Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và khả năng sinh tổng hợp enzym endolysin có hoạt lực diệt vi khuẩn staphylococcus aureus của dòng thực khuẩn thể NA6

Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh Staphylococcus aureus của dòng thực khuẩn thể NA6 35 3.1.1.. Sinh viên: Nguyễn Thị DungDANH MỤC HÌNH Hình 2: Tụ cầu Staphylococcus aure

Trang 1

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

STAPHYLOCOCCUS AUREUS CỦA DÒNG THỰC KHUẨN THỂ NA6”

Người hướng dẫn : ThS Nguyễn Thị Hồng Hải Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Dung

Lớp : CNSH 13-02

Hà Nội - 2017

Trang 2

Sinh viên: Nguyễn Thị Dung

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS

Nguyễn Thị Hồng Hải, cùng toàn thể các cán bộ Bộ môn Vi sinh – Viện Di

truyền Nông nghiệp đã tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian thực tập tại Bộ môn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong khoa Công Nghệ sinh học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm tôi học tập Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quí báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn ở cạnh tôi, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng tôi kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong sự nghiệp cao quý Đồng kính chúc các Cô, Chú, Anh, Chị trong Bộ môn

Vi sinh – Viện Di truyền Nông nghiệp luôn dồi dào sức khỏe, đạt được nhiều thành công tốt đẹp trong công việc

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Dung

Trang 3

MỤC LỤC

1.1.Khái quát chung về tình hình ngộ độc thực phẩm hiện nay 3

1.2 Vi sinh vật gây bệnh Staphylococcus aureus 8

Trang 4

1.3 Tổng quan về enzym endolysin 21

1.3.4 Ứng dụng của endolysin trong công nghệ sinh học thực phẩm 26

1.4 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh enzym

1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy 28

PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.3.1 Các môi trường nuôi cấy chủ yếu 30

2.3.2.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của thực khuẩn thể

Trang 5

2.3.2.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy, thành phần môi trường tới sự phát triển và hoạt tính của dòng thực khuẩn thể NA6 33

3.1 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn gây bệnh Staphylococcus

aureus của dòng thực khuẩn thể NA6 35

3.1.1 Nguồn gốc và hình thái của dòng thực khuẩn thể NA6 35

3.1.2 Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus

3.2 Xác định nguồn sinh enzym endolysin có khả năng ức chế vi khuẩn

gây bệnh Staphylococus aureus của dòng thực khuẩn thể NA6 37

3.2.1 Đánh giá khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh của dòng

3.2.2 Xác minh endolysin qua khả năng kháng endolysin của dòng

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH, nhiệt độ đến sự phát triển và

hoạt tính của dòng thực khuẩn thể NA6 42

Trang 6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Những đặc tính của S aureus, S epidermidis và Micrococci 11

Bảng 2: Các đặc điểm của endolysin để ứng dụng trong thực phẩm 23

Bảng 3: Đường kính vòng phân giải vi khuẩn S aureus của dòng thực

Bảng 10: Ảnh hưởng của các nguồn Nitơ đến sự phát triển và hoạt tính

Trang 7

DANH MỤC HÌNH

Hình 2: Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dương dưới kính hiển vi 9

Hình 3: Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus 13

Hình 4: Cấu trúc điển hình của vách peptidoglycan của vi khuẩn

Gram dương 22

Hình 5: Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn Staphylococcus aureus 35

Hình 6: Hoạt tính đối kháng với vi khuẩn gây bệnh S aureus của

Hình 7: Khả năng ức chế vi khuẩn S.aureus của TKT NA6 khi nuôi ở 350C 43

Hình 8: Khả năng phát triển và ức chế vi khuẩn gây bệnh S.aureus

của dòng TKT NA6 trên môi trường TSB có bổ sung 0,5% lactose 46

Trang 8

Sinh viên: Nguyễn Thị Dung 1

LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay ngộ độc thực phẩm đã và đang là mối lo ngại nghiêm trọng cho

sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới Nguyên nhân là do con người sử dụng

các loại thực phẩm đã bị nhiễm các loài vi khuẩn gây bệnh hay độc tố của

chúng Mặc dù đã có công nghệ hiện đại, các phương pháp thực hành sản xuất

tốt (GMP), kiểm soát chất lượng và vệ sinh cũng như an toàn sản xuất và đánh

giá rủi ro (HACCP), nhưng số lượng các trường hợp bị ngộ độc và bị bệnh do

thực phẩm vẫn tăng lên trong suốt thập kỷ qua Ở châu Âu, mỗi năm ước tính có

hơn 380.000 người dân bị bệnh do sử dụng các sản phẩm thực phẩm nhiễm vi

khuẩn, các loại vi khuẩn gây bệnh như: Staphylococcus aureus, Salmonella và

Listeria [16]

Staphylococcus aureus là tác nhân phổ biến gây nhiễm trùng bệnh viện

cũng như trong cộng đồng dân cư với tỷ lệ mắc và tử vong cao trên toàn thế

giới S aureus khi nhiễm độc thức ăn, đồ uống do tiếp xúc giữa người mang

mầm bệnh sẽ có thể dẫn đến và viêm ruột cấp do các thức ăn có chứa độc tố ruột

của S aureus, gây mất nước và điện giải có thể dẫn tới sốc S aureus là một

trong những nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện, những chủng S

aureus gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường có khả năng kháng lại nhiều kháng

sinh S.aureus còn gây hội chứng sốc nhiễm độc do tiết ra độc tố gây sốc Theo

một số cơ quan quản lý thực phẩm châu Âu, các vi sinh vật gây bệnh phổ biến

có nguồn gốc từ thực phẩm bao gồm Salmonella, Escherichia coli O157:H7, S

aureus và Listeria cùng với một số loài khác Sử dụng các chất hóa học để bảo

quản thực phẩm ít được chấp nhận vì nhiều chất bảo quản hóa học đã làm ảnh

hưởng lâu dài tới sức khỏe cộng đồng Trong số các chất bảo quản sinh học

được biết hiện nay, endolysin hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa

học do nó có khả năng diệt và ức chế các vi sinh vật gây bệnh

Trang 9

Endolysins (hay tên gọi khác là lysins) là các enzym thủy phân có nguồn

gốc từ thực khuẩn thể (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan của

thành tế bào vi khuẩn trong giai đoạn cuối chu trình sinh sản của thực khuẩn thể

Các enzyme này làm giảm độ mạnh cơ học của thành tế bào dẫn đến dung giải

tế bào và giải phóng ra các thực khuẩn thể thế hệ tiếp theo Do đó khi có mặt

endolysins chúng có thể phân hủy lớp peptidoglycan của thành tế bào của mọi vi

sinh vật khi chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết, do vậy chúng được coi

như là một chất kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọn lọc, không thay đổi

