Trong số đó chỉ có một vài loài là có tiềm năng ứng dụng.Zymocin là một loại kháng sinh mới được các nhà nghiên cứu khoa học trên Thế giới rất quan tâm.. SS4.2”với mục đích tiếp tục tinh
Trang 1- -
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆ
ứu đặc tính zymocin của nấ
men Moniliella sp SS4.2
Hà Nội - 2016
ớng dẫn : PGS Vũ Nguyên Thành
: Phạm Mai Hương : K19 – Lớp 1203 - CNSH
N ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
- -
ỆP
ấm
Thành CNSH
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong Khóa luận này
là trung thực Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Khóa luận này đã được cám ơn và các thông tin được trích dẫn trong Khóa luận này
đã được ghi rõ nguồn gốc
Hà N ội, ngày 24tháng 5năm 2016
Sinh viên
Phạm Mai Hương
Trang 3Em cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô khoa Công nghệ Sinh Học, Viện Đại học Mở Hà Nội đã tận tình giảng dạy, dìu dắt em trong suốt thời gian học tập
Cuối cùng,em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn bè những người luôn động viên, khích lệ em trên con đường học tập, làm quen với công tác nghiên cứu khoa học
Hà N ội, ngày24tháng5 năm 2016
Sinh viên
Phạm Mai Hương
Trang 4MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC BẢNG vii
DANH MỤC HÌNH viii
MỞ ĐẦU 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 NẤM MEN MONILIELLA 3
1.1.1 Giới thiệu chung về nấm men Moniliella 3
1.1.2 Moniliella sp SS4.2 5
1.2 ZYMOCIN 6
1.2.1 Khái quát về zymocin 6
1.2.2 Đặc điểm của zymocin 8
1.2.3 Bản chất và cấu trúc của zymocin 10
1.2.4 Vai trò và ứng dụng của zymocin 11
1.2.5 Tình hình nghiên cứu zymocin trên thế giới 12
1.2.6 Tình hình nghiên cứu zymocin ở Việt Nam 14
1.3 THU HỔI VÀ TINH CHẾ PROTEIN 15
1.3.1 Phương pháp kết tủa 15
1.3.1.1 Kết tủa bằng muối ammonium sulfate 16
1.3.1.2 Kết tủa bằng các dung môi hữu cơ 16
1.3.2 Phương pháp sắc ký 17
1.3.2.1 Sắc ký lọc gel 17
1.3.2.2 Sắc ký trao đổi ion 18
1.3.2.3 Sắc ký tương tác kỵ nước 18
Trang 51.3.2.4 Sắc ký ái lực 18
1.3.2.5 Sắc ký lỏng cao áp 19
1.3.3 Phân tách protein bằng điện di SDS-PAGE 19
PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU 21
2.1.1 Đối tượng 21
2.1.2 Vật liệu 21
2.1.2.1 Hóa chất 21
1.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc 22
1.2.3 Thành phần môi trường dùng trong nghiên cứu 22
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.2.1 Nghiên cứu tinh chế zymocin 24
2.2.1.1 Cô đặc mẫu 24
2.2.1.2 Kết tủa phân đoạn bằng ammonium sulfate 24
2.2.1.3 Sắc ký tương tác kỵ nước 25
2.2.1.4 Sắc ký trao đổi ion 25
2.3.2 Phương pháp phân tích 26
2.3.2.1 Thử hoạt tính zymocin bằng phương pháp đục lỗ thạch 26
2.3.2.2 Phương pháp điện di SDS-PAGE 26
2.3.3 Khả năng bền nhiệt của zymocin sau tinh chế 28
2.3.4 Khả năng bền pH của zymocin sau tinh chế 29
2.3.5 Khả năng chịu kháng sinh của chủng Saccharomyces cerevisiae SBY 2576 theo thời gian 31
PHẦN 3: KẾT QUẢ 32
3.1 TINH CHẾ ZYMOCIN TỪ MONILIELLA sp SS4.2 32
3.1.1 Cô đặc mẫu 32
3.1.2 Kết tủa phân đoạn bằng (NH4)2SO4 32
3.1.3 Sắc ký tương tác kỵ nước 34
Trang 63.2 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ZYMOCIN DO CHỦNG
MONILIELLA sp SS4.2 SINH RA 40 3.2.1 Khả năng bền nhiệt của zymocin sau tinh chế 40 3.2.2 Khả năng bền pH của zymocin sau tinh chế 45
3.2.3 Khả năng chịu kháng sinh của chủng Saccharomyces cerevisiae SBY
2576 theo thời gian 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53
Trang 7DANH SÁCH KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Fast Protein Liquid Chromatography Revolutions per minute (tốc độ quay trong một phút) Sodium docetyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Ammonium persulfate
N,N,N’,N’-tetramethylene-ethylenediamine Yeast peptone dextrose
Kilo Dalton
Trang 8DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Những loài nấm men mà hoạt tính zymocin đã được công bố
Bảng 2. Lượng muối (NH4)2SO4 cần bổ sung để đạt được nồng độ bão hòa từ 30-50 %
Bảng 3. Thể tích dung dịch acid citric 1M/ HCl 1 M/ KOH 1 M cần
bổ sung vào 500 µl dịch zymocin gốc
Bảng 4. Thể tích dung dịch acid citric 1M/ HCl 1M/ KOH 1 M cần
bổ sung vào 500 µl dịch zymocin sau tinh chế
Bảng 5 Một số hình ảnh về khả năng chịu kháng sinh zymocin do
Moniliella sp SS4.2 sinh ra của chủng mẫn cảmSaccharomyces
cerevisiae SBY 2576 tại các mốc thời gian khảo sát
Trang 9DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Cây phả hệmô tả mối quan hệ giữa Moniliellasp SS4.2 và các
nhóm phân loại trong cùng chi
Hình 3.1: Hoạt tính zymocin sau khi lọc cross flow qua màng 5 kDa
Hình 3.2: Hoạt tính dịch zymocin gốc và các phân đoạn sau khi kết tủa bằng muối (NH4)2SO4
Hình 3.3: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12% các phân đoạn sau khi kết tủa zymocin bằng muối (NH4)2SO4
Hình 3.4: Sắc ký đồ tương tác kỵ nước trên cột HIC ở pH 7 mẫu zymocin các phân đoạn kết tủa muối nồng độ 30%, 40%, 50% bão hòa
Hình 3.5: Hoạt tính mẫu E1 và E2 thu được sau khi tinh chế bằng sắc ký tương tác kỵ nước trên cột HIC
Hình 3.6: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12 % mẫu E1 và E2 thu được sau khi tinh chế bằng sắc ký tương tác kỵ nước trên cột HIC
Hình 3.7: Sắc ký đồ trao đổi ion trên cột DEAE ở pH 8 mẫu zymocin sau khi tinh chếtrên cột HIC
Hình 3.8: Hoạt tính mẫu E1 và E2 thu được sau khi tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE
Hình 3.9: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12 % mẫu E1 và E2 thu được sau khi tinh chế bằng sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE
Hình 3.10:Độ bền nhiệt của zymocin gốc tại các nhiệt độkhác nhau
Hình 3.11: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12% khả năng bền nhiệt của zymocin gốc ở các nhiệt độ khác nhau
Hình 3.12:Độ bền nhiệt của zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử tại các nhiệt
độ khác nhau
Trang 10Hình 3.13: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12% khả năng bền nhiệt zymocin zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử.
Hình 3.14:Độ bền nhiệt của hai cấu tử sau khi gia nhiệt tại các nhiệt độ khác nhau và được trộn theo tỷ lệ 1:1
Hình 3.15: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12% cấu tử một – 20,7 kDa được gia nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau
Hình 3.16: Điện di SDS-PAGE trên gel acrylamide 12% cấu tử hai – 16,6 kDa được gia nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau
Hình 3.17:Độ bền pH của zymocin gốc
Hình 3.18:Độ bền pH của zymocin sau tinh chế gồm hai cấu tử
Trang 11ra zymocin còn có thể ứng dụng trong bảo quản nước hoa quả và các sản phẩm khác khỏi sự gây hư hỏng bởi nấm men và nấm mốc để thay thế cho các chất bảo quản có bản chất hóa học có thể ảnh hưởng tới sức khỏe con người Trong y học, zymocin có thể được sử dụng nhằm chống nhiễm trùng đường tiêu hóa, đường sinh dục và da bởi các nấm men gây bệnh, đặc biệt trong trường hợp điều trị các bệnh nhiễm trùng cơ hội ở bệnh nhân AIDS
Cho tới nay, đã có trên dưới 80 loài nấm men có hoạt tính zymocin đã được công bố Trong số đó chỉ có một vài loài là có tiềm năng ứng dụng.Zymocin là một loại kháng sinh mới được các nhà nghiên cứu khoa học trên Thế giới rất quan tâm Vì vậy tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tiến hành nghiên cứu zymocin do chủng
Moniliella sp SS4.2 sinh ra.Qua nghiên cứucho thấy hoạt tính zymocin do
chủng Moniliellasp SS4.2 sinh ra bao gồm hai cấu tử có khối lượng phân tử
lần lượt là 20,7 kDa và 16,6 kDa Tuy nhiên, kháng sinh zymocin do chủng này sinh ra lại chỉ biểu hiện hoạt tính khi có mặt đồng thời của cả hai cấu tử còn khi tách riêng rẽ hai cấu tử thì không sinh hoạt tính Chính điều này đã
Trang 12làm nên sự khác biệt và mới mẻ của zymocin do chủng Moniliellasp SS4.2 sinh ra.Do đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc tính
zymocin c ủa nấm men Moniliella sp SS4.2”với mục đích tiếp tục tinh chế
riêng rẽ 2 cấu tử và bước đầu xác định một số đặc tính của zymocin sau tinh chế như khả năng bền nhiệt, khả năng bền pH để phục vụ cho việc ứng dụng loại kháng sinh mới này vào bảo quản các sản phẩm nước hoa quả, các loại đồ uống được chế biến từ trái cây
Trang 13PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NẤM MEN MONILIELLA
1.1.1 Giới thiệu chung về nấm men Moniliella
Nấm men Moniliellađược biết đếnvào khoảng đầu thế kỉ 20 là một nhóm
phân loại không đồng nhất, thành tế bào có melanine và sinh sản bằng phương
thức nảy chồi Tuy nhiên, nấm men Moniliella là một loại nấm rất khó để
nhận dạng, vì vậy những hiểu biết về chúng vẫn chưa được hoàn chỉnh
Nấm men Moniliellalần đầu tiên được miêu tả năm 1966 với hai loài là
M.acetoabutens vàM tomentosa (Stolk & Dakin, 1966) Tiếp theo là hai loài
M.suaveolens vàM.mellis, được tìm ra bởi von Arx (1972) và Rao & de Hoog (1975) Năm 1984, De Hoog & Gue'ho đề xuất tổ hợp loài mớiMoniliella pollinis cho M tomentosavar pollinis dựa trên cơ sởsự khác biệt về sinh thái, hình thái và
sinh lý và sự khác biệt rõ rệt trong tỉ lệ (G + C) của DNA Năm 2009, Rosa và
cộng sự cho rằng Moniliella và Trichosporonoides (Haskins & Spencer, 1967) có thể xếp vào cùng một chi và do vậy bốn tổ hợp loài M.megachiliensis,
M.nigrescens, M.oedocephalis, M.spathulata và một loài mới M.fonsecae được đề
nghị Tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã
công bố ba loài mới là M.carnis, M.dehoogii (Thanh et al, 2012) và M.byzovii
(Thanh et al, 2013) Năm 2014, Wang và cộng sự đã phân tích dựa trên trình tự của sáu gen bao gồm các tiểu đơn vị nhỏ (18S), đoạn D1/D2 của rDNA 26S, vùng
ITS bao gồm rDNA 5.8S, hai tiểu đơn vị của RNA polymerase II (RPB1 và
RPB2 ) và các nhân tố dịch mã 1-α (EF1-α) Các nhà phân tích đã chỉ ra rằng
Malassezia và Moniliella là hai lớp mới trong Ustilaginomycotina, chúng có mối quan hệ họ hàng với Ustilaginomycotina, Exobasidiomycetes Và được sắp xếp theo trật tự: lớp Moniliellomycetes, bộ Moniliellales, họ
Moniliellaceae , chi Moniliella [9] Như vậy cho tới nay chi Moniliella gồm
12 loài:
Trang 14Moniliella acetoabutens Stolk & Dakin
Moniliella byzovii Thanh, Hien & Thom
Moniliella carnis Thanh, Hai, Hien, Takashima & Lachance
Moniliella dehoogii Thanh, Hai, Hien, Takashima & Lachance
Moniliella fonsecae Rosa, Nakase, Jindamorakot, Limtong, Lachance, Fidalgo-Jimenz, Daniel, Pagnocca, Inacio & Morais
Moniliella megachiliensis (Inglis & Sigler) Rosa & Lachance
Moniliella mellis Rao & dehoog
Moniliella nigrescens (Hocking & Pitt) Rosa & Lachance
Moniliella oedocephalis (Haskins & Spencer) Rosa & Lachance
Moniliella pollinis De Hoog & Gueho
Moniliella spathulata (de Hoog) Rosa & Lachance
Moniliella suaveolens (Lindner) von Arx
Phân bố: các loài thuộc chi Moniliella thường phân bố ở những nơi có
nồng độ đường cao (mật ong, phấn hoa ) hoặc nơi có nhiều dầu mỡ
Đặc điểmhình thái: Khuẩn lạc lúc đầu màu kem, sau chuyển sang màu xám đen hoặc đen oliu hoặc có thể màu xám hay xanh Các chuỗi hướng ngọn của các bào tử đính dạng chồi được tạo thành từ các gai nhỏ Đôi khi xuất hiện bào tử áo hình chùy, có vách dày Có khi xuất hiện sợi giả Tế bào hình elip đến hơi trụ, có lỗ vách Khuẩn ty phân nhánh, đường kính 2-6 µmmàu xanh lục, đứt gãy nhiều tạo thành các đốt ngắn [5]
Đặc điểm sinh lý:sinh trưởng chậm Có khả năng lên men đường, tổng hợp các polyol đặc biệt là erythritol và glycerol Ngoài ra chúng cũng đồng hóa được các polyol như mannitol, erythritol, sorbitolsau 5 ngày nuôi cấy, riêng inositol thì chúng không có khả năng đồng hóa hay lên men [5]
Trang 15Đặc tính sinh sản: sinh s
tử, xuất hiện bào tử đốt, cho
tính [5]
Một số nghiên cứu v
Viện Công nghiệp Thự
nghệ như khả năng chuy
sinh một loại kháng sinh m
khả năng chuyển hóa glucose t
1.1.2.Moniliella sp SS4.2
Moniliellasp SS4.2 là m
zymocin, được phân lậ
sinh vật Công nghiệp, Vi
quan hệ giữa Moniliella
vào hình cho thấy SS4.2 có m
loài khác
Hình 1.1: Cây phả hệmô t
loại trong cùng chi.Cây phân lo
đoạn D1/D2 LSU rRNA s
sử dụngnhư nhóm ngoài
chèn tương ứng 5% khác bi
n: sinh sản vô tính bằng nảy chồi, không hình thành nang bào
t, cho đến nay chưa phát hiện được hình thứ
u về Moniliella phân lập tại Việt Nam đượ
ực phẩm đã cho thấy tiềm năng ứng dụng trong công
ng chuyển hóa dầu thầu dầu thành tinh dầu đ
i kháng sinh mới (zymocin), khả năng sinh lipase, phosphatase và
n hóa glucose tạo erythritol
sp SS4.2
SS4.2 là một loài mới thuộc chiMoniliella,có kh
ập từ tương, thuộc bộ sưu tập giống của Trung tâm Vi
p, Viện Công nghiệp Thực phẩm Hình 1.1
Moniliella sp SS4.2 và các loài khác thuộcchi Moniliella
y SS4.2 có mức độ sai khác trình tự gen khá l
mô tả mối quan hệ giữa Moniliellasp SS4.2 và các nhóm phân
phân loại được xây dựng dựa trên sự sai khác trình t
n D1/D2 LSU rRNA sử dụng chương trình MEGA 6 Phylloporia pectinata
nhóm ngoài Mã số GenBank của trình tự rDNA sau tên loài Thanh
Moniliella, nhìn gen khá lớn so với các
SS4.2 và các nhóm phân sai khác trình tự trong ình MEGA 6 Phylloporia pectinata được
rDNA sau tên loài Thanh
Trang 16Đặc điểm hình thái của chủng SS4.2: Tế bào hình trứng Khuẩn lạc khi còn "non" có màu trắng nhưng khi về "già" lại chuyển sang màu vàng, lục và sau đó là nâu đen Khuẩn lạc khô, ghồ ghề phát triển chậm trong thời gian đầu Hình thức sinh sản sinh dưỡng bằng cách nảy chồi và phân cắt Pha sinh sản hữu tính chưa phát hiện được [2]
Hình 1.2.Hình ảnh khẩn lạc và tế bào chủng SS4.2 A - Hình ảnh khuẩn lạc chủng
Moniliella sp SS4.2 nuôi cấy trên đĩa thạch mal glucose 4°Bx; B - Hình thái tế bào chủng SS4.2 soi ở vật kính x40
Theo kết quả nghiên cứu của nhóm bảo tồn gen thuộc Trung tâm Vi sinh
vật Công nghiệp,Viện Công nghiệp Thực phẩm, chủng Moniliella sp SS4.2
có khả năng sinh zymocin cao nhất khi nuôi cấy lắc trong môi trường YPD ở 28°C,180 rpm trong 72 h, pH tối ưu 3,5 Dịch nuôi cấy sau đó được ly tâm
3500 rpm trong 15 phút để thu lấy phần dịch nổi có chứa zymocin và loại bỏ cặn tế bào
1.2 ZYMOCIN
1.2.1 Khái quát về zymocin
Năm 1963,Makower Bevan đã phát hiện ra một số chủng của
Saccharomyces cerevisiae có khả năng sinh tổng hợp nên các protein diệt các chủng khác cùng loài, những chủng này có khả năng tự miễn với các protein
Trang 17do chúng sinh ra Các protein đặc biệt này được gọi là các killer toxin (killer factor, zymocin, mycocin…) và các chủng nấm men tương ứng được gọi là các chủng sinh killer (killer strains) [3]
Quá trình tổng hợp các protein có hoạt tính sinh học (killer toxin) ở S
cerevisiae bị ảnh hưởng bởi các yếu tố của môi trường nuôi cấy như pH của môi trường, nhiệt độ, thành phần môi trường, mức độ lắc trong quá trình nuôi cấy và sự có mặt của các tác nhân làm ổn định môi trường.Tiếp sau đó là sự phát hiện ra hàng loạt các chủng nấm men killer toxin khác, các chủng này thường gặp ở cả các loài nấm men sử dụng trong công nghiệp, và nấm men phân lập ngoài tự nhiên [2]
Killer toxin có thể có phổ hoạt động rộng chống lại nhiều loài nấm men
khác nhau, một số có tác dụng đến cả các loài nấm men của chi khác
Hansenula saturnus CCY 38-4-2 có tác dụng diệt Zygosaccharomyces bailli (một tác nhân làm hỏngrượu vang), Saccharomyces cerevisiae, một vài chủng
Candida albicans , C krusei, Kluyveromyces phaffii, K marxianus,K fragilis,
K lactis và một số loài Hansenula spp Trong các trường hợp khác, hoạt lực
của các killler toxin thường có phổ hẹp và đặc hiệu hơn
