặc điểm lâm sàng là một trạng thái co cứng cơ liên tục và

có những cơn giật cứng Khởi đầu là co cứng cơ nhai, sau lan ra các cơ mặt, thân mình và tứ chi

Nhi ễm trùng da và mô mềm:

Các bệnh nhiễm trùng thường xuyên liên quan đến vi khuẩn kị khí bao gồm nhiễm trùng bề mặt, bị nhiễm bệnh do vết cắn của người hoặc động vật, loét da, viêm mô tế bào, mủ da, viêm tuyến mồ hôi, dạ dày hoặc vết thương mở khí quản, ghẻ hoặc nhiễm trùng kerion, eczema, bệnh vẩy nến, viêm da dị ứng, eczema herpeticum, nhiễm dưới da nang bã nhờn và nhiễm trùng vết thương sau phẫu thuật Bệnh nhiễm trùng mô dưới da bao gồm: áp xe dưới da và áp xe vú, loét tư thế nằm, u nang pilonidal hoặc xoang, viêm loét Meleney của bệnh tiểu đường (mạch máu hay dinh dưỡng) loét, vết cắn, vết thương, kị khí viêm mô tế bào và hoại tử, hoại tử vi khuẩn hiệp đồng và nhiễm trùng vết thương Nhiễm trùng mô mềm kị khí sâu hơn đang hoại tử, viêm mô tế bào hoại tử và viêm mô tế bào crepitus Đây có thể liên quan đến viêm cơ và myonecrosis

Bệnh phẩm thu được từ vết thương và nhiễm trùng mô dưới da và áp xe trực tràng (áp xe quanh trực tràng, loét tư thế nằm) hoặc thu được từ các nhiễm trùng ở

bệnh nhân đái tháo đường Đây là những vi khuẩn thuộc nhóm B fragilis,

Clostridium spp, Enterobacteriaceae và Enterococcus spp Mặt khác, nhiễm trùng

trong và xung quanh vùng hầu họng, hoặc nhiễm trùng có nguồn gốc từ vị trí đó,

Peptostreptococcus spp Nhiễm trùng vết cắn của con người thường chứa

Eikenella spp và động vật cắn chứa Pasteurella multocida

Viêm t ủy xương và viêm khớp nhiễm khuẩn:

Vi khuẩn kị khí thường được tìm thấy trong oesteomyelitis của xương dài đặc biệt là sau khi chấn thương và gãy xương, viêm tủy xương liên quan với bệnh mạch máu ngoại biên, loét tư thế nằm và viêm xương tủy của xương mặt và

sọ Nhiều trường hợp nhiễm trùng xương là đa khuẩn trong tự nhiên

Vi khuẩn kị khí có thể được phân lập từ hầu hết các loại đường hô hấp trên, đầu và cổ, nhiễm trùng và đặc biệt phổ biến ở những người mãn tính Chúng bao gồm hạnh nhân, peritonsillar và áp xe sau hầu, viêm tai giữa mãn tính,viêm

xoang và viêm xương chũm, quai bị, sialadenitis, viêm tuyến giáp, nhiễm trùng odontogenic và sau phẫu thuật và không phẫu thuật đầu và cổ Các sinh vật chiếm

ưu thế là của hầu họng có nguồn gốc và bao gồm AGNB, Fusobacterium và

Peptostreptococcus

Viêm quanh r ăng và Sâu răng:

Vai trò chủ yếu của Streptoccus metans và thường có thêm Streptoccus

salivatus , Streptoccus feacalis, actinomyces và vi khuẩn kị khí phân lập từ cao răng

và viêm quanh răng chủ yếu là fusobacteroid funduliformis

Kháng sinh có chỉ định: penicilllin hoặc cefuroxyme (chú ý: ở đây có yếu tố quá mẫn không chỉ đơn thuần nhiễm trùng, nhất là viêm quanh răng)

- Apxe phổi: ổ apxe thường độc có đường kính từ 2cm trở lên

- Viêm phổi do vi khuẩn kị khí được chẩn đoán nhờ vào hình ảnh X quang với hình ảnh mờ rải rác, 2 phế trường nhưng không có hang

