Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn listeria monocytogenes và staphylococcus aureus nhiễm trên thịt bò bán tại chợ khu vực thành phố bắc giang, đề xuất biện pháp khống chế

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐOÀN THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC STAPHYLOCOCCUS AUREUS NHIỄM TRÊN THỊT BÒ BÁN TẠI CHỢ KHU VỰC THÀNH PHỐ BẮC GIANG, ĐỀ X

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐOÀN THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC

STAPHYLOCOCCUS AUREUS NHIỄM TRÊN THỊT BÒ BÁN TẠI CHỢ KHU VỰC THÀNH PHỐ BẮC GIANG,

ĐỀ XUẤT BIỆN PHÁP KHỐNG CHẾ

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

Thái Nguyên - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-0 -

ĐOÀN THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC

STAPHYLOCOCCUS AUREUS NHIỄM TRÊN THỊT BÒ BÁN TẠI CHỢ KHU VỰC THÀNH PHỐ BẮC GIANG,

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực tập và thực hiện đề tài này, tôi đã nhận được sự quan tâm, chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè;

sự động viên khích lệ của gia đình để tôi hoàn thành luận văn

Nhân dịp này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đặng Xuân Bình đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình hướng dẫn, góp ý hoàn thành luận văn

Xin trân trọng cảm ơn Ban Đào tạo Đại học Thái Nguyên; Phòng Đào tạo, Khoa Chăn nuôi thú y, Trường đại học Nông Lâm - Đại học Thái Nguyên; Trạm Chăn nuôi Thú y huyện Tân Yên, Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Bắc Giang, đã giúp đỡ, tạo điều kiện trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên để tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình

Trân trọng cảm ơn

Thái Nguyên, ngày tháng năm 2017

Học viên

Đoàn Thị Nguyệt

LỜI NÓI ĐẦU

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu công

bố trong luận văn là trung thực, chính xác và có trích dẫn rõ ràng Tác giả chịu trách nhiệm hoàn toàn về nội dung và các số liệu đã công bố trong luận văn này

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn đầy đủ

Thái Nguyên, ngày tháng 9 năm 2017

Học viên

Đoàn Thị Nguyệt

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI NÓI ĐẦU ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 1

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài 3

1.1.1 Ngộ độc thực phẩm (NĐTP) 3

1.1.2 Thịt tươi và các dạng hư hỏng của thịt 5

1.1.3 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn L monocytogenes gây ô nhiễm thịt 6

1.1.4 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn S aureus gây ô nhiễm thịt 9

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu 22

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 22

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 22

2.2.2 Thời gian nghiên cứu 23

2.3 Nội dung nghiên cứu 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp điều tra dịch tễ 23

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu thịt bò bán tại chợ 23

2.4.3 Quy định kỹ thuật đối với chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt tươi 24

2.4.4 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong thịt bò 24

2.4.5 Xác định chỉ tiêu Staphylococcus aureus trong thịt bò 25

2.4.6 Các phương pháp phát hiện L monocytogenes 29

2.4.7 Phương pháp xác định độc lực của vi khuẩn L monocytogenes và S aureus 33

2.4.8 Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn L monocytogenes và S aureus phân lập được 33

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 34

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Khảo sát tình hình kiểm soát giết mổ, kiểm tra vệ sinh thú y và tiêu thụ thịt bò tại một số chợ trên địa bàn thành phố Bắc Giang 35

3.2 Khảo sát chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí nhiễm trên thịt bò bán tại chợ khu vực thành phố Bắc Giang 36

3.3 Khảo sát chỉ tiêu vi khuẩn L monocytogenes và S aureus nhiễm trên thịt bò bán tại các chợ khu vực thành phố Bắc Giang 38

