Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic cho người từ vi khuẩn lactobacillus reuteri LA5

Lactobacillus reuteri được sử dụng trong các sản phẩm lên men sữa chua và rất có lợi cho đường tiêu hóa, ức chế mạnh các chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột.. Một mục tiêu cấp thiết đặt

Trang 1

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

- -

LUẬN VĂN THẠC SỸ Ngành: Công nghệ sinh học

Mã ngành: 62.42.02.01

Đề tài: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC CHO NGƯỜI

TỪ VI KHUẨN LACTOBACILLUS REUTERI LA5

Hà Nội - 2016

Giáo viên hướng dẫn: 1 TS Đào Thị Hồng Vân

2 ThS.Trần Thị Thu Phương

Học viên thực hiện: Đặng Lan Anh

Lớp: Cao học Công nghệ sinh học

Trang 2

Lu ận văn thạc sĩ Ngành Công ngh ệ sinh học

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Ngành: Công nghệ sinh học

Mã ngành: 62.42.02.01

Đề tài: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC

CHO NGƯỜI TỪ VI KHUẨN LACTOBACILLUS REUTERI

LA5

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin trân thành cảm ơn

Ban giám hi ệu, phòng đào tạo sau đại học trường Viện đại học Mở Hà Nội đã

t ạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:

Ban lãnh đạo, cán bộ nhân viên trung tâm Công nghệ sinh học – Viện thực

ph ẩm chức năng luôn quan tâm tạo điều kiện tốt cho tôi học tập và thực hiện luận

v ăn này

Ti ến sĩ Đào Thị Hồng Vân, Khoa công nghệ sinh học – Viện đạo học Mở Hà

N ội người đã trực tiếp dạy bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Cu ối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, những người trong gia đình đã

luôn ch ăm lo động viên giúp tôi yên tâm học tập nghiên cứu

Hà N ội, ngày tháng năm 2017

Tác gi ả

Đặng Lan Anh

Formatted: Font: 16 pt, Bold Formatted: Centered Formatted: Font: 16 pt, Bold, English (United States)

Formatted: Font: Bold, Italic Formatted: Left, Indent: First line: 0.31" Formatted: Indent: First line: 0.31" Formatted: Font: Italic

Formatted: Justified, Indent: First line: 0.31" Formatted: Font: Bold, Italic

Formatted: Indent: First line: 0.31" Formatted: Font: Italic

Formatted: Justified, Indent: First line: 0.31"

Formatted: Centered, Tab stops: 3.5", Left Formatted: Font: Italic

Formatted: Font: Italic Formatted: Right

Formatted: Centered Formatted: Font: Italic Formatted: Font: Italic

Trang 4

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của tôi, tất cả các số liệu kết quả

trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong đề tài nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Trang 5

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG 5

DANH MỤC CÁC HÌNH 6

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về Probiotic 3

1.2 Đặc điểm và phân loại của Lactobacillus reuteri 15

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về Lactobacillus reuteri 19

1.4 Ứng dụng 20

PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu 21

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.2 Hoá chất, môi trường và thiết bị 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Xác định mật độ tế bào [1] 22

2.2.2 Nhuộm gram [1] 23

2.2.3 Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường 24

2.2.4 Khả năng chịu muối mật [1] 24

2.2.5 Lên men thu sinh khối vi khuẩn quy mô 10 lít, 60 lít 24

2.2.6 Tính hiệu suất thu hồi sản phẩm 25

2.2.7 Tạo chế phẩm probiotic và bảo quản chế phẩm 25

2.2.8 Xác định hàm lượng axit amin 26

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Một số đặc điểm sinh học chủng Lactobacillus reuteri LA5 27

3.1.1 Đặc điểm hình thái 28

3.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa và thành phần axit amin 28

3.2 Khảo sát một số điều kiện lên men thu sinh khối 30

3.2.1 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng 30

Trang 6

3.2.3 Tối ưu hóa điều kiện lên men thu sinh khối 42

3.3 Lên men thu sinh khối quy mô 10 lít, 60 lít 44

3.4 Quy trình tạo chế phẩm 47

3.5 Tạo chế phẩm probiotic và bảo quản 47

KẾT LUẬN 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 59

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Những vi sinh vật được dùng làm probiotic [16] 7

Bảng 1.2 Một số bacteriocin của các probiotic [16] 9

Bảng 3.1 Các phản ứng sinh hóa của L reuteri LA5 29

Bảng 3.2 Thành phần axit amin trong tế bào vi khuẩn 29

Bảng 3.3 Khả năng chịu muối mật của chủng Lactobacillus reuteri LA5 30

Bảng 3.4 Sự tác động đồng thời của yếu tố pH và nhiệt độ đến quá trình phát triển của chủng vi khuẩn L reuteri LA5 43

Bảng 3.5 Lên men thu sinh khối L reuteri LA5 quy mô 10 lít 44

Bảng 3.6 Lên men thu sinh khối L reuteri LA5 quy mô 60 lít 45

Bảng 3.7.Tỷ lệ phối trộn sinh khối vi khuẩn với phụ gia để tạo chế phẩm probiotic 48 Bảng 3.8 Sự biến động số lượng tế bào chủng vi khuẩn L reuteri LA5 trong quá trình bảo quản 49

Bảng 1.1 Những vi sinh vật được dùng làm probiotic 11

Bảng 1.2 Một số bacteriocin của các probiotic 13

Bảng 3.1 Các phản ứng sinh hóa của Lactobacillus reuteri LA5 31

Bảng 3.2 Thành phần axit amin trong tế bào vi khuẩn Lactobacillus reuteri LA5 32

Bảng 3.3 Khả năng chịu muối mật của chủng Lactobacillus reuteri LA5 32

Bảng 3.4 Mật độ và lượng sinh khối thu được sau lên men quy mô thí nghiệm 10 lít 41

Formatted: Left

Formatted: English (United States) Formatted: Heading 1, Centered Formatted: Space After: 0 pt

Trang 7

Bảng 3.5 Mật độ và lượng sinh khối thu được sau lên men quy mô thí nghiệm 60 lít

41

Bảng 3.6 Công thức trộn và khối lượng thu được 42

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tế bào Lactobacillus reuteri 15

Hình 1.2 Lịch sử phát triển của Lactobacillus reuteri [5] 16

Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn Lactobacillus reuteri khi phóng đại 17

Hình 1.4 Lactobacillus reuteri ATCC PTA 6475 ức chế sản xuất TNF 18

Hình 1.5 Cơ chế sản xuất các yếu tố miễn dịch từ L reuteri ATCC PTA 6475 19

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Lactobacillus reuteri LA5 28

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ đường glucose đến sự phát triển của chủng Lactobacillus reuteri LA5 31

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ cao thịt đến sự phát triển 32

của chủng Lactobacillus reuteri LA5 32

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ pepton đến phát triển của 34

chủng Lactobacillus reuteri LA5 34

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sự phát triển của chủng Lactobacillus reuteri LA5 35

Formatted: English (United States)

Formatted: Space After: 0 pt

Formatted: English (United States)

Formatted: Centered, Indent: Left: -0.13"

Formatted: Centered

Formatted: Space After: 0 pt Formatted: Font: Italic Formatted: Font: Italic Formatted: Font: Italic

Formatted: Font: Italic

Trang 8

Hình 3.6: Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của L reuteri LA5 37

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ sự phát triển của L reuteri LA5 39

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian (khi không chỉnh pH) đến sự phát triển của chủng L reuteri LA5 40

Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian (khi chỉnh pH) đến sự phát triển 42

của chủng L reuteri LA5 42

Hình 3.10 Chế phẩm probiotic có chứa chủng vi khuẩn L reuteri LA5 51

Hình 1.1 Ảnh của tế bào Lactobacillus reuteri 19

Hình 1.2 Lịch sử phát triển của Lactobacillus reuteri 20

Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn Lactobacillus reuteri khi phóng đại 22

Hình 1.4 Lactobacillus reuteri ATCC PTA 6475 potently ức chế sản xuất TNF 23

Hình 1.5 Cơ chế đề xuất các yếu tố miễn dịch bằng tiết ra từ Lactobacillus reuteri ATCC PTA 6475 23

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Lactobacillus reuteri LA5 31

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng phát triển của chủng Lactobacllus reuteri LA5 33

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ cao thịt đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Lactobacillus reuteri LA5 34

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ peptone đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Lactobacillus reuteri LA5 34

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng Lactobacillus reuteri LA5 35