- Viêm phổi hoại tử (Nescrositing pneumonia): phổi có nhiều vùng hoại tử và

có hang nhỏ trên nhiều thuỳ phổi hay trên nhiều phân thuỳ của một thuỳ, có thể lan sang màng phổi

Viêm n ội tâm mạc:

Kỹ thuật nuôi cấy kị khí đã có nhiều tiến bộ và cũng do yêu cầu của các bác

sỹ lâm sàng ngày càng chú ý nên việc phân lập được vi khuẩn kị khí trong nhiễm trùng nội tâm mạc ngày càng tăng Đặc điểm là ít xảy ra trên bệnh nhân có bệnh tim từ trẻ nhưng sau thay van động mạch chủ lại hay gặp và hay có biến chứng nghẽn mạch

Nguồn gốc là từ nhiễm trong miệng họng và dạ dày ruột Các chủng vi khuẩn

thường gặp: Bacteroid fragilis, Fusobacterium nucleatum, Fusobacterium

necophorun, Clostridium perfringens

Việc điều trị khá khó khăn, phải kết hợp clindamycin với imipinem

Nguồn gốc là từ nhiễm trùng xoang mặt hoặc từ xương chũm gây apxe màng

Nhi ễm trùng bụng:

Viêm phúc mạc thứ cấp và nội áp xe ổ bụng bao gồm lách và áp xe gan thường xảy ra do sự xâm nhập của vi sinh vật đường ruột vào trong khoang phúc mạc qua thành ruột hoặc nguyên nhân khác như là tắc nghẽn, nhồi máu hoặc chấn thương trực tiếp, viêm ruột thừa, viêm túi thừa, viêm ruột và phẫu thuật đường tiêu hóa thường kết hợp với nhiễm đa khuẩn gây ra bởi vi khuẩn hiếu khí và kị khí, trong đó số

lượng các chủng có thể trung bình 1/2 Các vi khuẩn hiếu khí phổ biến là Escherichia

coli, Streptococcus spp (bao gồm cả Enterococcus spp.), và các vi khuẩn kị khí thường xuyên nhất được phân lập là B fragilis nhóm, Peptostreptococcus spp và

Clostridium spp

Nhiễm trùng ổ bụng là đặc trưng hai pha: một giai đoạn đầu của viêm phúc mạc liên quan đến vi khuẩn Escherichia coli nhiễm trùng huyết, và một giai đoạn

sau này, trong đó áp xe ổ bụng chứa vi khuẩn kị khí (bao gồm B fragilis nhóm)

Apxe gan do vi khuẩn thường có vi khuẩn kị khí phối hợp vi khuẩn ái khí vì apxe gan thường xảy ra trên những hoàn cảnh thuận lợi như sỏi đường mật ngoài gan, viêm tắc tĩnh mạch mạc treo hay tĩnh mạch cửa Các vi khuẩn kị khí như

bacteroid fragilis, clostridium perfringens lại có khả năng phát triển trong mật

Nhiễm trùng đường mật thường được gây ra bởi E coli, Klebsiella và

Enterococcus spp Vi khuẩn kị khí (chủ yếu là B fragilisnhóm và hiếm khi C

perfringens ) các bệnh nhiễm trùng phức tạp liên quan đến ung thư, nhiễm trùng tái phát, tắc nghẽn, phẫu thuật đường mật hoặc thao tác

Nhiễm trùng huyết từ nguồn gốc nhiễm trùng ổ bụng do loét dạ dày tá tràng,

u ác tính ở ruột già bên phải, lymphoma ruột non, viêm ruột thừa bị vỡ đã tạo ra điều kiện thuận lợi, khởi đầu là nhiễm trùng các hạch rồi từ đó tràn vào máu

Các loại vi khuẩn có liên quan đến nhiễm khuẩn huyết bị ảnh hưởng rất

nhiều bởi sự xâm nhập và các bệnh tiềm ẩn B fragilis và Clostridium spp thường gắn liền với nguồn gốc tiêu hóa; Prevotella, Porphyromonas spp và Fusobacterium spp ở hầu họng và phổi; Fusobacterium spp với các địa điểm đường sinh dục nữ và