3.3.1 Tình hình nhiễm L monocytogenes trên thịt bò tại một số chợ thuộc khu vực thành phố Bắc Giang 41

3.3.2 Tình hình nhiễm S aureus trên thịt bò bán tại chợ khu vực thành phố Bắc Giang 54

3.4 Đề xuất một số biện pháp khống chế 65

3.4.1 Các biện pháp về quản lý 65

3.4.2 Các biện pháp về kỹ thuật 66

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 81

MỘT SỐ HÌNH ẢNH CỦA ĐỀ TÀI 81

L monocytogenes : Listeria monocytogenes

S aureus : Staphylococcus aureus

E coli: : Escherichia coli

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi 24

Bảng 2.2 Tính chất sinh vật hóa học của L monocytogenes 30

Bảng 2.3 Primers xác định gene hly mã hóa sản sinh Listeriolysin của vi

khuẩn Listeria monocytogenes 32

Bảng 2.4 Primers xác định gene mã hóa sản sinh SEB của vi khuẩn

Staphylococcus aureus 32

Bảng 3.1 Thực trạng giết mổ và tiêu thụ thịt bò tại một số khu chợ khu

vực thành phố Bắc Giang 35 Bảng 3.2 Chỉ tiêu tổng số VKHK nhiễm trên thịt bò 36

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát chỉ tiêu L monocytogenes và S aureus nhiễm

trên thịt bò tại các chợ nghiên cứu 39

Bảng 3.4 Tình hình nhiễm L monocytogenes trên thịt bò theo địa điểm 41 Bảng 3.5 Tình hình nhiễm L monocytogenes trên thịt bò theo thời điểm

lấy mẫu 43

Bảng 3.6 Tình hình nhiễm L monocytogenes trên thịt bò theo tháng 45 Bảng 3.7 So sánh tình hình nhiễm L monocytogenes trên thịt bò với Tiêu

chuẩn Việt Nam 7046:2009 47

Bảng 3.8 Đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn L

monocytogenes phân lập được 49 Bảng 3.9 Độc lực của các chủng vi khuẩn L monocytogenes phân lập được 51 Bảng 3.10 Xác định ADN mang gen mã hóa sản sinh Listeriolysin O của vi

khuẩn L monocytogenes phân lập được 52

Bảng 3.11 Tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của các

chủng L monocytogenes phân lập được 53 Bảng 3.12 Tình hình nhiễm S aureus trên thịt bò theo địa điểm 54 Bảng 3.13 Tình hình nhiễm S aureus trên thịt bò theo thời điểm lấy mẫu 55

Bảng 3.14 Tình hình nhiễm S aureus trên thịt bò theo tháng lấy mẫu 57 Bảng 3.15 So sánh tình hình nhiễm S aureus trên thịt bò với Tiêu chuẩn

Việt Nam 7046:2009 59

Bảng 3.16 Đặc tính sinh vật, hoá học của vi khuẩn S aureus phân lập được 60

Bảng 3.17 Độc lực của các chủng vi khuẩn S aureus phân lập được 61

Bảng 3.18 Xác định ADN mang gene mã hóa sản sinh độc tố đường ruột

Staphylococcal enterotoxin B (SEB) của vi khuẩn S aureus phân

lập được 63 Bảng 3.19 Tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của vi

khuẩn S aureus phân lập được 64

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 3.1 Biểu đồ so sánh chỉ tiêu tổng số VKHK nhiễm trên thịt bò 37Hình 3.2 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm vi khuẩn L monocytogenes và S aureus

trên thịt bò bán tại chợ 40Hình 3.3 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm L monocytogenes trên thịt bò theo địa điểm 42Hình 3.4 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm L monocytogenes trên thịt bò theo thời

điểm lấy mẫu 44Hình 3.5 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm L monocytogenes trong thịt bò theo tháng 46Hình 3.6 Biểu đồ so sánh tình hình nhiễm vi khuẩn L monocytogenes trên thị

bò so với Tiêu chuẩn Việt Nam 7046:2009 48Hình 3.7 Biểu đồ so sánh tình hình nhiễm S.aureus trên thịt bò theo thời điểm

lấy mẫu 56Hình 3.8 Biểu đồ so sánh tình hình nhiễm S.aureus trên thịt bò theo tháng lấy mẫu 58Hình 3.9 Biểu đồ so sánh tình hình nhiễm S aureus trên thịt bò với Tiêu

