Nghiên cứu tạo đột biến UV tăng hiệu suất sinh tổng hợp axit clavulanic từ chủng xạ khuẩn streptomyces clavuligerus

STT Nội dung Trang Bảng 3.1 Kết quả về khả năng ức chế vi sinh vật của chủng xạ khuẩn S.clavuligerus 41 Bảng 3.2 Bảng thử các nồng độ kháng sinh Amp và Amox với B.cereus 37 Bảng 3.3 Bản

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-
   -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:Nghiên cứu tạo đột biến tia UV tăng hiệu suất sinh tổng hợp axit clavulanictừ xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus.”

Giáo viên hướng dẫn: TS.Tạ Thị Thu Thủy

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Hồng Hoa

Lớp: 13-02

Hà Nội – 2017

Với lòng biết ơn sâu sắcem xin gửi lời cảm ơn chân thành của mình tới

TS Tạ Thị Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em những kiến thức

chuyên môn vô cùng quý báu cũng như lòng nhiệt tình trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Em xin cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình dạy dỗ cho em những kiến thức cơ bản đồng thời đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em được học tập trong một môi trường khoa học và hoàn thiện nhất

Đồng thời em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo – Kỹ

sư công nghệ sinh học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, những người

đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Do thời gian và khả năng của bản thân còn hạn chế, vì vậy bài khóa luận của

em không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự chỉ bảo của thầy

cô và sự đóng góp ý kiến của các bạn để khóa luận của em được đầy đủ và hoàn chỉnh hơn

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Hoa

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Phần I : TỔNG QUAN 2

1.1.Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1.Lịch sử về nghiên cứu kháng sinh 2

1.1.2.Khái niệm về kháng sinh 5

1.1.3.Phân loại kháng sinh 5

1.1.4.Các kháng sinh nhóm β – lactam 10

1.2 Đại cương về xạ khuẩn 14

1.2.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn 14

1.2.2.Cấu tạo xạ khuẩn 14

1.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh trong xạ khuẩn 16

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn 17

1.2.5.Đặc điểm về Streptomyces clavuligerus 18

1.2.6 Giới thiệu về axit clavulanic 20

1.3 Đột biến tăng khả năng sinh kháng sinh ở vi sinh vật 22

1.3.1.Khái niệm đột biến 22

1.3.2 Mục đích 22

1.3.3 Đột biến nhân tạo bằng các tác nhân vật lý 23

1.3.4.Đột biến nhân tạo bằng tác nhân hóa học 23

1.3.5.Đột biến nhân tạo bằng phương pháp sốc nhiệt 24

1.3.6 Một số thành tựu trong ứng dụng đột biến gen tăng khả năng sinh kháng sinh ở vi sinh vật 24

1.4 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài 24

1.4.1 Mục tiêu nghiên cứu 24

1.4.2.Nội dung nghiên cứu 24

Phần 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu nghiên cứu 25

2.1.1 Các chủng vi sinh vật 25

2.1.2.Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 25

Bảng 2.3.Môi trường LB 28

2.2.Sơ đồ quy trình nghiên cứu 28

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy chủng vi sinh vật 29

2.3.2 Phương pháp bảo quản giống 31

2.3.3.Phương pháp xác định khối lượng tế bào 31

2.2.4.Phương pháp gây đột biến xạ khuẩn bằng tia UV 31

2.4.Tách chiết và thu kháng sinh 35

Phần 3 - KẾT QUẢ 37

3.1 Xác định hoạt tính axit của chủng S.clavuligerus 37

3.3.So sánh khả năng đột biến từ bào tử và khuẩn ty 38

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian gây đột biến UV đến khả năng sinh trưởng và sinh axit 39

3.5 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng xạ khuẩn đột biến 40

3.7 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng đột biến 41

3.7.1.Ảnh hưởng của hàm lượng cacbonhydrat đến khả năng sinh trưởng và sinh axit 41

3.7.2 Ảnh hưởng của nguồn pepton tới khả năng sinh trưởng và sinh kháng sinh 42

3.7.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đa lượng 44

3.8 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 45

3.8.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 45

3.8.2 Ảnh hưởng của pH 45

3.8.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 46

3.9 Quy trình tách và thu nhận axit quy mô thí nghiệm 47

4.1 Kết luận 48

4.2.Đề xuất 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

STT Nội dung Trang

Bảng 3.1 Kết quả về khả năng ức chế vi sinh vật của chủng xạ khuẩn

S.clavuligerus

41

Bảng 3.2 Bảng thử các nồng độ kháng sinh Amp và Amox với B.cereus 37

Bảng 3.3 Bảng thử các nồng độ kháng sinh Amp và Amox với E.coli 37 Bảng 3.4 Bảng kết quả kết hợp giữa axit clavulanic và kháng sinh

