Giải trình tự gen ADN ty thể vùng cytochrome b ứng dụng trong giám định phân biệt ADN ty thể người và một số động vật

- Phân tích đặc điểm đa dạng di truyền trên ADN ty thể vùng Cytochrome B của các mẫu nghiên cứu từ đó ứng dụng trong phân biệt ADN người và một số động vật... Ví dụ, trong tế bào gan ngư

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Đào Thị Hồng Vân

đã đã tận tình giúp đỡ và giúp em được thực tập tại Viện Pháp y quốc gia

Và với tất cả lòng biết ơn chân thành, em xin gửi lời cảm ơn đến:

Các thầy cô giáo trường Viện đại học Mở Hà Nội đã giúp em có được những kiến thức trong quá trình học tập tại trường

ThS Hà Hữu Hảo - Trưởng khoa Y – Sinh học, Viện Pháp y quốc gia

đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy và tạo điều kiện cho em được tham gia lớp học đào tạo chuyên môn về giám định ADN của TS.Nguyễn Đức Nhự - Viện trưởng Viện Pháp y quốc gia, cùng Khóa đào tạo về phân tích ADN ty thể do các chuyên gia Phòng thí nghiệm nhận dạng ADN người thuộc quân đội Hoa

Kỳ giảng dạy

Trong quá trình thực tập, làm việc và thực hiện luận văn, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo của các cán bộ Viện Pháp y quốc gia đã tạo điều kiện cho em có thời gian học tập, giúp em tiếp cận được với các kỹ thuật trong phòng nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, Ngày 15 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Yên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về ADN và giám định ADN 3

1.1.1 ADN và cấu trúc của ADN 3

1.1.2 Giám định ADN 3

1.2 Ty thể và ADN ty thể 4

1.2.1 Ty thể 4

1.2.2 ADN ty thể 6

Vai trò việc nghiên cứu ADN ty thể 6

Cơ sở khoa học của di truyền ADN ty thể 8

Cấu trúc ADN ty thể 10

1.3 Cytochrome B 11

1.4 Tình hình nghiên cứu gen Cytb trong và ngoài nước 13

1.4.1 Tình hình nghiên cứu gen Cytb ở nước ngoài 13

1.4.2 Tình hình nghiên cứu gen Cytb ở Việt Nam 14

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu nghiên cứu 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 15

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Tách chiết ADN 16

2.2.2 Điện di ADN tổng số 19

2.2.3 Phản ứng PCR 20

2.2.5 Giải trình tự ADN 22

2.2.6 Xử lý và thống kê số liệu 24

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 25

3.2 Kết quả khuếch đại ADN ty thể vùng Cytb 26

3.3 Kết quả giải trình tự gen Cytb trên các mẫu nghiên cứu 28

3.4 Kết quả so sánh ADN ty thể vùng Cytb của người và một số động vật 29

3.4.1.Kết quả so sánh trình tự gen Cytb của các mẫu nghiên cứu so với trình tự tham khảo trên Genbank 29

3.4.2 Kết quả so sánh trình tự gen Cytb giữa người và một số động vật 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

1 Kết luận 55

2 Kiến nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

(Trình tự tham khảo của Cambridge đã được chỉnh sửa)

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 : Cấu trúc chung của một gen điển hình 3

Hình 2:Mô hình ty thể 5

Hình 3: Cấu trúc hệ gen ty thể 8

Hình 4: Sơ đồ phả hệ xác định di truyền theo dòng mẹ ADN ty thể 10

Hình 5: Vị trí gen Cytb trong ADN ty thể [16] 11

Hình 6: Chương trình thiết lập phần mềm giải trình tự 24

Hình 7: Điện di ADN tổng số trên gel agarose 0.8% 25

Hình 8: Điện di sản phẩm PCR vùng Cytochrome B trên gel polyacrylamide27 Hình 9: Kết quả giải trình tự mẫu L2CB theo hướng dẫn của hãng ABI (Mỹ)28 Hình 10: Kết quả giải trình tự của mẫu L2CB 29

Hình 11: So sánh các trình tự nucleotide thu được từ mẫu của người với trình tự tham khảo trên Genbank 34

Hình 12: So sánh các trình tự nucleotide thu được từ mẫu của bò với trình tự tham khảo trên Genbank 38

Hình 13: So sánh các trình tự nucleotid thu được từ mẫu của chó với trình tự tham khảo trên Genbank 40

Hình 14: So sánh các trình tự nucleotid thu được từ mẫu của lợn với trình tự tham khảo trên Genbank 43

Hình 15: So sánh các trình tự nucleotid từ bò, chó, lợn nghiên cứu với trình tự nucleotid người (Homo sapiens JN034136.1) 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Trình tự các cặp mồi dùng khuếch đại vùng Cytb 20

Bảng 2: Thành phần PCR 20

Bảng 3: Chu trình nhiệt được thực hiện dùng cho máy PCR 21

(Eppendorf-Đức) 21

Bảng 4: Thành phần hóa chất điện di 21

Bảng 5: Thực hiện PCR với BigDye Terminator kit [12]: 23

Bảng 6: Chu trình nhiệt PCR: 23

Bảng 7: Tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng BigDye Xterminator purification kit [10]: 23

Bảng 8 Tỉ lệ phần trăm trình tự đa hình giữa các mẫu nghiên cứu với trình tự loài tương ứng trên Genbank 43

Bảng 9: Tỉ lệ phần trăm trình tự đa hình giữa mẫu người với bò, chó, lợn 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong vòng 20 năm trở lại đây, sinh học phân tử và công nghệ gen đã phát triển mạnh mẽ và đem lại một trong những thành tựu vĩ đại nhất cho khoa học và công nghệ cuối thế kỉ 20 đầu thế kỉ 21, đó là việc giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen người Từ đó sinh học phân tử cũng trở thành công cụ đắc lực cho nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau như: khảo cổ học, nhân chủng học, di truyền y học và đặc biệt trong giám định các vụ án hình sự Ngày nay, phương pháp giám định gen đã được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia khác nhau, đưa ra những bằng chứng đáng tin cậy nhất cho việc phá án, giúp đem lại sự công bằng cho xã hội