chuẩn Việt Nam 7046:2009 59

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, vấn đề đảm bảo chất lượng và an toàn thực phẩm đang là mối quan tâm của các cấp, các ngành và của toàn xã hội Thực phẩm an toàn đóng góp to lớn trong việc cải thiện sức khỏe con người và chất lượng cuộc sống Ngộ độc thực phẩm và các bệnh do thực phẩm kém chất lượng gây ra không chỉ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và cuộc sống của mỗi con người mà còn gây thiệt hại lớn về kinh tế An toàn thực phẩm không chỉ ảnh hưởng trực tiếp, thường xuyên đến sức khỏe mà còn liên quan chặt chẽ đến năng suất, hiệu quả phát triển kinh tế và an sinh xã hội Đảm bảo an toàn thực phẩm góp phần quan trọng thúc đẩy phát triển kinh tế - xã hội, xóa đói giảm nghèo

Trong các loại thực phẩm thiết yếu hàng ngày của mỗi gia đình, thịt tươi là sản phẩm có vai trò quan trọng, khó thay thế Tuy nhiên, thịt tươi cũng tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây mất vệ sinh an toàn thực phẩm, thậm chí gây ngộ độc hàng loạt Nguyên nhân có thể do quá trình vận chuyển, giết mổ, kinh doanh, buôn bán không đảm đúng quy trình kỹ thuật; một số vi sinh vật có khả năng xâm nhiễm vào thịt

tươi gây ngộ độc thực phẩm với tỉ lệ tử vong cao, trong đó có vi khuẩn Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus và các độc tố của chúng

Xuất phát từ những yêu cầu cấp thiết trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Listeria monocytogenes và Staphylococcus aureus nhiễm trên thịt bò bán tại chợ khu vực thành phố Bắc Giang, đề xuất biện pháp khống chế”

2 Mục tiêu của đề tài

- Khảo sát tình hình tiêu thụ và xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí, vi

khuẩn Listeria monocytogenes (L monocytogenes) và Staphylococcus aureus (S aureus) nhiễm trên thịt bò bán tại một số chợ khu vực thành phố Bắc Giang

- Nghiên cứu đặc điểm sinh học, độc lực, độc tố gây ngộ độc thực phẩm và

tính kháng thuốc của vi khuẩn L monocytogenes và S aureus phân lập được

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Bổ sung tư liệu khoa học về yếu tố gây bệnh của vi khuẩn L monocytogenes

và S aureus nhiễm trên thịt bò bán tại chợ khu vực thành phố Bắc Giang, làm cơ sở

để tiến hành các nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán nhanh thịt bị nhiễm khuẩn hoặc độc tố gây ngộ độc thực phẩm

Kết quả nghiên cứu về tính kháng kháng sinh của các vi khuẩn L

monocytogenes và S aureus phân lập được tiếp tục làm rõ cơ chế phát triển gene

kháng thuốc của vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm nói riêng và các vi khuẩn gây bệnh đường tiêu hóa nói chung

3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt bò tại một số chợ thuộc khu vực thành phố Bắc Giang, quy trình quản lý giết mổ, kiểm tra vệ sinh thú y đối với sản phẩm thịt bò giúp cho công tác quản lý giết mổ tiếp tục được củng cố và hoàn thiện các quy trình

Tình hình nhiễm vi khuẩn L monocytogenes và S aureus trên thịt bò giúp các

cơ quan chuyên môn đề xuất biện pháp hạn chế ô nhiễm thịt bò do L monocytogenes

và S aureus nói riêng và ô nhiễm thịt do vi sinh vật gây bệnh nói chung

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

1.1.1 Ngộ độc thực phẩm (NĐTP)

1.1.1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm (Intoxication) hay còn gọi là trúng độc thức ăn do ăn phải những thức ăn có chứa chất độc, thường xảy ra một cách đột ngột hàng loạt (nhưng không phải là các bệnh dịch), có những triệu chứng của một bệnh cấp tính (Costa W L

và cs., 2015) [54] Bệnh thường có biểu hiện nôn mửa, ỉa chảy (trừ nhiễm độc tố của vi khuẩn độc thịt thì lại bị táo bón) và các triệu chứng khác đặc hiệu cho mỗi loại ngộ độc