Amox

38

Bảng 3.5 Kết quả so sánh đột biến từ khuẩn ty và bào tử 38 Bảng 3.6 Tỉ lệ sống sót của chủng xạ khuẩn qua thời gian chiếu tia UV 39 Bảng 3.7 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng xạ khuẩn đột biến 40 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nguồn cacbonhydrat đến khả năng sinh trưởng

và sinh tổng hợp axit của chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột

biến

41

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nguồn pepton đến khả năng sinh trưởng và

sinh tổng hợp axit của chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột

biến

43

Bảng

3.10

Ảnh hưởng của hàm lượng đa lượngđến khả năng sinh trưởng

và sinh tổng hợp axit của chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột

biến

44

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum và bào tử của chúng 3 Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin 11 Hình 1.3 Công thức cấu tạo kháng sinh Ampicillin 12 Hình 1.3 Công thức cấu tạo kháng sinh Amoxicillin 12 Hình 1.3 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin 12 Hình 1.6 Khuẩn lạc,khuẩn ty và bào tử của xạ khuẩn 16

Hình 1.7 Hình ảnh về chủng xạ khuẩn S.clavuligerus và khuẩn ty 20

Hình 3.1 Hình thử hoạt tính khuẩn ty và bào tử 39

Hình 3.2 Chủng S.clavuligerusđột biến UV bằng bào tử 40

Hình 3.3 Kiểm tra tính kháng khuẩn của chủng S.clavuligerusđột biến

và tự nhiên

41

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nguồn cacbonhydrat đến khả năng sinh tổng

hợp axit của chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến

42

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nguồn pepton đến khả năng sinh tổng hợp axit

của chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến

43

Hình 3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng đa lượng đến khả năng sinh tổng

hợp axit của chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến

44

Hình 3.7 Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh

tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus

45

Hình 3.8 Biểu đồ ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến khả năng sinh tổng

hợp axit của chủng S.clavuligerus

46

Hình 3.9 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh

tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus

46

MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học là bộ môn tập hợp các ngành khoa học và công nghệ bao gồm: sinh học phân tử, di truyền học, vi sinh vật học, sinh hóa học, công nghệ học, nhằm tạo ra các quy trình công nghệ khai thác ở quy mô công nghiệp các hoạt động sống của vi sinh vật, tế bào động, thực vật để sản xuất các sản phẩm có giá trị phục

vụ đời sống, phát triển kinh tế - xã hội và bảo vệ môi trường

Kháng sinh là một trong các lĩnh vực nghiên cứu của công nghệ sinh học.Kháng sinh là một chế phẩm sinh học được sản xuất nhằm tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh cải thiện tình trạng bệnh lý của con người, động vật, thực vật

Tình trạng kháng kháng sinh lại đang là một mối lo ngại hiện nay.Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) dự tính đến năm 2050 cứ 3 giây sẽ có một người tử vong

do các siêu vi khuẩn kháng thuốc, tương đương với khảng 10 triệu người mỗi năm Khi đó, các bệnh thông thường như ho hay một vết cắt cũng có thể gây ra tử vong Hiện nay để ngăn ngừa tình trạng kháng kháng sinh thì con người phải tìm ra một chế phẩm để phối hợp với kháng sinh làm giảm nồng độ kháng sinh và tăng hoạt lực kháng sinh giúp ngăn chặn nguy cơ kháng kháng sinh đang ngày càng trở thành hiểm họa của loài người

Trong đó chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligenus có khả năng sinh ra axit

clavulanic có thể giúp ta ngăn chặn được phần nào khả năng kháng thuốc của một

số chủng vi sinh vật có khả năng sinh ra enzym β − lactamase

Clavulanic acid là chất bán tổng hợp có khả năng ức chế hoạt động của nhóm

β − lactamase đây là enzym do vi sinh vật tiết ra để làm giảm hoạt lực kháng sinh của nhóm β − lactam.Nó là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp ra bởi chủng xạ khuẩn

Streptomyces clavuligerus.

Tuy nhiên, khả năng sinh axit của chủng xạ khuẩn tự nhiên này chưa cao, rất cần có các biện pháp cải thiện năng suất nhằm thu được hàm lượng sinh axit cao hơn Vì vậy nhóm nghiên cứu thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo đột biến UV tăng

suất sinh tổng hợp clavulanic acid từ xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Phần I : TỔNG QUAN 1.1.Đại cương về kháng sinh

1.1.1.Lịch sử về nghiên cứu kháng sinh

- Trên Thế giới

Sự phát triển về vi sinh vật học nói chung và vi sinh vật công nghiệp nói riêng, với bước ngoặt lịch sử là phát minh vĩ đại về chất kháng sinh của Alexander Fleming vào năm 1928, nhà khoa học người Anh đã tình cờ phát hiện chủng nấm

Penicillium notatum nhiễm sinh vào môi trường nuôi cấy Straphylococus aureus và

ức chế sự phát triển của vi khuẩn này Ông chứng minh rằng loại nấm này tiết ra

một chất có khả năng ức chế sự phát triển của Starphylococus aureus, chất này về sau gọi là Penicillin [22] [26]

Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum và bào tử của chúng

Vìbộ phận sinh sản của loài nấm mốc đó có hình dạng giống cái bút lông nên được đặt tên là Penicillium(tiếng la tinh Penicillium nghĩa là cái bút lông)

Năm 1938, Fleming nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được hợp tác với ông để tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về Penicillin và họ đã thử nghiệm thành công Penicillin trên chuột vào năm 1940

Năm 1944,nhóm đã chọn được loại nấm sinhPenicillin ưu việt nhất là chủng

Penicillium chrysogenum, chế tạo loại Penicillin có hoạt tính cao hơn cả triệu lần Penicillin do Flemming tìm thấy lần đầu năm 1928

Năm 1945,Fleming được giải thưởng Nobel về y học cùng Ernst Boris Chain

và Howard Walter Florey

Cùng với việc phát hiện ra Penicilin,thập kỉ 40,50 của thế kỉ XX cũng ghi nhận những bước tiến vượt bậc trong việc khám phá ra hàng loạt chất kháng sinh mới có giá trị trong y học như:Sulfonamid (Gerhard Domard, 1932), Streptomycin (Selman Waksman và Albert Schat,1944), Cloramphenicol(Erhlich,1947), Chlotetraxyclin (Dugar,1948),…

Tốc độ tìm kiếm các chất kháng sinh ngày càng được đẩy mạnh.Nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện hàng loạt chất kháng sinh mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn.Năm 1945 phát hiện được 30 chất kháng sinh, năm 1949 con số này

là 150 chất kháng sinh, năm 1953 xấp xỉ 450 chất kháng sinh, năm 1980 có 5.500 chất và đến nay số lượng chất kháng sinh được phát hiện lên tới 17.000 chất và khoảng 30.000 chất kháng sinh bán tổng hợp.Tuy nhiên, trong số đó chi có 1÷2% chất kháng sinh là có đủ tiêu chuẩn để được sử dụng trong y học

Năm 1999, kháng sinh Lospomal HA – 92 được tách chiết từ xạ khuẩn

Streptomyces CDRLL – 312, cótác dụng ngăn chặncholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh

Tại Nhật Bản, năm 2003, Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn

Streptomyces sp TP – A0356 bằng phương pháp sắc ký cột Chất kháng sinh này có

khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans Chất này

còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư, có giá trị MIC là 0,01÷ 0,3 mg/ml

Tại Hàn Quốc, năm 2007, phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp

C684 sinh chất kháng sinh Laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng Methicillin và các cầu khuẩn kháng Vancomycin

Năm 2002, tại Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp 201 có khả

năng sinh chất kháng sinh mới là 2 - methylheptyl isonicotinate, chất kháng sinh

này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Furasium oxysporum, F

Solina,

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

- Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, người đầu tiên nghiên cứu chất kháng sinh là giáo sư Đặng Văn

Ngữ Ông đã lấy dịch nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum và xạ khuẩn

Streptomycesgrieus để điều trị vết thương cho thương binh trong chiến dịch Đông Xuân 1951-1952, kháng chiến chống Pháp

Năm 1968, bộ môn công nghiệp Dược (trường Đại học Dược Hà Nội) được thành lập và đào tạo cán bộ chuyên khoa kháng sinh chuẩn bị cho công nghiệp kháng sinh Năm 1970, đơn vị nàybắt đầu nghiên cứu chuyên đề kháng sinh do GS Trương Công Quyền phụ trách.Tại đâyđã phân lập được hàng nghìn chủng xạ khuẩn

từ các mẫu đất khác nhau.Đáng chú ý là đã tuyển chọn được một chủng có khả năng chống vi khuẩn Gram (-), có hiệu quả tốt đối với vi khuẩn gây bệnh mủ xanh

(Pseudomonas aeruginosa) Kháng sinh này lấy tên là Dekamycin và sau này được

xác định là Neomycin

Từ năm 1974,tại Viện Khoa học Việt Nam (nay là Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam) đã có một nhóm nghiên cứu về chất kháng sinh.Nhiều chủng vi sinh vật sinh chất kháng sinh có hoạt tính mạnh đã được ứng dụng trong bảo vệ thực vật.Một số chế phẩm kháng sinh như: Tetravit, Biovit, Baxitraxin…đã được sản xuất và đưa vào sử dụng trong chăn nuôi

Sau đó Việt Nam được nhiều đối tác nước ngoài như Liên Xô (cũ), Trung Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác và giúp sản xuất điều chế kháng sinh song cũng không thành công do nhiều nguyên nhân

Từ năm 1985 – 1990, một chương trình nghiên cứu cấp Nhà nước vềsản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin nhưng kết quả đạt được không cao về công nghệ lẫn hiệu suất

Từ năm 2000 đến nay, ở nước ta cũng có một số nhóm đã và đang tham gia nghiên cứu về kháng sinh và thu được một số kết quả như: nghiên cứu tối ưu điều

kiện lên men và môi trường sản xuất kháng sinhVancomycin từ chủng Streptomyces

orientalis (2004); nghiên cứu quy trình công nghệ lên men sản xuất Vancomycin (2006); nghiên cứu quy trình tách chiết, tinh chế Doxorubicin (DXR)từ xạ khuẩn làm nguyên liệu điều chế thuốc điều trị ung thư và hệ bạch huyết

Ở Việt Nam cũng sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật nhập khẩu từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ

khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryae gây bệnh đạo ôn và F oxysporum

gâybệnh thối rễ ở thực vật Tuy nhiên việc sử dụng chất kháng sinh trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định

1.1.2.Khái niệm về kháng sinh

Từ năm 1941, khi Penicillin được sản xuất để dùng trong lâm sàng thì kháng

sinh được coi là:“ những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tạo

ra, có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác” [21]

Về sau,với sự phát triển của khoa học,người ta đã có thể tổng hợp,bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (Cloramphenicol); tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh: Sulfamid, Quynolon hay chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được

tế bào ung thư (Actinomycin) Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được thay đổi“

kháng sinh là các hợp chất nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật nhiễm sinh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung [25]

1.1.3.Phân loại kháng sinh

Có nhiều cách phân loại kháng sinh,tùy theo mục đích nghiên cứu và cách sửdụng chúng

- Dựa vào mức độ tác dụng

CKS diệt khuẩn gồm những kháng sinh có cơ chế tác dụng đến khả năng tạo vách tế bào,sinh tổng hợp ADN và ARN,giải phóng men autolyza,vi khuẩn tự phân giải như: nhóm Lactamin gồm các loại Penicillin và các chất kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin, nhóm Aminoglucozid (Streptomycin, Neomycin, Kanamycin, Gentamycin, Framomycin), nhóm đa peptid : Colistin,Bacitracin,Vanomycin

CKS kìm khuẩn gồm các chất ức chế sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gắn vào các enzym hay các ribosome 30S, 50S và 70S như: Sulphamid

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Teracillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Novobiocin, các chất kháng sinh được phối hợp giữa Sulphamid với Trimethorpim theo tỉ lệ 5/1 và Tiamulin

- Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh

- Nhóm có phổ tác dụng hẹp,chỉ tác dụng lên một loại hay một nhóm vi khuẩn nào đó: Penicillin cổ điển chỉ dụng lên vi khuẩn Gram (+) hay nhóm thuốc tác dụng lên vi khuẩn Gram (-) như Streptomycin

- Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng rộng,chúng có tác dụng với cả vi khuẩn Gram(+), Gram (-), Rickestsia, virus cỡ lớn, đơn bào : Chloramphenicol, Tetracillin

- Nhóm kháng sinh dùng ngoài là các chất kháng sinh không hoặc ít được hấp thụ ở đường tiêu hóa Chất kháng sinh nhóm này thường độc, bao gồm các kháng sinh có tác dụng với vi khuẩn Gram (-) như: Baxitraxin, Heliomycin; tác dụng với vi khuẩn Gram (-) như: Neomycin, Polymycin

-Nhóm kháng sinh chống lao: Rifamycin

-Nhóm kháng sinh chống nấm như: Nystatin, Grycefulvin, Ampoterytin-B

- Dựa vào nguồn gốc

Kháng sinh có nguồn gốc từsinh vật, xạ khuẩn

Nhóm kháng sinh có nguồn gốc hóa dược hay do con người tổng hợp nên

- Dựa vào cơ chế tác dụng

Dựa vào cơ chế tác dụng người ta phân chia thành 2 nhóm:

Nhóm kháng sinh có tác dụng lên tế bào vi khuẩn gồm các kháng sinh:

- Kháng sinh tác dụng lên quá trình tạo vách tế bào: Penicillin và các chất thuộc nhóm ß – lactamin, Vanomycin, Baxitracin…

- Kháng sinh tác dụng lên màng tế bào Các chất này làm rối loạn tính thấm của vỏ và màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn, làm cho chức năng hàng rào

bị phá hủy,vi khuẩn bị rối loạn quá trình đồng hóa và dị hóa Do vậy mất khả năng lấy chất dinh dưỡng cần thiết và thải các sản phẩm của quá trình dị hóa ra ngoài: Colistin, Polymycin…

Nhóm kháng sinh tác dụng lên hệ phi bào làm rối loạn các hoạt động sống của tế bào trong nguyên sinh chất bao gồm:

- Kháng sinh làm rối loạn và ức chế tác dụng và tổng hợp protein của tế bào

vi khuẩn ở mức ribosome Vi khuẩn không tạo nên các chất tham gia vào quá trình phân chia, di truyền của tế bào vi khuẩn

- Kháng sinh ức chế sự tổng hợp nên các axit nucleic: ADN và ARN Các kháng sinh này rất độc, dùng để chữa ung thư, ít dùng trong thú y

- Dựa theo cấu trúc hóa học

Phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái nhìn tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh Theo đó, kháng sinh được

Các kháng sinh macrolid (erythromycin)

Các kháng sinh polyen (nystatin)

4) Các kháng sinh peptid và axit amin

Các dẫn xuất axit amin (cycloserin)

Các kháng sinh β-lactam (penicillin)

Các kháng sinh peptid (bacitracin)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Các peptid tạo kelat (bleomycin)

5) Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ

Các kháng sinh nucleozid (polyoxin)

6) Các kháng sinh dị vòng chứa oxy

Kháng sinh polyete (monenzin)

7) Kháng sinh mạch vòng no

Các dẫn chất alkan (cycloheximid)

Kháng sinh steroid (axit fuzidic)

8) Kháng sinh chứa nhân thơm

Các dẫn chất benzen (chloramphenicol)

Các chất nhân thơm ngưng tụ (griseofulvin)

9) Các kháng sinh mạch thẳng

- Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh

- Nhóm có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng lên một loại hay một nhóm

vi khuẩn nào đó: Penicillin cổ điển chỉ tác dụng lên vi khuẩn Gram (+) hay nhóm thuốc tác dụng lên vi khuẩn Gram (-) như Streptomycin

- Nhóm kháng sinh có tác dụng rộng, chúng có tác dụng với cả vi khuẩn Gram (+), Gram (-), Rickestsia, virus cỡ lớn, đơn bào: Chloramphenicol, Tetracillin

- Nhóm kháng sinh dùng ngoài là các chất kháng sinh không hoặc ít được hấp thụ ở đường tiêu hóa Chất kháng sinh này thường độc, bao gồm các kháng sinh có tác dụng với vi khuẩn Gram(-) như: Baxitraxin, Heliomycin: tác dụng với vi khuẩn Gram (-) như Neomycin, Polymycin

- Nhóm kháng sinh chống lao: Rifamycin

Nhóm kháng sinh chống nấm như: Nystatin, Frycefulvin, Ampoterytin-B

- Dựa vào nguồn gốc

- Kháng sinh có nguồn gốc từ sinh vật, xạ khuẩn

- Nhóm kháng sinh có nguồn gốc hóa dược hay do con người tổng hợp nên

- Dựa vào cơ chế tác dụng

Dựa vào cơ chế tác dụng người ta chia thành 2 nhóm:

Nhóm kháng sinh có tác dụng lên tế bào vi khuẩn gồm các kháng sinh:

- Nhóm kháng sinh tác dụng lên quá trình tạo vách tế bào: Penicillin và các chất thuộc nhóm β – lactamin, Vanomycin, Baxtracin…

- Kháng sinh tác dụng lên màng tế bào Các chất này làm rối loạn tính thấm của vỏ và màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn, làm cho chức năng hàng rào bị phá hủy, vi khuẩn bị rối loạn quá trình động hóa và dị hóa Do vậy mất khả năng lấy chất dinh dưỡng cần thiết và thải các sản phẩm của quá trình dị hóa ra ngoài: Colisstin, Polymycin…

Nhóm kháng sinh tác dụng lên hệ phi bào làm rối loạn các họat động sống của tế bào trong nguyên sinh chất bao gồm:

- Kháng sinh làm rối loạn và ức chế tác dụng tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn ở mức ribosome Vi khuẩn không tạo nên các chất tham gia vào quá trình phân chia, di truyền của tế bào vi khuẩn

- Kháng sinh ức chế sự tổng hợp nên các acid nucleic: DNA và RNA Các kháng sinh này rất động, cùng để chữa ung thư, ít dùng trong thú y

- Dựa vào mức độ tác dụng

Kháng sinh diệt khuẩn là những kháng sinh có cơ chế tác dụng đến khả năng tạo vách tế bào, sinh tổng hợp ADN và ARN, giải phòng men autolyza, vi khuẩn tự phân giải như: nhóm Lactamin gồm các loại Penicillin và các chất kháng sinh thuộc nhóm Stephalosporin, nhóm Aminoglucozid (Streptomycin, Neomycin, Canamycin, Gentamycin, Framonomycin), nhóm đa peptid: Colistin, Bacitracin, Vanomycin Chất kháng sinh kìm khuẩn gồm các chất ức chế sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gắn các emzyme hay các ribosome 30S, 50S, và 70S như: Slphamid Teracillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Novobiocin, các chất kháng sinh được phối hợp giữa Sulphamid với Trimethorpim theo tỉ lệ 5/1 và Tiamulin

- Cơ chế tác dụng của kháng sinh

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh Chúng liên kết vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đổi chất.Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết Nhìn chung, có thể phân chia cơ chế tác dụng của kháng sinh theo các nhóm kháng sinh như bảng 1:

Bảng 1 Cơ chế tác dụng của các kháng sinh

Nơi tác dụng Kháng sinh Quá trình bị ngăn cản Loại tác dụng Thành tế bào Bacitracin

Các cephalosporin Các penicillin Cycloserin Vancomycin

Tổng hợp mucopeptid Thành tế bào

Thành tế bào Tổng hợp peptid của thành

tế bào Tổng hợp mucopeptid

Nystatin Polymycin

Chức năng của màng Chức năng của màng Tương tác của màng

Diệt nấm

- Diệt khuẩn Các Ribosom Chloramphenicol Tổng hợp protein Kháng khuẩn Tiểu phân 50S Erythromycin Tổng hợp protein Kháng khuẩn Tiểu phân 30S Các aminoglycosid

Các tetracyclin

Tổng hợp protein và làm sai lệch quá trình này Tổng hợp protein

Diệt khuẩn

Kháng khuẩn Các axit

nucleic

Actinomicin Griseofulvin

Tổng hợp ADN và m.ARN Phân chia tế bào

Diệt khuẩn

Kháng nấm ADN hoặc

ARN

Mitomycinl Rifampin

Tổng hợp ADN Tổng hợp mARN

Diệt nấm Diệt khuẩn 1.1.4.Các kháng sinh nhóm β – lactam

A Định nghĩa

Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin

B Cấu trúc và phân loại

* Các penicillin

Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β- Lactam

Hinh 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: ( 2S, 5R, 6R,

3,3-dinethyl-7-7oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid) khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có caassu hình 2S, 5R, 6R ta

có các penicilin có dộ bền, được động học và phổ kháng khuẩn khác nhau Với M là gốc cation thường là K,Na,H

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau Một số kháng sinh nhóm penicillin như:

Kháng sinh Ampicilin: làkháng sinh phổ rộng thuộc nhóm β -lactam, tức là nhóm kháng sinh có cấu trúc phân tử gồm khung β –lactam,có hoạt phổ rộng với nhiều chủng vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-) Ampicillin có tác dụng chống lại những vi khuẩnmẫn cảm gây nhiễm khuẩn đường hô hấp, dẫn mật, tiêu hoá, tiết niệu, một sốbệnh ngoài da như viêm bì có mủ, áp -xe, đầu đinh viêm tai giữa, bàng quang và thận

CTPT: C16H19N3O4S

CTCT: (2S,5R,6R)-6-([(2R)-2-amino-2-phenylacetyl]amino) 4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2- carboxylic acid

-3,3-dimethyl-7-oxo-KHÓA LUẬN TỐT NGHI

t các loại vi khuẩn gram dương nhưviêm họng, da t

m trùng da, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm phổi

{[(2R)-2-amino- 2-(4-hydroxyphenyl)- acetyl]amino} 1-azabicyclo[3.2.0]heptane- 24-carboxylic acid

CTHH:

4 Công thức cấu tạo kháng sinh Amoxycilin

Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 c

ng cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R Khác nhau b

Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

C MỞ HÀ NỘI

Page 12

penicilin, nó ngăn , da tấy mũ hay

acetyl]amino}- carboxylic acid

3,3-Lactam 4 cạnh gắn với

u hình 6R, 7R Khác nhau bởi các gốc

o các kháng sinh cephalosporin

Tên gọi chung của các cephalosporinkhi chưa có gốc R là: azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid

(6R,7R)8-oxo-5-thia-1-Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R,7R được các

cephalosporin có độ bền, tính khang khuẩn và dược độc khác nhau

Dựa vào phổ kháng khuẩn, chia cephalosporin thành 4 thế hệ Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau

C .Tính chất vật lý và hoá học của β-lactam

Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm – COOH và –NH2

Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ)

Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2,5-2,8 tùy vào cấu trúc phân

tử Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử,

mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng

Cơ chế:

Các penicilin có khả năng acyl hóa các D-alanin tranpeptidase, làm chi quá trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện.Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngưng lại Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-) Mặc khác, các penicillin có hoạt hóa enzyme

tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi khuẩn

bị tiêu diệt Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn Các kháng sinh β-lactam có hoạt động phổ rộng

Kháng thuốc:

Vi khuẩn sinh ra các β-lactam, là enzyme có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào các nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gian tiếp ( được gọi

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Vi khuẩn thường phát triển kháng thuốc kháng sinh lactam bằng cách tổng hợp lactamase , một enzyme tấn công vòng β-lactam Để khắc phục sự đề kháng này, thuốc kháng sinh β-lactam thường được dùng với các chất ức chế β-

β-lactamase nhưclavulanic acid

1.2 Đại cương về xạ khuẩn

1.2.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm Tên xạ khuẩn là actinomycete, bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) Ban đầu

xạ khuẩn được coi là nấm nhỏ vì chúng sinh trưởng giống với nấm

Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn Gram (+) và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật và vi khuẩn nhân sơ Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chị còn lại được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm [22] [26]

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25-0oC Tuy nhiên, nhiệt độtối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường chỉ nằm trong khoảng 18-28oC.Độ ẩm thích hợp đối với xạ khuẩn dao động trong khoảng 40 - 50%, giới hạn pH trong khoảng 6.8 – 7.5 Xạ khuẩn không có giới tính[22] Xạ khuẩn có khả năng hình thành enzyme và các chất kháng sinh nên được ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực của đời sống

1.2.2.Cấu tạo xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram (+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân

+ Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60 ÷ 120 Å, khi già có thể đạt tới 150 ÷ 200Å, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50Å, lớp trong dày khoảng 50Å Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptitbao gồm các gốc N -axetyl glucozamin liên kết với N-axetyl

muramic Khi xử lý bằng lysozym, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este - clorofom và các dung môi hoà tan lipit khác Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit (thành HSKS có nhiều lipit hơn so với HSCC) khác với nấm Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenlulozơ và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào

+ Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính

- Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L

- ADP) và glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm này

- Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic (m - ADP) và glyxin

- Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso 2,6 diaminopimelic

Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic, arabinozơ và galactozơ

+Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn + Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryot

ở chỗ chúng có tỷ lệ G-C rất cao trong ADN, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 ÷ 45%

Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram (+) nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể (NST) còn có các yếu tố di truyền ngoài NST, chúng có thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như: có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gen, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn…Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau

Hình1.6 Khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử xạ khuẩn

(từ trái sang phải)

1.2.3 Sự hình thành chất kháng sinh trong xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh.Trong số 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới có trên 80% là

có nguồn gốc từ xạ khuẩn [22] Một trong những tính chất của các chất kháng sinh

có nguồn gốc từ vi sinh vật nói chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc Mỗi chất kháng sinh chỉ có tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định Hầu hết chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng.Khả năng kháng khuẩn của các chất kháng sinh là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh, nhưng có hai giả thuyết được ủng hộ hơn cả là:

• Việc tổng hợp chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục

bộ đó

• Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng sống sót cao của chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là các loài có bào tử Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh

ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định

Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất như Chloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm nucleoside.Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau như lincomycin, novobiocin Chất kháng sinh được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất trao đổi bậc một, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chất kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn

- Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình thành chất kháng sinh Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đường là khác nhau, có chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucozơ, mannozơ, fructozơ có chủng sử dụng tốt loại đường đôi như saccarozơ, maltozơ Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại axit hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh chất kháng sinh

- Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ thực vật như: bột đậu tương, cao ngô Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên lượng phốt phát vô cơ trong cao ngô cao sẽ ức chế sinh tổng hợp chất kháng sinh.Nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là muối amon Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp chất kháng sinh của nhiều chủng xạ khuẩn

- Ảnh hưởng của pH

Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym và tác động gián tiếp qua môi trường pH thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

sinhthường là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp chất kháng sinh

- Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp chất kháng sinh của xạ khuẩn Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 ÷ 300C, nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng và tổng hợp chất kháng sinh thường chỉ nằm trong khoảng 18 ÷ 280C

- Ảnh hưởng của các yếu tố vi lượng

Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men Nếu môi trường lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng đã

có sẵn Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp chất kháng sinh của nhiều chủng xạ khuẩn

1.2.5.Đặc điểm vềStreptomyces clavuligerus

Streptomyces là vi khuẩn Gram dương Vi khuẩn này được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả từ sản sinh geosmin trong quá trình chuyển hóa các chất Streptomyces

khuẩn (Actinomyces) Streptomyces thường sống ở đất có vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng Chủng vi sinh này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế

tên năm 1943 Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Các đại diện này có HSKS và HSCC phát triển theo hướng phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩn dài 1 – 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn và có đường kính khoảng 1 – 5mm Khuẩn lạc có cấu trúc chắc, dạng màng mọc đâm sâu vào cơ chất Bề mặt xạ khuẩn thường được phủ bằng KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kị nước

sinh thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có nhiều dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng xoắn, có móc, vòng,…

Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng 2 phương pháp: phân đoạn và cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với

đường kính khoảng 1,5 µm Màng tế bào có thể nhẵn, gai khối u, nếp nhăn… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy

đặc điểm rất rõ Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sinh khí cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau

Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn gram

(+), hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 300C, pH tối

ưu 6,5 – 8,0 Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh

Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi và các tế bào ung thư, virus và động vật nguyên sinh

Các kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn có tính phổ kháng khá rộng.Là kháng sinh có tính chất chọn lọc

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời 2 hay nhiều chất kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều chỉnh đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp kháng sinh, còn có các enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất và cofactor

Streptomyces clavuligerus(S.clavuligerus)là một loài vi khuẩn Gram dương được dùng để sản xuất acid clavulanic

S.clavuligerus ATCC 27064 (NRRL 3585, DSM 738) đã được phát hiện lần đầu tiên bởi Higgens và Kastner, nó được phân lập từ một mẫu đất Nam Mỹ Tên của nó là hình dạng của chi nhánh sợi nấm bào tử : từ tiếng Latinh, clavula

S.clavuligerus bào tử có màu xám đến xám xanh

S.clavuligerus sản xuất hơn 20 chất chuyển hóa thứ cấp, trong đó có nhiều loại thuốc kháng sinh β − lactam như acid clavulanic, cephamycin C, deacetoxycephalosporin C, penicillin N (chất trung gian trong cephamycin C đường), và ít nhất bốn clavams khác kháng sinh Non-β-lactam bao gồm holomycin

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

và một kháng sinh phức tạp, MM 19.290, liên quan đến tunicamycin; mộtβ
lactamase ức chế protein cũng đã được biết đến

Một đặc điểm quan trọng của S clavuligerus là nó không có khả năng sử

dụng glucose như một nguồn carbon vì nó thiếu một hệ thống vận chuyển glucose

Hình 1.7 Hình ảnh về chủng xạ khuẩn S.clavuligerus và khuẩn ty

1.2.6 Giới thiệu về axit clavulanic

- Giới thiệu

Axit clavulanic có tên bắt nguồn từ nguồn gốc từ chủng S clavuligerus

Axit clavulanic được phát hiện khoảng 1974-1975 bởi nhà khoa học người Anh đơn xin cấp bằng sáng chế Mỹ bảo vệ cho thuốc vào năm 1981, và được cấp bằng sang chế Mỹ 4.525.352, 4.529.720, 4.560.552 và đã được cấp trong năm 1985

Axit clavulanic được tổng hợp từ axit amin arginine và đường glyxeral dehyde- 3 - phosphate

Axit clavulanic là kháng sinh thuộc nhóm β-lactam có chức năng như một cơ chế dựa vào chất ức chế β-lactamase

Axit clavulanic kết hợp với nhóm thuốc kháng sinh pencillin, nó có thể vượt qua kháng kháng sinh trong vi khuẩn tiết ra β-lactamase ,mà không làm bất hoạt penicillin

- Cấu trúc của axit clavulanic

Công thức phân tử: C8H9NO5

Tên thương mại: CA

Tên IUPAC : (2R,5R,Z)

aza- bicyclo (3.2.0)heptane

Khối lượng phân t

và Staphylococcus sinh ra

Bản thân acid clavulanic có tác d

a enzyme Điều này bảo vệ kháng sinh β -lactam khác tlactamase xúc tác, qua đó tăng cường tác dụng kháng khuẩn Cơ ch

p với thuốc kháng sinh dễ bị β -lactamase, như nicillin và cephalosporin, để điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn sản xu

lên men của S.clavuligerus có cấu trúc β - lactam

ức chế beta - lactamase do phần lớn các vi khusinh ra

n thân acid clavulanic có tác dụng kháng khuẩn rất yếu

ề Clavulanic acid nước ngoài

4 OXA

-1-β-lactam (

t enzym

β-lactamase phân lập lactam và liên kết

a nó, do đó cản trở lactam khác từ β -

ơ chế này lactamase, như

n xuất β lactam gần giống

-n các vi khuẩ-n gram âm

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

Clavulanic acid lần đầu tiên được tinh chế như một chất ức chế β –

lactamase từ Streptomyces clavuligerus ATTCC27.064, được phân lập từ đất

Nam Mỹ năm 1971( Higgens và Kastner, 1971; Brown et al, 1976)

Con đường sinh tổng hợp Clavulanic acid (Kanehisa và Goto,2000;

Lynch và Yang,2004;Kanehisa et al, 2016)

Hợp chất này lần đầu tiên được thu hồi từ quá trình lên men, mà còn là một trong những chiến lược thường xuyên nhất được sử dụng để sản xuất các

loại thuốc quan trọng và trung gian của họ để sử dụng làm thuốc.để tạo

thuận lợi cho sản xuất cao hơn các hợp chất có giá trị ,công nghệ lên men đã được phát triển, trong đó bao gồm hệ thống lên men fed-batch(Thiry vad

Cingolani,2002;Schmidl,2005)

Các nghiên cứu về Clavulanic acid trong nước

Nước ta đã nghiên cứu sử dụngClavulanic acid được tách chiết từ chủng xạ khuẩn

S.clavuligerus để kết hợp với kháng sinhAmoxicillin làm tăng khả năng hoạt động của kháng sinh

1.3 Đột biến tăng khả năng sinh kháng sinh ở vi sinh vật

1.3.1.Khái niệm đột biến

Đột biến là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền ở cấp độ phân

tử (DNA, gen) hoặc cấp độ phân tử ( nhiễm sắc thể), dẫn đến sự biến đổi đột ngột của một hoặc một số tính trạng, những biến đổi này có tính bền vững và có thể di truyền qua các đời sau Đột biến là những biến đổi đột ngột, riêng rẽ,ngẫu nhiên, không định hướng ở cơ thể sống trong điều kiện tự nhiên Đa số là đột biến gen lặn

và có hại, một số ít có lợi và có ý nghĩa cho quá trình tiến hóa và chọn giống.Những

cá thể mang đột biến đã biểu hiện trên kiểu hình của cơ thể gọi là thể đột biến 1.3.2 Mục đích

Trong thực tế không thể phân lập được từ tự nhiên một chủng vi sinh vật có khả năng tạo chất kháng sinh mong muốn với hàm lượng đủ để thỏa mãn yêu cầu của sản xuất công nghiệp Các chủng nguyên thủy sau phân lập thường sinh chất kháng sinh có hoạt tính thấp, đồng thời trong quá trình nuôi cấy hoạt tính của chúng thường giảm dần do hiện tượng thoái hóa giống Vì vậy, đột biếncải tạo giống vi