Có hai phương pháp giám định gen là phân tích ADN trong nhân tế bào

và phân tích ADN ty thể Phân tích bộ gen trong nhân tế bào là phương pháp

có nhiều ưu điểm nhưng bên cạnh đó cũng có nhiều hạn chế là đòi hỏi phải thu đươc ADN nhân nguyên vẹn của mẫu phân tích Tuy nhiên, trong trường hợp mẫu phân tích đã bị phân hủy không thể thu được ADN trong nhân tế bào thì phương pháp duy nhất được áp dụng là phân tích ADN ty thể Với các đặc trưng nổi bật của ADN ty thể như: di truyền theo dòng mẹ, có kích thước tương đối nhỏ nên bền vững trong thời gian rất dài có thể lên tới hàng nghìn năm, cùng số lượng bản sao rất lớn trong tế bào Cấu trúc ADN mạch vòng,

và được bảo vệ bởi các cấu trúc đặc biệt như keratin ở tóc, và hydroxyapatite

ở xương hoặc răng Vì vậy, phân tích ADN ty thể trở thành công cụ không thể thiếu trong khoa học y học và khoa học điều tra

Trong công tác giám định pháp y, khi phân tích những dấu vết sinh học không rõ nguồn gốc, thì một trong những việc quan trọng đầu tiên cần tiến hành là phải xác định mẫu vật đó có nguồn gốc từ con người hay từ một động vật nào khác Đôi khi việc xác định được nguồn gốc loài của mẫu phân tích trong một số trường hợp sẽ đóng vai trò quyết định đến khả năng kết luận vụ việc (như các tai nạn giao thông liên quan đến động vật, các tai nạn do bị

động vật tấn công…) Tuy nhiên, đối với những mẫu đã bị cháy, mất các đặc điểm hình thái đặc trưng, dập nát, bị phân hủy do để lâu trong những điều kiện không thuận lợi (chẳng hạn các mẫu xương lâu năm đã bị phân hủy do chôn trong điều kiện ngập nước, bị phân hủy do tính axit của đất, vi khuẩn, ánh sáng, nhiệt độ…) nhiệm vụ này nhiều khi không thể thực hiện được bằng các phương pháp nhận biết thông thường Vì vậy, để nhận biết những trường hợp như trên thì việc có được một phương pháp nhận biết nguồn gốc loài của mẫu giám định một cách hiệu quả là hết sức cần thiết

Vì vậy tôi thực hiện đề tài: “Giải trình tự gen ADN ty thể vùng Cytochrome B - Ứng dụng trong giám định phân biệt ADN ty thể người

và một số động vật” Với mục tiêu chính:

- Hoàn thiện kỹ thuật khuếch đại ADN ty thể vùng Cytochrome B

- Phân tích đặc điểm đa dạng di truyền trên ADN ty thể vùng Cytochrome B của các mẫu nghiên cứu từ đó ứng dụng trong phân biệt ADN người và một số động vật

PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về ADN và giám định ADN

1.1.1 ADN và cấu trúc của ADN

ADN là một loại vật chất di truyền tồn tại trong tất cả các tế bào của cơ thể, được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, được lưu trữ trong tế bào còn sống thậm chí cả khi tế bào đã chết

Cấu trúc của ADN:

Mỗi ADN có hai mạch polinucleotit, nhưng chỉ có mạch gốc (3' 5') mang thông tin mã hóa cho các axit amin, mạch còn lại được gọi là mạch bổ

sung Mỗi gen mã hóa protein gồm 3 vùng trình tự nucleotit

Hình 1 : Cấu trúc chung của một gen điển hình

Vùng điều hòa: Nằm ở đầu 3’của gen mang tín hiệu đặc biệt giúp ARN

polimeraza nhận biết và liên kết để khởi động quá trình phiên mã và chứa trình

tự nucleotit điều hòa quá trình phiên mã

Vùng mã hoá: mang thông tin mã hóa các axit amin

Vùng kết thúc: nằm ở đầu 5' của mạch mã gốc mang tín hiệu kết thúc phiên mã

1.1.2 Giám định ADN

Giám định ADN là phân tích, so sánh những đoạn ADN tách chiết được từ tế bào cơ thể gồm: máu, chân tóc, mô, tinh dịch, dấu vết sinh học chứa ADN Khi phân tích và so sánh gen của tế bào sống hay đã chết đều có thể xác minh được sự giống nhau và khác nhau của gen, qua đó có thể kết

luận phả hệ của các mẫu phân tích để nhận diện cá thể hoặc mối liên quan của các cá thể, sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử

bào và phân tích ADN ty thể Phân tích bộ gen trong nhân tế bào là phương pháp có nhiều ưu điểm nhưng bên cạnh đó cũng có nhiều hạn chế là đòi hỏi phải thu đươc ADN nhân nguyên vẹn của mẫu phân tích Tuy nhiên, trong trường hợp mẫu phân tích đã bị phân hủy không thể thu được ADN trong nhân tế bào thì phương pháp duy nhất được áp dụng là phân tích ADN ty thể Giám định ADN đã được ứng dụng trong giám định pháp y – hình sự trong các lĩnh vực:

- Giám định ADN để xác định quan hệ huyết thống nhằm xác định mối quan hệ huyết thống trong các vụ việc dân sự (tìm bố - con, xác định quyền làm cha, trách nhiệm nuôi con trong hoặc ngoài giá thú, thất lạc người thân vv…) Giám định ADN với mục đích xin thị thực di dân