Peptostreptococcus spp chủ yếu là hầu họng, phổi và các đường sinh dục nữ Sự kết hợp của những sinh vật này có liên quan đến nguồn gốc của nhiễm trùng ban đầu và

hệ vi khuẩn nội sinh

Trẻ sơ sinh tiếp xúc với hệ vi khuẩn âm đạo mẹ, trong đó có hệ vi khuẩn hiếu khí và kị khí có thể dẫn đến sự phát triển của nhiễm khuẩn kị khí Các bệnh nhiễm

trùng bao gồm viêm mô tế bào (gây ra bởi Bacteroides spp.), nhiễm khuẩn huyết, viêm phổi (do Bacteroides spp.), viêm kết mạc (do clostridial), viêm rốn và ngộ độc trẻ sơ sinh do loài Clostridial có thể đóng một vai trò trong viêm ruột hoại tử Quản

lý các nhiễm trùng nên cần điều trị của bệnh lý nền hiện tại và quản lý điều trị kháng sinh thích hợp

Nhiễm trùng đường sinh dục nữ gây ra bởi vi khuẩn kị khí là đa vi trùng và bao gồm: mô mềm vùng tầng sinh môn, âm hộ và áp xe tuyến Bartholin, viêm âm đạo do vi khuẩn, nội mạc tử cung, pyometra, salpingitis, áp xe phần phụ, áp xe buồng trứng, nhiễm trùng liên quan đến biện pháp tránh thai trong tử cung, viêm vùng chậu, có thể bao gồm viêm mô tế bào vùng chậu và áp xe, amnionitis, viêm tắc tĩnh mạch vùng chậu, phá thai, bệnh nhiễm trùng sản khoa và phụ khoa sau phẫu thuật Điều quan trọng là để tránh làm nhiễm với hệ vi sinh bình thường

Tiêu ch ảy do viêm ruột già có giả mạc sau khi dùng kháng sinh:

Triệu chứng tiêu chảy thông thường thấy có sau khi dùng kháng sinh như penicillin G, ampiciline, tetraciline, chloramphenicol, cotrimoxazol, lincomycine nhưng viêm ruột già có giả mạc (Pseudomembrannous) là một trạng thái khá nặng

và thường xảy ra sau khi dùng clindamycin trong đó vai trò của Clostridium difficile

được nêu lên hàng đầu Clostridium difficile thường trong ruột già nhưng số lượng

rất ít và việc phân lập cũng rất khó khăn Độc tố của Clostridium difficile có tính

kháng và kém chịu nhiệt cũng như tác động của axit Về hoạt tính sinh học thì nó không gây kích hoạt adenylcylase

1.5 Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn kị khí trên thế giới và Việt Nam

1.5.1 Trên thế giới

Trên thế giới, việc nuôi cấy và thử nghiệm kháng sinh đối với vi khuẩn kị khí thường quy nên có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về tỉ lệ mọc vi khuẩn kị khí ở các loại bệnh phẩm khác nhau cũng như mức độ nhạy cảm kháng sinh của chúng Nghiên cứu tại Trung Quốc của các tác giả Bao Zy và cộng sự về tỷ lệ nhiễm

và kháng kháng sinh của các vi khuẩn kỵ khí trên các bệnh nhân có nhiễm trùng răng miệng Các tác giả tiến hành nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí từ 61 mẫu mủ của các bệnh nhân bị nhiễm trùng răng miệng có 6 trường hợp (9,8%) dương tính với 1 loại

vi khuẩn hiếu khí, có 7 trường hợp (11,5%) dương tính với 1 loại vi khuẩn kị khí,

Số ca nhiễm trùng hỗn hợp cả vi khuẩn hiếu khí và kị khí là 48 trường hợp chiếm 78,7% Có 55 trường hợp (90,2%) tìm thấy vi khuẩn kỵ khí trong mẫu bệnh phẩm Trong đó các vi khuẩn kỵ khí Gram dương hay gặp nhất Một số chủng phổ biến là