đặc điểm cảm quan, kết cấu của thực phẩm và rất an toàn cho con người

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng sinh tổng hợp enzym endolysin

có hoạt lực diệt vi khuẩn Staphylococcus aureus của dòng thực khuẩn thể

NA6”

MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và khả năng sinh tổng hợp enzym

endolysin để dòng thực khuẩn thể NA6 có hoạt lực diệt vi khuẩn gây bệnh

Staphylococcus aureus cao nhất

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

1 Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn gây bệnh S aureus của dòng thực khuẩn

thể NA6

2 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của dòng thực khuẩn thể NA6

3 Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy (nguồn carbon, nitơ, muối

khoáng ) đến khả năng sinh tổng hợp enzym endolysin và hoạt tính kháng

khuẩn của dòng thực khuẩn thể NA6

4 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ đến sự phát triển và hoạt tính của dòng thực

khuẩn thể NA6

Trang 10

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Khái quát chung về tình hình ngộ độc thực phẩm hiện nay

1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên thế giới

Từ năm 1973 đến năm 1987, theo thống kê của Cơ quan Kiểm soát bệnh

tật (Centers for Disease Control: CDC) tại Atlanta (Hoa Kỳ), ước tính có khoảng

500 trận dịch bệnh do thức ăn gây nên, ảnh hưởng trung bình khoảng 16.000

người mỗi năm Tuy nhiên, những con số này chưa được đánh giá một cách đầy

đủ, chưa phản ánh thật sự tầm quan trọng của vấn đề Tỉ lệ mắc bệnh hàng năm

là bao nhiêu thì không rõ, nhưng theo thống kê của các cơ quan y tế Hoa Kỳ, chỉ

riêng tại Hoa Kỳ, ước tính có khoảng 6.500.000 đến 81.000.000 lượt bệnh mỗi

năm Ở Á châu, nhiều trận dịch ngộ độc thức ăn gần đây được ghi nhận tại Nhật

và điều này làm cho nhiều quốc gia khác phải lo ngại

Từ tháng 3 đến tháng 5 năm 2010, một biến cố ngộ độc do vi khuẩn

E.coli nhiễm từ cải Romaine lettuce đã xảy ra tại Michigan, New York,

Tennessee và Pennsylvania, Hoa Kỳ Thủ phạm là một chủng E.coli mới, đó là

E.coli 0145 Đây là một chủng loại hiếm thấy nên ít được các nhà khoa học

quan tâm đến E.coli 0145 cũng gây bệnh tương tự như E.coli 0157:H7 Biến cố

trên đã làm cho vài chục người ngã bệnh

Vào trung tuần tháng 5 năm 2011, Châu Âu chấn động vì dịch bệnh ngộ

độc thực phẩm do E.coli 0104, một chủng làm hủy hoại xuất huyết niêm mạc

ruột Enterohemorrhagic E.coli EHEC Đây là một loại rất hiếm thấy từ xưa nay

Người ta nghi rằng nguồn lây nhiễm là từ dưa leo hữu cơ organic sản xuất từ

vùng Almeria và Malaga, thuộc Tây Ban Nha và được nhập vào các quốc gia

Châu Âu Tính đến 30/5/2011, Đức là quốc gia bị nặng nhất với gần 400 nguời

bệnh và đã có 14 tử vong và Đan Mạch có 11 tử vong Ngoài ra, dịch bệnh

cũng được thấy xuất hiện tại Thụy Điển, Anh Quốc, Hà Lan…

Trang 11

Vi khuẩn là một trong những nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm nhiều

nhất Tại nước Anh, trong 2000 ca bị ngộ độc thực phẩm riêng lẻ do vi khuẩn thì

Campylobacter jejuni chiếm 77,3 %, Salmonella 20,9 %, Escherichia coli

0157:H7 1,4 %, các vi khuẩn còn lại gây ra ít hơn 0,1 % số ca Triệu chứng ngộ

độc thực phẩm do vi khuẩn thường chỉ xuất hiện sau 12-72 giờ hoặc hơn nữa

sau khi ăn thức ăn bị nhiễm khuẩn

Hoa Kỳ: theo các số liệu của FoodNet từ năm 1996 đến 1998, CDCP ước

tính rằng hàng năm có 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm (26 nghìn ca trên 10 vạn

dân), trong đó: 325 nghìn nhập viện (111/10 vạn dân); 5 nghìn chết (1,7/10 vạn

dân) Tổn thất gây ra bởi sự sụt giảm năng suất cùng chi phí điều trị năm 1997 là

35 tỉ Mỹ kim

Pháp: số vụ ngộ độc báo cáo từ năm 1999-2000 cho thấy: 32% số vụ là do

sản phẩm sữa và đặc biệt là phô mai, 22% do thịt, 15% do xúc xích, bánh pate;

11% do cá và hải sản; 11% do trứng và sản phẩm trứng; 9,5% do gia cầm Ngộ

độc do S.aureus đứng hàng thứ hai sau Salmonell

Những thực phẩm bị nhiễm tụ cầu và gây ngộ độc thường gặp là thịt, cá,

gà và sản phẩm của chúng, rau cải, trứng, nấm, sữa và sản phẩm từ sữa, kem,

phomai, thực phẩm lên men…[39]

Đài Loan: S aureus chiếm 30% trong số các vụ dịch từ năm 1986 đến

năm 1995, Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu tại một

trường trung học ở Taichung County làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện

ngộ độc 2-3 giờ sau khi ăn sáng Tại Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã

xảy ra hai vụ dịch làm 378 người bị ngộ độc do dùng phomai và sữa tươi có

nhiễm tụ cầu [48] Tại Pháp, năm 1997 người ta tìm thấy S aureus là tác nhân

gây ra 569 trong tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm [44]

Trang 12

Ở Nhật, từ năm 1994 đến năm 1998 số trường hợp ngộ độc do tụ cầu chiếm

3,1-11,9% tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Ngày 17/6/1999, 21

trong số 53 công nhân sau khi ăn trưa tại căng tin công ty ở Shizuoka Prefecter thì

có biểu hiện bệnh, trong đó có 8 trường hợp phải nhập viện

Các loại thực phẩm liên quan đến ngộ độc thực phẩm do S aureus cũng

rất khác nhau ở mỗi quốc gia Chẳng hạn ở Mỹ, 50% số vụ ngộ độc được báo

cáo từ năm 1969-1990 là từ các sản phẩm thịt, các món ăn từ thịt và đặc biệt là

thịt muối; 22% trường hợp là do gia cầm, các món ăn từ gia cầm, 8% từ sữa và

sản phẩm sữa; 7% do cá và tôm cua, ghẹ; 3,5% do trứng Số vụ ngộ độc báo cáo

từ năm 1975-1982 cho thấy: 36% do thịt; 12,3% do salad; 11,3% do gia cầm;

5,1% do bánh nướng, bánh bao và chỉ có 1,4% do sữa và sản phẩm hải sản

17,1% thực phẩm liên quan vụ ngộ độc không được biết Sự khác biệt này là do

thói quen ăn uống cũng rất khác nhau theo từng nước Tụ cầu gây ra khoảng

14% trong các vụ ngộ độc thực phẩm; và hàng năm, Mỹ mất khoảng 1,5 tỉ đôla

cho những vụ ngộ độc do tụ cầu Trong các loại độc tố gây ra các vụ ngộ độc thì

SEA là loại độc tố chiếm tỷ lệ cao nhất (77,8%), SED (37,5%) và SEB (10%)

(Normanno G.và ctv, 2005) Ngoài vấn đề viện phí còn phải mất nhiều thời gian

làm việc cũng như sản phẩm lao động của người bệnh, và cả việc phải loại bỏ

những sản phẩm bị nhiễm.…

Hầu hết các vụ ngộ độc do tụ cầu là do quá trình chế biến hoặc bảo quản

thực phẩm không tốt Tụ cầu thường nhiễm trực tiếp vào thực phẩm do tay

người chế biến bị trầy xước hay do ho, hắt hơi Việc bảo quản thực phẩm ở nhiệt

độ không phù hợp cũng rất quan trọng, một khi thực phẩm đã nhiễm tụ cầu,

chúng sẽ tăng nhanh số lượng do tụ cầu phát triển được trong khoảng nhiệt độ

rất lớn, từ 7-48oC Điều đáng lo ngại độc tố được tạo ra trong suốt quá trình phát

Trang 13

triển của tụ cầu nhưng lại không gây ảnh hưởng đến cảm quan của thực phẩm,

do đó ít được chú ý [34]

1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam

Ở Việt Nam nhiều vụ ngộ độc thực phẩm hay xảy ra, đặc biệt là ngộ độc

tập thể, rơi nhiều vào đối tượng công nhân (khi ăn, uống tại các bếp ăn tập thể

không đảm bảo vệ sinh, an toàn chất lượng thực phẩm) Theo một thống kê năm

2008, mỗi năm ở Việt Nam có khoảng 250- 500 ca ngộ độc thực phẩm với 7.000

- 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong Có 8 triệu người ngộ độc thực phẩm

mỗi năm tại Việt Nam Đây là công bố của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) về tình

hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam Tuy nhiên chỉ có 8.000 người được thống

kê, phát hiện, bằng 1% số người ngộ độc thực phẩm trên thực tế

Theo số liệu từ cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong

những vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do

tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40-45% trong các loại gây ngộ độc, trong

số đó có nhiều vụ được xác định tác nhân là Staphylococcus aureus (Nguyễn Đỗ

Phúc và cs, 2003)

Từ năm 2002 đến 2004 theo số liệu của trung tâm y tế dự phòng đã có 77

vụ ngộ độc thực phẩm mà phần lớn nguyên nhân là do thức ăn bị nhiễm khuẩn,

chiếm 66% (Nguyễn Lý Hương và cs, 2005)

Từ dữ liệu của Hội nghị tổng kết dự án bảo đảm chất lượng vệ sinh an

toàn thực phẩm của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm năm 2006, số vụ ngộ độc

thực phẩm ở nước ta là 164 vụ (tăng 14,6% so với năm 2005), làm 7.135 người

bị ngộ độc (tăng 65,8% so với năm 2005), trong đó có 64 vụ (38,8%) là do vi

sinh vật gây ra (Hội nghị tổng kết dự án đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm,

tháng 3/2007, Cục vệ sinh an toàn thực phẩm, Bộ Y tế)

Trang 14

Qua các cuộc khảo sát tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực

phẩm chế biến sẵn tại các chợ cho thấy mức độ nhiễm Staphylococcus aureus là

rất cao, phù hợp với các kết quả xét nghiệm trong các vụ ngộ độc tại thành phố

Hồ Chí Minh trong những năm qua Đáng chú ý hơn cả là ở các mẫu bánh mì

thịt nguội là 16/30 mẫu (53%), các mẫu thịt quay là 18/20 mẫu (90%) (Nguyễn

Đỗ Phúc và cs, 2003; Nguyễn Lý Hương và cs, 2005)

Một số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta liên quan đến S aureus và độc tố

ruột của chúng đó là vụ ngộ độc thực phẩm của cán bộ, sinh viên khoa Địa chất

và Sinh học trường Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM vào ngày 27/7/2006

trong chuyến đi thực tế và đã ăn trưa tại Nha Trang (Khánh Hòa) Ba giờ chiều

cùng ngày, nhiều cán bộ sinh viên đau đầu, tiêu chảy, ói mửa, tất cả 105 người

phải vào bệnh viện để cấp cứu Nguyên nhân được xác định là do thức ăn chế

biến không hợp vệ sinh, lại để lâu nên đã nhiễm tụ cầu trùng vàng và đã sinh

độc tố enterotoxin Enterotoxin do tụ cầu tạo ra là loại độc tố cực mạnh gây ngộ

độc cấp tính Mấy năm gần đây, những vụ ngộ độc thức ăn do tụ cầu được phát

hiện và nói đến nhiều hơn (Đỗ Thị Hòa, 2006)

Ở Thành phố Hồ Chí Minh vụ ngộ độc xảy ra tại Trường Tiểu học Thanh

Đa-Khu phố II Cư xá-Thanh Đa, P.27, Q Bình Thạnh ngày 03/5/2006, có

khoảng 20 cháu bị ngộ độc Các món thức ăn gồm có cơm, canh cải thảo, thịt

bò, thịt heo kho tiêu, bánh flan Sau khi ăn khoảng 30 phút các cháu có triệu

chứng đau bụng, nôn ói, nhức đầu Qua xét nghiệm cho thấy trong mẫu chất nôn

đã có độc tố tụ cầu nhóm A

Vụ ngộ độc ở nhà trẻ Hồng Nhung, thị trấn Đông Dương - H Phú Quốc,

Kiên Giang ngày 2/9/2006 Thức ăn gồm có yaourt, cơm, thịt xào Các triệu chứng

cũng tương tự như nôn ói, đau bụng Kết quả kiểm tra cho thấy phần lớn các mẫu

Trang 15

thực phẩm đầu nhiễm S aureus từ 101 vi khuẩn/gam cho đến 107 vi khuẩn /gam

Trong đó độc tố được phát hiện có trong mẫu yaourt, độc tố nhóm C [4]

Ngộ độc thực phẩm không chỉ xảy ra ở nước ta mà còn xảy ra ở nhiều

nước trên thế giới kể cả những nước phát triển Theo WHO/FAO (tháng

5/2005), ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người và kinh

tế, làm 1,5 tỉ lượt người bệnh, ở các nước công nghiệp 30% dân số bị ngộ độc

thực phẩm hàng năm

1.2 Vi sinh vật gây bệnh Staphylococcus aureus

1.2.1 Giới thiệu về Staphylococcus

Staphylococcus là loại cầu khuẩn, bao gồm cả giống hiếu khí

Micrococcus, Planococcus và Deinococcus, giống kị khí tùy nghi

(Staphylococcus, Stomacoccus, Streptococcus, Leuconostos, Pedio coccus,

Aerococcus và Gemella) và giống kị khí (Peptococcus, Peptostreptococcus,

Ruminococcus, Coprococcus và Sarcina) Họ Micrococcaceae gồm bốn giống:

Micrococcus, Stomacoccus, Planococcus và Staphylococcus Những đặc tính

khác nhau của cầu khuẩn Gram (+) gồm: sự sắp xếp của tế bào, hiếu khí bắt

buộc, kị khí tùy nghi hay vi hiếu khí, kị khí bắt buộc, phản ứng catalase, sự hiện

diện cytochromes, sản phẩm lên men từ quá trình kị khí, peptidoglycan, axit

eichoic trong thành tế bào vi khuẩn [47]

Trong số các loài Staphylococcus thì Staphylococcus aureus là loài thường

gặp nhất, chúng thuộc nhóm cho phản ứng coagulase dương tính Tên

Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng Latinh, staphylo (chùm nho) và coccus

(hạt).Staphylococci là những tế bào hình cầu Gram (+), đường kính 0,5-1,5µm,

có thể đứng riêng rẽ, từng đôi, bốn con, chuỗi ngắn (3-4 tế bào) hoặc chùm

không theo một trật tự nào cả Sự hình thành chùm thường xảy ra trong quá

trình vi khuẩn phát triển trên môi trường đặc, do kết quả của sự phân chia tế bào

Trang 16

quá nhiều Staphylococci không di động, không sinh nha bào, nang thì có mặt

trong những tế bào còn non, nhưng biến mất khi tế bào ở giai đoạn pha ổn định

Màu sắc khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc như tryptic soy agar (TSA)

có thể màu kem đến màu hồng sáng

S aureus là loài phổ biến nhất trong giống Staphylococcus Trong điều

kiện kị khí sự phát triển của vi khuẩn cần có amino acid và vitamin, nhưng trong

điều kiện hiếu khí cần có thêm uracil và các nguồn carbon S aureus phát triển

tốt nhất ở điều kiện hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 35oC, nhưng

có thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ từ 10 đến 45oC khoảng pH có thể

phát triển từ 4,5 đến 9,3, nhưng pH tối thích khoảng 7,0 đến 7,5

1.2.2 Staphylococcus aureus

1.2.2.1 Hình thái, đặc điểm sinh hóa

Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những

tính chất chung của Staphylococcus S aureus là những vi khuẩn hình cầu,

không di động, gram dương, đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình

chùm nho, không di động Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với

lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầu nối pentaglycin của tụ cầu

Trang 17

S aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có enzyme

catalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước:

catalase

H2O2 H2O + O2

Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có

khả năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose Tất cả các dòng S

aureus đều nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường

chứa đến 15% muối NaCl [5]

Một số dòng S aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch

máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan

máu hẹp hơn so với đường kính khuẩn lạc Hầu hết các dòng S aureus đều tạo

sắc tố vàng, nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà

thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng Sắc tố được tạo ra nhiều

hơn trong môi trường có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà

vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng [14]

Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S aureus có

màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng

rộng 2-5 mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy

phân lòng đỏ trứng của lethinase) [34, 44] Trên môi trường MSA (Manitol salt

agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu

vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên

men đường manitol) [34]

Đa số các dòng S aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin trong

môi trường có nhiệt độ trên 15oC, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ

35-37oC [5]

Trang 18

Bảng 1 Những đặc tính của S aureus, S epidermidis và Micrococci

Đặc tính S aureus S epidermidis Micrococci

1.2.2.2 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố

Nhu cầu dinh dưỡng cho sự phát triển của Staphylococcus aureus thay đổi

tùy thuộc vào từng dòng S aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ

rất rộng, từ 7-48oC, với nhiệt độ cực thuận là 30-45oC; khoảng pH 4,2-9,3, với

độ pH cực thuận là 7-7,5; và trong môi trường chứa trên 15% NaCl Tụ cầu bền

vững khi có nồng độ đường cao, nhưng bị ức chế bởi nồng độ 60%; nồng độ từ

33-55%, tụ cầu vẫn phát triển, trong khi các vi khuẩn khác như Shigella và

Salmonella bị ức chế Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều

loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy

khô và lọc thấm Chính nhờ những đặc điểm trên giúp S aureus có sự phân bố

rộng, chủ yếu được phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của người và động

vật máu nóng S aureus được cho là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên

ngoài kí chủ Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi và trong nước dù

chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn

Tuy nhiên, S aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 60oC từ 2-50 phút tùy

Trang 19

từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh vật khác

ức chế [8]

Có 10-50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S aureus [8] Tuy nhiên

khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S aureus cũng rất lớn do chúng

phân bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố Tụ cầu nhiễm thực phẩm vào

chủ yếu qua con đường chế biến có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với người

Sự hiện diện với mật độ cao của S aureus trong thực phẩm cho thấy điều kiện

vệ sinh của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế

biến không tốt Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm

đó sẽ gây độc, điều đó chỉ xảy ra khi S aureus được phân lập tạo độc tố Ngược

lại, chỉ với một lượng nhỏ S aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc

1.2.2.3 Tính kháng thuốc kháng sinh

Hầu hết các dòng S aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau

Một vài dòng kháng với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và

những dòng này ngày càng tăng Những dòng MRSA (Methicilin resistant

Staphylococcusaureus) rất phổ biến và hầu hết các dòng này cũng kháng với

nhiều kháng sinh khác.Trong phòng thí nghiệm, người ta đã tìm thấy plasmid

kháng vancomycin ở Enterococcus faecalis có thể chuyển sang S aureus , và

người ta nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường

tiêu hóa chẳng hạn Ngoài ra, S aureus còn kháng với chất khử trùng và chất tẩy

uế (Kenneth Todar , 2005) [28].Từ khi sử dụng penicillin vào những năm 1940,

tính kháng thuốc đã hình thành ở tụ cầu trong thời gian rất ngắn Nhiều dòng

hiện nay đã kháng với hầu hết kháng sinh thông thường, và sắp tới sẽ kháng cả

những kháng sinh mới Thật sự là trong hai năm gần đây, việc thay thế kháng

sinh cũ bằng vancomycin đã dẫn đến sự gia tăng các dòng kháng vancomycin

Trang 20

VRSA (Vancomycin Resistant Staphylococcusaureus) (Kenneth Todar , 2005)

[28]

Khảo sát tính chất chống đối kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm

2005 cho thấy các chủng S aureus phân lập từ bệnh phẩm cho thấy có đến

94,1% chủng kháng Penicillin, 52,9% kháng Ciprofloxacin, 52% kháng

Amoxillin và 12,5% kháng Getamicin (Nguyễn Thị Kê và cs, 2006) [4]

1.2.2.4 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc

ở người Thường xảy ra ở những chỗ xây xước trên bề mặt da như nhọt, gây ra

nhiều bệnh nhiễm nghiêm trọng như viêm phổi, viêm vú, viêm tĩnh mạch, viêm

màng não, nhiễm trùng tiểu và những bệnh nguy hiểm khác như viêm xương

tủy, viêm màng trong tim S aureus cũng là nguyên nhân chủ yếu của việc

nhiễm trùng vết mổ và những vụ nhiễm trùng do dụng cụ y khoa S aureus còn

gây ngộ độc thực phẩm do tạo độc tố ruột enterotoxin trong thực phẩm, và gây

hội chứng shock độc tố do chúng tạo ra siêu kháng nguyên trong máu (Kenneth

Todar, 2005) [28]

Hình 3 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus

Trang 21

S aureus tạo nhiều yếu tố độc lực:

- Protein bề mặt: thúc đẩy việc bám dính vào tế bào chủ Ngoài ra, hầu hết các

dòng đều tạo protein gắn kết fibronogen và fibronetin làm kích thích sự kết dính

các khối máu và mô bị chấn thương Các protein gắn kết chất tạo keo cũng

thường gặp ở những dòng gây bệnh viêm xương tủy và viêm khớp

- Yếu tố xâm lấn (hemolysins, leukocidin, kinase, hyaluronidase): giúp vi khuẩn

lan ra trên mô, phân hủy màng tế bào eukaryote

1.2.2.5 Các yếu tố chống lại sự tự vệ của tế bào chủ

Capsule polysaccharide: còn gọi là microcapsule do ta chỉ có thể nhìn

thấy chúng dưới kính hiển vi điện tử Trong các mẫu bệnh phẩm, S aureus có

thể tạo ra một lượng lớn polysaccharide nhưng khả năng này sẽ giảm nhanh khi

đưa chúng vào nuôi cấy trong phòng thí nghiệm Chức năng gây độc của vỏ

capsule không rõ lắm mặc dù chúng có thể ngăn chặn sự thực bào

Protein A: là protein bề mặt có thể gắn phân tử IgG nhờ vùng Fc Trong

huyết thanh, vi khuẩn sẽ gắn các phân tử IgG sai hướng làm phá hủy sự opsonin

hóa và sự thực bào Các chủng S aureus đột biến thiếu protein A cho sự thực

bào trong ống nghiệm hiệu quả hơn, và những đột biến trên mẫu nhiễm sẽ làm

giảm độc tính

Leukocidin: S aureus tạo độc tố rõ nhất trên các bạch cầu đa nhân Sự

thực bào là một cơ chế quan trọng chống lại sự nhiễm tụ cầu, do đó leukocidin là

một yếu tố gây độc

Exfoliative exotoxin: gồm hai loại ETA và ETB Chúng gây hội chứng

phỏng da ở trẻ sơ sinh (Scalded Skin Syndrome) và gây chốc lở (Bullous

Impetigo) ở cả trẻ em và người lớn

Trang 22

1.2.2.6 Khả năng gây bệnh

Tụ cầu vàng thường ký sinh ở da và mũi họng Vi khuẩn này gây bệnh

cho những người bị suy giảm đề kháng do chúng có nhiều yếu tố độc lực Tụ

cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều bệnh

khác nhau (Lê Huy Chính, 2001) [1]:

- Nhiễm khuẩn da:

Do tụ cầu ký sinh trên da và niêm mạc mũi, nên nó có thể xâm nhập qua lỗ

chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da Sau đó gây nên các nhiễm khuẩn

sinh mủ : mụn nhọt, các ổ áp xe, eczema, hậu bối Mức độ các nhiễm khuẩn này

phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn Nhiễm tụ cầu

ngoài da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch Đinh râu có thể gây

nên những biến chứng nguy hiểm

- Nhiễm khuẩn huyết:

Tụ cầu vàng là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn đường huyết nhất Do

chúng gây nên nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da, từ đây

vi khuẩn xâm nhập vào máu gây nên nhiễm khuẩn đường huyết Ðây là một

nhiễm trùng rất nặng Từ nhiễm khuẩn đường huyết tụ cầu đi tới các cơ quan

khác nhau và gây nên các ổ áp xe (gan, phổi, não, tuỷ) hoặc viêm nội tâm mạc

Có thể gây nên các viêm tắc tĩnh mạch Một số nhiễm trùng khu trú này trở

thành viêm mãn tính như viêm xương

- Viêm phổi:

Viêm phổi do tụ cầu vàng rất ít gặp Nó chỉ xảy ra sau khi viêm đường hô

hấp do virus hoặc sau nhiễm khuẩn huyết Tuy vậy cũng có viêm phổi tiên phát

do tụ cầu vàng ở trẻ em hoặc người suy yếu.Tỷ lệ tử vong ở những bệnh nhân

này khá cao, vì thế nó được coi là bệnh nguy hiểm

Trang 23

1.2.2.7 Ngộ độc thực phẩm do Staphylococcus aureus

Những triệu chứng thường gặp: Staphylococcus aureus được xem là một

trong ba tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước chỉ sau

Salmonella và Clostridium perfringens (Rosec J.P và cs, 1996; Fueyo J.M và cs,

2000 [19]; Viktoria A và cs, 2001 [54]) Triệu chứng thường gặp ở các vụ ngộ

độc do tụ cầu là buồn nôn, nôn mửa, đau bụng, có hay không có tiêu chảy, ngoài

ra còn có thể bị đau đầu, chuột rút, thay đổi huyết áp Triệu chứng ngộ độc xảy

ra nhanh, từ 3-6 giờ sau khi ăn thực phẩm bị nhiễm, tùy vào lượng thực phẩm đã

dùng, lượng độc tố có trong thực phẩm và độ nhạy với độc tố cũng như sức khỏe

của từng người Thường thì các triệu chứng chỉ kéo dài trong một thời gian ngắn,

khoảng 6-8 giờ (Trần Linh Thước, 2002) [5] và hết bệnh sau 1-2 ngày (Bremer

P.J và ctv, 2004)[8] Tuy nhiên khoảng 10% trường hợp người bệnh bị mất

nhiều nước cần phải nhập viện để truyền dịch

Tuy thời gian gây bệnh ngắn nhưng những vụ ngộ độc thực phẩm do tụ

cầu để lại hậu quả không nhỏ Theo đánh giá của tổ chức Y tế thế giới, hàng năm

Việt nam có khoảng trên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu

USD Trong những năm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở nước ta ngày càng

gia tăng Năm 2000 có 213 vụ ngộ độc thực phẩm với 4233 người mắc 59 người

tử vong (Bùi Thế Hiền, Tô Thị Thu và cs, 2003)[2]

1.2.3 Độc tố ruột enterotoxin của Staphylococcus aureus

1.2.3.1 Đặc điểm

Staphylococcal enterotoxin (SE) là những chuỗi protein đơn có trọng

lượng phân tử thấp, từ 25000-29000 dalton, mỗi chuỗi có những vị trí kháng

nguyên chuyên biệt Đặc điểm chính trong cấu trúc của độc tố là vòng cystein ở

giữa phân tử Vai trò của những vòng cystein chưa được biết rõ Tuy nhiên,

người ta chứng minh được chính những vòng cystein này giúp ổn định cấu trúc

Trang 24

phân tử và có thể góp phần vào việc kháng sự phân giải protein Theo sau vòng

cystein là chuỗi acid amin cần thiết, ban đầu người ta nghĩ rằng trình tự này là vị

trí hoạt động, nhưng những thí nghiệm thay thế amino acid vẫn chưa xác nhận

được điều này

1.2.3.2 Tính chất

SE là những protein đơn giản, hút ẩm, dễ tan trong nước và nước muối, là

những protein cơ bản, độ đẳng điện pI là 7-8,6, trừ SEG và SEH có độ đẳng điện

pI tuần tự là 5,6 và 5,7 Dù có một mức độ tương đồng giữa các SE, nhưng vẫn

có sự khác nhau giữa các trình tự amino acid làm cho các độc tố có các vị trí

kháng nguyên khác nhau (Scott E.M và cs, 2000)[ 47]

SE giàu lysine, acid aspartic, acid glutamid và tyrosine Hầu hết có vòng

cystine tạo cấu trúc thích hợp có thể liên quan đến hoạt tính gây nôn Chúng có

tính ổn định cao, kháng với hầu hết các enzyme phân hủy protein và vì thế chúng

giữ được hoạt tính trong đường tiêu hóa sau khi được ăn vào bụng Chúng còn

kháng với chymotrypsine, rennin và papain (Yves Le Loir và cs, 2003) [56] Đặc

biệt, tính bền nhiệt là một trong những tính chất quan trọng nhất của các SE

trong lĩnh vực an toàn thực phẩm Chúng không bị phân hủy ở 100oC trong 30

phút (Trần Linh Thước, 2002) [5], thậm chí ở 121oC trong 28 phút thì những SE

vẫn giữ đươc hoạt tính sinh học (khi thí nghiệm trên mèo) (Naomi Balaban và

Avraham Rasooly, 2000) [37], tính kháng nhiệt của SE trong thực phẩm cao hơn

so với trong môi trường nuôi cấy (Yves Le Loir và cs, 2003) [56]

1.2.3.3 Phân loại

Số loại SE khác nhau ở nhiều tài liệu khác nhau tùy thuộc vào năm phát

hiện và vai trò của các SE trong các vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu (Yves Le

Loir và cs, 2002) [56] Do số lượng SE khá lớn nên rất cần thiết phải phân loại

và sắp xếp chúng Năm 1962, người ta đã đưa ra hệ thống sắp xếp các độc tố

Trang 25

theo bảng chữ cái (Mary Sandel K và McKillip J.L., 2002) [34] Đầu tiên 5 loại

SE được tìm thấy và phân loại dựa vào tính kháng nguyên của chúng, đó là độc

tố A (SEA), độc tố B (SEB), độc tố C (SEC), độc tố D (SED) và độc tố E (SEE)

Trong đó, SEC được chia thành SEC1, SEC2, SEC3 Sau đó, các SE mới cùng

với các gen tương ứng được tìm thấy và đánh dấu từ SEG đến SER và SEU

(seg-ser, seu) (Jogensen H.J., 2004) [27].Không có độc tố SEF vì F là kí tự dùng để

chỉ TSST-1 (Scott E.M và cs, 2000[47]; Fueyo J.M., 2000 [19]) Tuy nhiên sự

liên quan giữa các SE mới này đến các vụ ngộ độc thì chưa rõ, hiện nay hầu hết

các bộ test thương mại chỉ thích hợp để xác định các độc tố từ SEA đến SEE là

các độc tố thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc (Capucine Letetre và cs, 2003

[11]; Jorgensen H.J và cs, 2004 [27]), và theo Rosec J.P.và Gigaud O.(2002)

[45] thì có khoảng 5% các vụ ngộ độc do tụ cầu là do các độc tố enterotoxin mà

ta chưa biết gây ra

Trong các loại độc tố trên thì SEA thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc

do tụ cầu (Tsen H.Y., 1996 [50]; Naomi Balaban và Avraham Rasooly, 2000

[37];Capucine Letetre và cs, 2003 [11]) Các dòng S aureus tạo độc tố SEA có

tần số cao nhất trong các mẫu thực phẩm (61,5%) và trên những người khỏe

mạnh (53,6%).Ngoài ra, Vernozy C.R và cs (2004) [53] cũng nhận thấy rằng

SEA là nguyên nhân của 75% các vụ ngộ độc do tụ cầu, tiếp đến là SED, SEC và

SEB, các vụ dịch do SEE thường rất ít gặp

1.2.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và việc tạo độc tố SE của tụ cầu

