Tìm hiểu hiện trạng nhiễm mầm bệnh vi rút trên tôm thẻ chân trắng nuôi ở ĐBSCL

Để đưa thẻ chân trắng vào hệ thống nuôi thủy sản ở vùng ĐBSCL một cách an toàn và hiệu quả là phải kiểm soát được dịch bệnh một cách chặt chẽ ngay từ giai đoạn đầu chọn giống, nhằm phát

Phần 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là một đồng bằng châu thổ lớn, có hệ thống sông ngòi chằng chịt, bờ biển dài với những điều kiện khí hậu thuận lợi cho việc phát triển thủy sản và đã trở thành nơi sản xuất thủy sản chủ lực, chiếm hơn 80% sản lượng thủy sản của cả nước

Nuôi trồng thủy sản đang ngày càng phát triển, thành phần nuôi cũng đa dạng hơn Hiện nay tôm thẻ chân trắng cũng được nuôi rất phổ biến ở các tỉnh ĐBSCL như: Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng… Thẻ chân trắng là đối tượng có giá trị kinh

tế cao thị trường tiêu thụ rộng, thời gian sinh trưởng ngắn (3 – 3,5 tháng), năng suất cao (trên 4 tấn/ha), thâm canh có thể đạt đến 20 tấn/ha Nhờ có giá trị dinh dưỡng cao mà hiện nay tôm chân trắng đang được người tiêu dùng ở các thị trường lớn ưa chuộng Mỹ là thị trường tiêu thụ tôm chân trắng lớn nhất sau đó là Châu Âu và Nhật Bản (Ts Trần Viết Mỹ, 2009)

Tuy không có lịch sử lâu đời như tôm sú nhưng TTCT đang là đối tượng nuôi có nhiều triển vọng Tuy nhiên TTCT cũng tiềm ẩn nhiều nguy cơ bộc phát dịch bệnh nguy hiểm do vi-rút gây ra như: vi-rút gây bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV), vi-rút gây Hội chứng Taura (TSV), vi-rút gây bệnh hoại tử cơ (IMNV), …gây thiệt hại lớn đến sản lượng (tỉ lệ chết cao 40-90%) Để đưa thẻ chân trắng vào hệ thống nuôi thủy sản ở vùng ĐBSCL một cách an toàn và hiệu quả là phải kiểm soát được dịch bệnh một cách chặt chẽ ngay từ giai đoạn đầu chọn giống, nhằm phát hiện sớm mầm bệnh cũng như đề ra biện pháp phòng

ngừa hiệu quả cho hệ thống nuôi Do đó đề tài: “Tìm hiểu hiện trạng nhiễm mầm bệnh vi-rút trên tôm thẻ chân trắng nuôi ở ĐBSCL” được thực hiện 1.2 Mục tiêu đề tài

Tìm hiểu sự hiện diện một số mầm bệnh vi-rút trên tôm thẻ chân trắng nuôi ở ĐBSCL

1.3 Nội dung nghiên cứu

Xác định sự hiện diện của một số loại vi rút (WSSV, TSV, IHHNV, MBV) trên TTCT giai đoạn giống

Xác định sự hiện diện của một số loại vi rút (WSSV, TSV, IHHNV, MBV) trên TTCT giai đoạn nuôi thương phẩm

Phần 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan tình hình dịch bệnh trên tôm thẻ chân trắng

2.1.1 Trên thế giới

Sản lượng ngành nuôi trồng Thủy Sản không ngừng tăng qua các thập niên gần đây Trong đó, nghề nuôi tôm trên thế giới được phát triển mạnh từ năm 1970 Năm 1975, Ecuador đã dẫn đầu về sản lượng tôm nuôi ở Tây Bán Cầu và Đài Loan Sản lượng tôm nuôi trên thế giới tiếp tục tăng từ 50.000 tấn năm 1975 lên đến 450.000 tấn năm 1988 Theo FAO, đến năm 1990 sản lượng tôm nuôi trên thế giới đạt 900.000 tấn/năm Năm 1992, Thái Lan trở thành nước có sản lượng tôm nuôi đứng đầu thế giới (Trần Ngọc Hải, 2004) Tuy nhiên, cùng với sự phát triển nghề nuôi thì dịch bệnh bùng phát ngày một nhiều hơn, trong vòng chưa đầy

15 năm dịch bệnh đã gây thiệt hại trên 100.000 tấn tôm nuôi, làm sản lượng tôm nuôi trên thế giới từ 733.000 tấn năm 1993 giảm xuống còn 600.000 tấn năm

2007 (Nguyễn Văn Hảo, 2002)

Vào năm 1984 Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu (IHHNV) lần đầu được

phát hiện ở Hawaii gây chết hàng loạt tôm P stylirostris (90%) Sau đó phát hiện

ở Mỹ và các vùng nuôi ven bờ biển Thái Bình Dương Khi nhiễm IHHNV, tôm thẻ chân trắng thường bị dị hình như chũy biến dạng hoặc mất, thân bị cong, chậm lớn làm tỉ lệ tôm nhỏ cao khi thu hoạch Trong khi đó, tôm sú lại không biểu hiện bất cứ triệu chứng nào khi nhiễm IHHNV và có khả năng mang mầm bệnh trong suốt thời gian sống của chúng Do vậy, khả năng lây lan mầm bệnh IHHNV sang tôm thẻ chân trắng khi có điều kiện thuận lợi là rất cao (Flegel, 2002)