Các chủng nấm men sinh killer toxin khác nhau ở phổ hoạt động chống lại các chủng mẫn cảm, đặc điểm của killer toxin và các yếu tố di truyền quyết định tính trạng killer cũng như khả năng tự miễn của chúng đối với các killer toxin Những chủng nấm men thiếu các gen mã cho killer toxin thì thường mẫn cảm với một hoặc nhiều killer toxin, các chủng này được gọi là các chủng mẫn cảm (sensitive strains)
Đã có trên dưới 80 loài nấm men có hoạt tính zymocin được công bố Việc tìm ra các zymocin mới với nhiều đặc tính quý và khả năng ứng dụng cao là vô cùng quan trọng
Trang 18Bảng 1 Những loài nấm men mà hoạt tính zymocin đã được công bố
Candida C dattila, C glabrata, C guilliermondii, C holmii, C
crusei, C maltosa, C neodendra, C parapsilosis, C
pseudotropicalis, C sonorensis, Candida sp., C sphaerica,
C valida, C versatilis Cryptococcus Cr albidus, Cr laurentii, Cr podzolicus
Cystofilobasidium Cys bisporidii
Debaryomyces D hansenii, D polymorphus, D vanrijiae
Filobasidium F capsuligenum
Hanseniaspora H uvarum
Kloeckera K apiculata, K japonica
Kluyveromyces Kv aestuarii, Kv dobzhanskii, Kv lactis, Kv lodderae,
Kv marxianus, Kv phaffii, Kv wickerhamii, Kv wikenii Metschnikowia M pulcherima
Pichia P acaciae, P amethionina, P anomala, P antillensis, P
bimundalis, P cactophila, P canadensis, P ciferrii, P fabianii, P farinosa, P guilliermondii, P holstii, P
inositovora, P jadinii, P kluyverii, P membranifaciens, P mexicana, P minuta var nonfermentans, P ohmeri, P
opuntiae, P petersonii, P pini, P quercuum, P spartinae,
P subpelliculosa, P thermotolerans Rhodotorula R fujisanensis, R glutinis, R mucilaginosa, R pallida
Saccharomyces S cerevisiae, S paradoxus, S unisporus
Sporidiobolus Sp johnsonii, Sp pararoseus
Trichosporon T capitatum
Williopsis W californica, W pratensis, W saturnus, W saturnus (W
beijerinckii), W saturnus var mrakii, W saturnus var
sargentensis, W saturnus var subsufficiens
1.2.2 Đặc điểm của zymocin
Hiện tượng killer toxin không đặc thù cho nấm men Quá trình tổng hợp các protein có độc tính đặc hiệu đối với các cá thể gần gũi và khả năng miễn
Trang 19dịch đặc hiệu tương ứng được biết ở nấm than (Smut fungi), trùng đế giầy (Paramecia), nấm nhầy (Slime molds) và vi khuẩn Ở vi khuẩn các protein này được gọi là bacteriocin, do vậy để nhấn mạnh bản chất chung của những tương tác đối kháng này thì có thể gọi killer toxin của nấm men là zymocin và các chủng killer là các chủng sinh zymocin
Cho đến nay hầu hết các kháng sinh được biết đều thuộc về ba nhóm vi sinh vật là vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn (ví dụ như nhóm kháng sinh vi khuẩn
có Bacitracin của Bacillus licheniformis, polimicin của Bacillus polymixa nhóm kháng sinh do nấm sinh ra có cephalosporin từ Cephalosporium
acremonium Penicillin từ Penicillium chrysogenum nhóm kháng sinh do xạ khuẩn có Kanamycin từ Streptomyces kanamycefius, Streptomycin từ
S.griseus ) Các kháng sinh này có thể có bản chất protein, peptide, các hợp chất vòng Nhìn chung phổ hoạt động của các kháng sinh này thường ít đặc hiệu cho loài, tác dụng của chúng thường vươn ra cả các loài khác và các chi khác
Ngược lại với các kháng sinh kể trên, các zymocin của nấm men đã được biết cho đến nay đều có bản chất protein và thường có tác dụng đặc hiệu, chúng thường chỉ có tác dụng trong các chủng cùng loài với chủng sinh zymocin tương ứng, đôi khi phổ hoạt động của chúng vươn ra cả một số chủng có họ hàng gần gũi Phần lớn các zymocin được biết chỉ có tác dụng chống nấm mà không có hoạt động kháng khuẩn và kháng các nguyên sinh động vật (ngoại trừ một vài zymocin nhất định có khả năng ức chế các vi
khuẩn Gram dương trong đó có Staphylococcus aureus) Trong nhiều trường
hợp khác khả năng sinh kháng sinh của nấm men có được là do sự thay đổi
pH môi trường, là kết quả của quá trình tổng hợp và bài tiết các acid hữu cơ hoặc do sự hấp thụ chọn lọc và trao đổi ion với môi trường [8] Các đặc tính này đã tạo nên sự khác biệt đáng kể của zymocin so với các chất kháng sinh khác
Trang 20Phần lớn các zymocin được mô tả cho đến nay đều có một số đặc tính chung Chúng thường bị bất hoạt hoàn toàn bởi nhiệt độ cao, sự xáo động quá mức hay ở pH cao (giá trị nhiệt độ và pH này khác nhau ở các zymocin khác nhau) Tuy nhiên bên cạnh đó vẫn có các ngoại lệ đó là trường hợp zymocin
của Hansenula mrakii IFO 0895 (về sau chủng này được phân loại lại là
Williopsis mrakii), zymocin được tiết ra bởi chủng này có khả năng chịu được
nhiệt độ cao (100ºC trong 10 phút) và pH từ 3-11 Zymocin của Hansenula
saturnus cũng có đặc tính tương tự Hầu hết zymocin mẫn cảm với các enzyme thuỷ phân protein [7] Những đặc tính này chỉ ra bản chất protein của các zymocin
1.2.3 Bản chất và cấu trúc của zymocin
