Nghiên cứu và so sánh đặc điểm sinh hóa của collagense tái tổ hợp từ chủng lysinibacillus sphaericus

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: NGHIÊN CỨU VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA COLLAGENASE TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG Lysinibacillus sphaericus --- Người hướng dẫn : TS...

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài: NGHIÊN CỨU VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA

COLLAGENASE TÁI TỔ HỢP

TỪ CHỦNG Lysinibacillus sphaericus

- Người hướng dẫn : TS Bạch Thị Mai Hoa Sinh viên : Nguyễn Thị Hà

Hà Nội-2017

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài: : NGHIÊN CỨU VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA

Tôi cũng mong muốn được gửi lời càm ơn chân thành nhất tới các cán

bộ, nhân viên, các sinh viên thực tập tại phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, Viện đại học Mở Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, cảm ơn anh chị em, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 15 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Hà

MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1

TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về Lysinibacillus và Lysinibacillus sphaericus 3

1.1.1 Lysinibacillus 3

1.1.2 Lysinibacillus sphaericus 3

1.2 Giới thiệu về collagen 5

1.2.1 Collagen 5

1.2.2 Ứng dụng của collagen 9

1.3 Collagenase 12

1.3.1 Đặc điểm của collagenase 12

1.3.2 Những nghiên cứu ở Việt Nam và thế giới về collagenase 14

1.3.3 Ứng dụng collagenase 17

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu 19

2.1.1 Chủng vi sinh vật 19

2.1.2 Hóa chất sử dụng 19

2.1.3 Môi trường 20

2.1.4 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng tái tổ hợp 21

2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và thời gian lên khả năng sinh tổng hợp collagenase của chủng tái tổ hợp 22

2.2.3 Tách DNA plasmid 22

2.2.4 Biến nạp E coli bằng phương pháp sốc nhiệt 23

2.2.5 Phương pháp khuếch đại gen col 23

2.2.6 Tinh sạch collagenase tái tổ hợp 24

2.2.7 Phương pháp định hoạt tính enzyme 25

2.2.8 Phương pháp zymogram gelatine 27

2.2.9 Phương pháp sắc ký protein trên polyacrylamid 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Đặc điểm sinh học của chủng tái tổ hợp 29

3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận collagenase từ chủng vi khuẩn BL21(DE3) pIN III ompA- col 31

3.2.1 Ảnh hưởng của pH 31

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt động của collagenase 32

3.2.3 Động thái sinh tổng hợp collagenase của chủng vi khuẩn 34

3.3 Tinh sạch collagenase 36

3.4 Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh của collagenase tái tổ hợp 41

3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng một số yếu tố pH, nhiệt độ, ion kim loại và chất ức chế lên hoạt động của enzyme đã tinh sạch 42

3.5.1 Ảnh hưởng của pH 42

3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt động của collagenase 43

3.5.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại và các chất ức chế lên hoạt động của collagenase đã tinh sạch 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

Kết Luận 46

Kiến Nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Một số collagenase từ các nguồn khác nhau đã được nghiên cứu 13 Bảng 2: Danh mục và xuất xứ của các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 19 Bảng 3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21 Bảng 4: Ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp

collagenase của chủng vi khuẩn BL21(DE3) pIN III ompA- col 32

Bảng 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và tổng hợp collagenase của

chủng vi khuẩn BL21(DE3) pIN III ompA- col 33

Bảng 6: Giá trị Km và V max của collagenase đối với các cơ chất khác nhau 42

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Hình ảnh nhuộm Gram của L Sphaericus 4

Hình 2: Cấu trúc collagen 6

Hình 3: Cấu trúc tropocollagen 7

Hình 4: Đường chuẩn protein 25

Hình 5: Đường chuẩn Leucine 26

Hình 6: Hình ảnh điện di vector pIN III ompA, col và pIN III ompA col trên agarose 1% Băng 1: pIN III ompA; Băng 2: col; Băng 3: col đã được cắt với enzym giới hạn BamHI và NotI; Băng 4: pIN III ompA- col 29

Hình 7: Đặc điểm nuôi cấy của của chủng tái tổ hợp và chủng vi khuẩn mang vector pIN III ompA trên môi trường LB có bổ sung 1% casein, gelatin và collage 30

Hình 8: Khả năng thủy phân cơ chất casein, gelatin và collagen của dịch phá vỡ tế bào của BL21(DE3) pIN III ompA- col 31

Hình 9: Định tính collagenase của dịch phá tế bào chủng tái tổ hợp trên điều kiện nhiệt độ nuôi cấy khác nhau 34

Hình 10: Động thái lên men của chủng BL21 PinIII ompiA-col 35

Hình 11 : Định tính collagenase của dịch phá tế bào chủng tái tổ hợp trên thời gian nuôi cấy khác nhau 36

Hình 12 Kiểm tra khả năng biểu hiện COL trên SDS-PAGE Giếng 1: 10 g protein của BL21(DE3) PIN III ompA Giếng 2: 20 g protein của pha không tan BL21(DE3) PIN III ompA- col Giếng 3: 10 g protein của pha tan BL21(DE3) PIN III ompA- col Giếng 4: Broad ranger protein marker 37

Hình 13: Quy trình tinh sạch collagenase 38

Hình 14: Định tính các phân đoạn tinh sạch của collagenase tái tổ hợp 40

Hình 15: Kết quả zymogram gelatin của các phân đoạn tinh sạch collagenase tái tổ hợp 41

Hình 16 : Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của collagenase 43

Hình 17: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của collagenase 44

Hình 18: Ảnh hưởng của ion kim loại và chất ức chế đến hoạt động của collagenase 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Collagen chiếm 30% thành phần protein trong cấu trúc cơ thể động vật và đến 70% cấu trúc da, nó là một cơ chất rất bền và khó phân giải nhất trong số các protein Chỉ có duy nhất collagenase là enzyme có khả năng phân giải collagen khi cơ chất này ở trạng thái siêu xoắn Bởi vì enzyme này có hoạt tính protease, gelatinase được biểu hiện ở khả năng phân cắt procollagen hoặc gelatin Trong khi nhiều protease, gelatinase đã nghiên cứu nhưng lại không có khả năng phân cắt bó sợi collagen ở dạng hòa tan

và không hòa tan

Việc nghiên cứu và sản xuất collagenase trở nên vô cùng hấp dẫn và đặc biệt trong những năm gần đây khi collagen ngày càng có nhiều ứng dụng lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y học, thẩm mỹ,

và các sản phẩm chăm sóc sức khỏe

Collagenase có khả năng phân cắt đoạn collagen, thành các đoạn có kích thước nhỏ, rút ngắn thời gian phân cắt, hiệu suất thu hồi cao, sản phẩm collagen có tính hòa tan cao, bảo toàn được đặc điểm sinh học và thân thiện với môi trường Collagenase từ vi khuẩn có khả năng phân cắt hầu hết các loại collagen và tại nhiều vị trí trên sợi collagen Các collagenase này hầu hết đều có nguồn gốc từ vi sinh vật gây bệnh cho con người nên cần có sự thận trọng trong việc ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm dành cho người

Lysinibacillus sphaericus là nhóm có khả năng sinh collagenase cao

nhưng chưa được nghiên cứu rộng rãi mặc dù thông tin trình tự gene mã hóa collagenase trong hệ gene đã được công bố, đặc biệt chúng không mang trình tự mã hóa của protein gây bệnh Đây là một ưu điểm khi sử dụng enzyme từ vi khuẩn này tạo sản phẩm collagen không chứa tác nhân gây miễn dịch hay dị ứng

Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài : “ Nghiên cứu và so sánh đặc điểm

sinh hóa của cllagenase tái tổ hợp từ chủng Lysinibacillus sphaericus ”với

mục tiêu chính :

1 Nghiên cứu thu nhận và tinh sạch collagenase từ chủng vi khuẩn

2 Xác định các đặc điểm sinh hóa của collagenase tái tổ hợp

Đề tài này được thực hiện tại Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam

Lý do chúng tôi lựa chọn nghiên cứu collagenase từ vi khuẩn là do collagenase từ vi khuẩn có khả năng phân cắt các loại collagen hòa tan và không hòa tan với hiệu suất thu hồi cao Bên cạnh đó collagenase từ vi khuẩn là enzyme có khả năng phân cắt được collagen type I, collagen type

II mà collgen type I và collagen type II chiếm đến 70% tổng số loại collagen đã được nghiên cứu Trong khi prokaryote collagenase và eukaryote collagen không có khả năng phân cắt hai loại collagen này

TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về Lysinibacillus và Lysinibacillus sphaericus

1.1.1 Lysinibacillus

Lysinibacillus thuộc họ Bacillaceae Trước đây nó được coi là thành

viên của chi Bacillus Nhưng đến năm 2007 dựa vào trình tự rARN nó đã được đổi thành chi Lysinibacillus So với Bacillus sp thì Lysinibacillus sp chứa lysine và aspartate trong peptidoglycan, khác với Bacillus sp là

diaminopimelic acid

Lysinibacillus thường được tìm thấy trong đất, nước bùn và một số mô

thực vật Chủng này cũng có thể phân lập từ các sản phẩm giống cây trồng lên men và thậm trí từ mẫu gan cá nóc [1]

Lysinibacillus thường sống yếm khí tùy tiện, tuy nhiên trong điều kiện

nhất định nó có thể sống kỵ khí

1.1.2 Lysinibacillus sphaericus

Lysinibacillus sphaericus là một trực khuẩn Gram dương (hình 1),

hình que sinh nội bào tử hình elip hoặc hình cầu, thuộc chi Lysinibacillus, còn có tên khác là Bacillus sphaericus ( NCBI genome project entez) Sự

thay đổi tên đã được đề xuất bởi Ahmet I trong năm 2007 dựa trên thành phần đặc biệt peptidoglycan của thành tế bào, cũng như phân tích đặc điểm

sinh lý của L sphaericus [2]

Hình 1: Hình ảnh nhuộm Gram của L Sphaericus

Trong điều kiện khắc nhiệt L sphaericus có thể hình thành nội bào tử

không hoạt động có khả năng chịu nhiệt, hóa chất và tia cực tím Những bào tử có thể sống sót trong một thời gian dài

Bộ gen của chủng L sphaericus C3-41 là dòng đầu tiên được giải

trình tự vào năm 2008

Trình tự bộ gen vi khuẩn này rất có ích vì nó đã làm tăng kiến thức của chúng ta về trực khuẩn cũng như cung cấp cái nhìn sâu sắc để cải thiện tương lai của các tác nhân kiểm soát sinh học quan trọng [3]

L sphaericus không có khả năng chuyển hóa polysaccharides, do

thiếu các enzyme và hệ thống vận chuyển cụ thể Sự phong phú của các

enzyme phân giải protein và hệ thống vận chuyển cho phép L sphaericus

sử dụng con đường chuyển hóa độc quyền sử dụng một loạt hợp chất hữu

cơ và axit amin Một đặc tính được biết đến của L sphaericus là không có

khả năng chuyển hóa cacbonhydrate nhưng các chi tiết về quá trình chuyển hóa năng lượng của nó vẫn chưa được làm sáng tỏ [3]

Chủng L sphaericus có thể sinh trưởng ở pH từ 5.5 - 9.5 với sự phát

triển tối ưu ở pH 7.5 và ngừng phát triển ở pH 5.0 Dải nhiệt độ phát triển

của chúng là từ 16°C - 45°C và phát triển tối ưu ở 37°C, không sinh trưởng

ở nhiệt độ ≥ 50°C, ở 16°C chúng sinh trưởng chậm và sau nhiều ngày mới quan sát thấy sự tăng số lượng tế bào Những phát hiện này giúp phân biệt

chủng từ các loài có liên quan chặt chẽ như Bacillus fusiformic (chỉ phát

triển ở nhiệt độ nhỏ hơn 40°C) Nghiên cứu ở nồng độ NaCl khác nhau ở

pH 7.0 và 30°C cho thấy chúng chịu được dải nồng độ muối từ 0-5% (w/v)

NaCl trong môi trường thạch, điều này khác với chủng Bacillus fusiformic

có thể chịu được dải nhiệt độ muối lên tới 7%(w/v) [4]

Một số công trình nghiên cứu về chủng L sphaericus đã được công bố

đa số liên quan đến khả năng sản xuất độc tố có tác dụng diệt côn trùng, đặc biệt là ấu trùng muỗi, do đó nó đã được sử dụng làm vector để kiểm

soát bệnh nhiệt đới L sphaericus được chia thành 5 nhóm chính trên cơ sở

sự tương đồng trình tự DNA của nó [5]

Năm 1960 việc phân lập vi khuẩn B thuringiensis hoặc L sphaericus

đã diễn ra mạnh mẽ để áp dụng cho việc xử lý môi trường, nó được coi như một thành phần trong thuốc trừ sâu sinh học để kiểm soát hoạt động của một số chủng muỗi và gián, sâu bướm[35]

Một nghiên cứu L sphaericus OT4b.31 công bố chủng vi khuẩn này không có khả năng chống muỗi vằn Quinquefasciatus nhưng có khả năng

xử lý các kim loại nặng trong môi trường ô nhiễm [5]

1.2 Giới thiệu về collagen

Collagen là một protein có cấu trúc bậc 4 điển hình, do các đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc Trong cấu trúc phân tử collagen, do tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kị nước và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen

Hình 2: Cấu trúc collagen

Về cấu trúc, phân tử collagen hay còn gọi là tropocollagen có dạng sợi hình ống, chiều dài khoảng 300 nm, đường kính 1,5 nm Mỗi sợi collagen này được cấu tạo từ ba chuỗi polypeptide (α peptide) nối với nhau bằng các liên kết hydro và xoắn lại với nhau như sợ thừng Mỗi một vòng xoắn có độ dài 3,3 gốc amino acid, chiều cao là 2,9Å Mỗi chuỗi có hình dạng xoắn ống từ trái sang phải, gọi là chuỗi xoắn bậc 3 (triplehelix) [5]

Hình 3: Cấu trúc tropocollagen

Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng

sợi, bao gồm những sợi mảnh nhỏ Đầu tiên ba sợi của collagen này xoắn

lại theo kiểu xoắn ốc xung quanh một sợi hình thành nên bộ ba

tropocollagen Sau đó trong tropocollagen liên kết với nhau theo kiểu đầu

nối đuôi hình thành collagen fibril Các collagen fibril này bó lại với nhau

hình thành sợi collagen siêu cấp collagen fiber Các chuỗi collagen sắp xếp

song song theo chiều dọc liên kết với nhau bằng liên kết ngang tạo thành

các sợi theo chu kỳ nhất định

Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67nm và có một khoảng

trống 40nm ở giữa những phân tử liền kề nhau

Nhờ vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được

chuyển sang các sợi collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và

những đặc tính cơ học riêng Vì thế collagen rất chắc, dai và bền

Collagen tồn tại ở nhiều bộ phận trong cơ thể Đã có 29 loại collagen

được tìm thấy và công bố trong các tài liệu khoa học Trên 90℅ collagen

trong cơ thể là loại I,II, III và IV.[5]

Collagen loại I : có trong da, gân, mạch máu, các cơ quan, xương ( thành phần chính của xương )

Collagen loại II: có trong sụn xương ( thành phần chính của sụn) Collagen loại III: có trong bắp ( thành phần chính của bắp), tìm thấy bên cạnh collagen loại I

Collagen loại IV: thành phần chính cấu tạo màng tế bào

Collagen loại V: có trong dây chằng, giác mạc, kẽ hở giữa các mô Collagen loại VI: có trong gan, thận, màng sụn

Collagen loại VII: có trong sự nối liền của da và biểu bì

Collagen loại VIII: có trong tế bào màng trong

Collagen loại IX: có trong sụn

Collagen loại X: có trong sụn bị khoáng hóa và phình to

Collagen loại XI: có trong sụn

Collagen loại XII: có trong dây chằng, sợi liên kết collagen

Collagen loại XIII: có trong biểu bì, nang tóc, tế bào gốc của móng Collagen loại XIV: có trong sợi liên kết collagen

Collagen loại XV: có trong nhiều mô khác nhau, tương đồng với collagen loại XVII

Collagen loại XVI: còn đang được nghiên cứu

Collagen loại XVII: có trong da

Collagen loại XVIII: có trong gan

Collagen loại XIX: có trong mắt, não, tinh hoàn, mô trong thời kỳ đầu phát triển

Collagen loại XX-XXIX: còn đang được nghiên cứu

Collagen loại I là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như

da, xương, gân Collagen loại II hầu như tồn tại ở các mô sụn Collagen loại III lại phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi của động vật, da heo còn trẻ chứa tới 50%, theo thời gian tỷ lệ này giảm 5 -10% những đoạn Collagen khác chỉ hiện diện với lượng rất nhỏ và chỉ ở một vài cơ quan đặc biệt

1.2.2 Ứng dụng của collagen

a Ứng dụng trong công nghiệp

Nếu collagen bị thủy phân thì các chuỗi polypeptide sẽ tách nhau một phần hoặc hoàn toàn, hình thành nên gelatin Gelatin được ứng dụng trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và nền công nghiệp phim ảnh Các nhà sản xuất bổ sung collagen thủy phân này cho các sản phẩm và khẳng định rằng sản phẩm của họ có thể cải thiện làn da, móng tay và sức khỏe xương khớp

Theo tiếng Hy Lạp, collagen có nghĩa là "người sản xuất keo hồ", nói đến quá trình nấu da và gân của ngựa cùng những loại động vật khác để thu được hồ Keo dán collagen đã được người Ai Cập sử dụng cách đây 4.000 năm và người Mỹ sử dụng nó cách đây khoảng 1.500 năm

Nó không những được dùng để giữ các dụng cụ trong gia đình mà còn rất hữu dụng trong việc sản xuất các loại nhạc cụ như violin hay guitar, những loại này thường được tháo ra để sửa chữa nên không thích hợp dùng các chất dính lâu bền, trong khi đó collagen khi đun nóng thì có thể được làm mềm một cách dễ dàng

b Ứng dụng trong y học

Collagen là một vật liệu có khả năng phân hủy sinh học, có tính tương thích sinh học, có khả năng cầm máu cho nên nó là một loại vật liệu

sinh học lý tưởng cho việc sản xuất các sản phẩm y học Màng collagen được sử dụng cho hàng loạt những ứng dụng như làm chất biệt chiến sinh học và cải thiện tính đáp ứng sinh học đối với những mô cấy collagen được

sử dụng như một hệ thống phân hủy sinh học cho ra các loại thuốc bao gồm thuốc tránh thai, kháng sinh, insulin, hormone tăng trưởng, Collagen được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, chữa lành vết thương cho các bệnh nhân bị bỏng, tái tạo xương và nhiều mục đích khác trong lĩnh vực nha khoa, phẫu thuật và chỉnh hình Collagen còn được dùng trong việc xây dựng cấu trúc da nhân tạo để chữa trị cho các vết bỏng nghiêm trọng Đôi khi chúng được sử dụng kết hợp với silicon, glycosaminoglycan, nguyên bào sợi, các tác nhân tăng trưởng và các hợp chất khác Collagen cũng được bán trên thị trường như một chất bổ sung cải thiện tính linh hoạt của khớp Ngoài ra, collagen còn là phần nền giúp tích tụ calcium trong xương Nếu hàm lượng collagen giảm đáng kể calcium không thể tích tụ làm cho xương giòn và dễ gãy sự dễ bị hao mòn tạo nên các cơn đau ở khớp gối và hông Như vậy để xương cứng cáp hơn, ngoài calcium cần bổ sung một lượng lớn collagen

Collagen là một polymer tự nhiên nó được dùng trong phẫu thuật tạo hình như bơm môi, căng da mặt, Mặc dù không thể hấp thụ qua da nhưng hiện nay collagen đang được dùng làm thành phần chính trong các sản phẩm mỹ phẩm

 Collagen dạng sợi

Collagen dạng sợi được dùng trong việc làm lành các vết thương, vết bỏng và vết rạch trong phẫu thuật Sợi collagen có thể được xử lý để tạo cấu trúc sợi thẳng, dài dùng làm những sản phẩm y học cho gân và dây chằng Những ống collagen (collagen tube) được sử dụng thay thế cho các cấu trúc như thực quản, dây thần kinh ngoại biên, niệu quản Nó cũng được

sử dụng trong việc nuôi cấy tế bào

 Màng mỏng collagen

Collagen dạng màng và lớp mỏng biết sử dụng để giữ cố định các vật chất sinh học chẳng hạn như nhân tố XY 11 trong máu, dùng trong sự tái tạo các mô, nổi kết lại võng mạc, làm mặt thẩm tích máu, làm vật thay thế lớp màng cứng của não Nó còn được dùng cho việc tái tạo dây thần kinh, khôi phục màng nhĩ, sụn và xương, kiểm soát sự chảy máu cục bộ, khôi phục tổn thương của gan, là lớp màng chắn bảo vệ não, có tác dụng phục hồi các vết thương

c Ứng dụng trong nghiên cứu

Sự phát triển của tế bào với sự hỗ trợ của collagen trong sự nuôi cấy

tế bào vừa được xem xét gần đây Việc sử dụng chất này collagen cho sự phát triển của tế bào da được công bố một cách rộng rãi Những tế bào nuôi cấy trên collagen kích thích làm vết thương mau lành Những nghiên cứu rộng rãi về sự phát triển của các tế bào da tự sinh và khác loại trên nền collagen chứng minh tính khả thi để tạo ra nhiều chủng loại mô và các cơ quan trong quá trình nuôi cấy Sử dụng nguồn nguyên liệu tế bào nuôi cấy thuộc nhiều chủng loại khác nhau có tác dụng to lớn đến việc điều trị cho bệnh nhân có những tổn thương về mô hoặc các cơ quan

d Ứng dụng trong mỹ phẩm

Khoảng 70% cấu trúc của da là collagen, phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da [5] Collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm, làm cho da được mịn màng, tươi tắn và trẻ trung Collagen giúp duy trì độ ẩm tối ưu cho tế bào

Sự suy giảm về chất lượng, số lượng collagen sẽ dẫn đến da trở nên khô, mất độ căng, đàn hồi và thúc đẩy quá trình lão hóa của cơ thể Chính vì vậy

mà collagen đóng vai trò quan trọng giúp cải thiện cấu trúc da, kích thích quá trình tái tạo của làn da, phục hồi tế bào da bị tổn thương

1.3 Collagenase

1.3.1 Đặc điểm của collagenase

Collagenase nhân sơ và nhân chuẩn đã được nghiên cứu cấu trúc và trình tự được phân loại thuộc nhóm metalloproteinase (MMP) Những nghiên cứu về cấu trúc và ái lực của MMP nhân chuẩn cho thấy đây là các enzyme hoạt động phụ thuộc vào sự có mặt của ion , gồm enzyme có hoạt tính như collagenase, stromelysin, gelatinase và loại enzyme màng metalloproteinase Tuy nhiên những đặc tính của MMP nhân sơ không giống với MMP nhân chuẩn - collagenase nhân chuẩn khác biệt với collagenase nhân sơ về đặc tính hóa sinh và trình tự amino acid, nhưng cả hai đều có đặc điểm chung là có khả năng tách sợi collagen và vẫn bảo toàn đặc điểm sinh học chuối xoắn của ba polypeptide Tuy nhiên collagenase nhân chuẩn chỉ có khả năng cắt sợi collagen thành 2 đoạn có chiều dài ¾ và

¼ sợi collagen ban đầu Còn collagen nhân sơ có khả năng các sợi collagen hòa tan và không hòa tan ở nhiều vị trí chỉ có collagenase mới có khả năng phân cắt bó sợi collagen tập hợp từ nhiều đoạn gồm 3 chuỗi xoắn procollagen Enzyme này có hoạt tính protease, gelatinase được biểu hiện ở khả năng phân cắt procollagen hoặc gelatin Tuy nhiên, nhiều protease, gelatinase đã nghiên cứu lại không có khả năng phân cấp bỏ sợi collagen ở dạng hòa tan và không hòa tan MMP nhân sơ được nghiên cứu nhiều nhất

là collagenase G và collagenase H từ C historiticum, collagenase A từ C

perfingens và collagenase từ V alginolyticus Một số nghiên cứu cấu trúc

sơ bộ đã chỉ ra collagenase từ loài Clostridium sp có chứa 3 vùng gồm

vùng hoạt động, vùng gây bệnh u nang thận ( polycystic kidney disease - PKD) và vùng bám vào sợi collagenase ( collagen - binding domain- CBD) Tất cả các enzyme này đều tồn tại một vùng để ion kim loại bám

và làm tăng khả năng hoạt động Tuy nhiên collagenase của chủng vi

khuẩn không gây bệnh Streptococcus lactis được phân loại như là serine

protease thì không chứa vùng để ion kim loại bám

Các collagenase là enzyme có khả năng thủy phân liên kết peptit dạng poly-L như prolin đặc trưng trong vùng xoắn của collagen ở trạng thái tự nhiên của cơ chất không biến tính Collagenase là các protein có khối lượng phân tử lớn và có cấu trúc phân tử không giống nhau Phân tử collagenase có thể được tạo nên bởi các tiểu phần Collagenase A với khối lượng phân tử 100 kDa được phát hiện ở vùng 4 tiểu phần không có hoạt

tính enzyme với trọng lượng của phân tử là 25 kDa, collagenase của Vibrio

B bao gồm 2 tiểu phần có khối lượng phân tử không giống nhau 24kDa và 28kDa

Đa số các enzyme đã được công bố có pH hoạt động trong khoảng trung tính hoặc hơi kiềm (pH 7-8) Tuy thế khả năng hoạt động của chúng cũng không vượt quá mức pH trung tính Nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động thường là 37°C các enzyme này bất hoạt khi tăng nhiệt độ lên

45°C Đặc biệt trong trường hợp của collagenase từ Vibrio B-30, enzyme

này bị mất tới 94% hoạt tính khi tăng nhiệt độ tới 45°C

Bảng 1: Một số collagenase từ các nguồn khác nhau đã được nghiên

và DFP

Collagenase Vibiro Collagen tự nhiên, MW: 81,875

[33] alginolyticus peptide tổng hợp cần có

mặt của Zn Collagenase

[34]

Clostridium histolyticum

Collagen tự nhiên, phenylazobenzyloxycarb only-pro-Leu-Gly-pro-D-Arg Cần có mặt cuả

Azocoll, collagen tự nhiên, cơ chất tổng hợp

có mặt của ion kim loại

MW: 105,000 (từ các tiểu phần có trọng lượng là 24,000 và 28,000 Da)

MW: 105,000 Phụ thuộc Ca, cần

Zn

1.3.2 Những nghiên cứu ở Việt Nam và Thế giới

a Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Trong những năm gần đây ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu chủ yếu để trích ly collagen từ da và phụ phế phẩm một số loại cá như:

- Năm 1997 Tô Thị Kim Oanh đại học Bách khoa Hà Nội và Cộng Sự

đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn có hoạt tính collagenase từ thực phẩm

truyền thống tác giả tập trung vào nghiên cứu collagenase từ Bacillus

subtillis FS-2 Tuy nhiên thông tin về trình tự amino acid chưa được

nghiên cứu ( To et al 1997; Nagano and To 1999, To and Nagano 2000, 2003)

- Năm 2004, GS Trương Nam Hải và đồng sự ( đề tài nhánh KC

04-07, viện CNSH) đã sàng lọc từ ngân hàng genome dòng gen mã hóa cho

enzyme thủy phân collagen của Bacillus subtillis Tuy nhiên enzyme tái tổ

hợp này chưa được nghiên cứu cấu trúc protein của collagenase và so sánh

sự khác biệt giữa collagenase của B Subtillis với các col H và col G từ C Histolyticum hoặc collagenase từ C Pergringens

- Năm 2008 tác giả Lê Thị Hông Nhan có những nghiên cứu về trích

ly collagen trên loài cá Ba Sa nuôi tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long

Do những ứng dụng to lớn của collagenase và sản phẩm tạo thành nên

nó đang ngày càng được nghiên cứu nhiều hơn tại Việt Nam

b Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Collagenase từ Clostridium histolyticum ( gây hoại tử ở các vết

thương hở) được nghiên cứu và sản xuất từ năm 1958 [6,7,8,9]

Năm 1966 Schoellman và Fisher phát hiện collagenase từ

Pseudomonas aeruginosa ( gây viêm loét phổi, dạ dày, đại tràng và các vết

thương hở) [10]

Năm 1975, collagenase từ vi sinh vật biển ở Vibrio B-30 ATCC

21250, vibrio vulnificus CYK279H ( gây viêm loét ở các vết thương và ngộ độc thực phẩm) và Achromobacter iophagus ( liên quan đến bệnh nhiễm

trùng cơ hội ) [11,12] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra collagenase tồn tại ở các

vi sinh vât gây bệnh khác như Streptomyces lavendulae ( liên quan đến

bệnh ở người) [13]; Bacillus subtillis [14] , Vibrio alginolyticus gây bệnh viêm tai giữa và nhiễm trùng vết thương [15], Streptococcus gordonii gây

bệnh viêm loét miệng, sâu răng hoặc viêm cơ tim [16] và

Thermoactinomycetes sp ( gây nhiễm trùng máu và phổi) [17], Borelia burgadoform ( lây truyền từ các vết cắn của ve tạo thành bệnh Lyme) [18], Peptostreptococcus magrisus ( nhiễm trùng huyết, hoại tử mô) [19], và Streptococcus sobrinus ( bệnh sâu răng) [20], Seratia marcescens ( nhiễm

trùng đường tiết niệu, vết thương) [21] và nhiều vi sinh vật khác như

Bacterroides melaninogenicus; Streptomyces sp; Bacillus cereus MBL31

và Aeromonas veronii [22,23] Tuy nhiên các nghiên cứu chưa đề cập tới

đặc điểm sinh hóa và trình tự amino acid của collagenase từ các vi sinh vật gây bệnh này

Enzyme thô của collagenase từ C histolycium được thương mại hóa từ

năm 1958 Nhưng đến năm 1994, Yoshihara và cộng sự mới công bố sản xuất collagenase type I và II tái tổ hợp với hoạt tính từ 75-125 U/mg Gen ColG mã hóa cho collagenase type I có trọng lượng phân tử 113,9 kDa Gen ColH mã hóa cho collagen type II có trọng lượng phân tử 112 kDa Cho đến nay, collagenase đã được tách chiết từ rất nhiều loại vi khuẩn, gen

mã hóa collagenase đã được tách dòng và giải trình tự [24] Collagenase có

trọng lượng phân tử 93 kDa đã được công bố ở Streptomyces parvulus (

gây bệnh nhiễm trùng mạch máu) [25] Collagen tái tổ hợp gồm 680 amino

acid có trọng lượng phân tử là 74 kDa đã được tách chiết từ Vibrio hollisae

1760 ( gây ngộ độc thực phẩm, và viêm loét dạ dày), protein tái tổ hợp này

đã được biểu hiện ở vi khuẩn Brevibacillus [26] Trình tự amino acid của

V.hollisae thể hiện độ tương đồng cao với collagenase 80 kDa của V alginolyticus ( gây viêm loét dạ dày) [15] và collagenase 64 kDa của Vibrio parahaemolyticus (gây viêm loét dạ dày) [27] Hoạt tính collagenase của V Hollisae và V Alginolyticus được công bố là cao hơn 2-3 lần hoạt tính của

các loại collagenase khác Collagenase từ loài Vibrio được phân loại thuộc

nhóm III

1.3.3 Ứng dụng collagenase

Collagenase là một enzyme đặc biệt, xúc tác quá trình thủy phân, phân cắt collagen nguyên bản và collagen biến tính Collagenase được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau, trong nghiên cứu cơ bản cũng như trong nghiên cứu ứng dụng thực tế về hóa sinh, y tế , công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm và công nghiệp thuộc da [14]

- Phân cắt vật liệu collagen nhờ khả năng phá vỡ các liên kết peptide

trong cấu trúc collgen

- Phân tách mô tế bào:

Collagenase có tầm quan trọng đặc biệt khi phân tách các mô quá nhiều sợi hoặc quá nhạy cảm cho phép sử dụng trypsin, chất mà không ảnh hưởng lên các vật liệu sợi và phá hủy các vật liệu không bền Sự phân tách thường được thực hiện bằng cách ngâm toàn bộ cơ quan hoặc bằng cách ủ một mẫu nhỏ mô cùng với enzyme hòa tan Collagenase đã được ứng dụng thành công cho việc phân lập rộng rãi và đa dạng các loại tế bào

- Phân tách các loại tế bào Langerhan của tuyến tụy:

Collagenase ứng dụng quan trọng trong sự phân lập các tế bào đảo Langerhan của tuyến tụy khi trong đảo có nhiều tế bào khác nhau đặc biệt Trong quá trình này một số nhân tố hạn chế sự thành công của phương pháp bao gồm sự khác nhau đáng kể trong việc chuẩn bị cho collagenase hoạt động, các nhân tố gây độc cho tế bào β- Cell, và tác dụng của collagenase lên tính di truyền miễn dịch và các đặc tính động học của tế bào đảo

- Phân lập các tế bào cơ tim:

Collagenase cũng được sự dụng trong việc phân lập các tế bào cơ tim

Sự phân tách các mô được tiến hành bằng cách ngâm nguyên vẹn cơ quan trong dung dịch enzyme, trong đó có collgenase được chọn lựa một mình

hoặc được kết hợp với một enzyme khác

- Phân lập tế bào gan:

Các tế bào gan đã phân lập được sử dung trong nghiên cứu các tế bào thúc đẩy sự phát triển của khối u, trong nghiên cứu các cơ chế điều khiển tế bào, trong thực phẩm và hệ thống phân tích chất gây ung thư

- Chuẩn đoán các tế bào ung thư phổi:

Sự tăng collagenase hoạt động trong đại thực bào phân lập từ cuống phổi là một dấu chuẩn để chuẩn đoán các tế bào ung thư phổi [28]

- Phân lập tế bào từ mô khác:

Collagenase được ứng dụng thành công trong việc phân lập các tế bào

từ mô xương, mô sụn, tuyến giáp trạng, mô buồng trứng , mô dạ con, mô biểu bì, màng trong của tế bào, các tế bào thần kinh và các tế bào khác

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

K HPO , KH PO Trung Quốc CaCl 6H O Trung Quốc

Sephadex G- 150 Trung Quốc Na MoO 2H O Trung Quốc

2- mecrapto methanol Mỹ Amonium persunphate Mỹ

2.1.4 Các thiết bị sử dụng

Bảng 3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Máy ly tâm lạnh ống nhỏ Eppendorf, Đức

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng tái tổ hợp

Chủng tái tổ hợp BL21(DE3) pIN III- col được nuôi cấy trên môi

trường thạch LB, casein và môi trường khoáng ở nhiệt độ 37 C Hình thái

khuẩn lạc và khả năng phát triển của chủng được quan sát sau 24h và 48h

nuôi cấy và so sánh với chủng đối chứng E coli và chủng gốc L

sphaericus

2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và thời gian lên khả năng sinh tổng hợp collagenase của chủng tái tổ hợp

a Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ

Để xác định khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp collagenase của

chủng BL21(DE3) pIN III- col ở các điều kiện khác nhau, chủng tái tổ hợp

được nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampiciline nồng độ 100 µg/ml và IPTG 50 M Nuôi ở các nhiệt độ khác nhau (10°C, 20°C, 30°C, 37°C, 45°C) và pH khác nhau (từ pH 5.0 – 9.0) tốc độ lắc 200 rpm Sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường sẽ được kiểm sau 48 giờ nuôi cấy ở

OD 600 nm Sinh khối sẽ được thu hồi và phá vỡ tế bào Dịch phá vỡ tế bào sẽ được định lượng và định tính collagenase

b Động thái sinh tổng hợp collagenase của chủng tái tổ hợp

Chủng tái tổ hợp BL21(DE3) pIN III- col được nuôi trong môi trường

LB lỏng có bổ sung ampiciline nồng độ 100µg/ml, và IPTG 50 M pH 7.5

ở 30°C, tốc độ lắc 200 rpm Sự phát triển của vi khuẩn và hoạt tính collagenase sẽ được kiểm tra cứ sau 2 giờ nuôi cấy trong vòng 48 giờ

2.2.3 Tách DNA plasmid

Các tế bào E coli mang vector mong đợi được nuôi đến pha cân bằng

thì được ly tâm thu sinh khối Phương pháp tách vector được tiến hành theo protocol của QIAGEN Miniprep Kit 1.5 ml dịch được nuôi trong môi trường LB có chứa 100 l ampiciline có mật độ OD = 1.5 sẽ được thu hồi bằng ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 3 phút Sinh khối tế bào được hoà tan trong 250 l buffer P1 Sau đó bổ sung 250 l buffer P2 và lắc nhẹ ngược xuôi khoảng 4 lần cho đến khi dung dịch có độ trong 350 l buffer N3

được bổ sung và lắc nhẹ ngay lập tức Lắc trong vòng khoảng 2 phút Hỗn hợp trên được ly tâm ở tốc độ cao nhất trong vòng 10 phút Dịch nổi được chuyển sang cột QIAGEN và ly tâm ở 13 000 rpm trong vòng 1 phút Dịch

ly tẩm được bỏ, 0.75 ml buffer PE được bổ sung vào cột và ly tâm ở 13 000 rpm, 1 phút Sau đó ly tâm lại bước trên để loại bỏ dịch sót lại trong cột Cột QIAGEN sẽ được chuyển sang effendof mới 50 l buffer EB được bổ sung vào chính giữa cột và giữ trong vòng 5 min Tiến hành ly tâm thu plasmid ở 13 000 rpm trong vòng 1 phút Plasmid sẽ được kiểm tra trên 1

% agarose

2.2.4 Biến nạp E coli bằng phương pháp sốc nhiệt

Đây là phương pháp để biến nạp plasmid vào tế bào E coli Các tế

bào được ủ trong để trở thành tế bào khả biến giúp cho chúng dễ tiếp nhận plasmid 1l DNA được bổ sung vào 100 l tế bào khả biến Sau đó ủ trên đá 10 phút sau đó sốc nhiệt trong 4 phút ở 42oC Sau sốc nhiệt thì bổ sung thêm 1 ml LB và ủ ở 37oC trong vòng 1 giờ Sau đó lấy 100 – 200 l dịch đã biến nạp trên trải trên môi trường thạch LB chứa 100 l ampiciline

và 50 M IPTG nuôi qua đêm ở 37oC

2.2.5 Phương pháp khuếch đại gen col

Khuếch đại gen col bằng phương pháp PCR, đây là một kỹ thuật được

sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học PCR dựa trên cơ sở phản ứng

mở rộng primer nhờ enzyme Taq plymerase để khuếch đại in vitro các đoạn DNA đặc trưng Taq polymerase là một enzyme DNA polymerase chịu nhiệt được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong môi trường có 4 loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) và hai primer Forward-BamHI –Col: 5’-GGATCCATGGGGTTAGTACAATGG-3’ và Rerver-NotI-Col:5’-GCGGCCGCTTACTGCACTTGTACTG-3’, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự Các đoạn