Peptostreptococcus, Bifidobacterium và Pemphigus Propionibacterium, 3 chủng

này cho kết quả nhạy cảm với các kháng sinh cefoxitin, amoxicillin Các chủng vi

khuẩn kị khí gram âm hay gặp là Porphyromonas và Prevotella Các chủng kị khí

phân lập được theo nghiên cứu này chưa cho kết quả kháng với các kháng sinh metronidazole, cefoxitin, amoxicillin Cũng trong nghiên cứu này, 48 bệnh nhân bị nhiễm trùng răng miệng và hàm mặt đã được xử lý theo các kết quả xét nghiệm kháng thuốc, và tỷ lệ chữa khỏi bệnh là 81,3% [8]

Theo nghiên cứu của các tác giả: Handal N và cộng sự năm 2015 nghiên cứu

197 mẫu máu phân lập vi khuẩn kỵ khí từ năm 2009 đến năm 2013 bằng hệ thống

MALDI-TOF Các chủng vi khuẩn kỵ khí phân lập được bao gồm Bacteroides spp.,

Clostridium spp., Prevotella spp., Fusobacterium sp và cầu khuẩn kị khí gram dương (GPAC) [17] Kết quả này được so sánh với những kết quả nghiên cứu khác

sử dụng PCR với trình tự 16S rRNA, và với MIC của benzylpenicillin, clindamycin, piperacillin-tazobactam, meropenem và metronidazole được xác định bởi Etests Hệ thống MALDI-TOF MS xác định một cách chính xác 94,9% số vi khuẩn yếm khí đến mức độ chi, và 86,8% với mức độ loài Theo nghiên cứu kết quả kháng kháng

sinh của các chủng vi khuẩn kỵ khí cho thấy 73,3% số mẫu phân lập đều không

nhạy cảm với penicillin, tỷ lệ kháng cao thường gặp ở Bacteroides (99,2%) và

Prevotella spp (69,2%) Khoảng 18,5% các chủng kháng clindamycin tazobactam cho kết quả nhạy cảm với hầu hết các chủng vi khuẩn kị khí trừ

Piperacillin-Bacteroides fragilis Có 43,8% số chủng Bacteroides fragilis không nhạy cảm với

kháng sinh Piperacillin-tazobactam Meropenem và metronidazole là 2 kháng sinh còn nhạy cảm nhiều nhất với 96,9% và 97,9% số chủng cho kết quả nhạy cảm

Áp xe não là một trong những áp xe của hệ thống thần kinh trung ương (CNS) bệnh gây tử vong cao, đặc biệt là ở các nước đang phát triển Nghiên cứu của

phương pháp hồi cứu 430 mẫu áp-xe não (dịch hút mủ và / hoặc mô) từ các bệnh viện có xét nghiệm nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí, từ năm 1987 đến năm 2014 cho kết quả có 116mẫu/430mẫu (27%) có vi khuẩn mọc Trong đó số mẫu có vi khuẩn kị

khí là 48 mẫu chiếm 41,1% Trong các vi khuẩn kị khí thu được Peptostreptococcus

là vi khuẩn hay gặp nhất chiếm 51,4% Ngoài ra các căn nguyên yếm khí hay gặp

khác là Bacteroides và loài Peptococcus [35]

Các kết quả nghiên cứu thu được đã cho thấy vi khuẩn kị khí vẫn nhạy cảm cao với Imipenem, chiếm 90.78%, đứng thứ hai là Piperacillin-tazobactam 86.43%, Chloramphenicol là 78.6%, Doxycyclin có độ nhạy tương tự, đề kháng cao nhất gặp

ở nhóm kháng sinh Metronidazole 25.47%

Theo nghiên cứu của Hammond JM trên 34 bệnh nhân áp xe phổi thì đến 66% bệnh nhân phân lập được vi khuẩn kị khí Trong số vi khuẩn kị khí phân lập được thì tỉ lệ nhạy cảm hoàn toàn với amoxicillin-clavulanate, chloramphenicol và các loại kháng sinh kết hợp với penicillin Tỉ lệ kháng của vi khuẩn kị khí với penicillin, metronidazole và clindamycin lần lượt là: 21%, 12% và 5% [16]