Tất cả các zymocin đã được biết đều có bản chất protein, có thể là các protein đơn giản hoặc glycoprotein chứa từ hai tới ba cấu tử Ở hầu hết các nấm men, trọng lượng phân tử của zymocin nằm trong khoảng 10.000 - 20.000 Dalton Ngoài ra có thể có một vài zymocin lớn hơn, chẳng hạn như đối với zymocin ở Kluyveromyces lactis và Pichia anomala có thể có kích thước tới hơn 100.000 Dalton (các zymocin này có bản chất glycoprotein) [8]
[14] [6]
Zymocin K1 do S cerevisiae tiết ra là một dimer toxin được cấu tạo từ hai
chuỗi α và β polypeptid, các chuỗi polypeptide này được liên kết với nhau bởi cầu disulfua và có chứa nhiều acid amin kị nước cũng như các acid amin mang điện tích Tiền chất của K1 được tổng hợp trong tế bào là một phân tử polypeptide mạch đơn có kích thước lớn với hai cấu tử α và β được tách biệt bởi vùng γ có độ glycosid hoá cao Phân tử zymocin K1 hoàn chỉnh được tổ chức từ tiền chất này gồm 4 vùng: 1 - vùng dẫn đầu N - amino; 2 - vùng α có chức năng liên kết với các thụ quan nằm trên thành tế bào mẫn cảm và hoạt động phá huỷ tế bào; 3 - α N - glucoside (chưa biết rõ chức năng); 4 - chuỗi β giữ vai trò liên kết với thụ quan thành tế bào
Trang 211.2.4 Vai trò và ứng dụng của zymocin
Các quá trình lên men công nghiệp và nuôi cấy nấm men ở quy mô công nghiệp có thể bị xâm nhiễm bởi các chủng nấm men hoang dại, đặc biệt nghiêm trọng là trong số đó có cả các chủng nấm men sinh zymocin Chúng tiêu tốn cơ chất và giết chết các chủng nấm men sử dụng trong lên men Kết quả là các quá trình lên men bị ảnh hưởng và cho sản phẩm không đạt chỉ tiêu chất lượng Vấn đề này có thể được giải quyết phần nào bởi việc sử dụng zymocin và sử dụng các chủng lên men công nghiệp có khả năng miễn dịch với các zymocin sinh ra bởi các chủng nấm men nhiễm tạp Các chủng nấm men sinh zymocin và các chủng nấm men không mẫn cảm với các zymocin
đã được tạo ra bằng các kỹ thuật lai thông thường như tiếp hợp, dung hợp tế bào chất… và đã được sử dụng trong công nghiệp rượu, bia, siro, ethanol… Tập tính lên men của các chủng này vẫn được duy trì như các chủng bố mẹ [13] [10]
Ở một số loại sản phẩm, nấm men làtác nhân chủ yếu gây ra hư hỏng mà điển hình là ở các đồ uống được chế biến từ trái cây Vốn là nơi sống tự nhiên của nấm men, trái cây trở thành nguồn lây nhiễm nấm men chính trong quá trình chế biến các đồ uống này Do đó các sản phẩm có nguồn gốc trái cây bị làm hỏng bởi nấm men là điều dễ xảy ra, ví dụ nhưđối với nước ép trái cây, các đồ uống nhẹ có nguồn gốc từ trái cây và các đồ uống cacbonate khác Các
đồ uống nhẹ và các đồ uống cacbonate với các đặc điểm như pH thấp, nồng
độ oxy thấp, nồng độ đường cao… đã cung cấp điều kiện sống lý tưởng và một môi trường chọn lọc cho sự phát triển của nấm men Nấm men có khả năng lên men các loại đường có trong các sản phẩm này dẫn đến gây hư hỏng sản phẩm Đôi khi còn nguy hiểm hơn khi lượng khí chúng sinh ra trong quá trình lên men có thể gây nổ các dụng cụ chứa đựng gây nguy hiểm cho con người Mặc dù đã áp dụng các quy trình sản xuất tiên tiến với các khâu kiểm tra vệ sinh nghiêm ngặt cùng với việc sử dụng các chất bảo quản thực phẩm
Trang 22như acid sorbic, benzoate sự phá hỏng sản phẩm có nguồn gốc trái cây bởi nấm men vẫn thường xảy ra Hơn nữa việc sử dụng các chất này trong bảo quản nảy sinh các vấn đề mới đó là nồng độ cần thiết của các chất này đủ để ngăn ngừa sự phát triển của các nấm men là rất cao trong khi nồng độ cho phép của chúng trong các sản phẩm này lại chưa đủ đáp ứng được yêu cầu đó [12]
Phần lớn các zymocin không ổn định trước sự thay đổi của nhiệt độ và
pH, tuy nhiên bên cạnh đó vẫn có các ngoại lệ chẳng hạn như zymocin của
các loại Hansenula sp và của Williopsis mrakii Các loài này tạo ra các
zymocin có khả năng chịu được nhiệt độ cao, khoảng pH hoạt động rộng và
có phổ hoạt động rộng chống lại nhiều loài nấm men khác nhau Những ưu điểm đó đã đem lại các khả năng ứng dụng hiệu quả các zymocin này trong bảo quản thực phẩm, đặc biệt là bảo quản các đồ uống có nguồn gốc trái cây
và các đồ uống có độ đường cao khỏi sự xâm nhiễm và làm hỏng của các loài nấm men [12]
Zymocin đa phần không phù hợp cho mục đích sử dụng như là một kháng sinh chống nấm trong y học bởi vì chúng có bản chất là protein và thường hoạt động ở nhiệt độ và pH thấp Tuy nhiên, việc sử dụng một số zymocin với mục đích chống nhiễm trùng đường tiêu hoá, đường sinh dục và da bởi các nấm men gây bệnh là khả thi Một số nấm men tiết ra các zymocin có khả năng tiêu diệt được các chủng nấm men gây bệnh Các nghiên cứu sâu hơn với mục đích ứng dụng zymocin vào y học là cần thiết Một số zymocin là chất cảm ứng sinh interferon Ngoài ra các zymocin còn có hiệu lực trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng cơ hội ở bệnh nhân AIDS [13]
1.2.5 Tình hình nghiên cứu zymocin trên thế giới
Trên thế giới, các nghiên cứu về zymocin chủ yếu ở các chi:
Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis,Pichia , Candida…
Trang 23Các nghiên cứu cho thấy hoạt tính zymocin không đồng nhất giữa các loài hay chủng, các yếu tố di truyền, các tính chất vật lý và hóa học hoặc cơ chế tác động tới chủng nhạy cảm (Magliani et al, 1997; Schmitt và Breinig, 2002; Schmitt và Breinig, 2006)
Zymocin được biết đến như một tác nhân kiểm soát sinh học trong ngành công nghệ thực phẩm đặc biệt là quá trình lên men (Palpacelli et al, 1991; Lowes et al, 2000; Ciani và Fatichenti, 2001), trong y khoa (Morace et al, 1984; Morace et al, 1989; Buzzini và Martini, 2001), và là tác nhân chống nấm mới (Polonelli et al, 1994; Magliani et al, 2004) cũng như trong việc thiết kế và phát triển các công cụ cho công nghệ DNA tái tổ hợp (Meinhardt
et al, 1990; Becerra et al, 2001)
Sónia da Silva và cộng sự (2007) đã tiến hành thu hồi và nghiên cứu
zymocin từ chủng Candida nodaensischo thấy zymocin do chủng này sinh ra
có khả năng đối phó với các điều kiện môi trường rất đa dạng Zymocin do chủng Candida nodaensis sinh ra hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 18-
30ºC, bị bất hoạt ở nhiệt độ 40ºC-50ºC và pH cao Vòng vô khuẩn được thể hiện rõ khi có mặt NaCl [11]
Langeveld và cộng sự (1998) đã nghiên cứu nhân bản gen mã hóa
zymocin và sử dụng zymocin trong đồ uống từ các chủng Williopsis mrakii IFO 895, Hansenula saturnus IFO 117và Hansenula saturnus IFO 1466 Sử dụng chủng Hansenula anomala IFO 569 là chủng mẫn cảm Các chủng sinh
zymocin này được nuôi trong môi trường YNB (Yeast Nitrogen Base) 2,5%, đường 2,5% ở 25°C, pH 5, tốc độ 300 rpm Ly tâm để loại bỏ tế bào, phần dịch nổi được lọc qua màng lọc vô trùng sau đó kết tủa bằng methanol Hòa tan kết tủa trong đệm 10 mM phosphate pH 3,4 rồi nạp vào cột S Sepharose Fast Flow trên thiết bị FPLC Zymocin được rửa giải bằng NaCl 1M trong đệm phosphate10 mM pH 3,4 Các phân đoạn mang hoạt tính zymocin được bảo quản trong đệm phosphate10 mM pH 4,4 và ở -20ºC Zymocin do các
Trang 24chủng này sinh ra bền trong khoảng pH 3-9, gia nhiệt ở 80ºC, 100ºC và 120ºC trong 10 phút thì ở 120ºC hoạt tính giảm đi nhiều nhưng chưa bị mất hoàn
toàn trong đó hoạt tính của chủng Williopsis mrakii IFO 895cao hơn so với
hai loài kia Phổ hoạt động chống lại các loài nấm men khác: Chủng
Williopsis mrakii IFO 895 tiêu diệt được 19/26 chủng, Hansenula saturnus IFO117 và Hansenula saturnus IFO 1466 đều tiêu diệt được 13/26 chủng
[12]
1.2.6 Tình hình nghiên cứu zymocin ở Việt Nam
Các nghiên cứu về zymocin ở Việt Nam chưa được triển khai rộng rãi và còn nhiều hạn chế Viện Công nghiệp thực phẩm đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sinh tổng hợp chế phẩm sinh học zymocin nhằm mục đích bảo quản sơ chế nông sản thực phẩm (nước hoa quả, đồ uống lên men)” (2003) từ các các
chủng nấm men IFO 0895 (Williopsis sartunus var mrakii), Moniliellasp
SS4.2 và N14.1 và đã thu được các kết quả như sau:
Quá trình sinh tổng hợp zymocin của hai chủng IFO 0895 vàSS4.2 tăng lên theo độ giàu của môi trường và đạt cao nhất ở môi trường có chứa nhiều acid amin và vitamin (YPD).Riêng chủng N14.1 thì ngược lại, quá trình sinh tổng hợp zymocin của chủng này đạt cao nhất ở môi trường malt 4°Bx và maltglucose 2°Bx Phổ hoạt động của các zymocin trên 41 chủng nấm men khác nhau được xác định Trong số 41 chủng thử thì chủng IFO 0895 chống được 20 chủng chiếm gần 50% Hai chủng còn lại có phổ hoạt động hẹp hơn, chống 6 trong số 41 chủng được thử Giá trị pH thích hợp cho sinh tổng hợp zymocin của IFO 0895 là 3,4, của N14.1 là 6,5 và của SS4.2 nằm trong khoảng 2,6 đến 4,6 Các zymocin chỉ hoạt động trong vùng pH acid [2]
Các zymocin sinh ra từ các chủng nấm men này được thử tính bền nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau Đại đa số zymocin khảo sát đều tỏ ra rất mẫn cảm dưới tác dụng của nhiệt Tuy nhiên zymocin của SS4.2 và N14.1 tỏ ra có tính chịu nhiệt cao Zymocin của N14.1 hoàn toàn không ảnh hưởng bởi tác động
Trang 25của các enzyme thuỷ phân protein như protease K hay tripsin trong khi đó zymocin của SS4.2 có giảm hoạt tính Đáng lưu ý là zymocin của N14.1 có thể tách chiết hoàn toàn bằng dung môi ethylacetate ở pH thấp Những đặc điểm trên cho thấy zymocin của N14.1 không có bản chất protein trong khi đó zymocin của SS4.2 lại có bản chất này [2]
Zymocin do chủng Moniliella sp SS4.2 sinh ra có khả năng chịu nhiệt và
chịu pH thấp là một trong những đặc điểm hứa hẹn về khả năng ứng dụng trong công nghệ bảo quản thực phẩm như các sản phẩm lên men, nước quả Vì vậyTrung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực Phẩm đã bước đầu tiến hành nghiên cứu tinh chế zymocin do chủng
Moniliella sp SS4.2 sinh ra.Nghiên cứu cho thấy zymocin gốc do chủng
Moniliella sp SS4.2sinh ra có khả năng ức chế nấm men khi có mặtNaCl, khá bền nhiệt (gia nhiệt ở 100°C trong 15 phút vẫn chưa bị mất hoạt tính hoàn toàn), có dải pH hoạt động rộng (từ 2-9) và hoạt tính cao trong vùng pH acid,
có khả năng kết tủa bằng các dung môi hữu cơ như acetone, ethanol Vàdịch
zymocindo chủng Moniliella sp SS4.2 sinh ra bao gồm hai cấu tử có khối
lượng phân tử lần lượt là 16,6 kDa và 20,7 kDa Hoạt tính kháng nấm men của zymocin được chứng minh gây ra bởi sự có mặt đồng thời của hai cấu tử
này Để nghiên cứu về hoạt tính zymocin do chủng Moniliellasp SS4.2 sinh
ra đầy đủ và chi tiết hơn chúng tôi tiếp tục tiến hành tinh chế và bước đầu nghiên cứu đặc tính của zymocin sau tinh chế
1.3 THU HỔI VÀ TINH CHẾ PROTEIN
1.3.1 Phương pháp kết tủa
Để tách chiết các proteincó thể dùng muối ammonium sulfatehoặc các dung môi hữu cơ Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước Sự tương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ
Trang 26bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein các dung môi hữu cơ hoặc muối ammonium sulfate [16]
1.3.1.1 K ết tủa bằng muối ammonium sulfate
Để tủa protein từ dịch chiết thô ta dùng muối ammonium sulfate (NH4)2SO4, do nó có độ hoà tan rất cao (bão hòa 767 g/l,nhiệt độ 25°C), ít làm mất hoạt tính của protein thậm chí còn có tác dụng làm bền protein Ngoài ra ammonium sulfate có khả năng tủa chọn lọc protein (các protein khác nhau có thể được tủa bằng các nồng độ muối khác nhau) do đó giúp loại
một số protein không mong muốn ra khỏi dịch chiết [16]
Nhược điểm của phương pháp này là mất thời gian do nồng độ ammonium sulfate cao nên tỉ trọng dung môi lớn, để kết tủa protein cần phải
ly tâm tốc độ cao và ở nhiệt độ thấp
1.3.1.2 K ết tủa bằng các dung môi hữu cơ
Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi giảm xuống, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa Ethanol hay acetone thường được dùng để tủa protein cho mục đích tinh sạch Sự kết tủa có thể có tính chọn lọc một phần, nghĩa là các protein khác nhau có thể được tủa bằng các nồng độ khác nhau của dung môi Sau đó dung môi được loại bằng cách cho bay hơi trong chân không hay thậm chí trong không khí
Phương pháp này cũng tiến hành ở nhiệt độ thấp (từ 5°C trở xuống) Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới 0°C và có thể đến -20°C, như vậy nó có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách sử dụng máy ly tâm Phương pháp này có lợi thế là không cần loại muối, nhưng có nhược điểm là hay có màu của môi trường nuôi cấy [16]
Trang 271.3.2 Phương pháp sắc ký
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động Pha tĩnh trì hoãn sự di chuyển của các thành phần trong mẫu Khi các thành phần này di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng sẽ được tách khỏi nhau theo thời gian Mỗi một thành phần
đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là thời gian lưu Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân tử sinh học Sắc ký là phương pháp nhanh, dễ dàng và không ảnh hưởng đến protein, đây
là phương pháp được đề nghị trong nghiên cứu định lượng protein hay các phân tử [15]
1.3.2.1 S ắc ký lọc gel
Sắc ký lọc gel là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được sử dụng phổ biến trong tách chiết và tinh sạch protein.Có thể dùng phương pháp lọc gel để phân tách các protein có khối lượng phân tử và kích thước khác nhau Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng carbonhydrate) hay polyacrylamide Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100 µm (0,1 mm).Khi dung dịch chạy qua cột sắc ký lọc gel những phân tử nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân
tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt Vì vậy, những phân tử có kích thước nhỏ có thể lọt vào lỗ rây nên chảy xuống cột chậm hơn các phân tử lớn không lọt vào lỗ rây.Ngoài ra còn có thể dùng kỹ thuật này để loại muối thay cho quá trình thẩm tích
Trang 281.3.2.2 S ắc ký trao đổi ion
Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng
số của các protein Tại bất kỳ một pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều mang một điện tích tương ứng ở pH đó Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử protein mang điện tích trái dấu với chúng Nếu hạt mang điện tích
âm (như cột carboxymethyl-cellulose)gọi là sắc ký trao đổi ion dương sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi
là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, những protein cùng dấu với các hạt mang điện tích trong cột sẽ chạy ra khỏi cột và những protein trái dấu sẽ bị giữ lại cột Để đẩy những protein trong cột
ta phải tăng nồng độ nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế những phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích
1.3.2.3 S ắc ký tương tác kỵ nước
Sắc ký tương tác kỵ nước là phương pháp sắc ký dựa trên nguyên lý tương tác kỵ nước giữa các nhóm kỵ nước trên bề mặt của protein cần phân tách với các nhóm kỵ nước trên giá thể sử dụng Trong môi trường có nồng độ muối cao, phân tử protein bị mất lớp áo nước bao quanh, các nhóm kỵ nước lộ ra bên ngoài và sẽ tương tác với các gốc kỵ nước của giá thể Khi mẫu được nạp vào cột, trong điều kiện nồng độ muối cao sẽ ép các phần tử kỵ nước lại gần nhau và đính với nhau Quá trình rửa giải được thực hiện bằng cách giảm dần nồng độ muối
1.3.2.4 S ắc ký ái lực
Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học chuyên biệt Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu
Trang 29trong việc tách các yếu tố phiên mã, những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA Hỗn hợp protein thấm qua cột
có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được gắn vào thể mang; những protein
có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại [1]
1.3.2.5 S ắc ký lỏng cao áp
Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột
có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh
1.3.3 Phân tách protein bằng điện di SDS-PAGE
Phương pháp điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide GelElectrophoresis) còn được gọi là phương pháp điện di trên gel acrylamide khôngliên tục và mẫu protein được gây biến tính(discontinuous and denaturing) Dưới tác động của điện trường sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉphụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơnnhững phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sựphân tách tốt hơn, người
ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liêntục (discontinuous gel) Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp:
- Lớp stacking gel: Thông thường lớp gel này có nồng độ gel thấpvào
khoảng 4-5%, và nằm phía trên nơi tạo giếng bơm mẫu Khi có tác động củađiện trường các protein có trong mẫu sẽ bắt đầu di chuyển từ những giếng mẫu qualớp gel này Nhờ đó, các protein trong mẫu được
Trang 30dồn lại và tạo một lớp băng mỏngnằm ngay phía trên lớp gel phân tách, tạo điều kiện thuận lợi hơn trong việc phân tách protein
- Lớp gel phân tách (running gel): Lớp gel này có nồng độ gelcao hơn so
với lớp gel gom, và nằm phía dưới Có tác dụng chính trong việc tạo racác băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợpprotein xuất phát ban đầu
Trang 31PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU
2.1.1 Đối tượng
Nghiên cứu zymocin từ chủng nấm men đen Moniliella sp SS4.2 thuộc
bộ sưu tập giống của Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm Chủng được phân lập từ tương
Chủng mẫn cảm sử dụng trong nghiên cứu là Saccharomyces cerevisiae
SBY 2576
2.1.2 Vật liệu
2.1.2.1 Hóa ch ất
- Hóa chất dùng trong nuôi cấy
Agar (Việt Nam), Glucose (Trung Quốc), Yeastextract (Ấn Độ), Malt extract (Ấn Độ), Peptone (Ấn Độ)
- Hóa chất dùng cho điện di protein
Dung dịch điện giải (10×): 30 g Tris; 144 g Glycine; 10 g SDS; Nước cất vừa đủ 1000 ml
Dung dịch nhuộm gel: 1 g Coomassie Brilliant Blue R- 250 ; 450 ml Methanol; 100 ml Axit acetic; 450 ml Nước cất
Dung dịch tẩy màu I: 800 ml Methanol; 140 ml Axit acetic; 1060 ml Nước cất
Dung dịch tẩy màu II: 100 ml Methanol; 140 ml Axit acetic; 1760 ml Nước cất
Sample buffer
Trang 32Nước cất, acrylamide 30%, 1,5M Tris-HCl (pH 8,8), 1M Tris-HCl (pH 6,8),sodium dodecyl sunfate (SDS 10%), ammonium per sulfate (APS 30%), TEMED
1.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc
Bộ điện di protein Cleaver Scientific (Anh)
Hệ thống sắc kí FPLC AKTA Purifier, GE (Thụy điển)
Máy cô chân không RVC 2-25 CD, Sartorius (Đức)
Máy ly tâm lạnh cao tốc Sorvall, Thermo Scientific, Mỹ
Nồi hấp thanh trùng Himayatoko (Nhật)
Hệ thống lọc cross flow (Quixstand systems)
Dụng cụ: Đĩa petri, ống Eppendorf, ống Falcon, Pipet, bình tam giác các loại, bình Schott các loại, đầu côn các loại, que cấy các loại
1.2.3 Thành phần môi trường dùng trong nghiên cứu
Môi tr ường malt glucose 4°Bx
- Thành phần: Dịch chiết malt (2%), glucose (2%), agar (2%), nước cất
- Chuẩn bị: Cân các thành phần, cho hỗn hợp vào bình Schott rồi hấp
thanh trùng ở 121°C trong 15 phút, sau đó đổ ra đĩa petri trong điều
kiện vô trùng
- Tác dụng: Làm môi trường nuôi cấy trẻ hóa chủng SS4.2 và SBY 2576
Môi tr ường YM agar