- Giám định ADN Pháp y nhằm truy tìm thủ phạm, tung tích nạn nhân, hung thủ hiếp dâm, giết người

- Giám định ADN xác định danh tính hài cốt liệt sĩ, mồ mả thân nhân bị thất lạc hoặc tranh chấp

- Giám định ADN để phân biệt loài nhằm xác định những mẫu sinh phẩm thu được tại hiện trường vụ việc là có nguồn gốc từ con người hay của một loài động vật nào khác từ đó tìm ra bằng chứng vụ việc

1.2 Ty thể và ADN ty thể

1.2.1 Ty thể

Ty thể được phát hiện và mô tả đầu tiên bởi Altman từ năm 1894 và đến năm 1897 Benda đặt tên là mitochondria Cấu trúc siêu hiển vi của ty thể

được Palad nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử vào năm 1952 và Sjostand vào năm 1953

Hình 2:Mô hình ty thể

Hình dạng chung của ty thể trong các loại tế bào khác nhau thì rất khác nhau và thường có dạng sợi, hạt hoặc cả sợi và hạt trong một tế bào Ví dụ: trong tế bào gan, ty thể có thể thay đổi từ dạng hạt sang sợi và ngược lại; còn trong tế bào biểu bì ruột, dạng sợi nằm ở phần ngoài, dạng hạt nằm ở phần trong

Kích thước của chúng cũng rất thay đổi, ở đa số tế bào ty thể có chiều dày tương đối cố định khoảng 0,5µm, chiều dài thì thay đổi và tối đa là 7µm

Số lượng ty thể trong các loại tế bào khác nhau thì khác nhau và ở các trạng thái sinh lý khác nhau cũng khác nhau Ví dụ: trong tế bào gan chuột có đến 2.500, còn trong tinh trùng một số sâu bọ chỉ có 5 - 7 ty thể Ty thể được cấu tạo bởi 2 lớp màng giống màng tế bào

- Màng ngoài: dày 60Å, bảo đảm tính thấm của ty thể

- Màng trong: dày 60Å Từ màng trong hình thành nên các mấu lồi ăn sâu vào trong xoang ty thể gọi là tấm hình răng lược (crista) Màng trong chia xoang ty thể thành 2 xoang

+ Xoang ngoài nằm giữa màng trong mà màng ngoài rộng khoảng 60 - 80Å và thông với xoang của các vách răng lược

+ Xoang trong được giới hạn bởi màng trong và chứa đầy chất nền của

ty thể gọi là matrix

Chất nền thường là đồng nhất, nhưng đôi khi quan sát thấy có các sợi mỏng hoặc các hạt nhỏ có mật độ điện tử cao, các hạt này là nơi đính các cation hai hoá trị, đặc biệt là Mg+2 và Ca+2 Các tấm hình răng lược là những vách ngăn không hoàn toàn Số lượng các tấm răng lược không giống nhau ở những tế bào khác nhau và ở các loài khác nhau Mặt trong của màng trong có những khối hình cầu đường kính 80 - 100Å đính vào bề mặt của tấm hình răng lược nhờ một cái cuống dài 30 - 50Å - gọi là hạt cơ bản Trong một ty thể có tới 104 - 105 hạt cơ bản (Vermander - Moran 1963) Hạt cơ bản có 3 chức năng:

- Thực hiện phản ứng oxy hoá khử, giải phóng e

ADN ty thể là phân tử ADN tồn tại ở trong ty thể, một cơ quan sinh

năng lượng nằm trong tế bào chất (ngoài nhân), đây là phân tử ADN có cấu trúc mạch vòng, có chiều dài 5µm Trong tế bào, mtDNA chiếm từ 1 – 5% ADN của tế bào Ví dụ, trong tế bào gan người, số phân tử mtDNA trong một

ty thể là 5, mỗi phân tử chứa khoảng 16600 cặp nucleotit, chúng nằm trong chất nền định khu cạnh các mào và thường liên kết với mào, mtDNA tự tái bản theo kiểu bán bảo thủ nhờ hệ ADN polimeraza có trong chất nền ty thể và xảy ra ở gian kỳ của chu kỳ tế bào mtDNA có dạng mạch vòng và không liên kết với histon, điều này làm cho mtDNA khác với ADN của nhân tế bào mtDNA là một trong những nhân tố quy định tính di truyền tế bào chất [5]

Phân tử ADN ty thể có hai chuỗi, một chuỗi nặng giàu guanin strand) và một chuỗi nhẹ giàu cytosin (L- strand) Chuỗi nặng chứa 12 trong

(H-số 13 gen mã hoá polypeptit, 14 trong (H-số 22 gen tRNA và cả 2 gen rRNA Vùng không mã hoá trên ADN ty thể được gọi là vùng điều khiển hay vùng D-loop, kích thước khoảng 1121 bp, chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng và các promoter phiên mã của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ [8, 18, 19 ] Trên phân tử ADN ty thể cũng có vùng siêu biến, tức là có sự thay đổi trình tự bazơ nitơ đặc trưng cho nhóm cá thể Khi dựa vào sự khuếch đại của phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR), phương pháp phân tích ADN ty thể xác định huyết thống tập trung vào vùng điều khiển hoặc các vùng nhỏ quan tâm nằm trong vùng điều khiển Chủ yếu những vùng quan tâm này được miêu tả như vùng siêu biến I (HV1), vùng siêu biến II (HV2), và vùng siêu biến III (HV3) đây là những vùng đa hình chủ yếu, có tốc độ tiến hóa cao Chính vì vây, nhận dạng ADN ty thể người thường dựa trên sự khác nhau về trình tự của các vùng siêu biến này

Kích thước của hệ gen ty thể (mtADN) ở phần lớn động vật có xương sống vào khoảng 16,8 kb, tuy nhiên có thể sai khác đôi chút do có những đoạn chèn vào, hoặc do mất đoạn, hoặc có những trình tự lặp lại nối tiếp

Bộ gen ty thể của tế bào động vật gồm các exon, cấu trúc tương đối giống nhau và phân bố tương đối không đồng đều, có kích thước khoảng

16000 – 19000 bp Đối với các tế bào động vật có vú, ADN ty thể chỉ chiếm khoảng dưới 1% tổng số ADN của tế bào, mỗi ty thể có chứa một số bản sao của ADN và bởi vì mỗi tế bào chứa nhiều ty thể nên số lượng ADN ty thể có thể rất lớn

Ở người bộ gen của ty thể rất ổn định, có chút đa hình mang tính chủng tộc Và điều độc đáo nhất là tuy cũng là một phân tử ADN sợi kép hình vòng như vi khuẩn nhưng điều khác là cả hai vòng đơn đều có gen mã hóa độc lập với nhau Mỗi ADN ty thể có 16.569 cặp bazơ (nucleotide) [9], là một phân tử

mạch vòng kín nằm trong chất nền ty thể, có hàng nghìn bản sao trong một tế bào Bao gồm 37 gen, mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide tham gia vào chuỗi

hô hấp tế bào, 22 gen tRNA và 2 gen rRNA

Hình 3: Cấu trúc hệ gen ty thể

(Forensic DNA typing 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press)

Vào năm 1981,cấu trúc ADN ty thể người lần đầu tiên, đại diện cho người da trắng đã được Anderon và cộng sự Cambridge (Anh) giải trình tự và công bố, tại phòng thí nghiệm của Fredrick Sanger [9] Sau đó được Anderon

và cộng sự chỉnh sửa lại vào năm 1999 [10] Đây được coi như là trình tự tham chiếu cho các trình tự khác Trong mỗi tế bào chứa khoảng 500 ty thể, trong mỗi ty thể chứa 2 -10 bản sao mtDNA, như vậy có hàng nghìn bản sao mtADN trong khi chỉ có 1 bản sao ADN nhân trên một tế bào

Cho đến nay, đã có trên 300 trình tự hoàn chỉnh của bộ gen ty thể người thuộc các chủng tộc và dân tộc khác nhau được nghiên cứu và đăng ký trong các Ngân hàng trình tự gen quốc tế EMBL(EBI)/Genbank/DDBJ

Cơ sở khoa học của di truyền ADN ty thể

Đối với sự tiến hóa của các động vật có cấu trúc phức tạp, bao gồm cả con người, ty thể đóng vai trò rất quan trọng Mỗi tế bào người chứa đến năm trăm ty thể trong bào tương Quá trình sao mã của mtADN xảy ra ở trong ty thể và độc lập với nhau Hay hệ gen của ty thể (mitochondria genome) độc lập với hệ gen nhân (nuclear genome) của tế bào, chúng có khả năng tự sao chép

mà không cần phụ thuộc vào quá trình phân chia của tế bào, tuy nhiên giữa hệ gen ty thể và hệ gen nhân đều có mối quan hệ rất chặt chẽ với nhau [17] Hệ gen ty thể chịu ảnh hưởng điều hòa của hệ gen nhân cho nên quá trình hoạt động, phân chia của ty thể phụ thuộc một phần vào sự chỉ huy của hệ gen nhân tế bào

Hệ gen ty thể là một cấu trúc tạo bởi ADN hai sợi khép kín, có cả ở nam và nữ giới nhưng chỉ có nữ giới mới truyền ADN ty thể của mình cho những người con và thế hệ sau (mẹ, con gái, dì, bà ngoại, ) Ví dụ điển hình nhất là tinh trùng Giao tử này có thể mang một ít ty thể ở phần sát đuôi như

là một nguồn năng lượng để cho tinh trùng hoạt động trên hành trình dài tìm đến với trứng Khi một tinh trùng nào đó may mắn gắn được với trứng trong quá trình thụ tinh thì đuôi của nó cũng rụng đi Hệ quả là cơ thể mới được tạo thành chỉ chứa ty thể của mẹ truyền cho Như vậy, không giống với ADN của nhân tế bào, vật chất di truyền của ty thể không có hiện tượng chộn lẫn qua mỗi thế hệ, trình tự ADN của gen ty thể thường ổn định qua một thời gian dài trong lịch sự tiến hóa và sự khác biệt trình tự của gen ty thể giữa các thành viên có quan hệ di truyền theo dòng mẹ là rất hiếm Vì vậy đặc tính di truyền theo dòng mẹ là một đặc tính quan trọng cùng với số lượng bản sao lớn mà ADN ty thể đã được ứng dụng trong giám định Trong quần thể người ADN

ty thể di truyền nghiêm ngặt theo dòng mẹ, trong tất cả các tế bào của các mô

và tổ chức của cơ thể đều có chứa ADN ty thể với cấu trúc như ADN ty thể của mẹ Mặt khác, toàn bộ trứng của một người mẹ sinh ra trong các thời điểm khác nhau đều có chứa trình tự bazơ - nitơ trong ADN ty thể giống nhau Trong quá trình thụ tinh, gần 99% ty thể của hợp tử nhận được từ tế bào

trứng nên mọi người con sinh ra từ một mẹ hay tất cả cá thể liên quan dòng

mẹ sẽ có trình tự nucleotide của ADN ty thể đồng nhất với nhau

Hình 4: Sơ đồ phả hệ xác định di truyền theo dòng mẹ ADN ty thể

Không chỉ vậy, ADN ty thể còn có đặc tính độc nhất là tốc độ tiến hóa cao So với hệ gen nhân, ADN ty thể đột biến cao gấp 5-10 lần Chính vì điều này mà nó có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu sự đa dạng về quần thể và

đa dạng các tộc người

Vai trò việc nghiên cứu ADN ty thể

ADN ty thể của người là một phần quan trọng đầu tiên của bộ gen người được giải mã Trình tự ADN của mtDNA cũng đã được xác định cho một số lượng lớn các sinh vật và cá thể, bao gồm cả một số sinh vật đã tuyệt chủng

Việc so sánh các trình tự ADN ty thể đóng vai trò trong nghiên cứu phát sinh chủng loài học (phylogenetics), trong đó nó cho phép các nhà sinh

học làm sáng tỏ mối quan hệ tiến hóa giữa các loài và kiểm tra mối liên hệ của các quần thể, và như vậy nó rất quan trọng trong lĩnh vực nhân chủng học

và sinh học

Đặc biệt trong công tác giám định pháp y – hình sự, đối với những mẫu sinh học lâu năm thì việc nghiên cứu ADN ty thể là hết sức quan trọng trong việc nhận dạng mẫu sinh học

1.3 Cytochrome B

Trong ADN ty thể có gen Cytb chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp

polypeptide Nó là một protein vận chuyển điện tử trong chuỗi hô hấp bên trong ty thể Protein này có vai trò quan trọng trong hoạt động sinh lý của tế bào và cơ thể động vật vì nó liên quan đến việc tạo năng lượng để cung cấp cho các hoạt động sống

Cytb là một trong 37 gen của hệ gen ty thể, có chiều dài khoảng 1140bp [32] và được đặt giữa hai vùng ND6 và vùng DLoop Phân cách bởi hai vị trí: tRNA Glu và tRNA Thr

14816F

ATG 15773R

14700 14747 15900

Hình 5: Vị trí gen Cytb trong ADN ty thể [16]

Để xác định định loài có thể dựa vào phương pháp điện di protein, miễn dịch hoặc sắc ký Tuy nhiên phương pháp dựa vào protein có nhiều hạn chế là

không được đặc hiệu và số loài thường bị hạn chế Phân tích trình tự gen Cytb

là một phương pháp lý tưởng để xác định loài cũng như nguồn gốc mẫu sinh

phẩm [15, 31, 33] Sở dĩ Cytb được sử dụng phổ biến nhất trong việc xác định

loài cho các mẫu giám định là vì nó có những đặc điểm rất độc đáo so với các

Cytochrome B

gen khác, nó mang tính đặc trưng riêng cho loài, có tính ổn định ít thay đổi qua các thế hệ của loài với nhau

Với một lượng lớn động vật, gen Cytb đã được giải trình tự ADN hoàn chỉnh và đầy đủ, so sánh trình tự gen Cytb giữa các loài cho thấy gen này có

tính đa hình cao giữa các loài Giữa các cá thể trong cùng một loài gần như

không có sự thay đổi về trình tự gen Cytb[13,16,18, 21, 22, 23, 25, 26]

Mặt khác, gen Cytb nằm hoàn toàn trên ty thể [7] nên nó mang những

đặc điểm riêng biệt so với các hệ thống ADN trong nhân như không có hiện tượng tái tổ hợp, mỗi tế bào có hàng nghìn bản sao mtDNA khiến cho việc

thu nhận và phân tích ADN vùng Cytb dễ dàng hơn phân tích ADN trong

nhân rất nhiều Điều này đặc biệt có giá trị trong các trường hợp giám định

với mẫu đã bị phân hủy nhiều [30] Bên cạnh đó, gen Cytb có tốc độ đột biến

nhanh hơn 4 - 5 lần so với ADN trong nhân do nó không có intron, thiếu các

cơ chế bảo vệ khỏi các tác nhân oxi hóa bên trong ty thể [27] Những đặc tính

này của gen Cytb cho phép tiến hành việc khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của

gen đó rồi phân tích tiếp bằng phương pháp đọc trình tự hoặc phân tích RFLP [7, 20]

Trong phân tích trình tự gen vùng Cytb trên hệ gen ty thể giúp phân biệt

một mẫu sinh phẩm là của người hay của một loài động vật nào khác Cũng như ở người, ở động vật với số lượng bản sao lớn cho phép phân tích ADN ty thể từ các mẫu đặc biệt (những mẫu chứa rất ít ADN nhân hoặc mẫu đã bị

phân hủy mạnh) Việc nghiên cứu và phân tích gen Cytb đóng vai trò quan

trọng trong nhiều lĩnh vực như: đa dạng sinh học, nghiên cứu tiến hóa loài, trong lĩnh vực y học (nghiên cứu di truyền bệnh), thực phẩm (xác định nguồn gốc các loại thịt,cá…), nhân chủng học, khoa học hình sự Đặc biệt trong lĩnh vực pháp y việc xác định nguồn gốc mẫu sinh phẩm, dấu vết sinh học là một phương pháp giám định trợ giúp đắc lực cho công việc điều tra

1.4 Tình hình nghiên cứu gen Cytb trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu gen Cytb ở nước ngoài

Do Cytb được coi là đối tượng được tập trung nghiên cứu và được tìm

hiểu kĩ nhất trong các gen ty thể nên tính đến nay trong Genbank đã có tới

hơn 8000 trình tự gen Cytb của các loài động vật có xương sống đã đươc lưu

lại [17]

-Năm 2000, bằng cách tách chiết ADN và phân tích trình tự của gen Cytb

W.Parson và cộng sự nghiên cứu nhận dạng 44 loài động vật khác nhau, bao

gồm 5 nhóm có xương sống lớn là động vật có vú, chim, bò sát, lưỡng cư và

các loài cá [25]

-Năm 2001, để phân biệt nguồn gốc của các mẫu sinh học thuộc những

loài có quan hệ gần gũi với nhau nhóm của Hsieh đã nghiên cứu và chỉ ra chỉ

với một đoạn trình tự gen Cytb có chiều dài 273 bp cũng đủ để đưa ra kết quả

[16]

-Matsuda và cộng sự (2005) đã chỉ ra rằng có thể xác định nguồn gốc con

người của một mẫu sinh học bằng cách dựa vào việc khuếch đại một đoạn

trình tự mtADN [19]