1.5.2 Tại Việt Nam

Những thập kỷ gần đây, nhờ tiến bộ của khoa học kỹ thuật một vài bệnh viện

đã đưa quy trình kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn kị khí thường quy nhưng kết quả còn rất hạn chế Trong các bệnh viện của khu vực Hà Nội thì có bệnh viện Việt Đức, bệnh viện

Trong đó bệnh viện Việt Đức đã thực hiện nuôi cấy thường quy từ năm 1988 bằng bình nuôi cấy MART: Khí trường kị khí của của bình được tạo ra bởi hệ thống

gắn trên nắp bình Khi chu trình thay thế oxy bằng hỗn hợp khí kết thúc, tháo bình ra

Ngoài ra còn có phương pháp nuôi cấy vi khuẩn kị khí khác bằng bình nuôi cấy giống bình MART có dung tích 2,9 lít, palladium bọc các hạt nhôm, túi thiếc chứa bicacbonatnatri và acid citric để tạo CO2, tạo khí H2 để khử oxy trong bình dùng phản ứng hóa học của kẽm và acid sulphuric

Hiện tại khoa Vi sinh của bệnh viện Việt Đức đang ứng dụng việc nuôi cấy vi khuẩn bằng túi hóa chất Genbag: Cấu tạo của túi Genbag là túi plastic trong suốt có

được tạo ra bởi 01 túi hóa chất được đưa cùng vào với đĩa thạch kị khí

Tại bệnh viện truyền nhiễm Trung Ương nuôi cấy vi khuẩn kị khí bằng hệ

thống Whitley anaerobic Workstations Model: VA500

Tại Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương đang sử dụng dụng việc nuôi cấy vi khuẩn bằng túi hóa chất Genbag cho công tác nghiên cứu

Một số bệnh viện hoặc trường học như Đại học Y Hải Phòng dùng hệ thống nuôi cấy bằng bình MART

Tại bệnh viện Việt Đức, việc nuôi cấy vi khuẩn kị khí đã đạt được một số thành tựu nhất định, đã có 03 công trình nghiên cứu của Lê Thị Thiều Hoa về nuôi cấy phân lập vi khuẩn kị khí tiến hành trong 3 giai đoạn khác nhau tại bệnh viện Việt Đức từ năm 1988 đến năm 2000 với số lượng dịch mật nuôi cấy tương ứng là

41, 211 và 100 mẫu đã thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn kị khí tương ứng là: 46 %, 27 %

và 24 % [3, 4,5]

Ngoài ra nghiên cứu của Lê Tiến Hải trong 40 mẫu nước mật của bệnh nhân sỏi mật tại viện Không Quân tỷ lệ vi khuẩn kị khí là 17,5 % [1]

Tỷ lệ vi khuẩn kị khí trong các nghiên cứu khác nhau và theo thời gian, có kết quả khác nhau có thể giải thích do việc sử dụng kháng sinh mới, phổ tác dụng rộng, liều cao trước khi mổ

Nuôi cấy vi khuẩn kị khí đã khó, thực hiện kháng sinh đồ với vi khuẩn kị khí

vì thế cũng còn nhiều hạn chế Đến nay có nhiều nghiên cứu về tính kháng kháng sinh

nhưng có rất ít nghiên cứu về mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn kị khí

Ngày nay, khoa học kỹ thuật đã phát triển mạnh về công nghệ nuôi cấy vi khuẩn kị khí và nhiều cơ sở bắt đầu trang bị những máy móc thiết bị hiện đại nhằm phục vụ cho việc nuôi cấy vi khuẩn kị khí thường quy nhưng cần thiết ứng dụng kết quả của đề tài này nhằm sử dụng trang thiết bị phù hợp với thực trạng của từng cơ sở

Hiện nay trên địa bàn thành phố Hà Nội cũng như trên cả nước số lượng phòng xét nghiệm có nuôi cấy vi khuẩn kị khí rất ít, hầu hết các bệnh viện của Hà Nội chưa triển khai việc xét nghiệm vi khuẩn kị khí thường quy vì những nguyên nhân sau:

- Các quy trình chuẩn về nuôi cấy vi khuẩn kị khí của nước ngoài là phức tạp, không phù hợp với điều kiện thực tế ở trong nước Do đó muốn đưa việc nuôi cấy vi khuẩn kị khí thường quy trong phòng xét nghiệm của các bệnh viện Hà Nội, ngoài việc cần tham khảo công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế thì cần xây dựng một quy trình phù hợp với điều kiện hiện tại Bên cạnh đó trang thiết bị phục

vụ nuôi cấy vi khuẩn kị khí hiện có trên thị trường quốc tế và tại Việt Nam cũng khá đa dạng về chủng loại và giá cả nhưng chưa có nghiên cứu nào chứng minh hiệu quả của chúng

- Với các phòng xét nghiệm đã nuôi cấy vi khuẩn kị khí nhưng chưa có quy trình chuẩn để áp dụng chung cũng như là chưa có nghiên cứu đánh giá hiệu quả của các hệ thống trang thiết bị, sinh phẩm hóa chất nuôi cấy vi khuẩn kị khí Và việc sử dụng hệ thống trang thiết bị này phụ thuộc vào việc giới thiệu, gợi ý của các hãng cung cấp, phụ thuộc vào năng lực kinh tế và sự đầu tư của cơ sở đó Do đó, kết quả của việc nuôi cấy vi khuẩn kị khí là không đạt hiệu quả về chất lượng xét

- Các phòng xét nghiệm đã được trang bị cơ sở máy móc, thiết bị cho nuôi cấy vi khuẩn kị khí nhưng số lượng mẫu bệnh phẩm hạn chế Ngược lại, có phòng xét nghiệm có số bệnh phẩm nhiều nhưng trang thiết bị không phù hợp Những điều này cũng ảnh hưởng trực tiếp đến kết quả của phòng xét nghiệm Việc nuôi cấy vi khuẩn kị khí là khó, đòi hỏi quy trình, các phương tiện, trang thiết bị phù hợp và dễ thất bại nên các bệnh viện của Hà Nội hầu như chưa triển khai được

- Việc nuôi cấy đã khó, việc xác định tính nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn

kị khí không phải dễ mà tỷ lệ tử vong do nhiễm trùng do vi khuẩn kị khí có nha bào (uốn ván, hoại thư sinh hơi, ngộ độc thực phẩm ) và không có nha bào (viêm phúc mạc, viêm ruột thừa, viêm đường mật, áp xe não, áp xe phổi, áp xe thận, áp xe phần phụ, áp xe tầng sinh môn ) không nhỏ

- Mức độ gia tăng đề kháng kháng sinh ngày càng nghiêm trọng, các phát minh kháng sinh mới giảm rõ rệt, trong 3 năm gần đây không có kháng sinh mới nào được FDA (Cục an toàn thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ) chấp nhận, mà tốc

độ đa kháng kháng sinh tăng lên tính hằng ngày Và đến nay trong nước chưa có nghiên cứu nào với cỡ mẫu lớn được công bố về mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn kị khí nói chung trên cả nước và khu vực Hà Nội nói riêng

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Là những vi sinh vật kị khí phân lập trên những mẫu bệnh phẩm dịch (dịch mật, dịch ổ bụng, dịch não tủy, ), mủ các loại, phân, máu, được thu thập trên các bệnh nhân nằm viện tại 2 bệnh viện: Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức, Bệnh viện Đa khoa Đức Giang từ tháng 01 đến tháng 07/2016

2.2 Vật liệu

2.2.1 Môi trường

Thiết bị: Whitley anaerobic Workstations model: DG250 Bình khí carbon

- Máy đo độ đục chuẩn

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy và lưu trữ mẫu

+ Bệnh phẩm máu: Điều dưỡng viên lấy máu theo đúng quy trình vô khuẩn, bơm máu vào trai cấy máu kị khí

+ Bệnh phẩm phân sau khi lấy cho ngay vào môi trường vận chuyển vi khuẩn kị khí

phẩm đối với các bệnh phẩm dịch, mủ, máu Còn đối với bệnh phẩm phân cần khoảng bằng hạt ngô hoặc thẫm đẫm tăm bông vô trùng

