Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải chất hữu cơ và ức chế vibrio từ mẫu trầm tích biển thu thập tại thanh hóa quảng bình quảng trị

Công ty cổ phần phân bón FITOHOOCMON có chế phẩm sinh học xử lý đáy ao BIOF và xử lý nước ao BTS trong nuôi trồng thủy sản; chế phẩm ATV Anti Vibrio gồm những vi sinh nhìn sâu sắc về việ

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CHẤT HỮU CƠ VÀ ỨC CHẾ VIBRIO TỪ MẪU TRẦM TÍCH BIỂN THU THẬP TẠI THANH HÓA – QUẢNG BÌNH – QUẢNG TRỊ

Giáo viên hướng dẫn 1 : TS LÊ THỊ HỒNG MINH

Giáo viên hướng dẫn 2 : TS VŨ THỊ QUYÊN

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ THÚY NGÂN Lớp : 13-01

Hà Nội – 2017

Chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Lê Thị Hồng Minh, Trưởng phòng Công nghệ sinh học – Viện Hoá sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, TS Vũ Thị Quyên và ThS Nguyễn Mai Anh, người đã truyền cho chúng em phương pháp học tập và nghiên cứu khoa học, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ chúng em trong suốt quá trình nghiên cứu vừa qua

Đồng thời, chúng em cũng gửi lời cám ơn tới các cô chú, các anh chị, các bạn trong Phòng Công nghệ sinh học – Viện Hoá sinh biển đã giúp đỡ chúng em rất nhiều trong thời gian thực tập

Cuối cùng, chúng em xin gửi tới gia đình, người thân, bạn bè lời cám ơn sâu sắc vì đã luôn giúp đỡ, động viên chúng em trong suốt thời gian học tập

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 3

1.1.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3

1.1.2 .Tình hình nghiên cứu trong nước 5

1.2 Xạ khuẩn 6

1.2.1 Vị trí và vai trò của xạ khuẩn trong vi sinh vật 6

1.2.2 Cấu tạo của xạ khuẩn 9

1.2.3 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 10

1.3 Sự phân giải của một số chất hữu cơ 12

1.3.1 Phân giải Protein (casein) 12

3.3.2 Phân giải Cellulose 13

1.4 Tổng quan về Vibrio trong nuôi trồng thủy sản 14

1.5 Ứng dụng của vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản 16

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu và hóa chất 19

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.1.2 Hóa chất, thiết bị 19

2.1.2.1 Hóa chất 19

2.1.2.2 Thiết bị 20

2.1.3 Môi trường 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Thu thập các mẫu trầm tích 22

2.2.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn 22

2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật bằng khuyếch tán trên đĩa thạch 23

2.2.4 Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme của các chủng nghiên cứu 24 2.2.4.1 Khả năng thủy phân tinh bột tan 24

2.2.4.2 Khả năng thủy phân casein 24

2.2.4.3 Khả năng thủy phân cellulose (CMC) 25

2.2.5 Phương pháp định danh xạ khuẩn bằng kỹ thuật SHPT 25

2.2.5.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 25

2.2.5.2 Phương pháp PCR 26

2.2.5.3 Phương pháp giải trình tự 28

4.1 Kết quả thu thập mẫu 29

4.2 Phân lập xạ khuẩn từ trầm tích 30

4.3 Thử hoạt tính kháng một số loài vi khuẩn Vibrio của các chủng nghiên cứu. 32

4.4 Khả năng sinh enzyme của các chủng nghiên cứu 34

4.4.1 Khả năng thủy phân tinh bột tan 34

4.5.2 Khả năng thủy phân protein (casein) 35

4.5.3 Khả năng thủy phân CMC 36

4.6 Định danh xạ khuẩn bằng sinh học phân tử 36

4.6.1 Tách ADN genom từ xạ khuẩn 36

4.6.3 Kết quả giải trình tự gene 16S của ba chủng xạ khuẩn 38

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

5.1 Kết luận 42

5.2 Kiến nghị 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

Chữ viết tắt Chú thích

AND Axit deoxyribonucleotit

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

Hình 1.1 : Hình ảnh cấu tạo và phân lập xạ khuẩn

Hình 4.1: Một số hình ảnh nơi lấy mẫu và các mẫu thu được

Hình 4.2 Một số hình ảnh khi phân lập xạ khuẩn

Hình 4.3 Một số hình ảnh làm sạch các chủng xạ khuẩn

Hình 4.4 Một số hình ảnh thử hoạt tính kháng một số chủng vi khuẩn Vibrio

Hình 4.5 Khả năng thủy phân tinh bột tan

Hình 4.6 Khả năng phân giảicasein

Hình 4.7 Khả năng phân giảicellulose

Hình 4.8 Kết quả điện di đồ AND tổng số của 3 chủng xạ khuẩn (Giếng 1-3 là các mẫu G290, G280, G278)

Hình 4.9 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR

Hình 4.10: Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S ADN riboxom của 3 chủng G290, G280, G279

Bảng 4.1 Danh sách tọa độ các mẫu mẫu trầm tích thu thập được tại Thanh Hóa – Quảng Bình – Quảng Trị

Bảng 4.2 Danh sách 15 chủng xạ khuẩn phân lập được

Bảng 4.3 Kết thử hoạt tính kháng một số chủng vi khuẩn Vibrio của các chủng

xạ khuẩn

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 1

MỞ ĐẦU Vùng biển Việt Nam có diện tích khoảng 1.000.000 km2 và 3.260 km bờ biển (không tính các đảo), với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, tạo cho nước ta tính đa dạng về cảnh quan tự nhiên và nguồn lợi thuỷ sinh vật Với mong muốn khám phá, khai thác và sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên phong phú của biển, nhiều nghiên cứu khoa học gần đây, nhất là công nghệ sản xuất sinh học đã chuyển dần từ khai thác sang tìm hiểu, ứng dụng và đưa vào sản xuất nguồn nguyên liệu từ những vùng nước ngập mặn, biển xa bờ, thậm chí cả đáy biển sâu để sinh trưởng bền vững dựa trên cơ sở của các công nghệ mới

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn nhân thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Xạ khuẩn được quan tâm và nghiên cứu nhiều

do có khả năng sản xuất các sản phẩm trao đổi chất quan trọng Trong số hơn 8000 chất kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì có trên 80% có nguồn gốc từ xạ

khuẩn chủ yếu là từ các chi Streptomyces và Micromonospora Giai đoạn những

năm 1980 trở về trước các nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào khám phá các chủng xạ khuẩn trên mặt đất Từ vài thập kỷ trở lại đây các nhà khoa học đã phát hiện ra các chủng xạ khuẩn biển có nhiều đặc tính quý như: khả năng sản xuất kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, ức chế các tế bào ung thư… có ý nghĩa ứng dụng trong y học ( Theo Tạp trí sinh học 2016, 38(1): 109-114)

Nuôi trồng thủy sản là một trong những lĩnh vực phát triển nhanh trong những năm gần đây và ngày càng mở rộng Việc sử dụng quá nhiều thức ăn và thuốc kháng sinh dẫn đến môi trường nuôi bị ô nhiễm, tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc cũng như sự mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột Đây cũng là thách thức lớn cho ngành thuỷ sản trong việc kiểm soát bệnh của thủy động vật và nâng cao năng suất, chất lượng của sản phẩm

Một trong các nguồn nguy hiểm cho thuỷ sản nói chung và cho ngành nuôi tôm nói

riêng là vi khuẩn Vibrio Vibrio có thể gây bệnh ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng

của tôm và được xem là nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng, tỉ lệ chết lên tới 100%

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 2

Việc phân lập và tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn từ trầm tích biển có khả

năng đối kháng vi khuẩn gây bệnh Vibrio là tiền đề quan trọng để có thể để tạo ra

các sản phẩm sinh học hoặc tách chiết và tinh chế các chất có hoạt tính sinh học cao góp phần ngăn ngừa bệnh dịch và cải thiện môi trường Vì vậy, chúng tôi thực hiện

đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải

chất hữu cơ và ức chế Vibrio từ mẫu trầm tích biển thu thập tại Thanh Hóa – Quảng Bình – Quảng Trị”

Mục tiêu:

Sàng lọc được 3 chủng xạ khuẩn từ mẫu trầm tích biển có hoạt tính phân giải

chất hữu cơ và đối kháng một số loài Vibrio để làm cơ sở cho xử lý môi trường

trong nuôi trồng thủy sản

Định danh bằng sinh học phân tử các chủng đã lựa chọn

Nội dung nghiên cứu:

- Phân lập các chủng xạ khuẩn từ mẫu trầm tích biển thu thập ở vùng biển Thanh hóa – Quảng Bình – Quảng Trị

- Sàng lọc vi sinh vật có hoạt tính phân giải chất hữu cơ và đối kháng một số loài

Vibrio

- Định danh tên khoa học bởi gene 16S-rRNA một số chủng có hoạt tính cao được lựa chọn

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 3

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới

1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Sản lượng nuôi tôm trên thế giới đang bị suy giảm do dịch bệnh, đặc biệt là do vi

khuẩn Vibrio hay vi rút gây ra Kháng sinh đã được sử dụng với khối lượng lớn

nhằm kiểm soát dịch bệnh, tuy nhiên, việc sử dụng này trong nhiều trường hợp thường không mang lại hiệu quả hoặc làm tăng thêm mầm bệnh Ứng dụng của chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản sẽ là chìa khóa giải quyết các vấn đề này Theo dự báo của Tổ chức Nông Lương Liên hợp quốc (FAO), ngành nuôi trồng thủy sản sẽ đáp ứng một nửa nhu cầu về sản phẩm thủy sản đến năm 2020 do ngành khai thác bị khai thác quá mức, dẫn đến sản lượng khai thác suy giảm Nghề nuôi tôm đang được mở rộng trên toàn thế giới, đặc biệt là các nước nhiệt đới do nhu cầu

về sản phẩm này ngày càng tăng Tuy nhiên, nghề nuôi tôm đang bị ảnh hưởng bởi

các bệnh do vi khuẩn vibrio và vi rút gây ra Mật độ thả nuôi trong các ao hồ và bể

chứa cao là nguyên nhân tạo ra các mầm bệnh và việc sử dụng các thức ăn giàu protein cũng tạo môi trường thuận lợi cho các vi khuẩn gây bệnh phát triển

Vibrio là nguyên nhân chính gây ra dịch bệnh trên tôm Để kiểm soát dịch bệnh do

vi khuẩn Vibrio gây ra, người ta sử dụng thuốc kháng sinh, tuy nhiên, cho đến thời

điểm này, hiệu quả của việc sử dụng thuốc kháng sinh là rất thấp

Ở Philipines, bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra đã tổn thất lớn về sản lượng tôm và gây thiệt hại về kinh tế cho người nuôi tôm trong năm 1996 Vi khuẩn Vibrio kháng lại mọi loại thuốc kháng sinh như chloramphenicol, furazolidone, oxytetracycline,

và streptomycin và còn nguy hiểm hơn so với trước đây

Tại Thái Lan, người nuôi đã sử dụng norfoxacin trong thức ăn, loại thuốc từng rất hiệu quả trong việc chống lại vi khuẩn Vibrio Tuy nhiên, điều trị này không mang

lại hiệu quả vì sau khi ngừng thuốc toàn bộ tôm bị chết trong hai ngày

Rõ ràng, dòng vi khuẩn Vibrio đã kháng thuốc Chlorine được sử dụng rộng rãi

trong các trại giống và trong các ao nuôi; tuy nhiên, việc sử dụng này lại kích thích

sự phát triển của gen kháng thuốc trong vi khuẩn Một số người nuôi tôm ở Thái

Lan cho biết khi chlorine được sử dụng trong các ao nuôi để diệt động vật phù du

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 4

trước khi thả tôm, tuy nhiên sau khi dừng thả chlorine thì thì khuẩn Vibrio lại phát

triển nhanh chóng

Như vậy, Vibrio không những chỉ kháng thuốc mà còn là nguyên nhân gây thêm

mầm bệnh Việc sử dụng thuốc chống vi khuẩn làm tình hình trở nên tồi tệ hơn Nếu thuốc kháng sinh hay thuốc sát trùng được sử dụng để diệt trừ vi khuẩn; một số vi khuẩn, mầm bệnh vẫn sống sót, bởi chúng đã mang gen kháng thuốc [44]

Biện pháp hiện nay để cải thiện chất lượng nước trong nuôi trồng thủy sản là áp dụng vi sinh vật/enzyme cho các hồ nuôi, được gọi là “bioremedation” Bioremedation gồm sử dụng các cơ thể sống (vi khuẩn, nấm, actinomycetes, cyanobacteria và đôi khi cả thực vật) để làm giảm hoặc loại bỏ hoàn toàn các chất ô nhiễm độc hại Việc sử dụng vi khuẩn có lợi (probiotics) để thế chỗ nguồn bệnh bằng quá trình cạnh tranh được sử dụng trong chăn nuôi đã cho thấy hiệu quả vượt trội so với dùng kháng sinh và hiện được chấp nhận để kiểm soát nguồn bệnh trong nuôi trồng thủy sản Các nhà nghiên cứu chứng minh việc sử dụng probiotics trong nuôi trồng thủy sản cải thiện được chất lượng nước bằng cách làm cân bằng quần thể vi sinh vật trong nước và giảm lượng vi sinh vật gây bệnh [35,37,38,39]

Rất nhiều vi sinh vật có khả năng cạnh tranh, sản sinh các cơ chất ức chế hoặc kích thích sinh trưởng của các cơ thể khác Vi sinh vật có hiệu quả đối kháng và kích thích sinh trưởng đều là những ứng viên quan trọng như probiotics trong nuôi trồng thủy sản Tiềm năng probiotic của các chủng vi khuẩn khác nhau, ngay cả trong

cùng một loài, cũng khác nhau [40] Einar (2002) báo cáo Vibrio và Pseudomonas

là những loài vi khuẩn có triển vọng nhất như probiotics cho cá và Bacillus cho các

hệ nuôi tôm [34,36] Năm 1998, Moriaty báo cáo sử dụng probiotic Bacillus thương

mại làm tăng chất lượng và sự sống của tôm nuôi trong hồ [41]

Sử dụng probiotics ở Trung Quốc bắt đầu từ khi nhập khẩu hàng từ Anh, Mỹ và Nhật vào thập niên 1990’s Ở Thượng Hải đã có trên 100 nhà sản xuất sản phẩm vi sinh dung cho nuôi trồng thủy sản đã ký thỏa thuận vào năm 2006 về an toàn thực phẩm trong sử dụng probiotics Các trại nuôi tôm ở Ấn Độ sử dụng thành công probiotics kể từ 1995 Hiện có khá nhiều chế phẩm sinh học được dùng trong nuôi

trồng thủy sản, một vài ví dụ bao gồm: Item Code để làm sạch hồ nuôi; Bioclean

Aqua Fish là loạt sản phẩm các công thức vi khuẩn cân bằng cải thiện chất lượng

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 5

nước nuôi trồng thủy sản và sức khỏe của cá Ngoài ra còn rất nhiều chế phẩm khác

như Bioclean Aqua Fis,Pond Clarifier, Biogut Aqua là probiotics cho tôm,

Bacterialconsortium, probiotics để hoạt hóa enzymes; aquatic probiotic; probiotics

để cải thiện hoạt tính đường ruột

1.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam trong những năm gần đây bệnh về tôm cá đã xuất hiện với tuần suất dày và diễn biến phức tập hơn, bệnh tôm đã trở thành rào cản chính đối với sự phát triển và mở rộng nuôi tôm về cả mặt số lượng, chất lượng, tính cân đối, tính liên tục

và ảnh hưởng tới thị trường xuất khẩu Theo báo báo kết quả nuôi trồng thủy sản năm 2003 của ngành cho thấy cả nước có 546,757 ha, các tỉnh từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29,000ha, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước Năm

2008 diện tích tôm sú và tôm thẻ bị bệnh của cả nước là 98,955ha và tổng thiệt hại

160 tỷ đồng Hậu quả là có nhiều vùng nuôi tôm thất bại liên tục đã bị bỏ hoang, gây nên tác động nghiêm trọng về kinh tế - xã hội

Trong số các tác nhân gây bệnh cho tôm, ta thấy vi khuẩn Vibrio là tác nhân phân

bố rộng khắp, hầu như đều xuất hiện trong các môi trường nuôi nước mặn, nước lợ, gây bệnh phổ biến nhất ở tôm [45]

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Trọng Nho và ctv (1996) đầm tôm ở các tỉnh Nam

Trung Bộ [6] bị bệnh có số lượng vi khuẩn Vibrio tổng số từ 110-1500 tế bào/ml

Theo Phan Lương Tâm và ctv (1998), Nguyễn Việt Thắng (1998) khảo sát các nguyên nhân gây chết tôm ở các tỉnh phía Nam cho rằng trong các đầm nuôi tôm bị

chết, số lượng vi khuẩn Vibrio spp tổng số cũng rất cao

Một trong số các đề tài nghiên cứu của Ngô Thị Tường Châu (Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên – Đại Học Quốc Gia Hà Nội) và cs: “Tối ưu hóa các nguồn

carbon và nitrogen cho sản xuất chế phẩm trợ sinh từ Steptomyces sp A1 đối kháng với Vibriio harveyi V7 gây bệnh trên tôm và Thừa Thiên Huế” đã phân lập được các chủng xạ khuẩn Streptomyces sp A1 có khả năng đối kháng với Vibrio sp V7 gây

bệnh từ trầm tích ao nuôi tôm ở Thừa Thiên Huế [46]

Đề tài cơ sở (2006): “Nghiên cứu khả năng và phương thức ức chế vi khuẩn gây

bệnh Vibrio cho tôm, của một số chủng vi khuẩn nội tại phân lập từ nước nuôi

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 6

tôm” đã được Viện Công nghệ sinh học thực hiện, bước đầu đã phân lập một số chủng có thể ứng dụng được

Việc ứng dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thuỷ sản rất được quan tâm trong những năm gần đây ở Việt Nam Đã có nhiều cơ sở nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản và nhiều chế phẩm đã được khảo nghiệm và ứng dụng: Bimviotech; Biof; Feedad NC5.1,….Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2 đã thương mại hóa một số chế phẩm sử dụng trong nuôi trồng

thủy sản như VEM gồm Lactobacillus spp 108 CFU/ml, Bacillus spp 106 CFU/

ml, Sacchromyces spp 107 CFU/ ml; BIO-T; Bio-II , Bio-III, Bio-H, Bio-HH, PB,

Bio-MN… gồm các loại vi sinh vật có ích khác nhau Công ty cổ phần phân bón FITOHOOCMON có chế phẩm sinh học xử lý đáy ao (BIOF) và xử lý nước ao (BTS) trong nuôi trồng thủy sản; chế phẩm ATV (Anti Vibrio) gồm những vi sinh

nhìn sâu sắc về việc sử dụng xạ khuẩn Streptomyces như một thay thế cho thuốc kháng sinh, đây là một probiotic trong việc kiểm soát dịch bệnh và nâng cao sức

khỏe và chất lượng trong nuôi trồng thủy sản

1.2 Xạ khuẩn

1.2.1 Vị trí và vai trò của xạ khuẩn trong vi sinh vật

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria), phân bố

rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, một phần trong bùn và trong các chất hữu cơ khác, thậm chí trong cả cơ chất mà các vi sinh vật khác không sinh trưởng được

Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật Đất giàu dinh

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 7

dưỡng và lớp đất bề mặt thường có số lượng lớn xạ khuẩn Trong 1 gam đất canh tác có thể phân lập được 5 triệu mầm xạ khuẩn, đất hoang hóa chỉ có 10 – 100 nghìn mầm Số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [5]

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hoại sinh và có cấu tạo dạng sợi phân nhánh Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ

đã công bố, có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn Xạ khuẩn chủ yếu trong đất

và đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Chúng

sử dụng acid humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi

và thường tạo nhiều bào tử Thậm chí một số loài xạ khuẩn còn hình thành túi bào

tử như Streptosporangium, Micromonospora và bào tử di động như chi

đó có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, nhiều nhóm xạ khuẩn có nguồn gốc từ biển

Xạ khuẩn biển thường có khả năng chịu mặn cao, đặc biệt có những chủng

Streptomyces ssp có thể sinh trưởng được ở nồng độ NaCl 16% và nhiều loài thuộc

chi Streptomyces và Nocardia sinh trưởng tốt khi ở nồng độ NaCl 10%,

Micromonospora sp và Salinospora sp cũng có khả năng chịu mặn cao [19, 20]

Trước đây, vị trí phân loại của Xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận giữa các nhà Vi sinh vật học, do nó có những đặc điểm vừa giống Vi khuẩn vừa giống Nấm Tuy nhiên đến nay, Xạ khuẩn đã được chứng minh là Vi khuẩn với những bằng chứng sau đây:

- Một số xa khuẩn như các loài thuộc chi Actinomyces và Nocardia rất giống với các loài Vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus và Corynebacterium

- Xạ khuẩn giống vi khuẩn ở chỗ không có nhân thật, chúng chỉ chứa nhiễm sắc chất phân bố dọc theo các sợi hoặc các tế bào

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 8

- Đường kính của sợi xạ khuẩn và bào tử giống với ở vi khuẩn Đồng thời sợi xạ khuẩn thường không chứa vách ngăn

- Xạ khuẩn là đích tấn công của các thực khuẩn thể giống như vi khuẩn, trong khi

đó, nấm không bị tấn công bởi thực khuẩn thể

- Xạ khuẩn thường nhạy cảm với các chất kháng sinh tác dụng lên vi khuẩn, nhưng lại thường kháng với những kháng sinh tác dụng lên nấm như các polyen

- Xạ khuẩn không chứa chitin, chất có mặt trong sợi và bào tử của nhiều nấm, mà không có ở vi khuẩn Đồng thời giống như phần lớn vi khuẩn, xạ khuẩn không chứa cellulose

- Tương tự với vi khuẩn,xạ khuẩn nhạy cảm với phản ứng acid của môi trường, đặc điểm này không có ở nấm

- Các đặc điểm về sợi và nang bào tử kín (sporangium) của chi Actinoplanes cho

thấy có thể chi này là cầu nối giữa vi khuẩn và các nấm bậc thấp

Xạ khuẩn tuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35

họ, 110 chi và hơn 1000 loài Hiện nay, 478 loài đã đươc công bố thuộc chi

Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ

 Hầu hết các xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces có khả năng sinh kháng sinh, nhiều kháng sinh quan trọng hiện nay được chiết suất từ xạ khuẩn như: tetraciclin, streptomycin, chloramphenicol (chất này hiện nay thú y cấm sử dụng), một số kháng sinh sản xuất từ xạ khuẩn có tác dụng diệt côn trùng hay tuyến trùng,

 Một số xạ khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh các chất sinh học như vitamin nhóm B, một số acid hữu cơ hay các enzyme như proteaza, ammylaza, kitinaza, +Một số xạ khuẩn có thể gây hại cho các vi sinh vật trong đất do nó tiết độc tố

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 9

phytotoxin Một số có khả năng gây bệnh cho người, gia súc được gọi chung là bệnh Actinomycose [18]

1.2.2 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự vi khuẩn Gram dương,, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập

Hình 1.1 : Hình ảnh cấu tạo và phân lập xạ khuẩn

Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10-20nm có tã dụng duy trì các hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose và kitin nhưng chưá nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất

và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [1],[2]

Dưới lớp tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là phospholipid và protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn

Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có gì khác biệt lớn so với tế bào

vi khuẩn Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chưa mezoxom các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol)

Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền trong NST còn có các yếu tố di truyền ngoài NST, chúng có thể tự nhân lên mà được gọi là plasmid Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 10

thêm khả năng phân giải một số hợp chất , chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với kháng sinh, chuyển gen, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn các bon chúng thường dùng là đường, tinh bột, rượu, và nhiều chất hữu cơ khác Nguồn Nito hữu cơ là protein, peptone, cao ngô, cao nấm men Nguồn nito vô cơ là nitrat, muối amon Khả năng đồng hóa các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau

Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng về mặt sinh thái trong vòng tuần hoàn tự nhiên Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như humic acid trong

đất [21] Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignin bằng cách sinh các

enzyme thủy phân cellulose, hemicellulose và các peoxidase ngoại bào [22] Các chủng xạ khuẩn xuât hiện trong môi trường giàu chất hữu cơ như compost, cả hai pha ôn hòa (mesophilic) và chịu nhiệt (thermophilic) [23], và ở cống rãnh nước thải nơi mà các xạ khuẩn chứa mycolic acid kết hợp với viêc tạo thành các bọt khí và váng bọt ổn định, đặc trưng [24]

Nhìn chung, nhiệt độ ôn hòa 25-300C và pH trung tính là điều kiện tối ưu cho xạ khuẩn phát triển Mặc dù vậy, nhiều loài đã được phân lập ở các môi trường khắc nhiệt ví dụ như Arthrobacter ardleyensis ưa lạnh được phân lập từ trầm tích hồ ở Nam cực có thể sống ở nhiệt độ 00C [25] [26]

1.2.3 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Ở trên môi trường đặc, xạ khuẩn sinh trưởng thành những khuẩn lạc khô, kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy từng loài và điều kiện ngoại cảnh Khuẩn lạc xạ khuẩn không trơn, ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ Do đó mới có tên gọi là xạ khuẩn (Actinomycetes, tiếng Hy Lạp: Aktis là “tia”, mykes là “nấm”) Mặt khuẩn lạc xù

xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo [4]

Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có 3 lớp: lớp vỏ ngoài là các sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong Màu sắc của khuẩn lạc rất đa dạng:

đỏ, da cam, vàng, lam, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện dinh dưỡng

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 11

Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ thể đơn bào, không có nhân thực và kích thước giống vi khuẩn Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn sinh trưởng thành 2 hướng tạo thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh Khuẩn ti cơ chất sinh trưởng cắm sâu vào trong môi trường với chức năng chủ yếu là lấy nước và thức ăn Khuẩn ti cơ chất sinh trưởng một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành khuẩn ti khí sinh Người ta gọi khuẩn ti khí sinh là khuẩn

ti thứ cấp để phân biệt với khuẩn ti sơ cấp là loại khuẩn ti sinh trưởng từ các loại bào tử nảy mầm [4] Nhiều loại chỉ có khuẩn ti cơ chất mà không có khuẩn ti khí

sinh, nhưng cũng có loại như chi Sporichthya lại chỉ có khuẩn ti khí sinh Khi đó

khuẩn ti khí sinh vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng vừa làm nhiệm vụ sinh sản

Khuẩn ti của xạ khuẩn thường mảnh hơn của nấm mốc, đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 – 1 m đến 2 – 3 m Đa số xạ khuẩn có khuẩn ti không có vách ngăn và không tự đứt đoạn Sau một thời gian sinh trưởng, ở đầu các khuẩn ti khí sinh thường hình thành các sợi bào tử Khuẩn ti không mang bào tử gọi chung là khuẩn ti dinh dưỡng

Thành tế bào xạ khuẩn (CW) có dạng kết cấu lưới dày khoảng 10 – 20 nm,

có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ti và bảo vệ tế bào

Thành tế bào xạ khuẩn chủ yếu gồm 3 lớp: lớp ngoài dầy 60 – 120 Å, khi già

có thể dầy tới 150 Å; lớp giữa rắn chắc dầy 50 Å và lớp trong dầy 50 Å Thành tế bào cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptid gồm các gốc N-acetylglucozamin liên kết với N-acetymuramic bởi liên kết 1,4-glicozit Khi xử lí bằng lysozym, các liên kết này bị phát vỡ, thành tế bào bị phá hủy và màng nguyên sinh chất bao bọc phần còn lại của tế bào tạo thành tế bào trần Cấu trúc sợi cũng mất đi khi xử lí bằng hỗn hợp ether và chloroform và các dung môi hòa tan lipit Điều đó chứng tỏ lớp ngoài thành tế bào xạ khuẩn có cấu tạo bằng lipit Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose hay chitin [5]

Đối với xạ khuẩn phân lập từ các vùng ngập mặn, chúng có thành tế bào dầy

và độ bền cơ học cao, có thể chống chịu với điều kiện bất lợi của môi trường (nồng

độ muối từ 3 - 4%, pH từ 6,8 – 8,5 và nhiệt độ dao động từ 20 – 35oC) Thành tế bào của xạ khuẩn chịu kiềm ngoài peptidoglycan còn có chứa nhiều axit polyme như axit galacturonic, axit glutamic, axit aspartic và axit phosphoric Với điện tích

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 12

âm của các thành phần axit không thuộc peptidoglycan, bề mặt thành tế bào có thể hấp thụ các ion Na+, H+ trong khi đẩy các ion OH- Bên cạnh đó, tuy cấu trúc lớp peptidoglycan là giống nhau ở xạ khuẩn trung tính và chịu kiềm nhưng lại khác nhau về thành phần hợp chất cấu thành, xạ khuẩn ưa kiềm chứa nhiều hesoamin và axit amin [3]

Màng sinh chất của xạ khuẩn dầy khoảng 7,5 – 10 nm gồm thành phần chủ yếu là phospholipit và protein, chúng có cấu trúc và chức năng tương tự như màng sinh chất của vi khuẩn Trên màng có nhiều enzym có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển các chất qua màng [4]

Thể trung gian hay mesosome nằm ở phía trong của màng sinh chất và có hình phiến, hình bọng hay hình ống Tác dụng của thể trung gian là làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bào và từ đó làm tăng cường hoạt tính của enzyme, tăng chuyển điện tử…[4]

Các thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm các hạt polyphosphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Soudan III) và polysaccarit (bắt màu với dung dịch Lugol) [4]

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, đặc biệt khác với những vi sinh vật nhân sơ khác là tỉ lệ G – C cao (>70%) trong khi đó ở vi khuẩn là 25 – 45%

Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về di truyền và thường xảy ra sự đột biến trong phân tử DNA Điều này tạo ra tính đa dạng về hình thái, tính kháng thuốc do sự xuất hiện các dị vòng Hơn nữa, sự

tự nhân lên của các đoạn DNA còn làm phức tạp thêm việc nghiên cứu di truyền ở

xạ khuẩn [5]

1.3 Sự phân giải của một số chất hữu cơ

1.3.1 Phân giải Protein (casein)

Cũng như các chất cao phân tử khác, các protein trước hết bị phân huỷ bên ngoài

tế bào bởi các enzym ngoại bào thành những mẩu nhỏ hơn có thể xâm nhập vào tế bào Các enzym phân huỷ protein (các protease), do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm tiết

ra, thuỷ phân protein thành các oligopeptit và các axid amin Các oligopeptit được

vi sinh vật hấp thụ nhờ những hệ thống vận chuyển đặc hiệu và sau đó được phân huỷ nhờ các protease nội bào thành các axid amin Những axid amin này hoặc được

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 13

thu nhận vào protein của tế bào, hoặc được tách amin trên những con đường trao đổi chất đặc biệt, được lôi cuốn vào các con đường trao đổi chất trung gian và bị oxi hoá tận cùng Như vậy chúng cũng được dùng làm nguồn năng lượng

Người ta thường xác định hoạt tính phân huỷ protein ngoại bào của vi sinh vật trên một môi trường rắn chứa gelatin Khi ấy hoạt tính được nhận biết qua vùng phân huỷ bao quanh khuẩn lạc, vùng này không bị kết tua bởi HCl Cũng theo nguyên tắc khuyếch tán này, có thể thay gelatin bằng sữa gầy, khi ấy môi trường có độ đục tự nhiên của sữa, và vùng phân hủy hiện ra trực tiếp như những quầng trong suốt bao quanh khuẩn lạc

Các protease là những enzym phân huỷ liên kết peptid Trước hết cần phân biêt protease nội bào và protease ngoại bào Loại đầu tiên thực hiện những chức năng của trao đổi chất trong tế bào, còn loại sau phục vụ cho sự phân huỷ các protease ngoại bào Tuỳ theo tính đặc hiệu của chúng có thể phân biệt các exopeptidase và các enđopeptiaza Các exopeptidase là những enzym mà tính đặc hiệu của chúng được qui định bởi đầu tận cùng cacboxy hoặc đầu tận cùng amino Còn các endopeptidaza, hay còn gọi là các proteinaza,thì phân hủy những liên kết peptid bên trong chuỗi polypeptide Có thể phân biệt ít nhất 4 nhóm proteinaza: serin - proteinase, xistein - proteinase, aspartat - proteinase, và kẽm - proteinase Những enzym nội bào này cực kỳ đặc hiệu và đóng vai trò to lớn trong sự điều hoà trao đổi chất của tế bào, ví dụ bằng cách phân hủy peptid tín hiệu và hoạt hoá hay bất hoạt các enzym này nhờ sự phân huỷ [47]

3.3.2 Phân giải Cellulose

Cellulose là thành phần chủ yếu của màng tế bào thực vật Cellulose được tích lũy nhiều trong đất do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết và từ các hoạt động của con người Cellulose được phân giải nhờ vào hệ enzyme cellulase gồm có 4 enzyme khác nhau

 Enzyme C1 (cellobiose dehydrolase): cắt các liên kết hydro biến cellulose

có cấu trúc không gian cellulose vô định hình

 Endoglucanase: cắt các liên kết β - 1,4 – glucoside tạo thành các chuỗi dài

 Exoglucanase: cắt các chuỗi thành cellobiose

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 14

 β - glucosidase: thủy phân cellobiose thành glucose

Các vi sinh vật phân giải Cellulose như:

 Vi nấm: Tricoderma (viride, reesei), Aspergillus, Fusarium Mucor

 Vi khuẩn : Bacillus subtilis, Clostridium, Ruminococcus

 Xạ khuẩn: Streptomyces

3.3.3 Phân giải tinh bột

Tinh bột là chất dự trữ chủ yếu của thực vật, đặc biệt là các cây có củ như ngũ cốc Gồm 2 thành phần là amylase và amylopectin

VSV phân giải tinh bột nhờ tiết ra hệ enzyme amylase gồm có 4 enzyme: α – amylase, β – amylase, amylose 1,6 – glucosidase, glucoamylase

α – amylase: Tác động vào bất kỳ mối liên kết 1,4 glucoside nào trong phân tử tinh bột Bởi thế α - amylase còn được gọi là endoamylase Tinh bột được cắt thành nhiều đoạn ngắn gọi là sự dịch hoá tinh bột, sản phẩm của sự dịch hoá thường là các đường 3 carbon gọi là maltotriose Sự phân giải tinh bột β – amylase

β - amylase chỉ có khả năng cắt đứt mối liên kết 1,4 glucoside ở cuối phân tử tinh bột bởi thế còn gọi là exoamylase Sản phẩm của β - amylase thường là đường disaccharide maltose

Amylose 1,6 - glucosidase có khả năng cắt đứt mối liên kết 1,6 glucoside tại những chỗ phân nhánh của amylopectin Glucoamylase phân giải tinh bột thành glucose và các oligosaccharide Enzyme này có khả năng phân cắt cả hai loại liên kết 1,4 và 1,6 glucoside

1.4 Tổng quan về Vibrio trong nuôi trồng thủy sản

Chi Vibrio thuộc họ Vibrionaceae là những loài vi khuẩn Gram (-), hình

que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5x1,4 – 2,6mm Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn

Tất cả những loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi

khuẩn không phát triển trong môi trường không muối (NaCl) và không sinh H2S Về

cơ bản, các loài vi khuẩn này đều có mặt trong môi trường nước, đặc biệt là nước

biển và cửa sông, Na+ kích thích cho sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 15

nhiều loài là nhu cầu tuyệt đối Hầu hết các mẫu phân lập từ bệnh vỏ và viêm ruột

của tôm trưởng thành đều gặp loài V.alginolyticus; V parahaemolyticus,

V.anguillarum.[32]

Vi khuẩn Vibrio trong các đầm nuôi rất phong phú, có xu hướng tăng dần

theo thời gian nuôi , đạt giá tri ̣ cực đại vào cuối mùa vụ Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Trọng Nho và ctv (1996) [6] ở các tỉnh Nam Trung Bộ , đầm nuôi bi ̣ bệnh

có số lượng vi khuẩn Vibrio tổng số từ 110 – 1500 tế bào/ml Việc định lượng vi khuẩn Vibrio rất quan trọng để chủ động kiểm tra chất lượng nước cũng như xác