-Năm 2006, L Cainé và cộng sự nghiên cứu nhận dạng các mẫu sinh

phẩm chưa rõ nguồn gốc dựa trên gen Cytb ở Bồ Đào Nha [14]

-Năm 2007, Nakaki và cộng sự nghiên cứu nhận dạng một số loài động

vật như người, chó, mèo bằng cách sử dụng kết hợp một phản ứng mở rộng

mồi đơn[24]

Trong một số báo cáo đã chỉ ra rằng một đoạn trình tự dài khoảng 385

bp trên gen Cytb có mặt một cách rộng rãi trong nhiều loài động vật có xương

sống thuộc các nhóm khác nhau Một số chuyên gia khác còn sử dụng đoạn

trình tự có chiều dài hơn 402 bp để xác định loài động vật và đoạn đó cho

thấy sự khác biệt ít hơn 3% giữa bất cứ loài nào[29]

Trong khoa học pháp lý Cytb đã được ứng dụng chủ yếu tập trung vào:

 Kiểm tra nguồn gốc thịt trong công nghiệp thực phẩm

 Phát hiện các sản phẩm làm từ thịt của các loài động vật bị cấm buôn

bán theo công ước quốc tế buôn bán về động vật hoang dã

 Trong các nghiên cứu về phát sinh chủng loại

Trên thế giới, mới chỉ có một vài công bố của các tác giả về nghiên cứu

Cytb để phát hiện nguồn gốc mẫu từ người nhưng chưa có quy trình chuẩn

1.4.2 Tình hình nghiên cứu gen Cytb ở Việt Nam

Cho đến nay các nghiên cứu về về Cytb ở Việt Nam vẫn chưa nhiều,

các công trình nghiên cứu còn hạn chế, chỉ tập trung vào việc nghiên cứu đa dạng và bảo tồn một số loài động vật

Các công trình nghiên cứu được công bố:

- Năm 2007, Nguyễn Anh và cộng sự nghiên cứu xác định trình tự gen

mã hóa Cytb của hệ gen ty thể và đánh giá mối quan hệ di truyền của một số

loài cá Song nuôi thả tại các vùng biển Việt Nam [1]

- Năm 2008, Nguyễn Minh Tâm và cộng sự nghiên cứu trình tự Cytb của

Sao la [3]

- Năm 2013, Nguyễn Mạnh Hà và cộng sự nghiên cứu khả năng sinh

trưởng và sự đa hình của gen Cytb của gà Bò và gà Mía phục vụ cho công tác

bảo tồn giống[2]

Việc nghiên cứu gen Cytb là rất quan trọng, tuy nhiên ở nước ta tình

hình nghiên cứu về gen này còn hạn chế trên người, và một số loài động vật như bò, chó, lợn Chính vì vậy đây là đề tài chủ yếu nghiên cứu về giải trình

tự gen ADN ty thể vùng Cytb từ đó ứng dụng trong giám định phân biệt ADN

ty thể người và một số động vật

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Tôi tiến hành phân tích ADN trên các trường hợp đến giám định tại Viện Pháp y quốc gia và các mẫu ADN động vật thu thập từ các nguồn khác nhau như: mẫu máu, mẫu lông tóc, mẫu mô, mẫu xương

- Cỡ mẫu: 35 mẫu

* Tiêu chuẩn lựa chọn:

- Mẫu ADN người: Thu thập mẫu máu, mẫu xương các trường hợp đến giám định ADN ty thể tại Viện Pháp y quốc gia (15 mẫu) Mẫu được ký hiệu

từ N1CB đến N15CB

- Mẫu ADN động vật: thu thập mẫu máu, mẫu lông, mẫu mô, mẫu xương từ các cơ sở khác nhau trên địa bàn Hà Nội

* Thiết bị:

+ Máy ly tâm lạnh (Hermle – Đức)

+ Máy ly tâm nhanh (Eppendorf – Đức)

+ Máy đo pH

+ Nồi hấp, tủ sấy (ALT – Nhật Bản)

+ Máy lắc ổn nhiệt (Labnet – Mỹ)

+ Máy đo nồng độ ADN (Genova Nano Spectrophotoneter Accessory – Bibby Scientific – Anh)

+ Máy PCR (Eppendorf – Đức)

+ Bộ điện di polyacrylamide (Thermo scientific)

+ Máy giải trình tự gen Applied Biosystems 3500 – Mỹ

+ Các thiết bị khác tại Khoa Y - Sinh học, Viện Pháp y quốc gia

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết ADN

Tùy theo từng loại mẫu: máu, mô hay xương sẽ tiến hành tách chiết ADN theo Quy trình giám định ADN [6]

Quy trình tách chiết đối với từng loại mẫu như sau:

 Tách chiết ADN từ mẫu máu có sử dụng Chelex ® 100 nồng độ 10%:

Bước 1 Chuẩn bị mẫu:

- Nếu vết máu khô trên thẻ lưu mẫu: Lấy dao tách khoảng ¼ diện tích vòng tròn trên thẻ thành những mảnh nhỏ cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng

- Nếu vết máu khô trên gạc hoặc vật chứa khác: Cắt khoảng 0,5 cm2 vết máu khô thành từng mảnh nhỏ cho vào ống eppendorf 1.5 ml vô trùng

- Nếu máu tươi: Lấy khoảng 5 - 50 µl máu tươi cho vào ống eppendorf 1.5 ml vô trùng

Bước 2 Bổ sung 1ml đệm PBS vào trong ống eppendorf, vortex đều

5-10 giây Để ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút

Bước 3 Ly tâm ở nhiệt độ phòng 12.000 vòng/phút, 5 phút

Bước 4 Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn (Lặp lại bước 2 - 4 từ 1 đến 2 lần

để làm sạch mẫu)

Bước 5 Bổ sung 150-200 µl dung dịch chelex 10%, 10-15 µl dung dịch proteinase K (10mg/ml)

Bước 6 Ủ ở nhiệt độ 56oC trong 30-60 phút

Bước 7 Đun sôi mẫu trong 8 phút

Bước 8 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Sau đó hút dịch nổi sang một ống eppendorf 1.5ml mới và bảo quản ở nhiệt độ -20oC

 Đối với mẫu lông, tóc:

Bước 1. Chuẩn bị mẫu: Lấy dao cắt 4 - 5 chân lông, tóc cho vào ống eppendorf 1.5ml

Bước 2 Bổ sung 1ml đệm PBS vào trong ống eppendorf, vortex đều

5-10 giây, Để ở nhiệt độ phòng khoảng 5 phút

Bước 3 Ly tâm ở nhiệt độ phòng 12.000 vòng/phút, 5 phút

Bước 4 Hút bỏ dịch nổi, giữ lại cặn (Lặp lại bước 2 - 4 từ 1 đến 2 lần

để làm sạch mẫu)

Bước 5 Bổ sung 150-200 dung dịch chelex 10%, 10 - 15µl dung dịch

proteinase K (10mg/ml)

Bước 6 Ủ ở nhiệt độ 56oC trong vòng 30 - 60 phút

Bước 7 Đun sôi mẫu trong 8 phút

Bước 8 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Sau đó hút dịch nổi sang một ống eppendorf 1.5ml mới và bảo quản ở nhiệt độ -20oC

Bước 1 Trích < 10 mg mẫu mô cho vào ống eppendorf 1.5 ml

Bước 2 Cho 180 µl Buffer ATL vào ống, để ở to 15-25 oC

Bước 3 Cho thêm 20 µl proteinase K, vortex khoảng 15 giây

Bước 4 Cho ống nghiệm vào máy ổn nhiệt ở 56 oC qua đêm đến khi mẫu ly giải hoàn toàn

Bước 5 Bổ sung thêm 200 µl AL, vortex khoảng 15 giây

Bước 6 Cho thêm 200 µl cồn tuyệt đối, vortex khoảng 15 giây Ủ ở

nhiệt độ phòng 15-25 oC trong 5 phút

Bước 7 Ly tâm nhanh

Bước 8 Chuyển toàn bộ dung dịch ly giải sang cột QIAamp MinElute

(trong ống 2 ml) Ly tâm 8000 vòng/phút Đặt cột sang ống 2 ml vô trùng khác Loại bỏ ống chứa dịch

Bước 9 Cho thêm 500 µl Buffer AW1 Ly tâm 8000 vòng/phút Đặt cột

sang ống 2 ml vô trùng khác Loại bỏ ống chứa dịch

Bước 10 Cho thêm 500 µl Buffer AW2 Ly tâm 8000 vòng/phút Đặt

cột sang ống 2 ml vô trùng khác Loại bỏ ống chứa dịch

Bước 11 Ly tâm 14000 vòng/phút, trong 3 phút và để khô hoàn toàn

Bước 12 Đặt cột vào ống 1,5 ml Loại bỏ ống chứa dịch Cho thêm từ

20-100 µl dung dịch AE vào giữa trung tâm màng lọc

Bước 13 Đậy nắp, để ở nhiệt độ phòng (15-25oC) trong 1- 5 phút Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 15 Bỏ cột, thu ống chứa dịch và bảo quản ở nhiệt độ -20℃

Tách chiết ADN bằng Qiamp® DNA micro kits

Bước 1. Chuẩn bị mẫu: Làm sạch mẫu bằng cơ học, sau đó dùng cưa cưa nhỏ thành các miếng khoảng từ 2-3cm rồi nạo sạch phần phân hủy bên ngoài

và bên trong ống xương

Bước 2. Ngâm xương trong EDTA 0.5M khoảng 48 giờ

Bước 3. Rửa sạch EDTA bằng Nước cất khử ion sau đó gọt xương bằng dao mổ thành những mẩu nhỏ cho vào ống eppendorf 1.5ml

Bước 4. Bổ sung 500µl đệm ATL + 100µl Proteinase K + 20µl DTT 1M, vortex 5 giây

Bước 5. Ủ ở nhiệt độ 56oC, từ 10-12 giờ (hoặc qua đêm)

Bước 6. Bổ sung thêm 620µl đệm AL vortex 5 giây

Bước 7 Ủ ở nhiệt độ 70oC/10 phút

Bước 8. Ly tâm nhanh

Bước 9. Chuyển toàn bộ dung dịch ly giải sang cột QIAamp MinElute (trong ống 2 ml) Ly tâm 8000 vòng/phút Đặt cột sang ống 2 ml vô trùng khác Loại bỏ ống chứa dịch

Bước 10. Cho thêm 500µl Buffer AW1 Ly tâm 8000 vòng/phút Đặt cột sang ống 2 ml vô trùng khác Loại bỏ ống chứa dịch

Bước 11. Cho thêm 500µl Buffer AW2 Ly tâm 8000 vòng/phút Đặt cột sang ống 2 ml vô trùng khác Loại bỏ ống chứa dịch

Bước 12 Ly tâm 14000 vòng/phút, trong 3 phút và để khô hoàn toàn

Bước 13 Đặt cột vào ống 1,5 ml Loại bỏ ống chứa dịch Cho thêm từ

20 - 100 µl dung dịch AE vào giữa trung tâm màng lọc

Bước 14 Đậy nắp, để ở nhiệt độ phòng (15 - 25oC) trong 5 phút Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 15. Thu và bảo quản ADN ở -20oC

2.2.2 Điện di ADN tổng số

ADN tổng số thu được sẽ được điện di trên gel agarose 0,8% sau đó

sát băng trên bàn soi gel

- Chuẩn bị agarose gel 0,8 % (100 ml đệm TBE 1X + 0,8 gram agarose)

- Đun sôi trong lò vi sóng, sôi 1 phút cho đến khi hòa tan hoàn toàn

- Đưa cốc agarose ra khỏi lò vi sóng, lắc kỹ Để nguội còn 50 - 60oC

- Đổ agarose vào khuôn, tạo giếng bằng lược 4 mm, để gel đông lại

- Tra hỗn hợp 5-7 µl mẫu + 2 µl loading dye vào giếng

- Chạy điện di trong đệm TBE 1X

- Điện di sao cho ADN di động theo chiều từ cực âm đến cực dương (6 V/cm theo khoảng cách giữa hai điện cực)

- Quan sát mẫu nghiên cứu trên bàn soi gel và chụp ảnh

2.2.3 Phản ứng PCR

Phản ứng PCR được thực hiện bằng cặp mồi 14816F và 15773R được

thiết kế để khuếch đại vùng Cytb

Bảng 1: Trình tự các cặp mồi dùng khuếch đại vùng Cytb

Bảng 3: Chu trình nhiệt được thực hiện dùng cho máy PCR

(Eppendorf-Đức)

phẩm

Giữ mẫu

2.2.4 Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Chạy điện di phát hiện sản phẩm PCR trên gel Polyacrylamide 6% [26]

Bảng 4: Thành phần hóa chất điện di

- Sau khi chạy điện di xong, tiến hành nhuộm gel như sau:

+ Cố định trong dung dịch dừng phản ứng (Stop solution: 5 ml acetic acid

+ 100 ml Ethanol 100% + nước cất đến đủ 1 lít) trong 5 phút

+ Ngâm trong dung dịch AgNO3 1% có bổ sung 1,5 ml formaldehyde 37% trong 10 phút

+ Rửa trong nước cất khoảng 10 giây

37% đến khi hiện băng

Bước 2: Chuẩn bị mẫu phản ứng

Bước 3: Đặt cột vào ống thu, ghi tên mỗi mẫu sinh phẩm một cột

Bước 4: Chuyển toàn bộ dung dịch của mẫu đã được chuẩn bị lên cột

và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút

Bước 5: Ly tâm toàn bộ ống trong cột ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong

1 phút Loại dịch qua cột Đặt cột lại ống thu

Bước 6: Rửa cột bằng cách thêm 700µl dung dịch màng (đã được thêm 95% công 100º)

Bước 7: Ly tâm toàn bộ ống nghiệm trong 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 8: Loại bỏ dịch qua cột, đặt cột lại ống thu

Bước 9: Lặp lại việc rửa bằng cách bổ sung 500 µl dung dịch rửa màng

Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 5 phút Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút (để bốc hơi hết Ethanol còn dư)

Bước 10: Chuyển cột vào ống eppendorf 15ml mới Bổ sung 50µl Nuclease – Free Water (tra vào chính giữa của cột không đụng mũi pipet vào màng cột) Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Sau đó ly tâm 14.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 11: Bỏ cột, thu ống thu có chứa ADN Bảo quản ở 4℃ hoặc -20℃

* Đo nồng độ sản phẩm PCR đã tinh sạch bằng máy Genova Nano Spectrophotometer Micro Volume Accessory (Bibby Scientific - Anh)

Nồng độ ADN (ng/µl) = 50 x Độ hấp thụ ở bước sóng 260

Bảng 5: Thực hiện PCR với BigDye Terminator kit [12]:

Lắc trên máy lắc ở nhiệt độ phòng trong 25 phút

Ly tâm nhanh, load mẫu lên khay mẫu, đưa khay vào máy giải trình tự gen

* Giải trình tự gen trên máy ABI 3500 [11]:

Thực hiện trên máy theo hướng dẫn nhà sản xuất:

Hình 6: Chương trình thiết lập phần mềm giải trình tự

2.2.6 Xử lý và thống kê số liệu

Các trình tự thu được từ hệ thống trình tự được xem trước và gọi tên peak bằng phần mềm Sequencing A6 Các trình tự nucleotide được phân tích trên phần mềm BioEdit lưu trữ dữ liệu dưới dạng file fasta và sau đó các trình

tự này sẽ làm dữ liệu đầu vào cho phần mềm ApE dùng để so sánh với trình

tự tham khảo trên ngân hàng gen quốc tế

Các trình tự thao khảo sử dụng cho các loài: người, bò, chó, lợn lần lượt tương ứng là: Homo sapiens (JN034136.1), Bos taurus (GU249573.1), Canis lupus (JF489119.1), Sus scrofa (AB015081.1)

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số

Để tách chiết ADN đạt hiệu suất và độ tinh sạch cao thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng Phương pháp tách chiết ADN bằng chelex là phương pháp khá phổ biến để tách chiết ADN từ các mẫu vật có nguồn ADN dồi dào như máu, mô, tóc Đối với mẫu xương việc tách chiết ADN bằng Qiamp DNA micro kits Chất lượng ADN thu được sau tách chiết và tinh sạch ảnh hưởng đến kết quả quá trình nghiên cứu Vì vậy, trong nghiên cứu này, các mẫu ADN tổng số sau khi tách chiết được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%, tiến hành nhuộm với GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain (Biotium - Mỹ) và bằng ánh sáng lục trên bàn soi gel để phát hiện băng của từng mẫu

Hình 7: Điện di ADN tổng số trên gel agarose 0.8%

Giếng số 1 - 8: ADN tổng số từ các mẫu máu người (1,2), máu bò (3,4), máu chó (5,6) và máu lợn (7,8)

Giếng số 9: ADN tổng số K562 (Promega - Mỹ)

Giếng số 10 - 13: ADN tổng số từ các mẫu tóc người (10), mô bò (11), mô chó (12) và mô lợn (13)

Giếng số 14,15: ADN tổng số từ mẫu xương người

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15