Mặc dù SE được tạo ra ở khoảng điều kiện rất rộng nhưng cũng giống như

sự phát triển của tụ cầu, cũng có những giới hạn về nhiệt độ, độ ẩm và độ pH

làm giảm hay ức chế sự tạo độc tố của S aureus Thường thì tụ cầu phát triển

đến 106 cfu/g thì có thể tạo SE (Simeão L.C., 2002 [48]; Yves Le Loir và cs,

2003 [56]) Các dòng tụ cầu khác nhau cần các amino acid khác nhau cho sự

Trang 26

phát triển và tạo độc tố (Yves LeLoir và cs, 2003) [56] Valine thì cần thiết cho

sự phát triển, arginine và cystine cần thiết cho cả sự phát triển lẫn việc sinh độc

tố Các amino acid khác thì có nhu cầu khác nhau tuỳ từng chủng (Onoue và

Mori, 1997) [42]

Điều kiện thích hợp nhất để tạo độc tố là pH trung tính và giảm hay bị ức

chế ở pH acid, thường là khi pH < 5 và độ ẩm thấp (dưới 0,86) (Rosamund M.B

và Lee W.H., 1995) [44] Ngược lại pH kiềm cũng làm giảm khả năng tạo độc tố

SEB, SEC và SED Bên cạnh đó, Braga L.C và cs (2004) [7] cũng đã tìm thấy

rằng dịch chiết từ lựu, ngoài tác dụng kháng khuẩn còn có thể ức chế tạo độc tố

enterotoxin

Glucose cũng là một thành phần ức chế sự tạo độc tố, đặc biệt là SEB và

SEC (Yves Le Loir và cs, 2003) [56] do sự trao đổi glucose làm giảm pH Ngoài

ra, nồng độ muối cao (trên 12%) cũng làm ức chế sự tạo độc tố Đặc biệt, S

aureus rất nhạy với vi sinh vật cạnh tranh Đặc tính này được chứng minh trong

các thực phẩm lên men Genigeorgis (1989) đã chứng minh rằng khi các vi sinh

vật cạnh tranh có trong sữa với mật độ cao sẽ làm giảm tỉ lệ phát triển cũng như

tạo độc tố của tụ cầu (Yves Le Loir và cs, 2003) [56]

1.2.3.5 Những hoạt tính của độc tố SE

Các độc tố tụ cầu SE thuộc họ độc tố gây sốt, làm biểu hiện miễn dịch

và tăng nhanh số lượng tế bào T không chuyên biệt Trong số các siêu kháng

nguyên đó thì chỉ có SE là có hoạt tính gây nôn Hoạt tính siêu kháng nguyên

và hoạt tính gây nôn là hai chức năng của hai protein riêng biệt nhưng sự liên

hệ giữa hai hoạt tính này vẫn chưa được làm rõ Tuy nhiên trong hầu hết

trường hợp, hai hoạt tính này tồn tại song song nhau, những đột biến làm mất

hoạt tính siêu kháng nguyên cũng làm mất hoạt tính gây nôn (Yves Le Loir và

cs, 2003) [56]

Trang 27

1.2.3.6 Tần suất của các chủng S aureus mang gen sinh độc tố

Việc kiểm soát vi sinh vật trong thực phẩm được thực hiện một cách

thường xuyên Trong số các chủng S aureus phân lập được trong thực phẩm, thì

tỷ lệ các chủng mang gen sinh độc tố ước tính khoảng 25% (Bergdoll, 1989)

Tuy nhiên, điều đó cũng còn phụ thuộc vào từng loại thực phẩm và từng nước

khác nhau Chẳng hạn như ở Đan Mạch, các chủng S aureus phân lập từ vú bò

bị viêm chỉ có 1/414 chủng mang gen sinh độc tố (Larsen và cs, 2000) [30] Ở

Minas Gerais, Brazil, các chủng S aureus phân lập từ vú bê bị viêm thì có

54/127 chủng có khả năng sinh độc tố (Cardoso và cs, 1999) [12], chiếm tỷ lệ

42,5% ở Pháp, trong số 61 chủng phân lập từ phô mai thì có 15,9% chủng mang

gen sinh độc tố (Rosec và cs, 2002) [45] Nhưng đây là những nghiên cứu về

cách chủng có khả năng sinh độc tố từ A đến E, không bao gồm một số chủng

mang gen sinh độc tố mới phát hiện sau này

Ở Singapore, đã nghiên cứu khả năng tạo độc tố của các chủng S aureus

trên các thực phẩm nước giải khát và thức ăn nhanh cho thấy trong 111 mẫu

kiểm tra có nhiễm S aureus trong đó khi xác định khả năng sinh độc tố chiếm tỷ

lệ 33/111(29,7%) , trong đó chủng có độc tố SEA:4, SEB:13, SEC:8, SED 6,

SEA- C:2 chủng Tỷ lệ SEC là phổ biến (24%) (Ng D.L.K và Tay L., 1993)

[38]

Trong những năm gần đây , ở Đức, nghiên cứu các chủng S aureus phân

lập từ sữa bò bị viêm vú cho thấy có tới 72,8% chủng mang gen độc tố từ nhóm

SEA đến SEJ Sự gia tăng tỷ lệ chủng mang gen sinh độc tố là do một số gen

mới được phát hiện Các chủng mang gen G, I và J thường tìm thấy trong các

chủng phân lập từ vú gia súc bị viêm

Norway , đã khảo sát tạp nhiễm S aureus trong sữa bò bán thành phẩm,

cho thấy có 36 /163 (22%) chủng S aureus phân lập có khả năng sinh độc tố ruột

Trang 28

trong đó SEB: 2, SEC: 28, SED: 4 và SEA- C: 2 chủng Như vậy ở Norway tỷ lệ

xuất hiện độc tố SEA không có Tỷ lệ SEC là phổ biến (77,8%) (Jorgensen H.J v

à cs, 2005)[27]

Hiện nay tại Việt Nam cũng đang triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử

trong việc xác định vi khuẩn S.aureus và xác định độc tố ruột bằng kỹ thuật

ELISA Kết quả cho thấy có 19/72 chủng S.aureus (26,8%) chủng có khả năng

sinh độc tố, trong đó độc tố SEA, SEB là 42%, SEC là 11% và chủng mang hai

gen SEA và SED là 5% (Nguyễn Đỗ Phúc, Nguyễn thị Kê, Trần Linh Thước,

2006) [3]

1.3 Tổng quan về enzym endolysin

1.3.1 Giới thiệu về enzym endolysin

1.3.1.1 Khái niệm

Endolysins (hay tên gọi khác là lysins) là các enzym thủy phân có nguồn

gốc từ thực khuẩn thể (bacteriophage) có tác dụng phá hủy peptidoglycan của

thành tế bào vi khuẩn trong giai đoạn cuối chu trình sinh sản của thực khuẩn thể

Các enzyme này làm giảm độ mạnh cơ học của thành tế bào dẫn đến dung giải tế

bào và giải phóng ra các thực khuẩn thể thế hệ tiếp theo Do đó khi có mặt

endolysins chúng có thể phân hủy lớp peptidoglycan của thành tế bào của mọi vi

sinh vật khi chúng tiếp xúc, dẫn đến vi sinh vật bị chết, do vậy chúng được coi

như là một chất kháng sinh thực phẩm có tính tác động chọn lọc, không thay đổi

đặc điểm cảm quan, kết cấu của thực phẩm và rất an toàn cho con người

1.3.1.2 Cấu tạo

Nhìn chung lysin có cấu trúc gồm hai domain bao gồm domain xúc tác ở

đầu N và domain gắn với vách tế bào ở đầu C Domain ở đầu N được phân thành

4 nhóm khác nhau phụ thuộc vào vị trí phân tách bao gồm: (a)

N-acetylmuramidases (lysozymes) và (b) N-acetyl-β-D-glucosaminidases

Trang 29

(glycosidases) có tác dụng thủy phân liên kết β-1-4 glycosidic ở một nửa phân tử

đường của vách tế bào (c) N-acetylmuramoyl-L-alanine amidases có tác dụng

tách liên kết amide nối nửa phân tử đường và peptide của vách tế bào vi khuẩn

(d) L-alanoyl-D-glutamate endopeptidases và interpeptidebridge-specific

endopeptidases có tác dụng là cầu nối đặc hiệu giữa các peptide của

peptidoglycan trong vách tế bào (Hình 4) (Fenton và cs, 2010) Domain liên kết

ở đầu C của hầu hết các lysin có trách nhiệm gắn enzym với một cơ chất đặc

hiệu trong vách tế bào vi khuẩn thông qua liên kết không cộng hóa trị của các

gốc carbohydrate

Hình 4 Cấu trúc điển hình của vách peptidoglycan của vi khuẩn

Gram dương Các vị trí phân cắt của các loại endolysin được đánh dấu từ 1 đến

4, trong đó (1) N-acetyl muramidases; (2) N-acetyl-β-D-glucosaminidases; (3)

N-acetylmuramoyl-L-alanine amidases; (4) L-alanoyl-D-glutamate

endopeptidases và interpeptide bridge-specific endopeptidases

1.3.1.3 Tính chất của endolysin

Một số loại endolysin có hoạt tính ổn định trong thời gian dài như Cp1-1

hoạt tính bền ở 4oC trong 6 tháng và ở 37oC trong 3 tuần (Loeffler và cs,2003)

Trang 30

[31] Endolysin KZ144 và EL188 vẫn duy trì hoạt tính khi bảo quản ở 4oC trong

- Hiệu quả loại bỏ biofilm trên bề mặt thực phẩm (ví

dụ như đối với tế bào vi khuẩn Gram dương)

- Bền nhiệt đối với sản phẩm xử lý nhiệt

+ + + +

+

2 Thực phẩm

- Không làm thay đổi đặc điểm cảm quan của thực

phẩm

- Kéo dài thời gian bảo quản

- Hiệu quả đối với tác nhân gây bệnh kháng kháng sinh

+ + +

3 Chấp thuận của cơ quan quản lý thực phẩm

- Tình trạng an toàn

- Tác nhân kháng sinh không tự sao chép

- Được người tiêu dùng và cơ quan quản lý chấp nhận

+ + +

4 Tác động kinh tế/thị trường

- Kháng sinh hiệu quả (ở mức độ nano)

- Kiểu tác động mới (phân hủy vách PGN)

- Tạo ra bằng công nghệ protein

+ + +

Trang 31

1.3.2.4 Vai trò và ứng dụng

Trong nông nghiệp, endolysin có thể sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học

để phòng trừ một số bệnh hại cà chua do Streptomyces scabies, Clavibacter

michiganensis và Xanthomonas campestris Trong chế biến sữa, endolysin sử

dụng như chất bảo quản thực phẩm dùng để tiêu diệt các loài vi khuẩn bền nhiệt

(như Bacillus spp và Paenibacillus spp.) và vi khuẩn chịu lạnh như

Pseudomonas spp., giúp sữa thanh trùng không thối hỏng và kéo dài thời hạn của

sản phẩm

Đối với vật nuôi, endolysin có thể dùng để kiểm soát các bệnh đường ruột

ở gia súc, gia cầm mà không làm thay đổi hệ vi sinh đường ruột (như lysin

Ply2626 kiểm soát vi khuẩn gây bệnh C perfringens ở gia cầm) (Zimmer và cs,

2002) [58] Ngoài ra, endolysin có thể kiểm soát vi khuẩn gây bệnh viêm vú ở

tuyến vú của gia súc lấy sữa, phòng trừ nhiễm chéo thực phẩm trong quá trình

lấy sữa và giết mổ gia súc (ví dụ như endolysin Ply700 và LysH5 kiểm soát vi

khuẩn gây bệnh Streptococcus uberis và S aureus) (Celia và cs, 2008; Obeso và

cs, 2008) Trong công nghiệp lên men, endolysin như Ply511 có thể được sử

dụng để kiểm soát vi khuẩn Listeria monocytogenes làm hỏng sữa (Gaeng và cs,

2000) [22] hoặc sử dụng lysine CTP1 để kiểm soát vi khuẩn clostridium trong

quá trình chế biến phomat (Mayer và cs, 2010) [35]

1.3.3 Tổng hợp nhân tạo endolysin kháng khuẩn

Trong tự nhiên, endolysin dung giải hiệu quả và nhanh chóng tế bào vi

khuẩn chủ nhằm đảm bảo sự tồn tại của thực khuẩn thể Tuy nhiên, trong thực tế

vẫn có thể cải thiện được tác dụng của endolysin để sử dụng trong thực phẩm

hoặc trong điều trị bệnh ở người bằng công nghệ protein Công nghệ này bao

gồm việc trao đổi các domain hoặc đột biến ngẫu nhiên làm thay đổi đặc điểm

liên kết và dung giải peptidoglycan

Định dạng
Số trang	62
Dung lượng	838,64 KB