Tiếp theo đó là bệnh đốm trắng (WSSV) đây cũng là một loại vi rút gây bệnh nguy hiểm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng với tỉ lệ chết lên đến 90% Lần đầu tiên bệnh được công bố ở Nhật Bản năm 1993 Sau đó vi rút nhanh chóng lây lan nhanh trên khắp các vùng nuôi tôm Châu Á Năm 1995, WSSV nhiễm và gây ảnh hưởng trên tôm thẻ chân trắng Ngoài ra WSSV còn lây nhiễm đến một số lượng

lớn các loài tôm và giáp xác khác như P merguiensis, Metapenaeus ensis,

Metapenaeus monoceros, Macrobrachium rosenbergiii, Palaemon setiferus, Euphausia superba và các ký chủ này cũng là nguyên nhân lây truyền WSSV

(Flegel, 1997; Hossain, 2001)

Theo tổ chức thú y thế giới, hội chứng Taura xảy ra đầu tiên ở Ecuador vào năm

1992 ở gần sông Taura làm thiệt hại gần 90% sản lượng tôm thẻ chân trắng, giảm 15-25% sản lượng thế giới Đồng thời bùng phát ở Honduran làm giảm 18% sản

lượng năm 1994 và 31% năm 1995 (Corral et al.,1999) Sau đó bệnh lan nhanh ra

các khu vực Châu Mỹ Latinh : Colombia, CostaRica, Salvado, Guatemale, Brazil,…Bệnh xảy ra ở Châu Á vào năm 1999 ở Trung Quốc và Đài Loan rồi lan sang các quốc gia khác như: Thái Lan, Malaysia, Indonesia,…Theo công bố của OIE thì ở vùng Châu Á- Thái Bình Dương có nhiều báo cáo về sự xuất hiện của TSV ở một số quốc gia như : Myanma, Trung Quốc, Indonesia, Thái Lan và Việt Nam (OIE, 2009)

Gần đây nhất là bệnh hoại tử cơ (IMNV) được phát hiện năm 2002 ở các ao nuôi tôm thẻ chân trắng ở miền Đông Bắc Braxin Sau đó bệnh lây lan sang các nước khác thuộc khu vực Châu Á như Indonesia, Thái Lan và tỉnh Hải Nam, Trung Quốc Đây là loại virus có khả năng phát dịch trên các đối tượng tôm nuôi như tôm thẻ chân trắng, tôm sú và tôm càng xanh Khi xảy ra bệnh, các ao tôm có thể

bị thiệt hại từ 40 -70% Quá trình lây lan của IMNV qua các châu lục khác nhau

được ghi nhận là do sự nhập chuyển của tôm bố mẹ P.vannamei Vi rút này đã

được đưa vào danh sách cần theo dõi của NACA/FAO/OIE vào tháng 2 năm

2006. (Poulos et al., 2006).

2.1.2 Ở Việt Nam

Tôm thẻ chân trắng được du nhập vào Việt Nam từ những năm đầu thế kỷ 21, trong đó Quảng Ngãi là một trong những địa phương có nghề nuôi tôm thẻ chân trắng sớm nhất và hiện là tỉnh có diện tích, năng suất, sản lượng và kỹ thuật nuôi cao nhất trong cả nước Từ một vài ha nuôi tôm thẻ chân trắng ở năm 2003, đến nay diện tích nuôi tôm thẻ chân trắng trên địa bàn tỉnh Quảng Ngãi đã đạt đến gần 600 ha Năng suất nuôi bình quân đạt khoảng 7tấn/ha/vụ, đặt biệt ở vùng nuôi tôm trên cát năng suất đạt trên 18tấn/ha/vụ, sản lượng tôm thẻ chân trắng nuôi năm 2008 trên toàn tỉnh đạt 5.440 tấn (http://www.quangngai.gov.vn)

Từ tháng 6 năm 2002, tôm thẻ chân trắng chính thức được Bộ Thủy sản cấp phép nuôi nhưng chỉ với qui mô nhỏ và thử nghiệm tìm hiểu sự ảnh hưởng tích cực cũng như tiêu cực đến môi trường cũng như nghề nuôi tôm Trong thời gian đầu, chín công ty thương mại được Bộ Thủy sản cấp phép nhập khẩu 48 triệu tôm P vannamei bột, 5900 tôm bố mẹ từ Hawaii và Trung Quốc, được kiểm dịch nghiêm ngặt để đảm bảo nguồn tôm không mang mầm bệnh Tuy nhiên, trong

thời gian gần đây tôm thẻ chân trắng được nuôi tương đối phổ biến nên nguồn tôm giống nhập vào Việt Nam là rất lớn và các cơ quan quản lý khó có thể quản

lý được tất cả các nguồn tốm giống nhập vào nước ta

Theo Báo cáo kết quả Nuôi Trồng Thủy Sản năm 2003: cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước

Chủ yếu là bệnh đốm trắng (WSSV) bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh

do vi khuẩn Vibrio, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi (Hà Anh, 2004)

Đầu năm 2008, Bộ NN&PTNT chính thức cho phép các tỉnh Nam Bộ nuôi thâm canh tôm TCT và nó đã khẳng định vị thế quan trọng trong cơ cấu sản xuất, xuất khẩu tôm của Việt Nam (Năm 2010, XK tôm đạt trên 2 tỉ USD, chiếm hơn 1/3 tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước (5 tỉ USD), trong đó tôm TTCT đóng góp 26% giá trị xuất khẩu)

Năm 2010, tại Phú Yên dịch bệnh trên tôm thẻ chân trắng bùng phát nhanh chóng làm thiệt hại trên 238,6 ha, chiếm 61,2% diện tích thả nuôi, dịch bệnh xảy ra chủ yếu tập trung ở huyện Tuy An 3,6 ha và huyện Đông Hòa 235 ha (Nguyên Lưu, 2010)

Theo thống kê của tổng cục thủy sản Việt Nam trong năm 2011, ở 8 tỉnh ĐBSCL thiệt hại diện tích thả tôm có đến 66.593ha (trong đó 64.758ha tôm sú và 1.835ha tôm thẻ chân trắng), tăng gấp 2,3 lần so với cùng thời điểm năm 2010

Cụ thể, từng địa phương có diện tích nuôi tôm bị thiệt hại nặng như Sóc Trăng 20.514ha, Bạc Liêu 13.536ha, Kiên Giang 11.252ha, Cà Mau trên 9.933ha, Trà Vinh 7.628ha, Long An 2.072ha,…đã làm ảnh hưởng đến sản lượng chung của cả nước Theo ghi nhận chung thì tôm sau khi thả nuôi chết phổ biến ở giai đoạn từ 15-40 ngày tuổi (www.agroviet.gov.vn)

2.2 Sơ lược một số bệnh vi rút trên tôm

2.2.1 Bệnh đốm trắng

2.2.1.1 Tác nhân gây bệnh

Bệnh đốm trắng do White spot syndrome virus (WSSV) gây ra, có dạng hình

trứng Thuộc giống Whispovirus, họ Nimaviridae Có 3 dòng vi rút đã được giải

mã hoàn chỉnh trình tự gen, vi rút có DNA mạch đôi (dsADN), đường kính 120 –

150 nm, chiều dài 270 – 290 nm

WSSV có thể tồn tại ít nhất 30 ngày ở 300C trong nước biển ở phòng thí nghiệm Trong ao nuôi WSSV tồn tại ít nhất 3 – 4 ngày Vi rút đốm trắng bất hoạt ở 500C (dưới 120 phút) và ở 600C (dưới 1 phút) Một chu kỳ sao chép của vi rút mất 20h

ở nhiệt độ là 250C

2.2.1.2 Dấu hiệu bệnh lý

Tôm bị bệnh đốm trắng thường có dấu hiệu tiêu thụ thức ăn giảm sút rõ ràng, đặc biệt có trường hợp tăng cường độ bắt mồi hơn bình thường, sau vài ngày mới có hiện tượng bỏ ăn Tôm bệnh dạt vào bờ, lờ đờ, tôm yếu ở tầng mặt với các dấu hiệu đặc trưng là xuất hiện các đốm trắng tròn dưới lớp vỏ kitin đường kính 0,5 –

2 nm, đặc biệt các đốm trắng tập trung ở giáp đầu ngực Tôm bệnh có khi chuyển sang màu đỏ Hiện tượng chết có thể xảy ra ngay sau đó, tỷ lệ chết cao có thể lên tới 100% trong vòng 3 – 10 ngày

Hình 2.1: Những đốm trắng trên vỏ đầu ngực và trên thân tôm nhiễm WSSV Khi tôm bị bệnh WSSV, trong mô của một số cơ quan như: mang, dạ dày, biểu mô dưới vỏ kitin, cơ quan tạo máu có những biến đổi đặc thù Những tế bào bị nhiễm vi-rút thể hiện sự hơi phình to của nhân tế bào, trong đó chứa duy nhất một thể vùi (Inclusion bodies), hình cầu, hoặc hình trứng bắt màu tím hồng của Haematoxylin và Eosin Khi bệnh nặng, các thể vùi thường chiếm hết thể tích của nhân tế bào phình to

Hình 2.2 Mang tôm bị nhiễm WSSV ( T.W Flegel)

2.2.1.3 Phân bố và lan truyền bệnh

Bệnh đốm trắng lần đầu tiên được phát hiện ở khu vực Đài Loan – Trung Quốc vào năm 1991 – 1992 Ở Nhật phát hiện vào 1993 từ tôm nhập khẩu của Trung Quốc Sau đó cũng phát hiện bệnh ở một số nơi khác như: Hàn Quốc, Đông Nam

Á, Nam Á, Ấn Độ, Địa Trung Hải, Trung Đông và một số nước ở Châu Mỹ (OIE,2008)

Bệnh xảy ra từ tôm giống đến tôm trưởng thành của các khu vực nuôi thâm canh

và quảng canh Bệnh phát hiện ở nhiều động vật giáp xác tự nhiên như các loài tôm he, tôm nước ngọt, cua, tôm hùm, chân bèo và ấu trùng, côn trùng Động lực hầu hết với các loài tôm có giá trị kinh tế (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004)

WSSV được truyền theo hai con đường:

Truyền dọc: từ bố mẹ bị nhiễm bệnh Noãn bào tôm nhiễm vi rút đốm trắng thì không thành thục được,nhưng trong quá trình tôm mẹ đẻ trứng của nó có thẻ thải

ra môi trường có vi rút đốm trắng do đó ấu trùng tôm nhiễm vi rút

Truyền ngang: vi rút từ tôm bệnh, vật chủ trung gian (giun nhiều tơ,artermia…) mang mầm bệnh truyền sang hoặc mầm bệnh sẵn có trong nước rồi truyền sang cho tôm khỏe

2.2.1.4 Phương thức chẩn đoán

Theo tài liệu của FAO về Hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy sản Châu Á thì

có các phương pháp để chẩn đoán WSSV:

Dự chẩn

Các quan sát chung (Mức độ 1)

Bệnh đốm trắng thường được báo hiệu trước bằng việc tôm ngừng ăn trong một vài ngày, tôm sắp chết bơi gần mặt nước ở bờ ao nuôi Những con tôm này sẽ có các thể vùi màu trắng lẫn trong biểu bì và thân tôm thường hay biến đỏ Các thể vùi ở lớp vỏ thay đổi từ những chấm nhỏ thành những đĩa có đường kính vài mm và chúng có thể liên kết lại với nhau thành những mãng lớn Chúng rất dễ nhận thấy nhờ việc bóc lớp vỏ kitin khỏi giáp đầu ngực, loại bỏ các mô bám và

vỏ kitin soi ra ngoài ánh sáng Sự xuất hiện những đốm trắng trong lớp vỏ kitin

có thể do một vài nguyên nhân khác tạo ra Riêng trong trường hợp mà Wang và cộng sự, 2000 đã thông báo được gọi là Hội chứng vi khuẩn đốm trắng (BWSS) rất dễ nhầm lẫn với bệnh đốm trắng (WSSV) Do đó, kiểm tra mô bệnh học là cần thiết để chẩn đoán khẳng định

Làm tiêu bản ép nhanh (Mức độ 2)

Hai kiểu làm tiêu bản nhanh có thể dùng để dự chẩn bệnh đốm trắng: (i) mẫu tôm tươi, không nhuộm màu, được cố định trong Formalin 10%, và soi trên nền tối của kính hiển vi với kính tụ quang ướt, (ii) các mô đã cố định được nhuộm màu H&E

Mô bệnh học (Mức độ 3)

Tôm nghi bị bệnh đốm trắng sắp chết cần được cố định trong dung dịch Davidson’s và nhuộm màu bằng Heamatoxylin và Eosin (H&E) Mô bệnh học của bệnh đốm trắng là rõ rệt và cho phép chẩn đoán khẳng định

Tôm sắp chết do vi-rút đốm trắng có biểu hiện hủy hoại các mô trung bì và ngoại bì Nhân của tế bào bệnh bị phình to và khi nhuộm màu với H&E sẽ nhìn thấy các thể vùi trung tâm bắt màu thuốc nhuộm kiềm từ nhạt đến sẫm và được bao bởi chất nhiễm sắc Cũng có thể nhìn thấy các thể vùi nội nhân này trong mẫu ép mang và mô ở lớp dưới kitin hoặc trong các lát cắt mô Những mô biểu hiên rõ nhất để xét nghiệm là dưới mô ở lớp dưới kitin của dạ dày, giáp đầu ngực hoặc các mô mang

Các mô thích hợp nhất cho việc kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử là các

mô ở dưới lớp kitin, mang và các chân bò đã được kiểm tra trước đó bằng mô học hoặc nhuộn ép nhanh sẽ thấy rõ nhân bị phồng với các thể vùi Cowdry type A hoặc chất nhiễm sắc bao quanh thể vùi bắt màu kiềm Cố định mô ít nhất 24 giờ trong chất cố định

Kính hiển vi điện tử nhuộm màu âm bản

Các tiêu bản huyết tương cuả tôm nhuộm âm bản có thể cho thấy virion có các phần phụ dạng đuôi bên trong các tế bào bệnh có nhân trương phồng, nhưng không thấy rõ có thể vùi

2.2.2 Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu

2.2.2.1 Tác nhân gây bệnh

Bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô do vi rút Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus – IHHNV gây ra, họ

Parvoviridae, acid nucleic ADN đơn mạch, chiều dài 4,1kb, đường kính 22nm

IHHNV có trong nhân tế bào tuyến anten, tế bào hệ bạch huyết, tế bào mang, tế bào dây thần kinh, tồn tại nhiều dòng vi rút khác nhau phân bố theo địa lý (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004)

chứng dị hình còi cọc, tôm giống (Juvenile) chủy biến dạng, sợi anten quăn queo,

vỏ kitin xù xì hoặc biến dạng Tuy vi rút này không gây chết cho tôm sú nhưng lại là một trong những tác nhân gây chậm lớn, dị hình, đặc biệt nguy hiểm cho

tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) và gây chết hang loạt ở tôm Penaeus

stylirostris (Flegel, 1997) Hệ số còi cọc trong đàn tôm giống chân trắng bị bệnh

IHHNV thường từ 10-30%, khi bị bệnh nặng hệ số còi cọc lớn 30% có khi tới

50% Tôm P stylirostris bị bệnh dạng cấp tính, tỷ lệ chết rất cao (có thể lên đến

90%) (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004) Khi tôm nhiễm bệnh, IHHNV được tìm thấy ở rất nhiều bộ phận như mang, biểu bì ruột trước, tuyến râu, dây thần kinh

Hình 2.3: Vi rút của IHHNV đường kính 22nm ở trong hệ bạch huyết

của tôm sú nuôi trong ao ương (DV Lightner) 2.2.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh

Năm 1984 IHHNV lần đầu tiên phát hiên ở Hawai gây chét hàng loạt tôm

Penaeus stylirostris (90%) Sau đó phát hiện ở Mỹ và các vùng nuôi ven bờ biển

Thái Bình Dương (OIE,2009) Những loài tôm bị nhiễm IHHNV: (theo

V.A.Graindorge & T.W Flegel, 1999) P.Vannamei, P Mondon, P.Stylirostris,

P.Occidentalis, P Californiensis, P Semisalcatus, P Japonicus Bệnh IHHNV

lan truyền cả chiều dọc và chiều ngang ở cả 2 loài tôm (P stylirostris,

P.vannamei) Vi rút có thể truyền từ tôm bố mẹ sang tôm ấu trùng hoặc lây

nhiễm ở giai đoạn sớm của ấu trùng tôm Có khả năng lây qua nguồn nước hoặc

do ăn xác tôm nhiễm IHHNV Vi rút bệnh lây từ mẹ sang ấu trùng (phương dọc) nhưng không phát bệnh, thường đến postlarvae 35 dấu hiệu bệnh quan sát là tỷ lệ chết cao, vi rút lây lan theo chiều ngang ở tôm giống ảnh hưởng rất mãnh liệt, tôm trưởng thành đôi khi có dấu hiệu bệnh hoặc chết (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004)

Hình 2.4: Tôm chân trắng bị bênh chủy biến dạng, anten quăn queo

2.2.3 Bệnh Còi

2.2.3.1 Tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh MBV (Monodon Baculovirus) là virus type A Baculovirus monodon, cấu trúc nhân là dsDNA, có lớp vỏ bao, dạng hình que Theo Mari và ctv., 1993 trích dẫn Bùi Quang Tề, 2004, thì chủng MBV của tôm sú từ Ấn Độ Thái Bình Dương có kích thước nhân 42 ± 3 x 246 ± 15 nm, kích thước vỏ bao

75 ± 4 x 324 ± 33 nm Chủng PMV của tôm (P.plebejus, P monodon, P merguiensis) từ Úc có kích thước nhân 45-52 x 260-300 nm, kích thước vỏ bao

60 x 420 nm

Vi rút ký sinh ở tế bào biểu mô hình ống gan tuỵ (Hepatopancreas) và tế bào biểu

bì phía trước ruột giữa, vi rút tái sản xuất bên trong nhân tế bào vật nuôi, bao gồm các giai đoạn sau:

 Giai đoạn O (tiềm ẩn): Sau khi tế bào nhiễm MBV là giai đoạn sớm của tế bào chất biến đổi

 Giai đoạn 1: Nhân tế bào sưng nhẹ, các nhiễm sắc thể tan ra và di chuyển

ra sát màng nhân Tế bào chất mất dần chức năng của chúng và hình thành giọt mỡ Vi rút bắt đầu gây ảnh hưởng

 Giai đoạn 2: Nhân sưng nhanh, số lượng virus tăng nhanh, xuất hiện thể ẩn (Occlusion bodies) trong nhân

 Giai đoạn 3: Tế bào bị bệnh, nhân tăng lên gấp 2 lần, đường kính bình thường và tăng 6 lần về thể tích, bên trong nhân có 1 đến nhiều thể ẩn, trong thể ẩn chứa đầy các vi rút Các virus phá huỷ các tế bào ký chủ, tiếp

tục di chuyển sang tế bào khác hoặc theo chất bài tiết ra ngoài môi trường, tạo thành virus tự do tồn tại trong bùn và nước

Gan tuỵ teo lại có màu trắng hơi vàng, thối rất nhanh

Tỷ lệ chết dồn tích, cao tới 70% hoặc có thể tôm chết hầu hết trong ao

2.2.3.3 Phân bố và lan truyền bệnh

Bệnh MBV được phát hiện đầu tiên năm 1980 ở đàn tôm sú (Penaues monodon) đưa từ Đài Loan đến nuôi ở Mehico (Lightner và ctv, 1981, 1983, trích dẫn Bùi Quang Tề, 2004) Tiếp theo các nhà nghiên cứu đã phát hiện bệnh MBV có xuất phát từ Đài Loan, Philippines, Malaysia, Polynesia thuộc Pháp, Singapore, Indonesia, Thái Lan, Trung Quốc Cho đến nay người ta biết bệnh MBV phân

bố rất rộng rãi: châu Á, Thái Bình Dương, châu Phi, miền Nam châu Âu, châu

Mỹ Tôm sú (P monodon) thường xuyên nhiễm bệnh MBV và một số tôm khác cũng nhiễm bệnh MBV: P merguiensis, P semisulcatus, P kerathurus, P

plebejus, P indicus, P penicillatus, P esculentus, P vannamei (có khả năng)

MBV nhiễm từ Post-larvae đến tôm trưởng thành

Bệnh MBV lan truyền theo phương nằm ngang, không truyền bệnh theo phương thẳng đứng

Ở Việt Nam tháng 10-11/1994 Bùi Quang Tề lần đầu tiên đã nghiên cứu về mức

độ nhiễm bệnh MBV trên tôm sú nuôi các tỉnh ven biển phía nam Tôm sú nuôi nhiễm vi rút MBV khá cao, tôm thịt ở Minh Hải: 50-85,7%, ở Sóc Trăng 92,8%; tôm giống ở Bà Rịa-Vũng Tàu 5,5-31,6%, tôm giống Nha Trang 70-100% Bệnh MBV là một trong những nguyên nhân gây chết tôm ở các tỉnh phía Nam năm 1993-1994 Đến nay kiểm tra tôm post sản xuất từ miền Bắc ở Quảng Ninh đến các tỉnh phía Nam ở Cà Mau hầu hết chúng đều nhiễm mầm bệnh MBV, ở mức

độ khác nhau Bệnh MBV không làm tôm chết hàng loạt, nhưng làm tôm chậm

lớn và chết rải rác Khi thu hoạch tỷ lệ tôm sống rất thấp đây là vấn đề nan giải của nghề nuôi tôm biển ở các tỉnh ven biển (Bùi Quang Tề và ctv, 1997)