Hình 3.6 Biểu diễn ảnh hưởng của pH 36

Hình 3.7 Biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ 37

Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian(khi không chỉnh pH) 38

Hình 3.9 Ảnh hưởng cuả thời gian khi chỉnh pH 39

Hình 3.10 Biểu diễn mật độ khi kết hợp nhiệt độ với pH 40

Hình 3.11 Biểu diễn mật độ ổn định qua các tháng ở 8-10 độ C 43

Hình 3.12 Biểu diễn mật độ ổn định qua các tháng ở 25-30 độ C 44

Trang 9

PHỤ LỤC

Hình PL1 Chuyển hóa citrate (âm tính) Hình PL2 Thử Cattanase (-) 59

Hình PL3 Sinh axit lactic Hình PL4 Thử MR (+) 59

Hình PL5 Thử VP (-) Hình PL6 Thử lên men đường (+) 60

Hình PL7 Thử khử nitrat (+) Hình PL8 Khả năng di động (-) 60

Hình PL9 Nuôi cấy Cấp 1 trên bình tam giác 60

Hình PL10 Nuôi cấy Cấp 2 trên bình duham Hình PL11 Chế phẩm probiotic có chứa chủng vi khuẩn Lactoabacillus reuteri LA5 61

Hình PL1 Chuyển hóa citrate (âm tính)

Hình PL2 Thử Cattanase (-) 51

Hình PL3 Sinh axit lactic

Hình PL4 Thử MR (+) 51

Hình PL5 Thử VP (-)

Hình PL6 Thử lên men đường (+) 51

Hình PL7 Thử khử nitrat (+)

Hình PL8 Khả năng di động (-) 52

Hình PL9 Nuôi cấy Cấp 1 trên bình tam giác 52

Hình PL10 Nuôi cấy Cấp 2 trên bình duham

Hình PL11 Chế phẩm probiotic có chứa chủng vi khuẩn Lactoabacillus reuteri LA5 52

Formatted: Centered Formatted: English (United States)

Formatted: Centered, Indent: Left: -0.13"

Formatted: Font: Bold Formatted: Centered, Space After: 0 pt Formatted: Space After: 0 pt

Formatted: Centered

Formatted: Space After: 0 pt

Trang 10

Formatted: Space Before: 0 pt

Formatted: Normal, Left

Formatted: Normal

Trang 11

MỞ ĐẦU

Tình hình sức khoẻ hiện nay có những biến chuyển và diễn biến phức tạp Vì

thế yêu cầu kiểm soát mầm bệnh đảm bảo sức khỏe là yêu cầu cấp thiết Đó cũng là

mục tiêu đòi hỏi các nhà khoa học nghiên cứu, ứng dụng thành quả nghiên cứu khoa

học vào đời sống

Hiện nay, các bệnh đường tiêu hóa đã và đang gây nhiều tổn thất về mặt kinh tế

cho ngành y tế Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh này đang dần hạn chế do

những tác dụng phụ Liệu pháp sử dụng probiotic (chế phẩm sinh học) thay thế cho

kháng sinh ngày càng được chú trọng Probiotic là một hỗn hợp các vi khuẩn sống

có lợi hay các enzyme của chúng Chúng có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây

bệnh, làm cân bằng lại hệ vi khuẩn đường ruột, tổng hợp vitamin B, thúc đẩy tăng

cường hệ miễn dịch Trong hỗn hợp probiotic, mỗi vi khuẩn có một đặc tính có lợi

riêng Trong đó, nhóm vi khuẩn Lactobacillus mà đặc biệt là Lactobacillus reuteri

giúp ổn định và cải thiện hệ thống thống tiêu hóa bằng cách chống lại các vi khuẩn

có hại khi đi vào cơ thể Lactobacillus reuteri được sử dụng trong các sản phẩm lên

men sữa chua và rất có lợi cho đường tiêu hóa, ức chế mạnh các chủng vi khuẩn gây

bệnh đường ruột Mặt khác, chủng Lactobacillus reuteri có ưu điểm mà đa số các

loài Lactbacillus khác không có là khả năng chịu nhiệt tốt và có hoạt tính kháng

khuẩn cao đối với nấm men, nấm mốc và vi khuẩn gram âm lẫn gram dương Nhờ

vậy mà Lactobacillus reuteri ngày càng được ứng dụng nhiều trong sản xuất chế

Trang 12

Hiện nay, ở Việt Nam, các chế phẩm probiotic hầu hết phải nhập ngoại với giá cao chưa đáp ứng đủ nhu cầu của người tiêu dùng Một mục tiêu cấp thiết đặt ra là phải nghiên cứu các ảnh hưởng về thành phần môi trường, các yếu tố ảnh hưởng đến

sự sinh trưởng và phát triển của chủng để có thể thu hồi sinh khối vi khuẩn lactic

Lactobacillus reuteri với hiệu suất thu hồi cao đồng ứng dụng vào làm chế phẩm probiotic cũng như sản phẩm miễn dịch vì thành phần tế bào có chứa các axit amin Yêu cầu ứng dụng này là đảm bảo hiệu quả kinh tế để có thể đưa vào sản xuất với quy mô công nghiệp

Với các đặc điểm nổi bật cũng như mục tiêu đặt ra như đã trình bày của

Lactobacillus reuteri như vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế

phẩm probiotic cho người từ vi khuẩn Lactobacillus reuteri LA5”

Mục tiêu đề tài:

Tạo chế phẩm probiotic từ chủng Lactobacillus reuteri LA5

Nội dung nghiên cứu:

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng (cao thịt, cao nấm men, pepton, glucose), nhiệt độ, thời gian, pH đến sự phát triển và tạo sinh khối của

chủng Lactobacillus reuteri LA5

+ Lên men thu sinh khối Lactobacillus reuteri LA5 (quy mô 10 lít, 60 lít)

+ Tạo chế phẩm probiotic và bảo quản

Trang 13

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về Probiotic

* Khái niệm

Thuật ngữ "probiotic" đã được Lilley và Stiwell đưa ra vào năm 1965 để mô tả

những chất được sản sinh bởi một vi sinh vật, giúp tăng trưởng một vi sinh vật khác

Từ đó đến nay có rất nhiềt định nghĩa khác nhau về probiotic

"Probiotic là những sản phẩm chứa một hay nhiều loại vi sinh vật sống có lợi,

có ảnh hưởng tốt đến sức khỏe con người hay động vật sử dụng chúng bằng cách cải

thiện hệ thống vi sinh vật bên trong cơ thể" [17]

Elie Metchknikoff là người đầu tiên đặt nền móng cho việc sử dụng probiotic

Nhiều nghiên cứu trong lĩnh vực này đều nhận thấy chế phẩm probiotic đã tạo ra

những thay đổi về khu hệ vi sinh vật trong đường ruột theo hướng cân bằng có lợi,

trong đó các vi khuẩn có ích tăng đáng kể, số lượng các vi khuẩn có khả năng gây

bệnh giảm mạnh [7] Thuật ngữ probiotic ra đời từ đây Probiotic có nghĩa là tăng

cường sự sống, người ta giả thiết probiotic tạo thành do ghép hai chữ tiếng anh:

prophylaxia-phòng bệnh và biotic-sự sống [7]

* Đặc điểm của probiotic

Probiotics là những chất bổ sung vào thực phẩm, chủ yếu gồm những vi khuẩn

hay nấm men có lợi, vi khuẩn lactic là một trong những loại được sử dụng thường

xuyên nhất Nó có thể sinh ra Bacteriocxin-một loại hợp chất có hoạt tính kháng

sinh và phổ ức chế các vi khuẩn gây bệnh, giải độc cho đường ruột, tăng khả năng

Formatted: Indent: First line: 0"

Comment [A1]: Viết sang tiếng anh cho thống nhất

Formatted: Font: 13 pt

Trang 14

tiêu hoá Probiotic trong đường ruột có thể tự tái thiết lập cân bằng khi cần thiết

[12]

Những tác động tích cực của probiotic cần phải phụ thuộc vào liều lượng được

tiêu thụ, nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy chỉ khoảng 10-30% lượng probiotic có

trong thực phẩm còn lại trong hệ tiêu hóa sau khi được hấp thụ Do đó hàm lượng

probiotic cần thiết trong thực phẩm tối thiểu phải đạt 107 CFU/ml [19]

Probiotic được chia làm 2 loại:

• Vi khuẩn không sinh lactic

Bacillus subtilis, Escherichia coli …

Chỉ có duy nhất một loài nấm men được sử dụng trong chế phẩm probiotic, đó

là Saccharomyces boulardii [16]

• Vi khuẩn lactic

- Giống Lactobacillus: L acidophilus, L casei, L plantarum, L fermentum,

L reuteri, L bulgaricus, L paracasei…

- Giống Bifidobacterium: B bifidum, B breve, B longum, B lactic…

Trong đó, hệ vi khuẩn axit lactic là hệ vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất trong

các sản phẩm probiotic, chủ yếu là giống Lactobacillus, do có khả năng chuyển hóa

đường (bao gồm cả lactoseza) và các hydratcacbon khác thành axit lactic Nó không

chỉ tạo vị chua cho các sản phẩm sữa lên men như sữa chua mà còn có tác dụng như

một chất bảo vệ bằng cách hạ pH, giảm khả năng phát triển của các vi sinh vật có

hại [16]

* Vai trò của probiotic

• Tăng cường khả năng miễn dịch

Đối với con người: hiệu quả của vi khuẩn lactic là liên kết bộ máy tiêu hoá và

tạo hiệu quả trong điều trị bệnh tiêu chảy và sự nhiễm trùng đường ruột Vi khuẩn

lactic có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch theo hai cách: chúng vừa chuyển

qua thành ruột non, phát triển và nhân lên tới một số lượng nhất định đồng thời

những kháng nguyên giải phóng ra được cơ thể hấp thụ và kích thích hệ miễn dịch

hoạt động Một hướng khác, các giống Lactobacillus hoạt động gián tiếp bằng cách

Formatted: Indent: Left: 0", First line: 0.31"

Comment [A2]: Chỉ duy nhất cần xem lại và có tài liệu tham khảo

Formatted: Not Highlight

Trang 15

tác động lên các thành phần khác của ruột non Đó là sản phẩm của sự biến đổi tạo

ra đáp ứng miễn dịich

Hệ miễn dịch được cải thiện nhờ vi khuẩn lactic được biểu hiện theo ba cách:

+ Tăng cường hoạt động của đại thực bào

+ Tăng cường sự sản xuất kháng thể thường xuyên: IgM, IgG và interferon (tác

nhân chống virus đặc hiệu)

+ Tăng lượng kháng thể tại chỗ (IgA) trên bề mặt màng nhầy như thành ruột

non, miệng

Trong các thí nghiệm in vitro đã chỉ ra: các lympho bào máu ngoại biên của

người đã được kích thích bởi một lượng nhỏ vi khuẩn sinh lactic trong sữa chua sẽ

tạo ra lượng interferon nhiều gấp 3-4 lần bình thường [18] Sự gia tăng lượng

interferon kéo theo sự gia tăng số lượng lympho B, và các tế bào NK (natural killer

cells) và tăng mật độ IgG

Đối với vật nuôi: Các thí nghiệm với loài gặm nhấm cho thấy Lactobacillus làm

tăng hoạt động của đại thực bào (thường là L acidophilus và L casei) Chúng kích

thích hoạt động của đại thực bào tới Listeria, làm tăng sự hình thành IgA ở ruột non

Sự gia tăng quá trình sản xuất kháng thể được tham gia với sự bảo vệ chống lại sự

xâm nhiễm của Salmonella typhimurium L casei được sử dụng như một tá dược để

ngăn chặn sự xâm nhiễm từ bên ngoài L acidophillus cũng có hiệu quả trong sự gia

tăng sản xuất kháng thể đường ruột Áp dụng thí nghiệm đó song khuếch tán miễn

dịch đã chứng minh rằng: sau khi cho ăn bổ sung thực phẩm có chứa L acidophillus

trong 7 ngày, số lượng kháng thể miễn dịch ở ruột non lợn tăng gấp 3 lần [18]

• Ngăn ngừa, ức chế, tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh

Hệ vi sinh vật đường ruột của cơ thể có các chức năng:

+ Duy trì pH của ruột, dạ dày

+ Kích thích sự tạo thành kháng thể

+ Hỗ trợ quá trình sinh tổng hợp enzyme và vitamin (VTM)

Hỗ trợ quá trình sinh tổng hợp VTM nhóm B (B1, B2, B3, B12), VTM K, enzyme

proteaseza, lipaseza trong quá trình tiêu hóa thức ăn Từ đó cải thiện khả năng tiêu

Comment [A3]: TLTK Formatted: Not Highlight

Comment [A4]: TLTK Formatted: Not Highlight

Trang 16

hóa của con người và vật nuôi Với cơ thể không tiêu hóa được lactoseza, vi khuẩn

sẽ tổng hợp một lượng khá lớn enzyme lactaseza giúp tiêu hóa đường lactoseza tốt hơn Bộ máy tiêu hóa của con người có hàng trăm loại vi sinh vật có lợi và có hại, ở trạng thái cân bằng Khi cơ thể bị ốm, tiêu chảy, loạn khuẩn do dùng kháng sinh…

sẽ làm mất cân bằng này, ảnh hưởng đến sức khỏe con người Vi khuẩn lactic được đưa vào cơ thể có thể ức chế các vi sinh vật gây bệnh: Samonella, E coli…bằng cách sản sinh ra axit lactic, H2O2 và các chất thuộc họ Bacteriocin Những chất này làm biến đổi môi trường ruột, tạo môi trường không thích hợp cho sự phát triển của

vi sinh vật gây hại làm chúng không sinh trưởng phát triển được hoặc tạo lỗ thủng ở thành tế bào làm kìm hãm quá trình sinh tổng hợp lớp peptidoglucan và làm tăng cường quá trình tự phân của tế bào Nhờ đó đã khôi phục lại sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột Vi khuẩn lactic được đưa vào thay thế vi sinh vật có lợi bị giết, làm giảm tác dụng phụ của thuốc kháng sinh khi sử dụng kháng sinh chữa bệnh [16] Ngoài ra vi khuẩn lactic còn làm giảm hoạt tính, mức độ của các chất gây ung thư và sự hoạt động của các khối u, giảm bệnh cao huyết áp, dị ứng, giữ cân bằng lượng eostrogen, tăng khả năng hấp thụ canxi để phòng bệnh loãng xương và bệnh trào ngược thực quản, ngăn chặn các bệnh về nhiễm trùng đường tiết niệu, đường hô hấp ở trẻ em

- Tăng “thành bảo vệ” miễn dịch, một số còn có khả năng kích thích cả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu

- Kém hãm sự phát triển của vi khuẩn, nấm, virus có hại

- Có khả năng xâm chiếm đường ruột, bám vào màng nhầy ruột

- Có khả năng chịu được axit dạ dày, chịu được muối mật

- Sinh ra các chất chống vi sinh vật gây bệnh như Samonella, E.coli,

Clostridium…

- Phòng và chữa một số bệnh đường tiêu hóa: tiêu chảy, táo bón, ung loét dạ dày,…

- Giảm triệu chứng dị ứng, triệu chứng không dung nạp được lactose

- Ngăn chặn ung thư đường ruột, ung thư ruột kết

Trang 17

Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu

thuộc Lactobacillus và Bifidobacterum, ngoài ra Enterococcus và Streptococus cũng

được sử dụng ít hơn Những vi khuẩn này thường cư trú trong ruột Một số chủng

tiêu biểu bao gồm Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus

casei, Lactobacillus rhamnosus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum

Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces boulardii cũng được xem

là probiotic [16]

Bảng 1.1 Những vi sinh vật được dùng làm probiotic [16]

Steptococus faecalis

* Tác dụng của probiotic đối với con người [16]

a Thu ỷ phân lactose, tăng sự hấp thu lactose

Sự có mặt của lactose disacharide cùng với việc thiếu hụt enzyme galactosidase (lactase) trong đường ruột có thể gây nên các triệu chứng khó chịu như đầy hơi, đau bụng, hay giới hạn việc hấp thu canxi… ở một số người Các probiotic đóng vai trò quan trọng trong việc chữa trị việc kém hấp thu lactose và sự thiếu hụt lactase Suốt quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh lactase thuỷ phân lactose thành glucose và galactose

β-Việc bổ sung Lactobacillus có thể làm tăng khả năng lên men lactose và do vậy

cải thiện được triệu chứng không dung nạp lactose Các vi khuẩn đường ruột giúp

Trang 18

chuyển hoá hầu hết lượng lactose không được hấp thu ở ruột non Ngoài ra các vi

khuẩn Lactobacillus làm tăng thời gian vận chuyển lactose từ miệng đến lúc bài tiết

theo phân, do đó cơ hội cho việc tiêu hoá lactose nhiều hơn

b Gi ảm một số bệnh về đường tiêu hoá

- Ung loét: bệnh loét trong hệ thống tiêu hoá có liên quan đến chế độ ăn uống

hàng ngày, ít sử dụng các sản phẩm sữa lên men và rau quả, sử dụng quá nhiều sữa,

thịt, tinh bột Việc sử dụng nhiều sản phẩm sữa lên men làm giảm nguy cơ bị ung

loét trong hệ tiêu hoá Các nghiên cứu cho thấy rằng L acidophilus và B bifidum

hoạt động như một liệu pháp sinh học cho viêm dạ dày và tá tràng

- Tác dụng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh: Các probiotic có tác dụng ngăn

chặn các vi sinh vật có hại bằng các cơ chế:

+ Sinh các axit axetic, axit lactic, và các axit h ữu cơ khác, làm giảm pH môi

tr ường ảnh hưởng bất lợi đối với một số vi sinh vật nhạy cảm với tính axit

Lactobacilli là loài có khả năng chịu được axit tốt hơn so với các loài khác,

chúng sinh axit lactic hydrogen peroxide và có thể có axit axetic và axit benzoic

Bifidobacteria có khả năng sinh những chuỗi axit béo ngắn (short-chain fatty acids

– SCFAs ) như axit axetic, propionic, butyric, formic và axit lactic

Tại giá trị pH tối ưu chúng có khả năng hạn chế việc phát triển của tế bào vi

khuẩn SCFAS dồi dào nhất do Bifidobacteria sinh ra là axit acetic, axit này có phổ

hoạt động chống vi khuẩn và chống nấm rộng nhất

+ Sinh các chất kháng sinh tự nhiên (Bacteriocin)

Bacteriocin là những chất ức chế đặc biệt được các vi sinh vật tiết ra và ức chế,

tiêu diệt các vi sinh vật khác, chủ yếu là vi khuẩn Bacteriocin là các peptide,

polypeptide, protein hoặc là những chất ít mang cấu trúc gen của protein và được

cấu tạo từ các amino acidaxit amin, cũng có thể bao gồm các amino acidaxit amin

hiếm như lanthionine hay beta-methyllanthionine

Các vi sinh vật sinh bacteriocin thường xuất hiện tự nhiên như trong sữa và các

sản phẩm từ sữa Việc sử dụng các vi sinh vật có khả năng sinh bacteriocin đã có từ

Formatted: Font: Not Italic

Trang 19

nhiều thế kỷ trước trong việc bảo quản thực phẩm Mỗi bacteriocin cũng chỉ có tác dụng với một số nhóm vi sinh vật xác định

Bacteriocin của các vi khuẩn lactic được chia làm 4 nhóm sau:

Nhóm 1 chứa lanthibiotic: đây là những peptic nhỏ và có khả năng chịu nhiệt, chứa amino acid như lanthionine

Nhóm 2 chia thành 3 nhóm nhỏ trong đó nhóm 2a thường gặp nhất bao gồm các

bacteriocin như pediocin có khả năng chống Listeria

Nhóm 3 là những nhóm protein không bền nhiệt

Nhóm 4 là phức hợp của protein, lipid, và glucid

Bảng 1.2 Một số bacteriocin của các probiotic [16]

Lactobacillus plantarum A2, BN,C-11,LPCO-10,

MI406, NCDO 1193, SIK-83, CTC 305

Lactoccocus lactis subsp.lactis

Lactocicin

Lactacin F, lacidin, acidophilin Lactacin B

Caseicin 80, caseicin LHS Lactobacillin, brevicin Bulgarican

Subtilin, thermophilin, subtilosin Enterocin 226NWC, AS-48 Bacteriocin Bc-48

Enteroccins

BN, plantaricin A and D, lactolin, plantaricin BN,A,S Nisin

- Bệnh tiêu chảy:

+ Tiêu chảy do virus rota: chữa trị bệnh tiêu chảy ở những trẻ em mà thường là

do virus rota gây ra; ở người lớn thì có thể do đi du lịch, do sử dụng thuốc kháng sinh Bệnh tiêu chảy gây ra nhiều tử vong ở các nước đang phát triển; và việc sử

Trang 20

dụng các probiotic có thể là một công cụ quan trọng trong việc tăng cường sức khoẻ

và dinh dưỡng ở nhiều nước đang phát triển

Các chủng Lactobacillus rhamnosus GG v và Bifidobacterium lactis BB-12 tỏ

ra khá hiệu quả trong việc phòng chống virus điều trị bệnh tiêu chảy do virus rota gây ra ở trẻ em Tính hiệu quả của việc trị bệnh tiêu chảy do virus rota gây ra liên quan đến khả năng sống sót của vi khuẩn lactic trong suốt quá trình đi trong hệ thống ruột, khả năng bám vỏ màng như virus định cư trong ruột

+ Tiêu chảy do các vi sinh vật khác: các nghiên cứu in vitro cho thấy một só

chủng probiotic có khả năng ngăn chặn sự bám chặt và phát triển của các vi sinh vật

gây bệnh đường ruột như Salmonella Và một điều quan trọng trong chữa trị bệnh

tiêu chảy bằng các probiotic là kết hợp với việc bổ sung nước nếu có thể Bệnh tiêu chảy cũng xảy ra trong quá trình điều trị bằng thuốc kháng sinh, thường gây ra bởi

Clostridium difficile Thông thường, C difficile ít khi có trong hệ thống đường ruột

khỏe mạnh, tuy nhiên sự mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột do thuốc kháng

sinh làm cho số lượng C difficile tăng lên và chúng sinh ra các độc tố Và nhiệm vụ

của các probiotic là khôi phục lại cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột ở trạng thái khoẻ mạnh

Một số nghiên cứu cho thấy L acidophilus và L casei hiệu quả trong việc chống sự nhiễm khuẩn của Salmonella và Shigella và các sản phẩm sữa chứa L

acidophilus khẳng định tính hiệu quả trong việc chữa trị bệnh tiêu chảy do

Escheriachia coli

- Dị ứng thức ăn:

Một số nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn probiotic như L rhamnosus GG thúc

đẩy cơ chế “hàng rào” nội sinh ở những bệnh nhân bị viêm da và dị ứng thức ăn, bằng cách giảm các bệnh viêm nhiễm đường ruột được xem là một công cụ hữu ích trong bệnh dị ứng thức ăn

Một phương pháp phòng chống dị ứng thức ăn là điều chỉnh hệ vi sinh vật đặc biệt là hệ vi sinh vật đường ruột, vì đây là nguồn vi sinh vật chính kích thích hệ thống miễn dịch Một số vi sinh vật đáp ứng miễn dịch loại Th1, Th2 người ta cũng

Trang 21

quan sát thấy ở những người thường bị dị ứng và những người ít bị dị ứng số lượng

vi khuẩn Lactobacilli; ở những người ít bị dị ứng số lượng vi khuẩn Lactobacilli nhiều hơn và ít Clostridia hơn [16]

Việc chữa trị bằng các vi khuẩn có lợi rất hữu ích cho việc chữa trị dị ứng thức

ăn Mới đây người ta đã điều tra và cho thấy việc chữa trị bằng L rhamnosus GG rất hiệu quả trong việc phòng chống những căn bệnh dị ứng ở trẻ em

L rhamnosus GG cũng như các vi khuẩn lactic khác có khả năng phân chia các protein trong sữa bao gồm cả casein thành các peptide và các amino acid Sự thuỷ

phân các protein casein trong sữa nhờ L rhamnosus GG làm giảm sự phát triển của

mitogen gây ra bởi các tế bào lympho và làm giảm sự sinh ra IL-4 (cytokine chính điều chỉnh đáp ứng miễn dịch dị ứng) so với các casein không được thuỷ phân

c T ổng hợp một số vitamin

Các vi khuẩn đường ruột có khả năng sinh nhiều vitamin khác nhau Việc hấp thu các vitamin trong đường ruột khá kém, do đó việc các vi khuẩn có khả năng sinh vitamin rất quan trọng Các vi khuẩn này sinh tất cả các loại vitamin B (folic acid, niacin, riboflavin, B12, B6, acid pantothenic) và vitamin K

Theo các nghiên cứu, L brevis có khả năng tổng hợp vitamin D và vitamin K;

B longum tổng hợp vitamin B; B bifidum và L acidophillus tổng hợp được các

vitamin B như niacin, axit folic, biotin, B6 và vitamin K [16]

d Gi ảm cholesterol

Bifido baccterium và L acidophilus đóng vai trò quan trọng trong quá trình

chuyển hóa cholesterol Vi khuẩn đường ruột chuyển cholesterol sang dạng khó hấp thu hơn (coprostanol) do đó làm cản trở việc hấp thu cholesterol vào hệ thống ruột Nhiều nghiên cứu ở người và động vật cũng đã chứng tỏ các vi khuẩn lactic có khả năng làm giảm cholesterol

Theo các nhà nghiên cứu, các vi khuẩn probiotic khống chế sự tăng cholesterol bằng các cơ chế chủ yếu sau:

Trang 22

- Các vi khuẩn này phát triển trong hệ thống đường ruột, chúng hấp thụ một lượng cholesterol có mặt trong đó Một phần cholesterol kết gắn vào tế bào của vi khuẩn

- Tăng chuyển hóa cholesterol thành chất khác và giảm sự hấp thu của chất này vào cơ thể

- Giảm sự hấp thu cholesterol của ruột và tăng sự bài tiết của phân

- Giới hạn sự biến đổi cholesterol thành axit mật cho gan dự trữ

e T ăng hệ miễn dịch

Yếu tố được xác định có vai trò hệ thống miễn dịch l thành phần của vách tế bào

vi khuẩn: peptidoglycan Sự phân hủy peptidoglycan tạo thành chất muramyl peptid

có tác dụng kích hoạt đại thực bào Saarela và cộng sự (2000) cho rằng khả năng bám vào niêm mạc ruột của probiotic tạo sự tương tác giúp probiotic tiếp xúc với hệ thống lympho đường ruột về hệ thống miễn dịch, nhờ đó thúc đẩy hiệu quả miễn

dịch virut tạo nên sự ổn định hàng rào bảo vệ ruột [16]

f Ng ăn chặn ung thư

Đa số ung thư ở người có liên quan đến thói quen ăn uống, nên một số chủng của vi khuẩn lactic được sử dụng trong các sản phẩm sữa lên men có thể xem như là một chất chống ung thư và chống gây đột biến Các sản phẩm có chứa các vi khuẩn

như L bugaricus, S themophilus hay L acidophilus và Bifidobacteria đều có khả

năng:

- Kết hợp, ngăn chặn hoặc làm mất hoạt tính của các yếu tố gây ung thư

- Giảm hoạt tính của các enzym ở phân, là nơi khơi nguồn của các mầm mống gây ung thư

- Kích thích hệ thống miễn dịch

- Ngăn chặn sự tạo thành khối u

Từ hai thập niên trước, các nhà khoa học đã quan tâm đến việc sử dụng các probiotic trong việc điều trị bệnh ung thư ruột kết, dựa trên nhiều cơ chế như ngăn chặn trực tiếp tác nhân gây ung thư, hoạt hóa hệ miễn dịch và ngăn chặn các vi khuẩn có hại, điều chỉnh lại hệ vi sinh vật trong hệ thống tiêu hóa Trong hệ thống

Trang 23

tiêu hóa, một số vi sinh vật làm tăng nguy cơ bị bệnh ung thư ruột kết, trong khi đó

một số vi sinh vật khác lại có khả năng giảm nguy cơ bị bệnh Quan sát ở những

người thường xuyên sử dụng các sản phẩm sữa lên men bằng các probiotic như

Bifidobacteria, người ta nhận thấy một số enzym trong phân giảm xuống như ezym

α-glucoronidase, mà những enzym này trực tiếp chuyển các chất tiền ung thư sang

các chất gây ung thư Nghiên cứu in vitro, các vi khuẩn lactic có khả năng chống lại

các tác nhân bên ngoài như phóng xạ, chất hóa học, virus gây ra các đột biến ở các

tế bào hay cơ quan Trong trường hợp đối với người, hiệu quả này đi liền với việc

tăng lượng vi khuẩn Bifidobacteria trong phân và giảm các chất gây thối rữa trong

phân như indole, p-cresol và amoniac

Các vi khuẩn có lợi có thể giảm các enzyme liên quan đến các tác nhân gây ung

thư (gulucoronidase, azoreductase, enzyme khử nitrate, nitroreductase và

α-glucosidase) và do đó làm giảm nguy cơ gây ung thư ruột kết Bifidobacteria ngăn

chặn các yếu tố tiền ung thư như nitrate và nitrosamines thông qua cơ chế nội bào và

enzymatic Chúng cũng có thể kết hợp với các heterocyclic amines (các chất gây

ung thư trong quá trình nấu thịt), các chất kết hợp này sau đó được bài tiết theo

phân

g Ch ống viêm nhiễm hệ thống niệu sinh dục – chống nấm Candida

Việc viêm nhiễm đường sinh dục là do sự mất cân bằng hệ vi sinh vật đường

ruột, do sử dụng thuốc kháng sinh, các chất khử trùng, hormones, và các yếu tố

khác Các vi khuẩn probiotic hiệu quả trong việc phòng chống các rối loạn hệ thống

niệu sinh dục bằng khả năng cư trú của chúng ở âm đạo, khả năng giảm số lượng vi

sinh vật gây bệnh trong quá trình giành chỗ cư trú và ngăn chặn sự phát triển của các

vi sinh vật gây bệnh

Một số chủng thuộc Lactobacillus có khả năng ngăn chặn sự phát triển và bám

chặt của nấm Candida albicans và các chủng Candida khác Việc sử dụng

Lactobacillus giảm nguy cơ nhiễm nấm trở lại, giảm nhiễm nấm âm đạo Ngoài ra

một số chủng Lactobacillus sp GR-1 và Lactobacillus sp RC-14 ngăn chặn sự

nhiễm đường tiết niệu do Escheriachia coli gây ra

Formatted: Font: Not Italic Formatted: Font: Not Italic

Trang 24

Phần lớn mọi người đều gặp phải những vấn đề liên quan đến nấm Candida,

chúng xâm nhập và cư trú vào trong lớp màng ruột, sau đó di chuyển từ dạng bào tử

nấm sang dạng sợi nấm để dễ dàng xâm để dễ dàng xâm chiếm lấy hệ thống ruột

Những sợi nấm cắm sâu vào trong màng nhầy ruột, chúng cũng có thể tiết ra các

protease, alkaline phosphophatase, coagulase, phospholipase làm phá hủy màng

ruột và giúp chúng dễ dàng cắm sâu vào bên trong màng nhầy ruột hơn Khi chúng

xâm chiếm hệ thống ruột, ở đây chúng sinh ra các độc tố được hấp thu bởi mang

ruột, cũng như các cơ quan khác trong cơ thể kể cả não Ngoài ra chúng cũng sinh ra

các chất như amines, ammonia, hydrogen sulfide, indoles và phenol phá hủy màng

ruột

Do đó, sử dụng các probiotic, các vi khuẩn có lợi này sẽ chiến đấu giành lấy nơi

cư trú trong màng nhầy ruột, giúp tống ra ngoài các vi sinh vật gây bệnh, kích thích

đáp ứng miễn dịch cũng như việc sinh ra các chất kháng sinh tự nhiên và hydrogen

peroxide giúp bảo vệ cơ thể chống lại các nấm có hại này

* Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong nước và thế giới

Thế giới

Trên thế giới, trong những thập niên gần đây, người ta hướng vào việc phân lập

và chọn các chủng vi sinh vật có tính đối kháng cao đưa vào đường ruột, nâng cao

sức chống đỡ đối với mầm bệnh, phòng trị bệnh đừờng ruột cho người, động vật

nuôi, nhất là trẻ sơ sinh, người già và thú non Hiện nay ở Mỹ, Nhật, Anh và nhiều

nước khác trên thế giới đã sản xuất những chế phẩm hỗn hợp nhiều loại enzym, kết

hợp nhiều loài vi sinh vật trong việc phòng trị bệnh, nâng cao khả năng tiêu hoá của

người và vật nuôi như: Biozim, Rozim F - 3C, Lactopure, NatureFlora,… [19]

Trong nước

Ở Việt Nam, hiện trạng sản xuất probiotic phục vụ cho đời sống của con người

vẫn còn rất mới mẻ và mới bắt đầu được quan tâm trong thập kỉ gần đây Cùng với

sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, việc sản xuất các chế phẩm cung cấp vi sinh vật có

lợi cho đường ruột ở nước ta không ngừng phát triển Hiện nay, ở nước ta ước

khoảng 50% các loại sữa dành cho trẻ em có bổ sung probiotic (ở sữa bột lẫn sữa

Trang 25

nước) ở một số công ty lớn nên chưa được phát triển rộng rãi, giá thành còn cao Chẳng hạn như những chế phẩm dạng dược phẩm sử dụng cho người vẫn chưa được phổ biến, và chỉ sử dụng để điều trị cho những người mắc bệnh về đường tiêu hoá hay những người bị rối loạn về tiêu hoá sau khi điều trị kháng sinh Vì vậy, mà các chế phẩm probiotic chưa được đưa vào thực đơn bố sung hàng ngày để đem lại lợi ích cho con người Chỉ một vài công ty có uy tín sản xuất những sản phẩm sữa chua hay yogurt có bố sung probiotic, đang rất là phổ biến và bắt đầu được sử dụng rộng rãi như: sữa chua uống “probi” của Vinamilk, sữa uống lên men “yakult” của Nhật Bản được sản xuất tại Việt Nam, sữa chua của Vinamilk với các hương vị hoa quả

rất dễ ăn được sử dụng các chủng probiotic như: L paracasei, L casei… đem lại

nhiều hiệu quả, lợi ích cho người sử dụng [12]

1.2 Đặc điểm và phân loại của Lactobacillus reuteri

Trang 26

Loài: Lactobacillus reuteri

Lactobacillus reuteri là vi khuẩn gram dương, hình que, và kỵ khí, sinh axit lactic, heterofermentatic vi khuẩn tự nhiên sống trong ruột của một các sinh vật, kể

cả con người, lợn, gà và chuột Cũng có thể được phân lập từ sữa mẹ ở con người,

trong nuôi cấy , Lactobacillus reuteri phát triển tối ưu trên môi trường MRS ở 37ºC

Tổ chức của Liên Hiệp Quốc thực phẩm và nông nghiệp chế phẩm sinh học mô

tả, probiotic là "các vi sinh vật sống mà khi dùng với số lượng đầy đủ mang lại lợi

ích sức khỏe trên động vật chủ" Lactobacillus reuteri sản xuất reuterin, một kháng

sinh ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn có hại, nấm, động vật nguyên sinh Do các đặc tính probiotic nên việc sử dụng Lactobacillus reuteri được cho là một liệu pháp đầy hứa hẹn cho giảm nghèo và giảm một số bệnh liên quan đến sức khỏe tiêu hóa, sức khỏe răng miệng và sức khỏe niệu sinh dục, bao gồm đau bụng trẻ con, eczema,

và nhiễm H pylori [17].

Hình 1.2 L ịch sử phát triển của Lactobacillus reuteri [5]

Trang 27

Các loài Lactobacillus reuteri được công nhận và ghi vào bảng phân loại khoa

học của vi khuẩn axit lactic, sớm nhất là vào đầu thế kỷ 20 Tại thời điểm này, nó đã

nhầm với nhóm có lại như một thành viên của Lactobacillus fermentum Đến năm

1980, Lactobacillus reuteri đã được xác định là một loài riêng biệt [11] và chủng

đầu tiên của Lactobacillus reuteri cho con người sử dụng đã được phân lập vào năm

1990 từ sữa mẹ, của một người mẹ Peru sống ở vùng Andes, đặt tên là Lactobacillus

reuteri ATCC 55730

Năm 2007, Lactobacillus reuteri DSM 17938 được tìm thấy có tác dụng tương

đương Lactobacillus reuteri ATCC 55730 và có tên thương mại là Lactobacillus

reuteri Protectis Các chủng khác được sử dụng thương mại là Lactobacillus L

reuteri ATCC PTA 5289 và L reuteri ATCC PTA 6475 [11]

Lactobacillus reuteri là vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, có hình

que, xếp riêng lẻ hoặc thành chuỗi, lên men kỵ khí hoặc hiếu khí, sinh axit lactic, sống trong ruột của một các sinh vật, kể cả con người, lợn, gà và chuột Cũng có thể được phân lập từ sữa mẹ ở con người Trong nuôi cấy, Lactobacillus reuteri phát triển tối ưu trên môi trường MRS ở 37oC L reuteri sản xuất reuterin (3

hydroxypropionaldehyde) - một kháng sinh ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn có

hại, nấm và động vật nguyên sinh Lactobacillus reuteri sản xuất carbon dioxide,

ethanol, acetate và axit lactic từ quá trình lên men glucose [28]

Hình 1.3 T ế bào vi khuẩn Lactobacillus reuteri khi phóng đại

* Điều hoà miễn dịch ở Lactobacillus reuteri:

Trang 28

Tiến sĩ Peera Hemarajata nghiên cứu các chức năng của các yếu tố phiên mã và vận chuyển để điều chỉnh việc sản xuất các hợp chất điều hòa miễn dịch tiết ra từ

Lactobacillus reuteri Ông đã sử dụng đột biến cùng với công nghệ cao và phân tích thông tin sinh học để khám phá những transcriptomes và proteome của vi khuẩn, để xác định các chức năng của các gen Sửa đổi di truyền của các gen này có thể dẫn đến các chủng mới của probiotics có thể được sử dụng một cách an toàn để ngăn chặn có hiệu quả hoặc thậm chí điều trị viêm dạ dày ruột ở tương lai gần Chất điều

hòa miễn dịch từ Lactobacillus reuteri có thể ngăn chặn sản xuất TNF từ tế bào

monocytoid như bệnh nhân bị bệnh Crohn có sự gia tăng của TNF (Hình1.4) Chất điều hòa miễn dịch từ probiotic Lactobacillus reuteri ATCC PTA 6475 potently ức chế sản xuất TNF trong bệnh bạch cầu monocytic (THP1) các tế bào kích hoạt nhân cấp tính và đại thực bào monocyte có nguồn gốc chính từ các bệnh nhân bị bệnh Crohn Tuy nhiên, các yếu tố hòa tan trung gian ức chế TNF này chưa được xác định

rõ ràng (Hình 1.5 )

Hình 1.4 Lactobacillus reuteri ATCC PTA 6475 ức chế sản xuất TNF

Trang 29

Hình 1.5 C ơ chế sản xuất các yếu tố miễn dịch từ L reuteri ATCC PTA 6475

1.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về Lactobacillus reuteri

* Trên thế giới:

Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về loài này, điển hình mới nhất năm 2015

là của nhóm tác giả người Mỹ với của tạp chí “Wegmann et al.BMC Genomic 2015”

đã chỉ rõ nhất về bộ gen của loài Lactobacillus reuteri giữa các chủng có sự khác

biệt về một số gen nhất định Ngoài ra, nghiên cứu tại Đức chỉ ra rằng loài

Lactobacillus reuteri DSM17648 có khả năng chống Helicobacter pylori để giảm

thiểu nguyên nhân gây ung thư dạ dày ở người và đã cho ra đời dòng sản phẩm có

tên “pylopass” Nhiều nghiên cứu đã được ứng dụng trong sản xuất thuốc như: chữa

bện đau bụng cho trẻ nhũ nhi, làm men tiêu hóa….[18]

* Trong nước:

Vấn đề dư lượng thuốc kháng sinh luôn là trở ngại đối với nuôi trồng thủy sản

Việt Nam Công ty TNHH Công nghệ sinh học dược Nanogen (TP Hồ Chí Minh) đã

chiết tách thành công Reuterin từ vi khuẩn Lactobacillus reuteri có hoạt tính sinh

học cao, phổ kháng khuẩn rộng và có thể thay thế kháng sinh trong việc phòng trị

các bệnh do vi khuẩn gây ra ở cá, tôm Vấn đề dư lượng thuốc kháng sinh luôn là trở

ngại đối với nuôi trồng thủy sản Việt Nam Nhằm tháo gỡ vấn đề này, Công ty

TNHH Công nghệ sinh học dược Nanogen (TP Hồ Chí Minh) đã nghiên cứu và

Formatted: Danh mục hình

Trang 30

chiết tách thành công Reuterin từ vi khuẩn Lactobacillus reuteri có hoạt tính sinh

học cao, phổ kháng khuẩn rộng Sản phẩm này không gây hại cho động vật và con

người, hơn nữa hoàn toàn không có ảnh hưởng xấu tới môi trường Tiến sĩ Trương

Thúy Hường, Giám đốc chi nhánh thủy sản – Công ty Nanogen cho biết quy trình

sản xuất Reuterin gồm nhiều công đoạn: lên men, tách chiết, phân đoạn, kiểm tra

hoạt lực Lactobacillus reuteri được lên men trong 24 giờ ở 37oC với điều kiện yếm

khí, sau đó ly tâm thu phần dung dịch trong, thực hiện quá trình tinh sạch Reuterin,

thu các sản phẩm bằng phương pháp HPLC Cuối cùng kiểm tra hoạt lực của 3-HPA

theo phương pháp MIC Quy trình sản xuất đã được đăng ký bảo hộ độc quyền sáng

chế tại Việt Nam năm 2007 và tên thương mại của Reuterin do Nanogen sản xuất là

Microcin Microcin đã có mặt trong danh mục thuốc thú y thủy sản do Cục Quản lý

chất lượng an toàn vệ sinh và thú y thủy sản ban hành [21]

1.4 Ứng dụng

- Công nghiệp thực phẩm:

- Lactobacillus reuteri là vi sinh vật có lợi ưu tiến nhất hiện nay, đã được rất

nhiều nghiên cứu khoa học chứng minh giúp giảm đau bụng co thắt ở trẻ nhỏ, giảm

táo bón, giảm trào ngược và tăng cường sức khỏe hệ tiêu hóa cho trẻ Lactobacillus

reuteri DMS17938 đã được hãng sữa Guigoz của Pháp độc quyền dành cho trẻ em

nhằm tăng hệ miễn dịch cũng như giảm tình trạng co thắt ở trẻ sơ sinh Có loài

Lactobacillus reuteri đã được chứng nhận độc quyền bởi tập đoàn Nestlé [19]

- Y dược:

Hãng BioGaia đã có những sản phẩm độc quyền về chủng Lactobacillus reuteri

trong sản xuất men hỗ trợ tiêu hoá Ngoài ra, một số nước cũng đã có những sản

phẩm thuốc dung trong hỗ trợ tiêu hoá [19]

- Thuỷ sản:

Công ty TNHH Công nghệ sinh học dược Nanogen (TP Hồ Chí Minh) đã chiết

tách thành công Reuterin từ vi khuẩn Lactobacillus reuteri có hoạt tính sinh học cao,

phổ kháng khuẩn rộng có thể thay thế kháng sinh trong việc phòng trị các bệnh do vi

khuẩn gây ra ở cá, tôm Theo tiến sĩ Hồ Nhân, Tổng giám đốc Công ty TNHH

Formatted: Indent: First line: 0.31", No bullets or numbering, Tab stops: 0", Left + Not

at 0.3"

Trang 31

Nanogen: sản phẩm Microcin do Nanogen sản xuất có phổ kháng vi sinh vật rất rộng

bao gồm: vi khuẩn gram dương, gram âm, nấm men, nấm mốc, bào tử trùng, ký sinh

trùng và thậm chí cả virus [8]

PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Lactobacillus reuteri LA5 từ bộ sưu tập giống của Trung tâm công

Trang 32

Triaminicitrate, K2HPO4.3H2O, CH3COONa.3H2O, MgSO4.7H2O,

MnSO4.H2O, NaOH, NaCl, Tween 80, glucose, axit ascorbic, Trehalose (Trung

Quốc); Cao thịt, cao men, peptone (Ấn Độ); Lysozym, protease, trypsin (sigma-

Mỹ); Sữa gày (New Zealand); Tinh bột bắp (Italia)

*Môi trường:

Môi trường MRS (g/l): cao thịt 8,0; peptone 10,0; cao nấm men 4,0;

K2HPO4.3H2O 2,0; Triamonicitrate 2,0; MgSO4.3H2O 0,2; MnSO4 H2O 0,05;

Tween 80 1ml, Glucose 20,0; CH3COONa.3H2O 5,0

*Thiết bị:

Cân điện tử (Đức), Cân phân tích (Thụy Sĩ), Kính hiển vi Olympus CHD-2

(Nhật), Máy đo pH (Rumani), Máy ly tâm lạnh (Mỹ), Nồi hấp khử trùng (Nhật), Tủ

ấm (Trung Quốc), Tủ cấy vô trùng (Pháp), Tủ -30 (Nhật), Máy đông khô (Mỹ), Nồi

lên men 10 lít và 60 lít (Việt Nam)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định mật độ tế bào [1]

Để xác định số lượng vi sinh vật có trong các mẫu, sử dụng phương pháp pha

loãng tới hạn và nuôi trên các môi trường đặc trưng bằng nước muối sinh lý 0,85%

trong điều kiện vô trùng, nồng độ pha loãng theo cơ số 10 Quá trình thực hiện như

sau:

Đối với mẫu nước: Hút 1ml dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất

khử trùng, lắc đều Dịch trong ống tương đương với độ pha loãng 10-1 Hút 1ml từ

ống nghiệm có độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 2, lắc đều Dịch trong ống

tương đương với độ pha loãng 10-2 Làm tương tự với các ống nghiệm khác tới 10-6

- Dịch đã pha loãng được cấy trên đĩa petri có chứa các môi trường tương ứng:

Hút 0,2ml dịch trong ống nhỏ lên các hộp petri có chứa môi trường đặc trưng cho

mỗi loại vi sinh vật điển hình để xác định số lượng vi sinh vật Dùng que gạt đều lên

trên mặt thạch

Formatted: Indent: First line: 0.31"

Formatted: Font color: Auto

Formatted: Indent: First line: 0.31", Tab stops: 0.06", Left + Not at 0"

Formatted: Font color: Auto, Not Expanded by / Condensed by

Formatted: Not Superscript/ Subscript Formatted: Not Superscript/ Subscript Formatted: Not Superscript/ Subscript Formatted: Not Superscript/ Subscript Formatted: Not Superscript/ Subscript Formatted: Not Superscript/ Subscript Formatted: Not Superscript/ Subscript Formatted: Not Superscript/ Subscript Formatted: Not Superscript/ Subscript Formatted: Font: Bold

Formatted: Normal

Formatted: Font: Not Bold Formatted: 17, Indent: First line: 0.31", Tab stops: 0.06", Left

Formatted: Indent: First line: 0.31", Line spacing: 1.5 lines

Trang 33

Các đĩa thạch sau khi cấy được ủ ở nhiệt độ 28-30oC trong vòng 24-96 giờ tùy

theo từng nhóm vi sinh vật Đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành trên đĩa thạch và tính

toán số lượng vi sinh vật có trong 1ml mẫu theo công thức:

CFU/ml (g) = A x 1/K x 1/V A: Số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên đĩa petri có cùng độ pha loãng

V: Thể tích dịch pha loãng trang trên mỗi đĩa (ml)

K: Độ pha loãng của dịch được cấy

2.2.2 Nhuộm gram [1]

Nguyên t ắc:

Nhuộm Gram (phản ứng Gram) có vai trò đặc biệt trong việc phân loại vi

khuẩn Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với tím kết tinh và

iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iot bên trong tế bào Khi vi khuẩn

Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hoà tan làm tăng tính thấm của

màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím – iot và làm cho vi khuẩn mất màu Khi

nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc này (Đỏ vàng với Safranin hay đỏ tía

với Fuchsin) Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co

lại do đó phức chất tím – iot bị giữ lại bên trong tế bào

Ti ến hành:

- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi

cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí

- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần

- Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh (tím gentian) trong 1 phút, rửa nước rồi

thấm khô

- Nhuộm lại bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhỏ cồn 90o, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước rồi

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt

Formatted: Font color: Auto

Trang 34

- Kết quả nhuộm Gram: Vi khuẩn Gram dương (G+) bắt màu tím xanh, còn vi

khuẩn bắt màu tím hồng là vi khuẩn Gram âm (G- )

2.2.3 Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường

- Ảnh hưởng của các thành phần môi trường: sử dụng môi trường gốc

MRS giữ nguyên các thành phần khoáng: thay đổi nguồn glucose bổ sung với nồng

độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0%; cao thịt, pepton, cao nấm men bổ sung với nồng độ 0,5; 0,75;

1,0; 1,25% Nuôi tĩnh ở 37oC trong 24 giờ, sau đó xác định mật độ tế bào (cfu/ml) ở

từng thí nghiệm

- Ảnh hưởng của điều kiện môi trường: sử dụng môi trường thích hợp,

tiến hành thay đổi các điều kiện:

+ pH môi trường từ 6.0; 6,5; 7,0 và 7,5

+ Nnhiệt độ nuôi 30; 35; 37 và 40oC,

+ Thời gian thu nhận sinh khối 20; 22; 24 và 26 giờ,

Sau đó xác định mật độ tế bào (cfu/ml) ở từng thí nghiệm

2.2.4 Khả năng chịu muối mật [1]

- Hút 1 ml dịch nuôi cấy vi khuẩn ở cuối pha sinh trưởng đem ly tâm với tốc độ

4500 vòng/phút trong 5 phút để thu tế bào đem trộn với dịch dạ dày mô phỏng gồm

glucose (3,5 g/lít), NaCl (2,05 g/lít), KH2PO4 (0,60 g/lít), CaCl2(0,11 g/lít), và KCl

(0,37 g/lít) được chuẩn độ về các pH 2,0 bằng dung dịch HCl 1M và lọc bằng màng

lọc 0,2 µm

- Sau đó bổ sung lysozyme (0,1 g/lít) và pepsin (13,3 mg/lít) được cho vào dịch

(dịch mật lợn hoặc dịch mật gà tươi đã được lọc vô khuẩn) với lượng bổ sung ủ

trong 2 giờ

- Dịch sau xử lý được cấy vạch bằng tăm gỗ tiệt trùng lên và xác định mật độ

các chủng còn sống sót trên đĩa thạch chứa môi trường MRS để mục đích so sánh

tốc độ sinh trưởng so với các mẫu đối chứng trong nước và được cất giữ ở 4ºC

2.2.5 Lên men thu sinh khối vi khuẩn quy mô 10 lít, 60 lít

- Chủng vi khuẩn sau quá trình nhân giống cấp I trên môi trường MRS trong

bình tam giác 250ml trong thời gian 36 giờ được chuyển sang bình lên men 5 lít với

Formatted: Indent: First line: 0.31", Right: -0.02", Tab stops: Not at 0.1"

Formatted: Font: Font color: Auto, Portuguese (Brazil)

Trang 35

lượng giống bổ sung 2% trên môi trường thích hợp, với các điều pH 7.0, nhiệt độ

37oC, nuôi có khuấy đảo nhẹ, không sục khí, thời gian kết thúc lên men 20 – 22 giờ

- Với quá trình lên men trên bình 60l, chủng trải qua hai lần nhân giống cấp I,

cấp II và được bổ sung vào bình 60 lít với lượng giống 5%, nuôi có khuấy đảo nhẹ,

không sục khí thời gian thu hồi là sau 20-22 giờ lên men

- Sinh khối ướt được thu nhận bằng phương pháp ly tâm thu ở nhiệt độ 4°C,

tốc độ 8500 vòng/phút trong thời gian 10 phút Sinh khối ướt được rửa lại hai lần

bằng nước tinh khiết với điều kiện tương tự Sau quá trình loại bỏ nước, sinh khối

được cân để xác định trọng lượng ướt

- Đối với bình lên men 60l, sinh khối được thu nhận qua hệ thống lọc tiếp

tuyến với đường kính lỗ lọc 0,2µm, sinh khối thu được sau lọc đem xác định trọng

lượng sinh khối ướt

2.2.6 Tính hiệu suất thu hồi sản phẩm

V dịch sau lọc (l) x mật độ tế bào có trong dịch sau lọc (cfu/ml)

H = x

100%

V dịch lên men ban đầu (l) x mật độ tế bào có trong dịch lên men (cfu/ml)

H: hiệu suất thu hồi (%), V: thể tích dịch (lít), mật độ dịch (cfu/ml)

2.2.7 Tạo chế phẩm probiotic và bảo quản chế phẩm

- Phối trộn sinh khối vi sinh vật với phụ gia:

Sinh khối vi khuẩn được phối trộn với phụ gia đường trehalose, sữa gày và axit

ascorbic với tỷ lệ theo 2 công thức:

CT1: 35% đường Trehalose +15% sữa gày + 0.5% axit ascorbic + 50% sinh khối

CT2: 40% đường Trehalose +10% sữa gày + 0.5% axit ascorbic + 50% sinh khối

- Đông khô chế phẩm:

Đông khô ở điều kiện ở -43ºC, áp suất 0.08mbar, thời gian 24 – 28 giờ

- Bảo quản chế phẩm:

Chế phẩm được đóng gói nilon, bảo quản ở 2 điều kiện: lạnh (8-10ºC), phòng

(25-30ºC) Kiểm tra mật độ tế bào trong chế phẩm theo thời gian

Comment [A8]: đem

Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt, Font color: Auto

Formatted: Heading 1, Left, Tab stops: Not at 0.1"

Formatted: Tab stops: 0.39", Left

Trang 36

2.2.8 Xác định hàm lượng axit amin

a Phá vách b ằng enzym kết hợp với siêu âm

Sau khi lên men thu sinh khối đem đi ly tâm 8500 vòng/phút, loại bỏ bớt phần nước để thu phần xác tế bào, ly tâm rửa 2 lần nước muối loãng 0.9% Sau đó đem phá vách với 4 công đoạn [6]

- GĐ1: ủ Tris HCl theo tỉ lệ 2 sinh khối: 1 tris HCl, chỉnh pH đưa về 7.5; đem siêu âm tại bể rung siêu âm 1h với tần số 50-100hz

- GĐ2: Bổ sung enzym E1=E2=1/100ml dịch, sau đó đem ủ lắc ở 37 độ/ 2h/tốc

độ lắc 120 vòng/ph

- GĐ3: Siêu âm trong bể rung siêu âm 1h với tần số 50-100hz

- GĐ4: Bổ sung enzym E3=E4=1/100ml dịch, sau đó đem ử lắc ở 37 độ/2,5h/tốc

độ lắc 120 vòng/ph

Đến đây là kết thúc xong phần phá vách để thu axit amin, ta đem mẫu này đê xác định hàm lượng các axit amin Còn lại phần dịch ta trộn với nguyên liệu manitol theo tỉ lệ 1:1 đem đông khô, thu sản phẩm khô (lysozym, protease đã được mã hóa với tên E1, E2, E3, E4)

b D ịch thu được đem xác định axit amin theo công thức:

mt: khối lượng mẫu thử (g)

P: hàm lượng % của chuẩn axítamin

Dt, Dc: độ pha loãng của dung dịch thử và chuẩn tương ứng

Trang 37

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Một số đặc điểm sinh học chủng Lactobacillus reuteri LA5

3.1.1 Đặc điểm hình thái

Lactobacillus reuteri LA5 có nguồn gốc từ bộ sưu tập giống của Viện Thực

phẩm chức năng Lactobacillus reuteri LA5 đã được nghiên cứu và cho thấy có đầy

đủ đặc tính của một probiotic (an toàn, sinh lactase, ức chế vi sinh vật có hại, kích

Formatted: Normal, Justified, Indent: First line: 0.31"

Formatted: Normal, Indent: First line: 0.31"

Trang 38

thích miễn dịch, cung cấp một số vitamin và axit amin, ) Sau đây là một số đặc

điểm nổi bật của chủng

3.1.1 Đặc điểm hình thái

Lactobacillus reuteri LA5 sinh trưởng tốt trên môi trường MRS, mật độ tế bào

đạt khoảng 108 CFU/ml sau 48h20-22h nuôi cấy ở 37oC

Khuẩn lạc có kích thước nhỏ (khoảng 1mm), hình tròn, màu trắng sữa, trơn và

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Lactobacillus reuteri LA5

A: Hình thái khuẩn lạc B: Hình thái của tế bào

3.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh lý, sinh hóa và thành phần axit amin

Qua nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa cho thấy Lactobacillus reuteri LA5

không có khả năng sinh Catlase, V-P, citrat, chuyển hóa citrat, khử nitrat và không

di động Tuy nhiên, L reuteri LA5 lại có khả năng sinh axit lactic, lên men đường

glucose và MR (Bảng 3.1)

Formatted: Font color: Auto Formatted: Normal, Indent: First line: 0.31"

Comment [A9]: (Hình 1A)

Formatted: Font: Not Bold Formatted: Font: Not Bold

Formatted: Font: Bold Formatted: Space Before: 6 pt Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Formatted: Font: Bold Formatted: Normal, Indent: First line: 0.31"

Formatted: Tab stops: 1.06", Left + 1.13", Left

Trang 39

Bảng 3.1 Các phản ứng sinh hóa của L reuteri LA5

Phản ứng sinh hóa Kết quả

Khả năng lên men đường glucose (+)

3.1.3 Đặc điểm thành tế bào và khả năng

Bảng 3.2 Thành phần axit amin trong tế bào vi khuẩn

Thành phần axit amin Kết quả lần 1 (mg/g) Kết quả lần 2 (mg/g)

Kết quả bảng 3.2 cho thấy, cả 4 axit amin là alanin, axit aspartic, glutamic, lysin

có hàm lượng tương đối cao Điều đó chứng tỏ chủng Lactobacillus reuteri LA5 này

có thành phần có khả năng kích thích tạo miễn dịch mạnh và tốt tương tự với

Iummne Gama của chủng Lactobacillus fermentum Kết quả nghiên cứu này mở ra

thêm một hướng khai thác ứng dụng nữa của Lactobacillus reuteri là thu nhận các

axit amin song song với việc sử dụng vi khuẩn sống

Ngoài ra, Lactobacillus reuteri LA5 còn có khả năng chịu muối mật ở nồng độ

1,5 -2 % (36)… Ở trong môi trường dạ dày mô phỏng mật độ Lactobacillus reuteri

Formatted: DANH MỤC CÁC BẢNG, Left, None, Add space between paragraphs of the same style

Định dạng
Số trang	79
Dung lượng	3,81 MB