định khả năng bệnh lí có thể xảy ra trong đầm nuôi tôm Lượng vi khuẩn tổng số là chỉ tiêu xác định điều kiện vệ sinh cũng như mức độ nhiễm bẩn do các hợp chất hữu

cơ, chất thải của tôm cá, thức ăn thừa , xác thủy sinh vật chết đồng thời dự báo tình hình dịch bệnh trong đầm nuôi và nguồn nước cung cấp cho đầm nuôi Lượng vi khuẩn tổng số có chiều hướng tăng dần theo thời gian nuôi , đặc biệt vào thời gian

có lượng mưa lớn , nguồn nước bi ̣ ô nhiễm từ các con sông đổ ra Lượng vi khuẩn tổng số ở nguồn nước cung cấp cho đầm nuôi tôm cao hơn nhiều so với trong đầm nuôi Môi trường nước có mật độ vi khuẩn cao hơn 107 tế bào/ ml có dấu hiệu bi ̣ ô nhiễm nhe ̣, dịch bệnh có thể phát sinh [7]

Nhóm vi khuẩn Vibrio tồn tại trong môi trường nước nuôi như một thành

phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong đầm nuôi nhưng khi gặp điều kiện bất lợi cho tôm, chúng trở thành vi khuẩn có khả năng gây bệnh, vì vậy chúng được xếp

vào loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên tôm Vibrio spp rất phổ biến trong nước mặn, một số loài có khả năng gây bệnh cho tôm (V cholera, V parahaemolyticus,

V alginolyticus, V vulnificus, V urnissii…) Chúng thường gây ra các bệnh nghiêm

trọng cho tôm như bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh phát sáng… Khi bị nhiễm

vi khuẩn này, lúc đầu, một số nơi trên cơ thể tôm sẽ bị tiêu hủy như phần đuôi hoặc phần lưng rồi dần dần làm bế tắc hệ thống lưu thông của máu Tôm thay đổi tập tính như bơi ven bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bỏ ăn, đổi màu đỏ hoặc xanh Nếu môi trường tiếp tục xấu đi hay số lượng vi khuẩn gây bệnh tăng mạnh, tôm sẽ chết nhiều trong một thời gian ngắn hoặc bệnh sẽ chuyển thành dạng nhiễm khuẩn mãn tính Những bệnh này chỉ mang tính chất cơ hội khi nước bị ô nhiễm, đặc biệt là nước bị

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 16

ô nhiễm hữu cơ hoặc tôm cá chịu tình trạng sốc do một trong các điều kiện gây ra như sự thay đổi nhiệt độ, pH, mật độ thả quá dày, sự thay đổi về độ mặn của nước 1.5 Ứng dụng của vi sinh vật trong nuôi trồng thủy sản

Đầm nuôi tôm, cá là những hệ sinh thái nước không đặc trưng do chịu nhiều tác động của con người Tuy vậy, cũng giống như khu hệ sinh thái nước tự nhiên khác, hệ sinh thái đầm nuôi tôm, cá được cấu thành bởi nước, khoáng chất, các hợp chất hữu cơ hòa tan và hệ thủy sinh vật Vi sinh vật là một thành phần quan trọng của hệ thủy vi sinh vật ở đây bởi chúng không những đóng vai trò chủ đạo trong các chu trình chuyển hóa các nguyên tố cơ bản cấu tạo nên hợp chất hữu cơ mà tác động trực tiếp hoặc gián tiếp lên nguồn lợi thủy sản của người nuôi trồng [8], [9] Vi sinh vật hữu ích trong nước nuôi tôm bao gồm các nhóm có khả năng phân giải và tái vô

cơ hóa các hợp chất hữu cơ, chuyển hóa các hợp chất vô cơ, đồng thời bản thân chúng cũng không gây hại với tôm (không sinh ra sản phẩm độc hại, không gây bệnh) Hoạt động sống của chúng sẽ giúp ích cho việc cải thiện chất lượng môi trường nước, ổn định pH, tạo điều kiện môi trường không thuận lợi đối với các vi sinh vật gây hại, cạnh tranh và ức chế sự phát triển của nhóm vi sinh vật gây bệnh ở tôm cá, qua đó giúp tôm, cá tăng trưởng nhanh, khỏe mạnh và môi trường sinh thái trong đầm được cân bằng [10] Trong môi trường nước nuôi tôm, cá luôn tồn tại các hợp chất hữu cơ từ nhiều nguồn khác nhau như: lượng thức ăn dư thừa, phân tôm cá, chất tiết ra từ mọi quá trình trao đổi chất của thủy sinh vật, xác động vật, thực vật phù du…[11] Do đó, nếu nồng độ của chúng trong nước quá cao sẽ gây ô nhiễm nguồn nước và dẫn tới các hội chứng sốc ở tôm, cá Hoạt động tích cực của các vi sinh vật phân giải các hợp chất hữu cơ sẽ giúp giải phóng những tồn tại hữu

cơ gây ô nhiễm nguồn nước, đồng thời bổ sung trực tiếp hoặc gián tiếp vào nguồn dinh dưỡng cần thiết cho động vật nuôi trồng [27] Cơ chế các hoạt động phân giải chất hữu cơ ở vi sinh vật hữu ích chính là cơ chế của các quá trình trao đổi chất và trao đổi năng lượng trong cơ thể chúng Nấm, động vật nguyên sinh và đa số vi khuẩn là vi sinh vật dị dưỡng nên chúng cần chất hữu cơ từ bên ngoài môi trường

để làm thức ăn Chúng sử dụng những chất này để thu nhận các tiền chất cho việc xây dựng nên tế bào của mình và thu nhận năng lượng cho các quá trình sống Khi

đó vật chất hữu cơ được vi sinh vật biến đổi thành các chất nghèo năng lượng và

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 17

cuối cùng trong những điều kiện phù hợp thì chuyển hóa ngược lại thành những chất vô cơ ban đầu Trong môi trường nước nuôi tôm, cá các loại chất hữu cơ thường chiếm tỷ lệ lớn là: protein, cacbonhidrat, kitin,… Sự phân hủy protein trước

hết là nhờ nhiều loại vi khuẩn như Pseudomonas, Clostridium, Bacillus và họ vi

khuẩn Enterobacteriaceae [12] Đại diện cho nhóm vi sinh vật hữu ích chuyển hóa

các hợp chất cacbonhidrat bao gồm các chi Bacillus, Lactobacillus, Streptococus,

Cellulomonas, Aerobacter… Các nghiên cứu cụ thể hơn còn cho thấy bên cạnh khả

năng phân giải chất hữu cơ, nhóm vi khuẩn này còn có khả năng cạnh tranh sinh

học, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh ở tôm là Vibrio và Aeromonas

[13], [28] , [29] Môi trường nước nuôi tôm, cá vốn là một môi trường giàu dinh dưỡng, thức ăn giàu đạm luôn được con người cung cấp dư thừa, ngoài ra còn từ phân tôm, cá và xác động vật thủy sinh Mặt khác, một số hợp chất nitơ vô cơ như NH3 là một khí độc với tôm và NO3- là tác nhân gây ung thư đối với nhiều động vật Do đó, vai trò phân giải hợp chất nitơ hữu cơ của nhóm vi khuẩn amôn hóa, nhóm vi khuẩn nitrat hóa và nhóm vi khuẩn phản nitrat hóa đặc biệt được quan tâm Tuy nhiên, chỉ một số ít vi sinh vật (vi khuẩn sống tự do trong đất và nước, vi khuẩn sống cộng sinh với thực vật, vi khuẩn quang hợp,…) có khả năng cố định nitơ phân

tử thành dạng nitơ hợp chất mà các vi sinh vật khác có thể sử dụng được Dạng amôniac (NH3) và nitrat (NO3-) được tảo và nhiều vi sinh vật hấp thụ tạo nên nguồn nitơ hữu cơ, sau đó có thể chúng lại trở thành nguồn thức ăn cho động vật thủy sinh - Nhóm vi khuẩn amôn hóa: Nhóm này phân giải protein và các hợp chất hữu cơ chứa nitơ tạo thành amôniac, hoạt động của nhóm vi khuẩn amôn hóa giúp loại bỏ các hợp chất hữu cơ gây ô nhiếm nguồn nước nuôi tôm, cá góp phần tạo nên một môi trường trong sạch cho tôm cá phát triển - Nhóm vi khuẩn nitrat hóa: vi khuẩn amôn hóa là vi khuẩn hữu ích, song sản phẩm mà chúng sinh ra là NH3, nếu trong nước nồng độ NH4+ quá cao vượt mức cho phép sẽ gây hại cho động vật nuôi trồng [14] Nhóm vi khuẩn nitrat hóa đó là các chi Nitrosomonas, Nitrococus, Nitrobacter, Nitrospira,… được xếp vào nhóm vi khuẩn hữu ích trong môi trường nước nuôi tôm cá vì chúng có khả năng chuyển hóa NH4+ thành NO3- (dạng không độc với môi trường và các sinh vật khác trong đầm) Mặt khác, NO3- do hoạt động của chúng sinh ra lại có thể được đồng hóa trong tổng hợp protein của nhiều sinh

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 18

vật và tảo Như vậy, nhóm vi khuẩn nitrat hóa không chỉ làm giảm độ độc của nước

mà còn góp phần làm mới nguồn nước, mang lại các chất dễ hấp thụ cho động vật

thủy sinh [30], [31] Pseudomonas, Bacillus, Paracoccus… là các vi khuẩn có khả

năng khử NO3- thành N2 khí quyển, giúp khép kín vòng tuần hoàn nitơ trong thủy vực, đồng thời hạn chế một tác nhân gây hại cho động vật nuôi trồng Trong nước nuôi tôm cá cũng như tại các nhà máy xử lý nước thải, số lượng và hoạt động sinh

lý của nhóm vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn phản nitrat hóa được xem như các thông số giới hạn tốc độ quá trình chuyển hóa sinh học của nitơ trong nước [15] Vi sinh vật dị dưỡng sinh trưởng và thu nhận năng lượng bằng nhiều phản ứng xúc tác enzym Các enzym có tính đặc hiệu cơ chất cũng như có hiệu quả xúc tác chuyển hóa cao Một số enzym cũng tham gia vào chuỗi các phản ứng sinh hóa để hiệp đồng chuyển hóa một số cơ chất khó phân hủy Có 2 loại enzym là enzym nội bào vào enzym ngoại bào Enzym ngoại bào phân hủy các cơ chất cao phân tử thành các phân tử nhỏ hơn để có thể di chuyển vào tế bào qua màng sinh chất Enzym nội bào xúc tác các phản ứng oxy hóa cơ chất thu năng lượng và sinh tổng hợp trong tế bào Trong quá trình phân hủy cơ chất hữu cơ, vai trò hàng đầu thuộc về các vi sinh vật

có khả năng sinh tổng hợp các enzym thủy phân ngoại bào

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 19

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và hóa chất

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

- Năm mẫu trầm tích được lấy tại các tọa độ khác nhau bằng hai phương pháp dùng cuốc và Scuba từ đáy biển Thanh Hóa – Quảng Bình – Quảng Trị được chuyển đến phòng Công Nghệ Sinh Học, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để phân lập và giữ chủng

- Các chủng vi khuẩn Vibrio gây bệnh cho tôm cá: V alginolyticus, V

parahaemolyticus, V Cholera , V vulnificus

- Cặp mồi khuyết đại gen 16S rRNA của vi khuẩn:

16SF 5'AGA GTT TGA TCA TGG CTC A3' 52 42%

- Hóa chất gồm: Tris HCl (pH 8) 0.01M, EDTA (pH 8) 0.025m, SDS, enzyme lysozym, phenol, chloroform, isoamyl alcohol, isobutanol, ethanol, iso propanol, cồn, NaOH pH 7,3

- Hoá chất chạy PCR: mồi, Master mix

- Hóa chất điện di gồm: TAE 1X, ethidium bromide, loading dye, agarose (0.8%)

Nguyễn Thị Thúy Ngân Page 20

2.1.2.2 Thiết bị

STT Tên thiết bị Hãng sản xuất

1 Box cấy vô trùng Sanyo (Nhật)

3 Nồi hấp vô trùng Nhật

6 Máy Vortex Mimishaker, IKA (Đức)

7 Máy khuấy từ Rotorab, OSI

8 Máy đo OD UV/VIS Spectrophotomater (Nhật)

9 Máy ly tâm Centrifuge

11 Máy chạy điện di Takara, Nhật

- Các dụng cụ nghiên cứu vi sinh thông thường như que cấy, đĩa peptri, bình tam giác, que ria, que chang