2.2.4 Hội chứng Taura

2.2.4.1 Tác nhân gây bệnh

Theo Bonami et al và Mari et al (1997), hội chứng Taura là do Taura

Syndrome Virus gây ra Theo hệ thống phân loại của ICTV thì TSV thuộc họ

Dicistroviridae, vi rút có dạng hình cầu 20 mặt, kích thước khoảng 32nm, không

có màng bao, mật độ nổi 1,338g/ml Vật chất di truyền là RNA sợi đơn với kích thước phân tử 10,2kb

2.2.4.2 Dấu hiệu bệnh lý

Bệnh được chia làm 3 giai đoạn (OIE, 2009)

Giai đoạn cấp tính: hậu ấu trùng hay tôm lớn của loài P vannamei khi bị

bệnh có sự chuyển màu đỏ nhợt ở đuôi và các chân bơi (do sự phình to của các sắc tố đỏ trong biểu mô vỏ) nên được gọi là bệnh đỏ đuôi (hình 2.5) Có sự hoại

tử cục bộ ở mép chân bơi, chân bơi và đuôi tôm Tôm bệnh kèm theo các dấu hiệu khác như: mềm vỏ, ruột rỗng, thường chết khi lột xác và sự tấn công của các loài chim biển

Giai đoạn chuyển tiếp: chỉ diễn ra trong thời gian ngắn (vài ngày) với các dấu hiệu như: nhiều điểm bị tổn thương màu nâu, đen trên vỏ kitin (hình 2.6) Màu đen của sắc tố melanin là sản phẩm của cơ chế hoạt động miễn dịch tự nhiên Trong giai đoạn này có thể có hoặc không có hiện tượng mềm vỏ, đổi màu phụ bộ Tôm bệnh trong thời kỳ này vẫn có thể bắt mồi bình thường

Giai đoạn mãn tính: tôm bệnh sống sót sau giai đoạn cấp tính và giai

đoạn chuyển tiếp sẽ chuyển sang giai đoạn mãn tính Thời kỳ này có thể kéo dài cho đến cuối đời của những con tôm bệnh, sau vài lần lột xác cơ thể tôm trở lại bình thường, các dấu hiệu bệnh lý ở các thời kỳ trước biến mất, nhưng trong cơ thể tôm vẫn mang vius gây bệnh cho đến suốt cuộc đời

Hình 2.5: Đuôi tôm bị phồng và đỏ do TSV gây ra ở giai đoạn cấp tính

(Lightner, 2006)

Hình 2.6: Cơ thể tôm bị những đốm đen do hiện tượng melanin hóa do

TSV gây ra ở giai đoạn mãn tính (Lightner, 2006)

2.2.4.3 Phân bố và phương thức lây truyền bệnh

Bệnh xuất hiện lần đầu tiên tại vùng nuôi tôm gần sông Taura, Ecuador năm 1992 sau đó lan nhanh ra các nước ở khu vực Châu Mỹ Latinh: Colombia, Costarica, Salvado, Guatemale, đảo Hawai, Brazil, Venezuala, các bang Florida,

Texas,…

Bệnh xuất hiện ở Châu Á năm 1999 ở Trung Quốc và Đài Loan sau đó lan sang các quốc gia khác như: Thái Lan, Malaysia, Indonesia,

Phương thức lây nhiễm:

Phương thức lây nhiễm theo chiều ngang: những tôm bệnh sẽ truyền mầm bệnh sang tôm nhạy cảm với bệnh Côn trùng và chim mòng biển cũng là vật

mang mầm bệnh Cụ thể, loài Tricholoxira reticulara (Coraxidae) ăn tôm chết

được coi là vật làm lây lan TSV trong quá trình di chuyển từ ao này sang ao khác

Trong đợt dịch bệnh 1995 ở Texas, phân chim mòng biển (Larus atricilla) thu

được ở quanh các ao bệnh đã được xác định có nhiễm TSV Ngoài ra, các sản phẩm tôm đông lạnh cũng là vật mang mầm bệnh (OIE, 2009)

Phương thức lây nhiễm theo chiều dọc: những tôm ở dạng mãn tính sau khi thành thục được chọn làm bố mẹ trong quá trình sinh sản sẽ lây sang ấu trùng Tuy vậy, cần phải tiến hành nghiên cứu thêm để xác nhận chính xác mối liên quan này (OIE, 2009)

2.2.4.4 Phương pháp chẩn đoán

Theo tài liệu của OIE (2009) và FAO (2005) về hướng dẫn chẩn đoán bệnh động vật thủy sản Châu Á thì có thể chẩn đoán TSV như sau:

Dự chẩn:

Quan sát chung ( mức độ I):

Khi tôm bị nhiễm TSV thì ở phần đuôi và chân bụng chuyển sang đỏ nhợt Hiện tượng tôm mềm vỏ, ruột rỗng và thường chết khi lột vỏ cũng có thể xuất hiện Sẽ có sự xuất hiện của các loài chim biển xung quanh ao nuôi khi có dịch

bệnh nặng

Mô bệnh học (mức độ II)

Khi xử lý mẫu với H&E, tế bào chất bắt màu Eosin không bình thường và nhân bị ngưng kết của các tế bào bị hoại tử Ở giai đoạn cấp tính, các tổn thương thường có nhiều mảnh vụn của các tế bào hoại tử và chúng giống như các thể hình sần sùi (đường kính 1-20µm) Màu nhuộm thay đổi từ màu Eosin sang màu kiềm sáng (màu xanh da trời) Một đặc tính khác của TSV ở giai đoạn cấp tính là

có sự ngưng kết hồng cầu hoặc các biểu hiện khác do khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ

Hình 2.7: Tế bào biểu mô mang bị nhiễm TSV, mũi tên chỉ sự hiện diện thể vùi của vi rút (Đồng Thanh Hà và Đỗ Thị Hòa, 2007)

Hình 2.8: Tế bào biểu mô chân bơi bị nhiễm TSV, mũi tên chỉ hiện diện vi rút những ổ viêm với nhân tế bào bị thoái hóa kết đặc (Đồng Thanh Hà và

Kiểm khẳng định

Phương pháp sinh học ( Mức độ I/II): có thể sử dụng 2 phương pháp sau

- Cho ăn: tôm được xác định nhiễm TSV đem băm nhỏ và được dùng làm thức ăn cho tôm khỏe được bố trí cảm nhiễm Bể đối chứng với tôm khỏe không có mầm bệnh và được bắt cùng một nguồn tôm với tôm bố trí cảm nhiễm, đồng thời tôm trong bể đối chứng chỉ dùng thức ăn bình thường không nhiễm TSV Sau 3-4 ngày bố trí thí nghiệm, thì tiến hành kiểm tra

TSV Nếu kết quả gây cảm nhiểm thành công thì tôm sử dụng thức ăn nhiễm TSV sẽ có các triệu chứng chung của nhiễm TSV, đồng thời kiểm tra mô học sẽ thấy các dấu hiệu tổn thương Để kiểm tra chính xác TSV phải sử dụng phương pháp PCR để xác định Nếu kết quả dương tính TSV thì sau 3-8 ngày tôm sẽ chết với số lượng đáng kể Tôm bể đối chứng vẫn khỏe mạnh và không có các triệu chứng chung hoặc sự biến đổi mô bệnh học

- Tiêm truyền: Nghiền mẫu tôm đã được kiểm tra dương tính với TSV để làm thí nghiệm tiêm truyền Ngoài ra, có thể dùng mẫu tôm nhiễm TSV ở giai đoạn chuyển tiếp và giai đoạn mãn tính để tiêm truyền trong bố trí thí nghiệm cảm nhiễm Bể đối chứng được tiêm truyền với mẫu tôm đem nghiền là sạch bệnh không nhiễm TSV

Mô bệnh học (mức độ II):

Quan sát các tổn thương ở mức độ tế bào đã mô tả như trên có thể được coi là phương pháp kiểm khẳng định đối với những loài nhạy cảm với bệnh ( hình 2.7 và 2.8)

Kính hiển vi điện tử (TEM) (mức độ III):

Dùng kính hiển vi điện tử để xác định những tổn thương biểu mô ở giai đoạn cấp tính hoặc các khối cầu ở cơ quan bạch huyết; xác định trong tế bào chất của các tế bào bị nhiễm có các tiểu phần vi rút 20 mặt, không có màng bao, đường kính 31-32nm

Phương pháp Dot Blot (mức độ III):

Hiện nay đã có bộ kit thử Dot Blot của DiagXotics (Wilton CT, Mỹ) và bộ kit ELISA sử dụng để kiểm tra TSV

Phương pháp Lai tại chổ (mức độ III):

Có thể sử dụng bộ kit thử lai tại chổ của DiagXotic (Wilton CT, Mỹ) để kiểm tra

Phương pháp PCR (mức độ III):

Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi, phổ biến với độ chính xác và nhanh chóng dùng cho việc xác định tác nhân do vi rút gây ra

2.3 Sơ lược về phương pháp RT-PCR

PCR phiên mã ngược (reverse transcriptase PCR) là phương pháp PCR được sử dụng để khuếch đại, phân lập hay xác định thư viện RNA của mô hay tế bào Để thực hiện RT-PCR trước hết RNA sau khi ly trích phải được phiên mã bằng men phiên mã ngược (Reverse transcriptase) để chuyển RNA thành cDNA (complementary DNA) rồi thực hiện PCR truyền thống với cDNA (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)

Do Taq polymerase không hoạt động trên mRNA nên khi thực hiện qui trình này cần phối hợp RT-PCR với enzyme phiên mã ngược (Reverse Transcriptase PCR) Đây là phương pháp được sử dụng để khuếch đại, phân lập hay xác định thư viện RNA của mô hay tế bào Để thực hiện qui trình trước tiên RNA sau khi ly trích tiến hành phiên mã ngược để chuyển thành cDNA (Complementary), sau đó thực hiện qui trình PCR truyền thống với cDNA (Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007) Mồi sử dụng trong giai đoạn này có thể là mồi đặc hiệu của PCR giai đoạn sau, có thể là mồi ologonucleotide oligodT (để bắt cặp với đuôi polyA của các mRNA), mà cũng có thể là các hexanucleotide (trình tự gồm

6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA Sau đó cDNA được khuếch đại nhờ Taq DNA polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003)

2.3.1 Nguyên lý

PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại trình tự DNA chuyên biệt trong phòng thí nghiệm mà không cần sự hiện diện của tế bào hay

còn gọi là kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp được phát minh bởi Karl Mullis et

al (1985) PCR có tính nhạy cao và cho phép phát hiện và xác định nhanh chóng

DNA của virus Ưu điểm vượt bật của phương pháp này là có khả năng phát hiện virus ở những cường độ nhiễm thấp hay những vi rút ẩn không có các biến đổi về

mô học Hiện nay phương pháp PCR được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, quân sự,…

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) thì PCR là một chuỗi chu kì lặp lại nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn biến tính (denaturation): Trong một dung dịch phản ứng bao

gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép DNA (dNTP, enzyme DNA polymerase, Mg2+…), phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở 94-950C trong 30-60 giây Nếu đoạn

DNA khuôn có tỷ lệ G-C cao, chuỗi G-C liền nhau dài cần tính toán để có nhiệt độ phù hợp Giai đoạn này sẽ tách đôi mạch DNA thành 2 mạch đơn

Giai đoạn lai (annealing): Trong giai đoạn này nhiệt độ hạ thấp hơn Tm của các đoạn mồi cho phép bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40-700C tùy thuộc vào Tm của các mồi sử dụng mà thời gian bắt cặp khác nhau và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng

Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (elongation): nhiệt độ được tăng lên

720C, đây là điều kiện tốt nhất để DNA polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu Thời gian khuếch đại tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Theo Geifand và White (1990), tốc độ tổng hợp của Taq là 150 nucleotide/giây ở nhiệt độ 75-800C; 60 nucleotide/ giây ở 700C; 24 nucleotide/giây ở 550C; 1,5nucleotide/giây ở 370C và 0,25 nucleotide/giây ở

220C

Phản ứng PCR là một chuỗi chu kỳ nối tiếp nhau và lặp lại, cứ sau mỗi chu kỳ thì một phân tử DNA khuôn sẽ được nhân lên gấp đôi, các đoạn vừa nhân lên lại tiếp tục làm khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì hai đầu của sản phẩm

bổ sung với mồi Sau mỗi chu kỳ số lượng đoạn DNA được tổng hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau n chu kỳ nhân bản sẽ tạo ra 2n bản DNA từ một khuôn ban đầu Do đó sau 30 chu kỳ khuếch đại sẽ là 106 so với lượng bản mẫu ban đầu

Hình 2.9: Nguyên tắc hoạt động của phương pháp PCR Trong phản ứng PCR, sau mỗi chu kỳ đầu thì ở các chu kỳ tiếp theo nhiệt

độ sẽ tăng lên 1-20C Do về sau lượng mồi giảm nhưng lượng khuôn tăng lên, mặt khác enzyme Taq DNA polymerase sẽ hoạt động yếu dần do tác động của nhiệt độ vì vậy nên tăng nhiệt độ ở các chu kỳ sau để làm tăng hiệu quả tổng hợp DNA

2.3.2 Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007:

DNA mẫu làm khuôn: phản ứng PCR tối ưu hóa khi DNA khuôn tinh

sạch, nhưng ưu điểm lớn của phương pháp PCR là cho phép nhân cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, mẫu đã bị phá hủy từng phần như những vết máu

đã để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc, móng tay của người chết,…hàm lượng DNA mẫu nằm trong khoảng 100ng -1µg

Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi: mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất

quyết định tính đặc hiệu của PCR để nhân bản một đoạn DNA đặc trưng nào đó Mồi luôn gắn với DNA khuôn ở đầu 3’ và Taq DNA polymerase kéo dài chuỗi tổng hợp theo chiều 5’->3’ Trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và nồng độ trong

phản ứng PCR là những nhân tố quyết định sự thành công của phản ứng PCR Việc chọn mồi phải tuân thủ theo một số nguyên tắc:

 Trình tự của mồi được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi

“xuôi” và mồi “ngược” và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một mồi

 Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt nhau quá xa

 Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại không trùng với các trình tự lặp lại trên gen

 Trình tự nằm giữa 2 mồi không quá lớn Phản ứng PCR sẽ tối ưu nếu đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb

Enzyme: Taq DNA polymerase càng mạnh thì phản ứng PCR càng xảy ra

triệt để, tùy vào các đặc tính của DNA polymerase, khả năng chịu nhiệt của enzyme mà hiệu quả phản ứng khác nhau Thông thường người ta sử dụng Taq DNA polymerase ở nồng độ 2,5U/phản ứng Việc tăng nồng độ Taq DNA polymerase đôi khi làm tăng hiệu quả phản ứng PCR, nhưng phải nằm trong khoảng nhất định Hơn nữa đây là thành phần đắt tiền nhất của phản ứng PCR nên việc chọn nồng độ thích hợp là rất quan trọng (Martha F Kramer và Donald

M Coen, 2001)

Nồng độ các loại nucleotide tự do: bốn loại nucleotide (dATP, dGTP,

dCTP, dTTP) được sử dụng ở nồng độ là 20-200µM/mỗi loại nucleotide, nếu sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide xảy ra sẽ dẫn tới lỗi sao chép của ADN polymerase Khi nồng độ quá thấp sẽ giảm hiệu quả PCR, ngược lại nồng

độ nucleotide quá cao dẫn tới sự khuếch đại “ ký sinh” (Khuất Hữu Thanh, 2003)

Nồng độ ion Mg 2+: cũng là nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR, chính là cầu nối gắn kết dNTPs với Taq làm tăng khả năng bám nối của mồi Nếu nồng độ Mg2+ quá cao sẽ tạo ra các sản phẩm phụ, ngược lại nếu nồng độ thấp sẽ không tạo ra sản phẩm PCR Tuy nhiên không có một quy luật chung cho vấn đề này Nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản ứng qua thử nghiệm

Chu kỳ phản ứng: trong thực tế số chu kỳ của phản ứng PCR không vượt

quá 40 chu kỳ Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn ra qua 2 giai đoạn Trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu Sau đó hiệu quả khuếch đại giảm do các nguyên nhân sau: