Nghiên cứu tạo chủng đột biến STREPTOMYCES CLAVULIGERUS bằng hóa chất MNNG tăng hiệu suất sinh tổng hợp axit CLAVULANIC

Hiện nay sử dụng các chất ức chế β-lactamase kết hợp với kháng sinh β-lactam được coi là biện pháp hiệu quả chống lại cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn.. Mặc dù không tác dụng như một khán

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -





 -

BÁO CÁO KHOA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô TS.Tạ Thị Thu Thủy người

đã định hướng nghiên cứu, tận tình giúp đỡ chúng em trong quá trình thực hiện đề tài

Chúng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới cô Nguyễn Thị Phương Thảo cùng toàn thể các thầy cô giáo Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử - Khoa Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tận tìnhgiúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng em hoàn thành đề tài này

Qua đây, chúng em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, cùng toàn thể các bạn Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã động viên và giúp đỡ chúng em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài này

Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân đã có nhiều cố gắng, nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nên chúng em rất mong nhận được những sự góp ý của quý thầy – cô cũng như các bạn trong lĩnh vực nghiên cứu

Chúng em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 17 tháng5 năm 2017 Sinh viên

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

D Đường kính trung bình vòng vô khuẩn tính theo

milimet

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1-TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về kháng sinh 2

1.1.1.Lịch sử về nghiên cứu kháng sinh 2

1.1.2 Khái niệm về kháng sinh 5

1.1.3Phân loại kháng sinh 6

1.1.4.Cơ chế tác dụng của kháng sinh 7

1.1.5 Kháng sinh nhóm β – Lactam 8

1.2 Đại cương về xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus 12

1.2.1 Các đặc điểm chung ,cấu trúc của xạ khuẩn trong tự nhiên 12

1.2.2 Xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus 13

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn 14

1.2.4 Các nghiên cứu trong nước và quốc tế về chủng Streptomyces clavuligerus 15

1.3 Axit clavulanic 15

1.4 Các phương pháp đột biến ở vi sinh vật 18

1.4.1 M ục đích 18

1.4.2 Đột biến tạo bằng các tác nhân vật lý 18

1.4.3 Đột biến nhân tạo bằng tác nhân hóa học 19

1.5 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài 19

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.1 Các chủng vi sinh vật 22

a Ch ủng xạ khuẩn 22

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 22

2.1.3 Môi trường nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy các chủng vi sinh vật 25

2.2.2 Phương pháp bảo quản giống 27

2.2.3 Phương pháp gây đột biến xạ khuẩn bằng hóa chất MNNG 28

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính axit 30

2.2.5 Xác định tỷ lệ sống sót 30

2.2.6 Sàng lọc sau đột biến 31

2.2.7 Phương pháp tách chiết axit clavulanic thô 31

Nguyên tắc: 31

2.2.8 Ph ương pháp sắc kí lớp mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC) 32

PHẦN 3: KẾT QUẢ 33

3.1 Khả năng ức chế β-lactamase của chủng S clavuligerus tự nhiên 33

3.2 Kết quả nghiên cứu đột biến hóa chất MNNG 35

3.2.1 Kết quả nồng độ hóa chất MNNG tạo đột biến 35

3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian gây đột biến MNNG 36

3.2.3 Phương pháp xác định pH gây đột biến 37

3.3 Kết quả sàng lọc sau đột biến 38

3.4 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp acid của chủng đột biến 39

3.4.1.Ảnh hưởng của hàm lượng cacbonhydrat đến khả năng sinh trưởng và sinh kháng sinh 39

3.4.2.Ảnh hưởng của hàm lượng nito đến khả năng sinh trưởng và sinh kháng sinh 42

3.4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng K2HPO4 43

3.5 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 44

3.5.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 44

3.5.2 Ảnh hưởng của pH 45

3.5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 46

3.6 Quy trình tách và thu nhận axit quy mô thí nghiệm 47

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Khả năng ứng dụng kết quả nghiên cứu của đề tài 48

4.3 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

A TÀI LIỆU TIẾNG ANH 49

B: TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 51

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin 10

Bảng 1.2 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu 11

Bảng 2.1 Dụng cụ, thiết bị dùng trong đề tài 23

Bảng 2.2 Thành phần trong 1000ml ( 1 lít) môi trường chuẩn gồm: 24

Bảng 2.3 Môi trường LB đặc có thành phần như sau: 24

Bảng 2.4 Thành phần trong 1000 ml (1lít) môi trường NDYE gồm: 25

Bảng 3.1 Thử các nồng độ kháng sinh 33

Bảng 3.2 Khả năng ức chế β-lactamase của CLA 34

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ MNNG đến khả năng sinh axit của chủng xạ khuẩnS clavuligerus 36

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian gây đột 37

Bảng 3.5 Ảnh hưởng pH đếnsinhaxit của chủng xạ khuẩnS.clavuligerus 37

Bảng 3.6 thử hoạt tính axit của các chủng sau đột biến 38

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nguồn cacbonhydrat đếnkhả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S.clavuligerusđột biến 40

Bảng 3.8 : Ảnh hưởng của hàm lượng Glycerol đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 41

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nguồn nito đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 42

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của các nguồn nito đến khả năng sinh trưởng và sinh kháng sinh 43

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum và bào tử của chúng 3

Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 7

Hình 1.3 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin 9

Hình 1.4 Công thức hóa học: 10

Hình 1.5 Công thức hóa học ampicilin 11

Hình 1.6 Xạ khuẩn S.clavuligerus trên đĩa thạch 14

S.clavuligerus soi trên kính hiền vi 100X 14

Hình 1.7 Công thức phân tử axit clavulanic 16

Hình 1.8 Các chất trung gian của quá trình tổng hợp axit clavulanic 18

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của MNNG,[36] 28

Hình 3.1 Thử hoạt tính kháng sinh Amox 34

Hình 3.2 Kết quả thử hoạt tính Amox khi bổ sung thêm axit clavulanic 35

Hình 3.5 Chủng xạ khuẩn S.clavuligerus đột biến cấy trang 38

Hình3.6 Đĩa thử hoạt tính AC của chủng S.clavuligerus đột biến và chủng tự nhiên 39

Hình 3.7 Ảnh hưởng của các nguồn glycerol đến khả năng sinh trưởng S.clvuligerus 41

Hình 3.8 Ảnh hưởng của các nguồn pepton đến khả năng sinh trưởng S.clvuligerus 43

Hình 3.10 Ảnh hưởng của các nguồn K2HPO4 đến khả năng sinh trưởng S.clvuligerus 44

Hình 3.11.Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus đột biến 45

Hình 3.12 Biểu đồ ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus đột biến 46

Hình 3.13 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus đột biến 46

MỞ ĐẦU

Hiện nay kháng kháng sinh đang là vấn đề mang tính toàn cầu và đặt biệt nổi trội ở các nước đang phát triển với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và mất nhiều chi phí cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới.Các bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, đường hô hấp và bệnh nhiễm khuẩn là nguyên nhân hàng đầu có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao ở các nước phát triển.Theo khảo sát

của BV Bạch Mai tại các tỉnh phía Nam, tỉ lệ E coli (vi khuẩn đường ruột) kháng kháng sinh lên tới 74,6%; tỉ lệ kháng của vi khuẩn gây nhiễm trùng K pneumoniae lên tới gần 60%; vi khuẩnA.baumannii có tỉ lệ kháng với hầu hết các loại kháng

sinh ở mức trên 90% [1]

Với nhóm kháng sinh penicillin và cephalosporin là nhóm kháng sinh mạnh nhất hiện nay cũng bị một số vi khuẩn kháng lại ,đặc biệt là các vi khuẩn gram âm mang gene kháng thuốc như β-lactamase Các β-lactamase là enzyme được sinh ra bởi các vi khuẩn gram âm và gram dương, chúng xúc tác sự mở vòng của cầu nối β-lactam làm cho các kháng sinh β-lactam mất hiệu lực Hiện nay sử dụng các chất

ức chế β-lactamase kết hợp với kháng sinh β-lactam được coi là biện pháp hiệu quả chống lại cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn Các chế phẩm phối hợp kháng sinh β-lactam và chất ức chế β-lactamase được sử dụng rộng rãi bao gồm amoxicillin/axit clavulanic, ticarcilin/axit clavulanic, ampicilin/sulbbactam

Axit clavulanic là một chất có chứa vòng β-lactam trong cấu trúc có khả năng ức chế β-lactamase Mặc dù không tác dụng như một kháng sinh nhưng khi kết hợp với kháng sinh nhóm penicillin nó có khả năng tiêu diệt được các vi khuẩn tiết enzyme β-lactamase làm tăng phổ kháng khuẩn của kháng sinh Axit clavulanic được sinh tổng hợp từ chủng Streptomyces clavuligerusđang được quan tâm và nghiên cứu của rất nhiều nước trên thế giới trong đó có cả Việt Nam Tuy vậy

chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus tự nhiên này sinh tổng hợp axit

clavulanic chưa cao, rất cần có biện pháp cải thiện năng suất nhằm thu được hàm lượng axit cao hơn Vì vậy em thực hiện đề tài : “ Nghiên cứu tạo chủng đột biến bằng hóa chất MNNG nhằm tăng hiệu suất sinh tổng hợp và thu nhận axit

clavulanic từ xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus.”

PHẦN 1-TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh

1.1.1.Lịch sử về nghiên cứu kháng sinh

 Nghiên cứu kháng sinh trên Thế giới

Kháng sinh còn được gọi là Trụ sinh là những chất được chiết xuất từ các vi sinh vật, nấm, được tổng hợp hoặc bán tổng hợp, có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu Nó có tác dụng lên vi khuẩn

ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn

Trước đầu thế kỷ 20, các cách trị nhiễm trùng chủ yếu dựa trên các phương pháp y học dân gian.Các hỗn hợp với các đặc tính kháng khuẩn đã được sử dụng trong điều trị nhiễm khuẩn đã được phát hiện cách đây hơn 2000 năm.Nhiều nền văn hóa cổ, bao gồm Hy Lạp cổ đại và Ai Cập cổ đại sử dụng nấm mốc được chọn lọc đặc biệt và nguyên liệu thực vật và chiết xuất để trị nhiễm khuẩn Các quan sát gần đây hơn được thực hiện trong phòng thí nghiệm về kháng sinh giữa các vi sinh vật đã đưa đến những phát hiện về các khánh sinh tự nhiên được tạo ra từ vi sinh vật Louis Pasteurnhận xét, "nếu chúng ta có thể can thiệp vào sự đối lập giữa các vi khuẩn được quan sát, có thể sẽ có nhiều hi vọng lớn trong các phương pháp điều trị"

Năm 1895, Vincenzo Tiberio, nhà vật lý học ở đại học Naples đã phát hiện

rằng một loại nấm mốc (Penicillium) trong nước có hoạt động kháng khuẩn tốt Sau

khi hợp chất hóa trị ban đầu tỏ ra có hiệu quả, những hợp chất khác cũng được theo đuổi cùng dòng điều trị, nhưng nó không được thực hiện cho đến năm 1928, khi Alexander Fleming quan sát kháng sinh chống lại vi khuẩn từ một loài nấm

trong chi Penicillium Fleming công nhận ảnh hưởng gián tiếp từ một hợp chất

kháng sinh có tên là penicillin, và các tính chất kháng sinh của nó có thể được khai thác cho phương pháp hóa trị Ban đầu ông ta miêu tả một số đặc tính sinh học của nó,và cố gắng sử dụng các điều chế thô để trị một số trường hợp nhiễm khuẩn

Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum và bào tử của chúng

do bộ phận sinh sản của loài nấm mốc đó có hình dạng giống cái bút lông

Năm 1938, Fleming nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford

là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được hợp tác với ông

để tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về Penicillin và họ đã thử nghiệm thành

công Penicillin trên chuột vào năm 1940

Năm 1944,nhóm đã chọn được loại nấm sinhPenicillin ưu việt nhất là chủng

Penicillin do Flemming tìm thấy lần đầu năm 1928

Năm 1945,Fleming được giải thưởng Nobel về y học cùng Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey

Cùng với việc phát hiện ra Penicilin,thập kỉ 40,50 của thế kỉ XX cũng ghi

nhận những bước tiến vượt bậc trong việc khám phá ra hàng loạt chất kháng sinh (CKS) mới có giá trị trong y học như:Sulfonamid (Gerhard Domard, 1932), Streptomycin(Selman Waksman và Albert Schat,1944), Cloramphenicol(Erhlich,1947), Chlotetraxyclin (Dugar,1948),…

Tốc độ tìm kiếm các CKS ngày càng được đẩy mạnh.Nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện hàng loạt CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn.Năm 1945 phát hiệnđược 30 CKS, năm 1949 con số này là 150 CKS, năm 1953 xấp xỉ 450 CKS, năm 1980 có 5.500 chất và đến nay số lượng CKS được phát hiện lên tới

17.000 chất và khoảng 30.000 CKS bán tổng hợp,[2],[7].Tuy nhiên, trong số đó chi

có 1÷2% CKS là có đủ tiêu chuẩn để được sử dụng trong y học

Năm 1999, kháng sinh Lospomal HA – 92 được tách chiết từ xạ khuẩn

đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh

Tại Nhật Bản, năm 2003, Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces

sp TP – A0356 bằng phương pháp sắc ký cột CKS này có khả năng kìm hãm sự

phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans Chất này còn có khả năng

chống lại các tế bào ung thư, có giá trị MIC là 0,01÷ 0,3 mg/ml

Tại Hàn Quốc, năm 2007, phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp C684 sinh

CKS Laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng Methicillin và các cầu khuẩn kháng Vancomycin

Năm 2002, tại Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp 201 có khả năng

sinh CKS mới là 2 - methylheptyl isonicotinate, CKS này có khả năng kháng được

nhiều loại nấm gây bệnh như Furasium oxysporum, F Solina,

 Nghiên cứu kháng sinh tại Việt Nam

Ở Việt Nam, người đầu tiên nghiên cứu CKS là giáo sư Đặng Văn Ngữ Ông

đã lấy dịch nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum và xạ khuẩn Streptomycesgrieus

để điều trị vết thương cho thương binh trong chiến dịch Đông Xuân 1951-1952, kháng chiến chống Pháp

Năm 1968, bộ môn công nghiệp Dược (trường Đại học Dược Hà Nội) được thành lập và đào tạo cán bộ chuyên khoa kháng sinh chuẩn bị cho công nghiệp kháng sinh Năm 1970, đơn vị nàybắt đầu nghiên cứu chuyên đề kháng sinh do GS Trương Công Quyền phụ trách.Tại đâyđã phân lập được hàng nghìn chủng xạ khuẩn

từ các mẫu đất khác nhau.Đáng chú ý là đã tuyển chọn được một chủng có khả năng chống vi khuẩn Gram (-), có hiệu quả tốt đối với vi khuẩn gây bệnh mủ xanh

(Pseudomonas aeruginosa) Kháng sinh này lấy tên là Dekamycin và sau này được

xác định là Neomycin

Từ năm 1974,tại Viện Khoa học Việt Nam (nay là Viện Khoa học và Công

có hoạt tính mạnh đã được ứng dụng trong bảo vệ thực vật.Một số chế phẩm kháng sinh như: Tetravit, Biovit, Baxitraxin…đã được sản xuất và đưa vào sử dụng trong chăn nuôi.Sau đó Việt Nam được nhiều đối tác nước ngoài như Liên Xô (cũ), Trung Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác và giúp sản xuất điều chế kháng sinh song cũng không thành công do nhiều nguyên nhân

Từ năm 1985 – 1990, một chương trình nghiên cứu cấp Nhà nước vềsản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin nhưng kết quả đạt được không cao về công nghệ lẫn hiệu suất

Từ năm 2000 đến nay, ở nước ta cũng có một số nhóm đã và đang tham gia nghiên cứu về kháng sinh và thu được một số kết quả như: nghiên cứu tối ưu điều

kiện lên men và môi trường sản xuất kháng sinhVancomycin từ chủngStreptomyces

(2006); nghiên cứu quy trình tách chiết, tinh chế Doxorubicin (DXR)từ xạ khuẩn làm nguyên liệu điều chế thuốc điều trị ung thư và hệ bạch huyết

Ở Việt Nam cũng sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật nhập khẩu từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ

khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F oxysporum

gâybệnh thối rễ ở thực vật Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định

1.1.2 Khái niệm về kháng sinh

Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được thay đổi: “Kháng sinh là tất cả các

h ợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp với nồng độ rất thấp có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng

th ời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên con người, động vật và thực vật bằng

con đường cung cấp chung”[2]

Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml dung dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một thể tích môi trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định trong thời

gian xác định[3] Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6 µg, còn 1 UI streptomycin = 1,0 µg (Hopwood, 2007)

1.1.3Phân loại kháng sinh

Việc phân loại nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục các CKS do việc tìm ra các CKS ngày càng nhiều Nhờ đó tiết kiệm thời gian khi nghiên cứu các CKS mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác dụng và khả năng ứng dụng trong công tác chữa bệnh

Có thể phân loại kháng sinh dựa trên nhiều phương diện như phổ tác dụng,

cơ chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay cấu trúc hóa học Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái

nhìn tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh

Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính [3]:

- Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate

- Nhóm 2: Các lactone macrolide

- Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dẫn xuất

- Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid

- Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ

- Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy

- Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no

- Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm

- Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng

1.1.4.Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

 Ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào của vi khuẩn

- Các β-Lactam ngăn cản sự tổng hợp các mucopeptide, làm rối loạn quá trình nhân lên của vi khuẩn Khi có mặt kháng sinh, vi khuẩn có thể vẫn tiếp tục nhân lên với vách không hoàn chỉnh hoặc không có vách nhưng chúng dễ bị tiêu diệt bởi thực bào, nhân tố lý hóa học

- Xycloserin tác động bằng cách ngăn cản tập hợp các tetra và pentapeptide do

ức chế enzym tổng hợp D-alanin

- Bacitracin: thay đổi tính thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên tương của vi khuẩn

 Ức chế chức năng của màng tế bào

- Thay đổi chức năng năng lượng, ảnh hưởng sự hô hấp tế bào: gramicidin, sideromycin

- Kháng sinh gắn lên màng tế bào chất làm thay đổi cân bằng thẩm thấu của màng tế bào như kháng sinh polypeptide: polymycin, colistin và kháng sinh chống nấm nistatin

 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

- Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome, ngăn cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường, can thiệp tiếp cận tRNA làm cho quá trình dịch mã không chính xác

- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide mới thành lập

- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi polypeptide

 Ức chế quá trình tổng hợp nucleic acid

- Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin)

- Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm cho hai mạchđơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA

- Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (paminobenzonic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleic acid

- Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác có quá trình tạo nhân purine làm ức chế quá trình tạo nucleic acid

 Ức chế quá trình trao đổi chất folate

Folic acid là cơ sở cho sự tổng hợp methionine, purine và pyrimidine, từ đó tổng hợp nên protein và các acid nucleic của vi khuẩn Sulfamid và trimethoprim có cấu trúc hoá học tương tự p-aminobenzoic acid (PABA) và folic acid Khi sử dụng, sulfamid đối kháng cạnh tranh với PABA một tiền chất để tổng hợp folic acid, sẽ gây thiếu purine, nucleic acid Trimethoprim ức chế dihydrofolate reductase ngăn quá trình chuyển hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động của folic acid), làm cho sự hoạt động của tế bào bị rối loạn

1.1.5Kháng sinh nhóm β – Lactam

Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ

biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin

a C ấu trúc và phân loại

 Các penicillin

Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β- Lactam

Hình 1.3 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: ( 2S, 5R,

thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có caassu hình 2S, 5R, 6R

ta có các penicilin có dộ bền, được động học và phổ kháng khuẩn khác nhau Với M

là gốc cation thường là K,Na,H

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau

I Kháng penicelliiase, không tác động vào vòng β-lactam được

Amoxycillin hoặc moxicillin hay được gọi tắt là amox, là thuốc kháng sinh

cùng họ với penicilin thuộc nhóm kháng sinh β- lactam , nó ngăn chặn và diệt các

loại vi khuẩn gram dương như viêm họng, da tấy mũ hay nhiễm trùng da, nhiễm

trùng đường tiết niệu, viêm phổi…

Hình 1.4Công thức hóa học:

Công thức phân tử:C16H19N3O5S

 Ampicillin

Ampicillin là kháng sinh phổ rộng thuộc nhóm β- lactam , tức là nhóm kháng sinh

có cấu trúc phân tử gồm khung β- lactam

Ampicillin thực chất là một penicillin bán tổng hợp nhóm A có phổ tác dụng

rộng với nhiều chủng vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-) Ampicillin có tác

dụng chống lại những vi khuẩn mẫn cảm gây nhiễm khuẩn đường hô hấp, dẫn mật, tiêu hoá, tiết niệu, một số bệnh ngoài da như viêm bì có mủ, áp -xe, đầu

đinh viêm tai giữa, bàng quang và thận

Ampicilin là một kháng sinh tương tự penicilin tác động vào quá trình nhân lên của vi khuẩn, ức chế sự tổng hợp mucopeptid của thành tế bào vi khuẩn nhưng không có khả năng kháng β- lactamase

Hình 1.5 Công thức hóa học ampicilin

Công thức phân tử:C16H19N3O4S

b Tính chất vật lý và hoá học của β-lactam

Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm – COOH và –NH2 Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ)

Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2,5-2,8 tùy vào cấu trúc phân tử Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân

tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng

Tên kháng

sinh

pKa1 Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1

Các penicilin có khả năng acyl hóa các D-alanin tranpeptidase, làm chi quá trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện.Sinh tổng hợp vách tế bào bị ngưng lại Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-) Mặc khác, các penicillin có hoạt hóa enzyme tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là

vi khuẩn bị tiêu diệt Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn Các kháng sinh β-lactam

có hoạt động phổ rộng

 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn sinh β-lactamase

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzyme có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào các nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gian tiếp ( được

gọi là methicilllin)

Vi khuẩn thường phát triển kháng thuốc kháng sinh β-lactam bằng cách tổng hợp β-lactamase , một enzyme tấn công vòng β-lactam Để khắc phục sự đề kháng này, thuốc kháng sinh β-lactam thường được dùng với các chất ức chế β-lactamase như axit clavulanic

1.2 Đại cương về xạ khuẩnStreptomyces clavuligerus

1.2.1 Các đặc điểm chung ,cấu trúc của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn là một nhóm VSV rất đa dạng trong đó đa sốsinh trưởng hiếu khí

và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tựnhưnấm Xạ khuẩn có danh pháp khoa học là: Actinobacteria, tên tiếng Anh là: Actinomycetes - bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp

“actys” (tia) và “mykes” (nấm) Ban đầu xạkhuẩn được coi là nấm nhỏvì chúng sinh trưởng giống với nấm Mạng lưới phân nhánh của thểsợi thường phát triển ở cảbềmặt cơchất rắn (tạo thành hệsợi khí sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất (HSCC)

Đa sốxạkhuẩn sinh bào tử, bào tửrất khác nhau vềhình dạng và kích thước Phần lớn xạ khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong đất, nướcvà xác thực vật Xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng về mặt sinh thái trong vòng tuần hoàn tự nhiên Chúng phân hủy và sử dụng các chất hữu cơ khó phân hủy như axithumic trong đất Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng hòa tan lignin và phân hủy các hợp

chất liên quan đến lignin bằng cách sinh các enzym thủy phân xenlulozơ và hemixenlulozơ và các peroxidaza ngoại bào,[28], [25]

Trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn còn có thể sinh ra các chất hữu cơ như các loại vitamin nhóm B (B1, B2, B6 B12), một số axit hữu cơ như axit lactic, axitaxetic,axit amin như axit glutamic, metionin, tryptophan, lizin

Vềmặt phân loại, lớp xạkhuẩn có 5 phân lớp, 6 bộ trong đó bộ được nhắc đến nhiều nhất (có giá trịtrong y học và kinh tế) là bộActinomycetales

BộActinomycetalescó13 dưới bộ, 42 họvà khoảng 200 chi, [34]

Xạkhuẩn thường được chia thành hai loại:Streptomycesvà không phải

các chất hữu cơbằng các enzym ngoại bào

Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS, 60 ÷ 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh CKS Cho tới nay khoảng hơn 8000 CKS hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra[14] Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như

1.2.2 Xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus

hợpaxit clavulanic S clavuligerus ATCC 27064 (NRRL 3585, DSM 738) đã được

phát hiện lần đầu tiên bởi Higgens và Kastner, nó được phân lập từ một mẫu đất

Nam Mỹ Streptomyces clavuligeruslà một loài vi khuẩn Gram dương

β-lactam kháng sinh như axit clavulanic, cephamycin C, deacetoxycephalosporin C, penicillin N ( chất trung gian trong cephamycin C đường) và ít nhất bốn clavams khác Kháng sinh Non-β-lactam bao gồm holomycin và một khu liên hợp kháng

sinh.Một điều quan trọng của S clavuligerus là nó không có khả năng sử dụng

glucose như một nguồn carbon vì nó thiếu một hệ thống vận chuyển glucose

Hình 1.6 Xạ khuẩn S.clavuligerustrên đĩa thạch

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình thành axit Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đường là khác nhau, có chủng

sử dụng tốt các loại đường đơn như glucozơ, mannozơ,glycerol, fructozơ có chủng

sử dụng tốt loại đường đôi như saccarozơ, maltozơ Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại axit hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh axit

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh axit đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô

cơ Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ thực vật như: bột đậu tương, cao ngô Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên lượng phốt phát vô cơ trong cao ngô cao sẽ ức chế sinh tổng hợp axit, [22] Nguồn nitơ vô

cơ thường sử dụng là muối amon Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp axit của nhiều chủng xạ khuẩn

 Ảnh hưởng của pH

Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường, pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym và tác động gián tiếp qua môi trường, pH thích hợp cho sinh tổng hợp axit thường là trung tính,

pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp axit,[17], [33]

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp axit của xạ khuẩn Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 ÷ 300C, nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng và tổng hợp axit thường chỉ nằm trong khoảng 18 ÷ 280C, [1]

 Ảnh hưởng của các yếu tố vi lượng

Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men Nếu môi trường lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng đã có sẵn Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng

kể khả năng tổng hợp axit của nhiều chủng xạ khuẩn

1.2.4 Các nghiên cứu trong nước và quốc tế về chủng Streptomyces clavuligerus

- Tối ưu hóa các yêu cầu dinh dưỡng và kế hoạch cung cấp chất dinh dưỡng

sinh tổng hợp axit clavulanic từ chủng Streptomyces clavuligerus Parag

S.Saudagar, Rekha S Singhal Phòng Kỹ thuật và Kỹ thuật Thực phẩm, Viện Công nghệ Hoá học, Đại học Mumbai, Matunga, Mumbai 400 019, Ấn Độ

- Nghiên cứu về sản suất axit clavulanic từ chủng Streptomyces

Hirata, L.C.M Casiano Filho, C Bellao Đại học São Carlos, Phòng kỹ thuật hóa chất

- Axit clavulanic: β-lactamase ức chế β-lactam từ Streptomyces clavuligerus

C.Reading và M.Cole Bộ phận Researeh Dược phẩm Beecham, Anh

1.3 Axit clavulanic

Axit clavulanic được phát hiện khoảng năm 1974-1975 bởi nhà khoa học người Anh làm việc tại các công ty dược Beecham Sau nhiều nỗ lực, cuối cùng Beecham đã đệ đơn xin cấp bằng sáng chế Mỹ bảo vệ cho thuốc vào năm 1981, và Bằng sáng chế Mỹ 4.525.352, 4.529.720, 4.560.552 và đã được cấp trong năm

1985.Axit clavulanic (CLA

chịu trách nhiệm cho quá tr

là một chất bán tổng hợp

CLA có hoạt tính kháng khu

giá trị nồng độ ức chế tối thi

β-lactam và liên kết mạnh m

do đó cản trở hoạt động c

β-lactamase xúc tác, qua đ

kết hợp với thuốc kháng sinh d

điều trị nhiễmtrùng do vi khu

Axit clavulanic (CLA) là một chất ức chế mạnh của β -lactamase

m cho quá trình thủy phân của kháng sinh β-lactam

ợp ức chế β-lactamase phân lập từ S clavuligeru

t tính kháng khuẩnyếu đối với hầu hết các loại vi khu

i thiểu 25-125 mg ml -1 Tuy nhiên ,CLA có ch

nh mẽ với β-lactamase tại hoặc gần vị trí ho

ng của enzyme Điều này bảo vệ kháng sinh lactamase xúc tác, qua đó tăng cường tác dụng kháng khuẩn Do đó

β-c kháng sinh dễ bị β-laβ-ctamase, như peniβ-cillin và β-cephalosporin, mtrùng do vi khuẩn sản xuất β-lactamase Các tiềm lực

ng độ thích hợp của thuốc kháng sinh của vi khuBaggaley.1997 )

xit clavulanic được biosynthetically tạo ra từ các axit amin

-phosphate

hydroxyethylidene)-7-oxo-4-oxa-l-azabi- cyclo[3.2.0]heptane

n tử có công thức cấu tạo :

Hình 1.7 Công thức phân tử axit clavulanic

t tính kháng khuẩn yếu, mặc dù có vòng β-lactam đlactam Tuy nhiên, sự giống nhau trong cấu trúc hóa h

ng tác với enzyme β-lactamase tiết ra bởi vi khuẩlactam kháng sinh

lactamase, các enzym lactam.Axit clavulanic

i vi khuẩn với các

có chứa một vòng trí hoạt động của nó, -lactam khác từ

Do đó được sử dụng penicillin và cephalosporin, để

AC là một chất ức chế tự tử , đồng hóa trị việc kết hợp với một serine dư

lượng ở vị trí hoạt động của β-lactamase Điều này tái cơ cấu các phân tử axit

clavulanic, tạo ra một loại nhiều phản ứng mạnh hơn tấn công một acid amin khác ở

vị trí hoạt động, vô hiệu hóa nó, và do đó bất hoạt các enzym Sự ức chế này sẽ khôi

phục lại hoạt động kháng khuẩn của kháng sinh β-lactam chống lại các vi khuẩn

kháng lactamase

Với cấu trúc β-lactam , axit clavulanic có cấu trúc tương tự với penicillin

nhưng sự sinh tổng hợp các phân tử này liên quan đến một con đường khác nhau và

tập hợp các enzyme khác Axit clavulanic được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn

bắt đầu của con đường Mặc dù tất cả các chất trung gian của con đường được biết,

các cơ chế chính xác của mỗi phản ứng enzym được không hiểu đầy đủ Các sinh

tổng hợp chủ yếu liên quan đến 3 enzyme: synthase clavaminate , β-lactam

synthetase và N 2 - (2-carboxyethyl) -L-arginine synthase (CEA) Clavaminate

synthase là sắt không heme α-keto-glutarate phụthuộc oxygenase được mã hóa bởi

orf5 của axit clavulanic cụm gen

Các cơ chế cụ thể về cách enzyme này hoạt động không được hiểu đầy đủ,

nhưng enzyme này quy định 3 bước trong quá trình tổng hợp tổng thể của acid

clavulanic Tất cả 3 bước xảy ra trong cùng một vùng của trung tâm sắt xúc tác,

nhưng không xảy ra trong trình tự và ảnh hưởng đến các khu vực khác nhau của các

cấu trúc AC

đồng thời trong quá trình nuôi c

tượng thoái hóa giống Vì v

không thể phân lập được từ tự nhiên một chủng VSV có kh

n với hàm lượng đủ để thỏa mãn yêu cầu của s

ng nguyên thủy sau phân lập thường sinh axit có ho

i trong quá trình nuôi cấy hoạt tính của chúng thường giả

ng Vì vậy, đột biếncải tạo giống VSV nhằm thu

ạo ra axit có hoạt tính cao, ổn định là một trong nh

n thiết ở quy mô phòng thí nghiệm trước khi đư

ARN trong tế bào chịu tác động trực tiếp của các tia phóng xạ hoặc chịu tác động gián tiếp qua quá trình tác động lên các phân tử nước trong tế bào Ngoài việc gây đột biến gen, các tia phóng xạ cũng gây đột biến NST

- Tia tử ngoại (hay tia cực tím, tia UV) là sóng điện từ có bước sóng ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy nhưng dài hơn tia X Phổ tia cực tím có thể chia ra thành tử ngoại gần (có bước sóng từ 380 đến 200 nm) và tử ngoại xạ hay tử ngoại chân không (có bước sóng từ 200 đến 10 nm) Tia cực tím gây hại cho ADN của sinh vật theo nhiều cách Một trong những cách phổ biến nhất là: tác động bất thường vào liên kết giữa

2 đơn phân kế cận (thường là 2 bazơ T)thay vì giữa các đơn phân bổ sung trên 2 mạch đối nhau (tạo bậc thang) Kết quả là DNA có một chỗ phình trong cấu trúc và

nó không còn có thể thực hiện những chức năng bình thường nữa, [40]

- Sốc nhiệt là sự tăng giảm nhiệt độ môi trường một cách đột ngột, làm cho cơ chế nội cân bằng của cơ thể để tự bảo vệ không khởi động kịp, gây chấn thương trong

bộ máy di truyền

Một số hóa chất khi thấm vào tế bào sẽ thay thế hoặc làm mất một nucleotit trong ADN gây đột biến gen Ví dụ:

- 5-Bromuraxin (5BU) là đồng đẳng của T có khả năng gây đột biến thay thế cặp

- HNO2 gây đột biến thay thế cặp Nu

Các tác nhân gây đột biến nhân tạo được ứng dụng có hiệu quả trong chọn giống VSV, chọn giống cây trồng tạo được hàng trăm giống có giá trị về năng suất, phẩm chất và khả năng thích nghi

1.5 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài

a. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài: Đột biến Streptomyces clavuligerus bằng

hóa chất MNNG để tăng hiệu suất tổng hợp axit clavulanic

b Các nội dung nghiên cứu

 Phương pháp xác định nồng độ hóa chất MNNG tạo ra đột biến

 Phương pháp xác định thời gian gây đột hóa chất MNNG

 Phương pháp xác định pH gây đột biến

 Sàng lọc tuyển chọn chủng xạ khuẩn sau đột biến

 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit clavulanic của

chủng S clavuligerusđột biến

 Tách chiết và thu nhận axit clavulanic từ chủng S clavuligerus đột biến

TIẾN TRÌNH NGHIÊN CỨU

Tách và thu nhận axit clavulanic Thử hoạt tính CLA

Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng cho chủng đột biến

Chủng xạ khuẩnStreptomyces

clavuligerus

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Các chủng vi sinh vật

Chủng xạ khuẩn S.clavuligerus cung cấp từ phòng thí nghiệmiBR – Khoa Hóa

dược – Đại học Sunmoon, Hàn Quốc

+VikhuẩnGram(-): Escherichia coli JM109(E coliJM109)

+ Vi khuẩn Gram(+): Bacillus ( B )

Các chủng VSV được cungKhoa vi sinh - Viện kiểm nghiệm thuốc TW

c Kháng sinh

+ Amoxicillin ( amox) , ampcillin (amp)

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

a Hóa chất

 Hóa chất dùng làm môi trường nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy: glycerol, cao nấm men, cao malt, pepton, K2 HPO4 , MgSO4 H2O , MnCl2.4H2O , FeSO4.7H2O , ZnSO4

Bảo quản giống: glycerol, agar của Trung Quốc, Việt Nam sản xuất

 Hóa chất dùng trong đột biến

- TM buffer pH 8;9, MNNG các nồng độ ,NaOH , nước cất, môi trường chuẩn các hóa chất được sử dụng đều là hóa chất có tiêu chuẩn chất lượng cao của Merck ( Đức), Việt Nam

 Hóa chất dùng trong tách chiết, phân tích

 Kháng sinh thử hoạt tính amoxicillin (amo) và ampicilin (amp)

c.Thiết biết bị