- Môi tr ường vận chuyển: Sử dụng môt trường Carryport hoặc môi trường

chuyên dụng cho vi khuẩn kị khí

ngay đến khoa vi sinh, sớm nhất có thể Thời gian từ khi lấy bệnh phẩm đến khoa vi sinh nhận mẫu bệnh phẩm là khoảng 5 phút đối với dịch mật loãng và 60 phút với các loại mủ Với các mẫu được đựng trong môi trường vận chuyển thì thời gian tối

đa là 120 phút

- L ưu trữ bệnh phẩm: Bệnh phẩm sau khi nuôi cấy trong các môi trường

được lưu trữ trong môi trường thạch mềm (gồm 13 gram canh thang, 6 gram pepton

- Lưu trữ chủng vi khuẩn kị khí phân lập được: Các chủng vi khuẩn được lưu

trong môi trường thạch lưu chủng BHI với glycerol (trong 1 lít nước cất có 37 gram

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn kị khí

Các bệnh phẩm sau khi được đẩy bỏ phần đầu của bơm tiêm, được cấy theo phương pháp 3 vạch lên đĩa thạch kị khí (Trong 1lit thạch Columbia có 50ml máu cừu, 2,5mg haemin và 1mg vitamin K) và một đĩa thạch máu thường, một đĩa thạch Maconkey Các mẫu cấy vi khuẩn kị khí được đặt 3 khoanh kháng sinh: Vancomycin 5mcg, Colistin 10 mcg và Kanamycine 1000mcg để ức chế các loại vi khuẩn ái khí

Nuôi cấy bằng thiết bị: Whitley anaerobic Workstations Model: DG250

Nhuộm một lam Gram trực tiếp từ bệnh phẩm, xác định hình thể và tính chất bắt mầu của các loại vi khuẩn dưới kính hiển vi Tất cả các loại vi khuẩn và tỷ lệ có mặt của chúng từ ít đến nhiều đều được ghi nhận

với đĩa thạch máu được nuôi cấy trong tủ ấm bình thường, chọn khuẩn lạc nghi ngờ

là vi khuẩn kị khí, đặc biệt các khuẩn lạc mọc trong vùng ức chế của các khoanh giấy kháng sinh Các vi khuẩn này tiếp tục được nuôi cấy trên hai môi trường kị khí

và ái khí, đồng thời nhuộm Gram để xác định hình thể vi khuẩn

Sau 24 - 48 giờ mọc trên môi trường kị khí mà không mọc trên môi trường

ái khí thì xác định đó là vi khuẩn kị khí, nếu vi khuẩn đó mọc trên cả hai môi trường thì xác định đó là vi khuẩn hiếu kị khí tùy tiện

2.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn kị khí bằng kít định danh ID 32A

Sau khi đã phân lập được vi khuẩn kị khí thì tiến hành định danh vi khuẩn

VKKK được cấy chuyển và tăng sinh trên một đĩa thạch kị khí mới, tùy thuộc chủng vi khuẩn mà chúng có thể mọc nhanh hay chậm, khuẩn lạc to hay bé

mà tăng sinh lên làm một hay nhiều đĩa để sao cho khi hòa tan các khuẩn lạc thuần này vào dung dịch nước muối đạt được nồng độ 4 - 5 Mac Farland

Sau 14 - 18 giờ, vi khuẩn ở thời kỳ sinh trưởng, các men được tạo ra có hoạt tính cao để tiến hành làm các phản ứng sinh lý sinh hóa Tiến hành định danh theo các bước:

B1: Chuẩn bị hộp nuôi cấy: Khay + nắp nhựa, kít định danh

B2: Lấy 5ml nước cất rải đều vào khay nhựa, mở túi giấy và đặt kít vào khay, ghi số bệnh phẩm lên vành khay, ghi rõ ngày, giờ làm xét nghiệm

B3: Mở lọ API (hoặc 2ml nước muối sinh lý 0,9%) nghiền từ 1 hay nhiều khuẩn lạc giống nhau sao cho có độ đục tương ứng McFarland 4

B4: Cho vào mỗi giếng 55 µl huyền dịch trên

B5: Phủ dầu parafin kín giếng URE

B6: Đóng nắp hộp, ủ ấm 37ºC

B7: Đọc kết quả: sau 4 giờ Theo phiên giải sau: