Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh trưởng sinh tổng hợp acid clavulanic sinh ra từ chủng xạ khuẩn streptomyces clavuligerus

45 Hình 3.12 Vòng kháng khuẩn của B.cereus tại hàm lượng pepton khác nhau46 Hình 3.13 Ảnh hưởng của hàm lượng K2HPO4 đến khả năng sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus tự nhiên ...

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -


   -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI : “ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ KHẢ

NĂNGSINH TRƯỞNG–SINH TỔNG HỢPACID CLAVULANIC TỪ

CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CLAVULIGERUS”

Giáo viên hướng dẫn : TS Tạ Thị Thu Thủy

Sinh viên thực hiện : Trình Thị Thanh Hương

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS.Tạ Thị Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, truyền thụ cho em những kiến thức chuyên môn vô cùng quý báu cũng như lòng nhiệt tình trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Em xin cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình dạy dỗ cho em những kiến thức cơ bản đồng thời

đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận này Đồng thời em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo – Kỹ sư công nghệ sinh học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình , bạn bè, những người đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Do thời gian và khả năng của bản thân còn hạn chế, vì vậy bài khóa luận của em không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự chỉ bảo của thầy cô và sự đóng góp ý kiến của các bạn để khóa luận của em được đầy đủ và hoàn chỉnh hơn

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày15 tháng 5 năm 2017

Sinh viên Trình Thị Thanh Hương

MỞ ĐẦU 1

Phần 1:TỔNG QUAN 3

1.1.Đại cương về kháng sinh 3

1.1.1.Lịch sử về nghiên cứu kháng sinh 3

1.1.2 Khái niệm về kháng sinh 6

1.1.3 Phân loại kháng sinh 6

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 9

1.1.5.Các kháng sinh nhóm β-lactam 11

1.2.Đại cương về xạ khuẩn 13

1.2.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn 13

1.2.2.Cấu tạo xạ khuẩn 13

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh axit của xạ khuẩn 17

1.3.Tổng quan xạ khuẩn Streptomyces clavunigerus 18

1.3.1.Giới thiệu về Streptomyces clavuligerus 18

1.3.2 Lịch sử nghiên cứu 21

1.3.4.Cơ chế hoạt động của axit clavulanic 22

1.3.5 Ứng dụng 22

1.4.Mục tiêu và nội dung đề tài 23

1.4.1 Mục tiêu đề tài 23

1.4.2 Nội dung đề tài 23

1.4.3 Sơ đồ quy trình nghiên cứu: 23

PHẦN 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Vật liệu, hóa chất, môi trường nuôi cấy chủng VSVvà thiết bị 25

2.1.1.Vật liệu và môi trường nuôi cấy chủng VSV 25

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiếtbị 25

2.2.Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy các chủng vi sinh vật 28

2.2.2 Phương pháp bảo quản giống 30

2.2.3.Phương pháp xác định khối lượng tế bào 30

2.2.4 Phương pháp thí nghiệm xác định khả năng sinh trưởng và sinh axit 31

2.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính axit 33

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1.Kết quả nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus 35

3.1.1 Đặc điểm hình thái tế bào chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus 35

3.1.2 Đặc điểm sinh hóa 37

3.1.3 Khả năng sinh axit clavulanic ức chế β-lactam của chủng xạ khuẩn S.clavuligerus tự nhiên 40

3.1.4 Khả năng hỗ trợ tăng hoạt tính axit của chủngS.clavuligerus 41

3.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp 42

3.2.1 Ảnh hưởng của hàm lượng glycerol 42

3.2.2 Ảnh hưởng của hàm lượng pepton 44

3.2.3 Ảnh hưởng của chất khoáng 46

3.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 50

3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 50

3.3.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ 51

3.3.3.Ảnh hưởng của pH 53

3.3.4.Kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của sản phẩm từ chủng S.clavuligerus54 Phần 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 55

4.1 Kết luận 55

4.2 Đề xuất 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CKS Chất kháng sinh

D Đường kính trung bình vòng vô khuẩn tính theo

milimet Gram (-) Gram dương

Gram (+) Gram âm

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Cơ chế tác dụng của các kháng sinh 10

Bảng 2.1 Dụng cụ và thiết bị dùng trong đề tài 25

Bảng 2.2 Thành phần trong 1000ml môi trường giàu khoáng 27

Bảng 2.3 Thành phần trong 1000ml môi trường ISP2 27

Bảng 2.4 Môi trường LB 28

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbonhydrat đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 37

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của nguồn nito đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 39

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chất khoáng đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 39

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 40

Bảng 3.5 Kết quả về khả năng ức chế vi sinh vật của chủng xạ khuẩn 41

Bảng 3.6 Thử các nồng độ kháng sinh 41

Bảng 3.7 Kết hợp giữa axit clavulanic với kháng sinh amoxicilin 42

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của hàm lượng glycerol đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 43

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 45

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng K2HPO4 đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 46

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO4.7H2O đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum và bào tử của chúng 3

Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 10

Hình 1.3 Khuẩn ty của xạ khuẩn 16

Hình 1.4 Bào tử xạ khuẩn 17

Hình 1.5 Công thức phân tử axit clavulanic 20

Hình 1.6 Quá trình tổng hợp axit clavulanic 21

Hình 3.1 Khuẩn lạc của chủng S.clavuligerus tự nhiên trên đĩa thạch 35

Hình 3.2 Hình thái khuẩn ty của chủng xạ khuẩn S.clavuligerus 36

Hình 3.3 Bào tử của xạ khuẩn 37

Hình 3.4 Màu sắc dịch nuôi sau 24h và 72h của chủng S.clavuligerus 37

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbonhydrat khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 38

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nguồn nito khác nhau đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 39

Hình 3.7 Ảnh hưởng của chất khoáng đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus 40

Hình 3.8 Vòng kháng khuẩn giữa 2 vi sinh vật kiểm định 41

Hình 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng glycerol đến khả năng sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus tự nhiên 43

Hình 3.10 Vòng kháng khuẩn của chủng 44

Hình 3.11 Ảnh hưởng của hàm lượng pepton đến khả năng sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus tự nhiên 45

Hình 3.12 Vòng kháng khuẩn của B.cereus tại hàm lượng pepton khác nhau46 Hình 3.13 Ảnh hưởng của hàm lượng K2HPO4 đến khả năng sinh tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus tự nhiên 47

Hình 3.14 Vòng kháng khuẩn của B.cereus ở hàm lượng K2HPO4 khác nhau 47

Hình 3.16 Vòng kháng khuẩn của B.cereus tại các hàm lượng MgSO4.7H2O

khác nhau 49

Hình 3.17 Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng

hợp axit của chủng S.clavuligerus tự nhiên 50

Hình 3.18 Vòng kháng khuẩn của B.cereus tại thời gian nuôi cấy khác nhau

51

Hình 3.19 Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng

hợp axit của chủng S.clavuligerus tự nhiên 52 Hình 3.20 Vòng kháng khuẩn của B.cereus nuôi cấy tại nhiệt độ khác nhau 52

Hình 3.21 Biểu đồ ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh

tổng hợp axit của chủng S.clavuligerus tự nhiên 53 Hình 3.22 Vòng kháng khuẩn của B.cereus nuôi cấy tại pH khác nhau 54 Hình 3.23 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của chủng S.clavuligerus 54

MỞ ĐẦU

Trung bình mỗi năm có 200.000 người chết/năm do kháng kháng sinh

và ước tính tới năm 2020 con số này lên tới khoảng 10.000.000 người/ năm.Cơn ác mộng mang tên kháng kháng sinh đang đến rất gần.Đó là hiện tượng vi khuẩn không còn bị tiêu diệt bởi thuốc kháng sinh nữa Đáng buồn là điều này xảy ra do chính loài người chúng ta đã sử dụng kháng sinh bừa bãi không đúng liều lượng tạo điều kiện cho vi khuẩn sống sót, thích nghi và tự tiến hóa gen kháng thuốc.Chúng sinh sôi nảy nở rất nhanh và phát triển thành một loại mới

Hàng năm có tới hơn 50.000 người tại Mỹ chết vì nhiễm trùng mà không

có thuốc chữa Chúng ta đang quá chậm trong cuộc chạy đua với chúng và đến một ngày con người sẽ chết vì một vết thương nhỏ do kháng sinh đã không thể ngăn chặn vi khuẩn tiêu diệt con người nữa

Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang chịu sự tác động bất lợi của

sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn.Kết quả phân lập vi khuẩn cho thấy tỷ lệ kháng penicillin ở Việt Nam cao nhất (71,4%) tiếp theo là Hàn Quốc (54,8%), Hồng Kông (43,2%) và Đài Loan (38,6%) Tỷ lệ kháng erythromycin cũng rất cao, ở Việt Nam là 92,1%, Đài Loan là 86%, Hàn Quốc là 80,6%, Hồng Kông là 76,8% và Trung Quốc là 73,9%

Hiện nay sử dụng các chất ức chế lactamase kết hợp với kháng sinh lactam được coi là biện pháp hiệu quả chống lại cơ chế kháng thuốc đặc hiệu của vi khuẩn Phổ kháng khuẩn của axit được mở rộng trên các chủng vi khuẩn đề kháng do khả năng ức chế dẫn đến bất hoạt đa số β-lactamase tiết ra bởi vi khuẩn gram âm, gram dương và vi khuẩn kỵ khí Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy chế phẩm phối hợp có hiệu quả trong điều trị các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp, nhiễm trùng ổ bụng, nhiễm trùng da và mô mềm Cũng

β-có các bằng chứng ghi nhận hiệu quả điều trị của các kháng sinh này trong

điều trị sốt giảm bạch cầu trung tính và nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt khi kết hợp với các axit khác

Một trong những nguyên nhân vi khuẩn kháng kháng sinh là vi khuẩn tiết ra các enzyme β-lactamase khác nhau ở một số vi khuẩn gây bệnh Các β-lactamase phổ rộng là những enzyme được tạo bởi các vi khuẩn gram âm, có khả năng thủy phân các kháng sinh β-lactam có chứa một nhóm oxyimino (các cephalosporins thế hệ 3) nhưng chúng lại bị ức chế bởi các axit clavulanic

Hiện nay, các chế phẩm phối hợp axit lactam và chất ức chế lactamase được sử dụng rộng rãi bao gồm amoxicilin/axit clavulanic,ampicilin/axit clavulanic Axit clavulanic được sinh tổng hợp từ

β-chủng Streptomyces clavuligerus đã và đang được quan tâm và nghiên cứu

rất nhiều nước trên thế giới trong đó có cả Việt Nam,chủng xạ khuẩn này rất

có triển vọng ứng dụng thực tiễn Chính vì vậy,song song với việc tìm ra các loại thuốc kháng sinh mới thì việc nâng cao hiệu suất quá trình tổng hợp axit clavulanic – chế phẩm phối hợp giúp tăng hoạt tính kháng sinh nhóm nghiên

cứu thực hiện đề tài:“Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh

trưởng-sinh tổng hợp acid clavulanic sinh ra từ chủng xạ khuẩn

Streptomyces clavuligerus ”

PHẦN 1-TỔNG QUAN 1.1.Đại cương về kháng sinh

1.1.1.Lịch sử về nghiên cứu kháng sinh

a Trên Thế giới

Năm 1928, Alexander Fleming, một nhà khoa học Scotland,lần đầu tiên

thấy trong môi trường nuôi cấy tụ cầu vàng nếu có lẫn nấm Penicillium thì

khuẩn lạc gần nấm sẽ không phát triển được.Năm 1939,Florey và Chain đã chiết ra được ra từ nấm đó chất Penicillin dùng trong điều trị

Hình 1.1 Nấm mốc Penicillium chrysogenum và bào tử của chúng

[32], [33]

Vìbộ phận sinh sản của loài nấm mốc đó có hình dạng giống cái bút lông nên được đặt tên là Penicillium(tiếng la tinh Penicillium nghĩa là cái bút lông)

Năm 1938, Fleming nhận được thư của hai nhà khoa học từ trường Đại học Oxford là Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey, với lời đề nghị được hợp tác với ông để tiếp tục thực hiện công trình nghiên cứu về Penicillin

và họ thử nghiệm thành công Penicillin trên chuột vào năm 1940

Năm 1944,nhóm đã chọn được loại nấm sinhPenicillin ưu việt nhất là

chủng Penicillium chrysogenum, chế tạo loại Penicillin có hoạt tính cao hơn

cả triệu lần Penicillin do Flemming tìm thấy lần đầu năm 1928

Năm 1945,Fleming được giải thưởng Nobel về y học cùng Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey

Cùng với việc phát hiện ra Penicilin,thập kỉ 40-50 của thế kỉ XX cũng ghi nhận những bước tiến vượt bậc trong việc khám phá ra hàng loạt chất kháng sinh (CKS) mới có giá trị trong y học như:Sulfonamid (Gerhard Domard,1932), Streptomycin(Selman Waksmanvà Albert Schat,1944), Cloramphenicol(Erhlich,1947), Chlotetraxyclin (Dugar,1948),…

Tốc độ tìm kiếm các CKS ngày càng được đẩy mạnh.Nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện hàng loạt CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn.Năm 1945 phát hiện được 30 CKS, năm 1949 con số này là 150 CKS, năm 1953 xấp xỉ 450 CKS, năm 1980 có 5.500 chất và đến nay số lượng CKS được phát hiện lên tới 17.000 chất và khoảng 30.000 CKS bán tổng hợp,[2],[7].Tuy nhiên, trong số đó chi có 1÷2% CKS là có đủ tiêu chuẩn

để được sử dụng trong y học

Năm 1999, kháng sinh Lospomal HA – 92 được tách chiết từ xạ khuẩn

Streptomyces CDRLL – 312, cótác dụng ngăn chặn cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh

Tại Nhật Bản, năm 2003Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn

Streptomyces sp TP – A0356 bằng phương pháp sắc ký cột CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans Chất

này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư, có giá trị MIC là 0,01÷ 0,3 mg/ml

Tại Hàn Quốc, năm 2007 phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp

C684 sinh CKS Laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng Methicillin và các cầu khuẩn kháng Vancomycin

Năm 2002, tại Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp 201 có

khả năng sinh CKS mới là 2 - methylheptyl isonicotinate, CKS này có khả

năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Furasium oxysporum, F Solina,

b.Tại Việt Nam

Ở Việt Nam, người đầu tiên nghiên cứu CKS là giáo sư Đặng Văn Ngữ

Ông đã lấy dịch nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum và xạ khuẩn Streptomycesgrieus để điều trị vết thương cho thương binh trong chiến dịch

Đông Xuân 1951-1952, kháng chiến chống Pháp

Năm 1968, bộ môn công nghiệp Dược (trường Đại học Dược Hà Nội) được thành lập và đào tạo cán bộ chuyên khoa kháng sinh chuẩn bị cho công nghiệp kháng sinh.Năm 1970, đơn vị nàybắt đầu nghiên cứu chuyên đề kháng sinh do GS Trương Công Quyền phụ trách.Tại đâyđã phân lập được hàng nghìn chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau.Đáng chú ý là đã tuyển chọn được một chủng có khả năng chống vi khuẩn Gram (-), có hiệu quả tốt đối với

vi khuẩn gây bệnh mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa) Kháng sinh này lấy

tên là Dekamycin và sau này được xác định là Neomycin

Từ năm 1974,tại Viện Khoa học Việt Nam (nay là Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam) đã có một nhóm nghiên cứu về CKS.Nhiều chủng VSV sinh CKS có hoạt tính mạnh đã được ứng dụng trong bảo vệ thực vật.Một số chế phẩm kháng sinh như: Tetravit, Biovit, Baxitraxin…đã được sản xuất và đưa vào sử dụng trong chăn nuôi

Sau đó Việt Nam được nhiều đối tác nước ngoài như Liên Xô (cũ), Trung Quốc, Tây Ban Nha, Triều Tiên hợp tác và giúp sản xuất điều chế kháng sinh song cũng không thành công do nhiều nguyên nhân

Từ năm 1985 – 1990, một chương trình nghiên cứu cấp Nhà nước vềsản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin nhưng kết quả đạt được không cao về công nghệ lẫn hiệu suất

Từ năm 2000 đến nay, ở nước ta cũng có một số nhóm đã và đang tham gia nghiên cứu về kháng sinh và thu được một số kết quả như: nghiên cứu tối

ưu điều kiện lên men và môi trường sản xuất kháng sinhVancomycin từ

chủng Streptomyces orientalis (2004); nghiên cứu quy trình công nghệ lên

men sản xuất Vancomycin (2006); nghiên cứu quy trình tách chiết, tinh chế Doxorubicin (DXR)từ xạ khuẩn làm nguyên liệu điều chế thuốc điều trị ung thư và hệ bạch huyết

Ở Việt Nam cũng sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật nhập khẩu từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số

chủng xạ khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F oxysporum gâybệnh thối rễ ở thực vật Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong

lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định

1.1.2 Khái niệm về kháng sinh

Từ năm 1941, khi Penicillin được đưa vào sản xuất để dùng trong lâm

sàng thì kháng sinh được coi là “những sản phẩm trao đổi tự nhiên được các VSV tạo ra, có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các VSV khác”

Về sau với sự phát triển của khoa học người ta có thể phát triển tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (Chloramphenicol); tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh Sulfamid, Quynolon hay chiết xuất từ VSV những chất diệt được tế bào ung thư (Antinomycin) Vì thế định nghĩa kháng

sinh đã được thay đổi “khángsinh là những chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các VSV nhiễm sinh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật bằng con đường cung cấp chung”,[25]

1.1.3 Phân loại kháng sinh

Có nhiều cách phân loại kháng sinh tùy theo mục đích nghiên cứu và cách sử dụng chúng Có thể dựa vào mức độ tác dụng, dựa vào phổ tác dụng kháng sinh, dựa vào nguồn gốc, dựa vào cơ chế tác dụng và cấu trúc hóa học của chất kháng sinh [25]

1.1.3.1Dựa theo cấu trúc hóa học

Phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái nhìn tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh Theo đó, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính [25]

1) Các kháng sinh cacbonhydrat

Các saccarid thuần nhất (nojimycin)

Các kháng sinh macrolid (erythromycin)

Các kháng sinh polyen (nystatin)

4) Các kháng sinh peptid và acid amin

Các dẫn chất axit amin (cycloserin)

Các kháng sinh β-lactam (penicillin)

Các kháng sinh peptid (bacitracin)

Các cromopeptid (actinomycin)

Các depipeptid (valinomycin)

Các peptid tạo kelat (bleomycin)

5) Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ

Các kháng sinh nucleozid (polyoxin)

6) Các kháng sinh dị vòng chứa oxi

Các polyete (monenzin)

7) Các kháng sinh mạch vòng no

Các dẫn chất alkan (cyclohexamid)

Kháng sinh stroid (acid fuzidic)

8) Các kháng sinh chứ nhân thơm

Các dẫn chất benzene (chloramphenincol)

Các chất nhân thơm ngưng tụ (griseofulvin)

Các ete thơm (novobiovin)

9) Các kháng sinh mạch thẳng

Các chất chứa P (phosphomycin)

Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh

Nhóm có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng lên một loại hay một nhóm vi khuẩn nào đó: Penicillin cổ điển chỉ tác dụng lên vi khuẩn Gram (+) hay nhóm thuốc tác dụng lên vi khuẩn Gram (-) như Streptomycin

Nhóm kháng sinh có tác dụng rộng, chúng có tác dụng với cả vi khuẩn Gram (+), Gram (-), Rickestsia, virus cỡ lớn, đơn bào: Chloramphenicol, Tetracillin

Nhóm kháng sinh dùng ngoài là các chất kháng sinh không hoặc ít được hấp thụ ở đường tiêu hóa Chất kháng sinh này thường độc, bao gồm các kháng sinh có tác dụng với vi khuẩn Gram(-) như: Baxitraxin, Heliomycin: tác dụng vớivi khuẩn Gram (-) như Neomycin, Polymycin Nhóm kháng sinh chống lao: Rifamycin

Nhóm kháng sinh chống nấm như: Nystatin, Frycefulvin,

Ampoterytin-B

Dựa vào nguồn gốc

Kháng sinh có nguồn gốc từ sinh vật, xạ khuẩn

Nhóm kháng sinh có nguồn gốc hóa dược hay do con người tổng hợp nên

Dựa vào cơ chế tác dụng

Dựa vào cơ chế tác dụng người ta chia thành 2 nhóm:

 Nhóm kháng sinh có tác dụng lên tế bào vi khuẩn gồm các kháng sinh:

- Nhóm kháng sinh tác dụng lên quá trình tạo vách tế bào: Penicillin và các chất thuộc nhóm β – lactamin, Vanomycin, Baxtracin…

- Kháng sinh tác dụng lên màng tế bào Các chất này làm rối loạn tính thấm của vỏ và màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn, làm cho chức năng hàng rào bị phá hủy, vi khuẩn bị rối loạn quá trình động hóa và dị hóa

Do vậy mất khả năng lấy chất dinh dưỡng cần thiết và thải các sản phẩm của quá trình dị hóa ra ngoài: Colisstin, Polymycin…

 Nhóm kháng sinh tác dụng lên hệ phi bào làm rối loạn các họat động sống của tế bào trong nguyên sinh chất bao gồm:

- Kháng sinh làm rối loạn và ức chế tác dụng tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn ở mức ribosome Vi khuẩn không tạo nên các chất tham gia vào quá trình phân chia, di truyền của tế bào vi khuẩn

- Kháng sinh ức chế sự tổng hợp nên các acid nucleic: DNA và RNA Các kháng sinh này rất động, cùng để chữa ung thư, ít dùng trong thú y

Chất kháng sinh kìm khuẩn gồm các chất ức chế sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gắn các emzyme hay các ribosome 30S, 50S, và 70S như: Slphamid Teracillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Novobiocin, các chất kháng sinh được phối hợp giữa Sulphamid với Trimethorpim theo tỉ lệ 5/1 và Tiamulin

1.1.4Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Hình 1.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất khác nhau của tế bào VSVgây bệnh Chúng liên kết vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào VSV mà tạo ra các phản ứng trao đổi chất.Các đích tác dụng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong nhiều trường hợp người ta vẫn chưa biết được chính xác hết Nhìn chung, có thể phân chia cơ chế tác dụng của kháng sinh theo các nhóm kháng sinh như bảng 1:

Bảng 1 Cơ chế tác dụng của các kháng sinh

Nơi tác dụng Kháng sinh Quá trình bị ngăn cản Loại tác

dụng Thành tế bào Bacitracin

Các cephalosporin Các penicillin Cycloserin

Vancomycin

Tổng hợp mucopeptid Thành tế bào

Thành tế bào Tổng hợp peptid của thành tế bào

Chức năng của màng Chức năng của màng Tương tác của màng

Diệt nấm

- Diệt khuẩn Các Ribosom Chloramphenicol Tổng hợp protein Kháng

khuẩn Tiểu phân

50S

Erythromycin Tổng hợp protein Kháng

khuẩn Tiểu phân

30S

Các aminoglycosid

Các tetracyclin

Tổng hợp protein và làm sai lệch quá trình này Tổng hợp protein

Diệt khuẩn

Kháng khuẩn Các axit

nucleic

Actinomicin

Griseofulvin

Tổng hợp ADN và m.ARN

Phân chia tế bào

Diệt khuẩn

Kháng nấm ADN hoặc

ARN

Mitomycinl Rifampin

Tổng hợp ADN Tổng hợp mARN

Diệt nấm Diệt khuẩn

1.1.5 Các kháng sinh nhóm β-lactam

Giới thiệu về kháng sinh nhóm β- lactam

• Amoxycillin

Amoxycillin hoặc moxicillin hay được gọi tắt là amox, là thuốc kháng sinh cùng họ với penicilin thuộc nhóm kháng sinh β- lactam, nó ngăn chặn và diệt các loại vi khuẩn gram dương như viêm họng, da tấy mủ hay nhiễm trùng

da, nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm phổi…

có mủ, áp -xe, đầu đinh viêm tai giữa, bàng quang và thận

Ampicilin là một kháng sinh tương tự penicilin tác động vào quá trình nhân lên của vi khuẩn, ức chế sự tổng hợp mucopeptid của thành tế bào vi khuẩn nhưng không có khả năng kháng β- lactamase

Công thức hóa học:

Công thức phân tử:C16H19N3O4S

1.2Đại cương về xạ khuẩn

1.2.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm Tên xạ khuẩn

là actinomycete, bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và “mykes” (nấm) Ban đầu xạ khuẩn được coi là nấm nhỏ vì chúng sinh trưởng giống với nấm

Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes (gồm vi khuẩn Gram (+) và xạ khuẩn(-), thuộc giới vi khuẩn thật và vi khuẩn nhân sơ Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó

có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chị còn lại được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm [33]

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt

độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25-30oC Tuy nhiên, nhiệt độtối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường chỉ nằm trong khoảng 18-28oC Độ ẩm thích hợp đối với xạ khuẩn dao động trong khoảng 40 - 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 – 7,5 Xạ khuẩn không có giới tính, [25] Xạ khuẩn có khả năng hình thành enzyme và các chất kháng sinh nên được ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực của đời sống

1.2.2Cấu tạo xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram (+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân

Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60 ÷ 120 Å, khi già có thể đạt tới 150 ÷ 200Å, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50Å, lớp trong dày khoảng 50Å Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptitbao gồm các gốc N -axetyl glucozamin liên kết với N-axetyl muramic Khi xử lý bằng lysozym, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este - clorofom và các dung môi hoà tan lipit khác Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit (thành HSKS có nhiều lipit hơn so với HSCC) khác với nấm Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenlulozơ và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào,[16], [23], [26], [29]

Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính,[14], [8]

Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L

- ADP) và glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm này

Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso -2,6- diaminopimelic (m - ADP) và glyxin

Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso diaminopimelic

-2,6-Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso -2,6- diaminopimelic, arabinozơ và galactozơ

Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn

Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với

tế bào vi khuẩn Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryot ở chỗ chúng có tỷ lệ G-C rất cao trong ADN, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 ÷ 45%,[10]

Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram (+) nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể (NST) còn có các yếu tố di truyền ngoài NST, chúng có thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như: có thêm khả năng phân giải một số hợp chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gen, sản xuất các CKS trong đất và môi trường tuyển chọn, [13]

Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng

là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn…Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau

là khác nhau

a.Khuẩn lạc

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh

và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử), [9]

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,

da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,52 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường

kính 1cm hoặc lớn hơn Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong

b.Khuẩn ty

Hình 1.3 Khuẩn ty của xạ khuẩn

Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (HSCC hay khuẩn ty cơ chất) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (HSKS hay khuẩn ty khí sinh) với chức năng chủ yếu là sinh sản

Nhiều loại chỉ có HSCC nhưng cũng có loại lại chỉ có HSKS (như chi

Sporichthya) Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ

dinh dưỡng

Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường

c Bào tử của xạ khuẩn

Hình 1.4 Bào tử xạ khuẩn

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạkhuẩn Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhấttrong

phân loại xạ khuẩn

Bào tửxạ khuẩn được bao bọc bởi màng polysaccarit giàu protein với độ dày khoảng 300 ÷ 400 Å,chia 3 lớp Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH…

Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên, những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau, [12]

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh axit của xạ khuẩn

Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình thành axit Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đường là khác nhau, có chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucozơ, mannozơ,glycerol, fructozơ có chủng sử dụng tốt loại đường đôi như saccarozơ, maltozơ Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại axit hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh axit

Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh axit đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ thực vật như: bột đậu tương, cao ngô Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên lượng phốt phát vô cơ trong cao ngô cao sẽ ức chế sinh tổng hợp axit , [22] Nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là muối amon Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp axit của nhiều chủng xạ khuẩn

Ảnh hưởng của pH

Sinh tổng hợp axit phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường, pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym và tác động gián tiếp qua môi trường, pH thích hợp cho sinh tổng hợp axit thường là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp axit,[17], [23]

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp axit của xạ khuẩn Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 ÷ 300C, nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng và tổng hợp axit thường chỉ nằm trong khoảng

18 ÷ 280C, [1]

Ảnh hưởng của các yếu tố vi lượng

Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men Nếu môi trường lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng đã có sẵn Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp axit của nhiều chủng xạ khuẩn

1.3 Tổng quan xạ khuẩn Streptomyces clavunigerus

Chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus là chủng xạ khuẩn được cung

cấp từ phòng thí nghiệm iBR – Khoa Hóa dược – Đại học Sunmoon, Hàn Quốc

1.3.1 Giới thiệu về Streptomyces clavuligerus

a. Streptomyces clavuligerus

Streptomyces clavuligerus là một loài vi khuẩn được sử dụng để sản

xuất axitclavulanic.S.clavuligerus ATCC 27064 (NRRL 3585, DSM 738) đã

được phát hiện lần đầu tiên bởi Higgens và Kastner,được phân lập từ một

mẫu đất Nam Mỹ.S clavuligerus là một loài vi khuẩn Gram.S.clavuligerus

sản xuất hơn 20 chất chuyển hóa thứ cấp, trong đó có nhiều β-lactam kháng sinh như axit clavulanic, cephamycin C, deacetoxycephalosporin C, penicillin N ( chất trung gian trong cephamycin C đường) và ít nhất bốn

clavams khác,[15],[20]

Một đặc điểm quan trọng củaStreptomyces clavuligerus là nó không có

khả năng sử dụng glucose như một nguồn carbon vì nó thiếu một hệ thống vận chuyển glucose

b Axit clavulanic

• Giới thiệu:

Axit clavulanic được phát hiện bởi nhà khoa học người Anh làm việc tại các công ty dược Beecham Sau nhiều nỗ lực, cuối cùng Beecham đã đệ đơn xin cấp bằng sáng chế Mỹ bảo vệ cho thuốc vào năm 1981, và Bằng sáng chế

Mỹ 4.525.352, 4.529.720, 4.560.552 và đã được cấp trong năm 1985.Axit clavulanic là một chất ức chế của β –lactamase mạnh, enzym chịu trách nhiệm cho quá trình thủy phân các kháng sinh β-lactam.AC là một chất bán

tổng hợp chất ức chế β-lactamase tách chiết từ chủng Streptomyces clavuligerus, [16].

Axit clavulanic có hoạt tính kháng khuẩn yếu đối với hầu hết các loại vi khuẩn với các giá trị nồng độ ức chế tối thiểu 25-125 mg ml -1 Tuy nhiên, axit clavulanic có chứa một vòng β-lactam và liên kết mạnh mẽ với β-lactamase tại hoặc gần vị trí hoạt động của nó, do đó cản trở hoạt động của enzyme Điều này bảo vệ kháng sinh β-lactam không bị thủy phân bởi enzyme β-lactamase xúc tác, qua đó tăng cường tác dụng kháng khuẩn của kháng sinh Do đó axit clavulanic được sử dụng kết hợp với thuốc kháng sinh

như penicillin và cephalosporin,

Với cấu trúc β-lactam, axit clavulanic có c

nhưng được sinh tổng hợ

enzyme khác nhau

khuẩn S.clavuligerus sử

penicillin và cephalosporin, để điều trị các bệnh nhiễmtrùng do vi khu

[17]

u trúc hóa học của axit clavulanic

Axit clavulanic có công thức cấu tạo: (3-(2-hydroxyethylidene)

azabicyclo[3.2.0] heptane-2-carboxylic acid

Hình 1.5 Công thức phân tử axit clavulanic

ổng hợp AC Axit clavulanic được tổng hợp từ các axit amin

glyceraldehyde 3-phosphate,[18]

lactam, axit clavulanic có cấu trúc tương tựổng hợp bởi các một con đường khác nhau vớenzyme khác nhau Axit clavulanic được sinh tổng h

Hình 1.

1.3.2 Lịch sử nghiên c

Axit clavulanic đư

khoa học Anh đang làm vi

nỗ lực, Beecham cuối cùng

1981, và bằng sáng chế

Một số nghiên cứu về ch

• Nghiên cứu sản xu

tự nhiên ở quy mô phòng thí nghi

• Tối ưu hóa các thành ph

Streptomyces clavuligerus

đời sống, Đại học Sun Yat

• Cải tiến quy trình nuôi ch

hợp axit clavulanic: lên men liên t

i cùng đã nộp đơn bảo hộ bằng sáng chế cho thu

ế Hoa Kỳ được ban hành năm 1985

chủng Streptomyces clavuligerus trên thế

n xuất axit clavulanic từ chủng Streptomyces clavuligerus

quy mô phòng thí nghiệm

u hóa các thành phần môi trường để sản xuất axit clavulanic b

Streptomyces clavuligerus ( Khoa Hóa sinh, trường cao đ

c Sun Yat-sen, Quảng Châu, Trung Quốc)

n quy trình nuôi chủng Streptomyces clavuligerus

p axit clavulanic: lên men liên tục hoặc bán liên tục của ngu

maltose và glycerol); lên men kiểm soát photphat hòa tan trong

ng ngay từ đầu và trong suốt quá trình lên men ( EP Patent

0822689, Antibioticos, SA)

75 bởi các nhà ,[23] Sau nhiều cho thuốc năm

m soát photphat hòa tan trong

t quá trình lên men ( EP Patent

• Đột biến Streptomyces clavuligerus bằng phương pháp vật lý: sử dụng

tia UV đã tạo ra chủng đột biến sinh tổng hợp axit cao hơn so với tự nhiên là 48% ( trung tâm nghiên cứu Dokki,Giza , Ai Cập )

1.3.3Cơ chế hoạt động của axit clavulanic

Axit clavulanic hoạt động như một chất ức chế mạnh của β-Lactamase Các cơ chế quan trọng nhất đối với các vi khuẩn kháng với beta-lactam các kháng sinh như penicillin và cephalosporin là sản xuất enzym β-lactamase.Giống vi khuẩn gram(-), Gram(+), gây bệnh có khả năng sản xuất β-lactamase dẫn đến ức chế hoạt tính kháng sinh thông qua quá trình thủy phân của vòng β-lactam hoạt động Axit clavulanic hoạt động như một chất

ức chế mạnh của β- lactamase và đãđược sử dụng kết hợp với các kháng sinh β-lactam thường, [22]

Axit clavulanic có chứa một vòng lactam và liên kết mạnh mẽ với lactamase tại hoặc gần vị trí hoạt động của nó, do đó cản trở hoạt động của enzyme Điều này bảo vệ kháng sinh β-lactam khác từ β-lactamase xúc tác, qua đó tăng cường tác dụng kháng khuẩn Chất này được sử dụng kết hợp với thuốc kháng sinh dễ bị β-lactamase, như penicillin và cephalosporin, để điều trị nhiễm trùng do vi khuẩn sản xuất β-lactamase, [24]

β-1.3.4 Ứng dụng

Sự kết hợp của axit clavulanic vớiamoxicillin là ví dụ phổ biến nhất và hiệu quảvới mức độ cao của hoạt tính kháng khuẩn được sử dụng trong cácđiều trị các bệnh truyền nhiễm

Axit clavulanic giúp cho amoxicillin không bị β- lactamase phá huỷ, đồng thời mở rộng thêm phổ kháng khuẩn của amoxicillin một cách hiệu quảđỗi với nhiều vi khuẩn thông thường đã kháng lại amoxicillin, kháng các penicillin khác và các cephalosporin

Có thể coi amoxicillin và clavulanat là thuôc diệt khuẩn đối với các

Pneumococcus, các Streptococcus β tan máu, Staphylococcus (chủng nhạy cảm với penicillin không bịảnh hưởng của penicillinase), Haemophilus influenza và Branhamella catarrhalis kể cả những chủng sinh sản mạnh β-

lactamase ,[19]

Sự kết hợp của axit clavulanic với amoxicillin được sử dụng trong các điều trị các bệnh truyền nhiễm:

• Nhiễm khuẩn nặng đường hô hấp trên: viêm amidan, viêm xoang, viêmtai giữa đãđược điều trị bằng các kháng sinh thông thường nhưng không đỡ

• Nhiễm khuẩn đường hô hấp dưới bởi các chủng H.influenza và Branhamella catarrbalis sản sinh β- lactamase: viêm phế quản

cấp và mạn, viêm phổi - phế quản, [21]

• Nhiễm khuẩn nặng đường tiết niệu - sinh dục bởi các chủng E.coli,

Klebsiella và Enterobacter sản sinh: viêm bàng quang, viêm niệu

đạo, viêm bể thận (nhiễm khuẩn đường sinh dục nữ)

• Nhiễm khuẩn da và mô mềm: mụn nhọt, áp xe, nhiễm khuẩn máu sản khoa, nhiễm khuẩn trong ổ bụng (tiêm tĩnh mạch trong nhiễm khuẩn máu, viêm phúc mạc, nhiễm khuẩn sau mổ, đề phòng nhiễm khuẩn trong khi mổ dạ dày, ruột,tử cung, đầu và cổ, tim, thận, thay khớp vàđường mật),[20]

1.4 Mục tiêu và nội dung đề tài

1.4.1 Mục tiêu đề tài

 Nghiên cứu về đặc điểm sinh học của Streptomyces clavuligerus

 Nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp- sinh trưởng của chủng xạ khuẩn để tạo ra axit clavulanic

1.4.2 Nội dung đề tài

 Nghiên cứu đặc điểm chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus

 Lựa chọn môi trường thích hợp sinh tổng hợp sinh axit clavulanic sinh

ra từ chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus

 Lựa chọn điều kiên thích hợp nuôi cấy xạ khuẩn sinh axit clavulanic

sinh ra từ chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus

1.4.3 Sơ đồ quy trình nghiên cứu:

Nuôi cấy chủng trên môi trường giàu khoáng

Lựa chọn được môi trường nuôi cấy

Thử hoạt tính kháng sinh

Nghiên cứu đặc điểm hình thái

Tối ưu môi trường nuôi cấy

Thời gian

Chủng xạ khuẩn Streptomyces clavuligerus

PHẦN 2:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hóa chất, môi trường nuôi cấy chủng VSVvà thiết bị

2.1.1Vật liệu và môi trường nuôi cấy chủng VSV

2.1.1.1 Chủng xạ khuẩn

Chủng xạ khuẩn S.clavuligerus cung cấp từ phòng thí nghiệm iBR –

Khoa Hóa dược – Đại học Sunmoon, Hàn Quốc

2.1.1.2 Chủng VSV kiểm định

VikhuẩnGram(-): Escherichia coli (E.coliJM109)

VikhuẩnGram(+): Bacillus cereus , ( B.cereus ).

Các chủng VSV được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử , Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học mở Hà Nội và Khoa vi sinh - Viện kiểm nghiệm thuốc TW

8 Máy ly tâm ống eppendorf LABNET , Mỹ