Trong đó có ngộ độc thực phẩm do nhiễm vi khuẩn L monocytogenes và S aureus

Theo thống kê từ Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm - Bộ Y tế (2009) [8], (2010) [9], (2011) [10], (2012) [11], (2013) [12], (2014) [13], (2015) [14]: Năm 2009 cả nước đã xảy ra 152 vụ ngộ độc thực phẩm với 5.212 người mắc và 35 người chết Năm 2010, số vụ ngộ độc trên cả nước tăng lên 175 vụ với 5.664 người mắc và 51 người chết Năm 2011, số vụ NĐTP có xu hướng giảm nhẹ còn 148 vụ với 4.700 người mắc và 27 người chết Tuy nhiên đến năm 2012, tình trạng NĐTP có xu hướng tăng trở lại, cả nước xảy ra 168 vụ NĐTP với 5.541 người mắc và 34 người chết Năm 2013, xảy ra 160 vụ NĐTP trên cả nước với 5.238 người mắc và 28 người tử vong So với năm 2013, trong năm 2014 số người mắc và đi viện do NĐTP giảm nhưng số vụ tăng lên 13% với 189 vụ ghi nhận hơn 5.000 người mắc và 43 người tử vong Trong năm 2015, toàn quốc ghi nhận 171 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.965 người mắc và 23 trường hợp tử vong Năm 2016, cả nước xảy ra 129 vụ NĐTP với 4.139 người mắc, trong đó có 12 trường hợp tử vong (Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm - Bộ Y tế, 2016 [15])

1.1.1.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm xảy ra khi con người ăn phải thức ăn, đồ uống nhiễm bẩn, bảo quản không đúng cách hoặc bị nhiễm trùng (nhiễm virus, vi khuẩn, protozoa, nấm mốc) hay hóa chất độc hại Nhiễm độc thực phẩm có thể chia làm hai loại:

Nhiễm độc do hóa chất và nhiễm độc do các yếu tố sinh vật (Ví dụ nội, ngoại độc tố của một số vi khuẩn)

Ở Việt Nam, NĐTP xảy ra hầu khắp các địa phương trong cả nước Gần đây, nhiều cơ quan liên bộ, liên ngành tham gia quản lý vấn đề này nhưng các ca ngộ độc vẫn gia tăng hàng năm

Tại Mỹ, mỗi năm có khoảng 112,6 triệu người bị ngộ độc thực phẩm Cuiwei Zhao

và cs (2001) [56] cho biết, ngộ độc thực phẩm xảy ra ở mọi quốc gia, ngay cả các nước phát triển Tình trạng NĐTP do ô nhiễm vi sinh vật nói chung, vi khuẩn nói riêng đang là mối quan tâm hàng đầu của các quốc gia phát triển như Mỹ, Anh, Nhật Bản…

1.1.1.3 Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật

Syne M và cs (2013) [95] tiến hành một đánh giá về vi khuẩn trong không khí và các sản phẩm thực phẩm ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình chế biến tại một nhà máy sản xuất thịt ăn ngay (Xúc xích hun khói, thịt gà và thịt xông khói)

ở Trinidad, West Indies Tác giả cho biết 16,7% (4/24) số mẫu thịt đã nấu chín

nhiễm S aureus; 50% (10/20) số mẫu hỗn hợp trước khi nấu nhiễm Listeria spp (4 mẫu nhiễm L monocytogenes)

Nimri L và cs (2014) [82] đã tiến hành đánh giá tình hình nhiễm khuẩn trên bánh mỳ kẹp thịt (sandwiches) tại miền bắc Jordan Kết quả cho thấy 28,3% số mẫu

dương tính với E coli (28,3%); 25,5% dương tính với Salmonella spp.; 15,9% dương tính với Citrobacter freundii và 8,3% dương tính với S aureus Tỷ lệ nhiễm

khuẩn cao hơn ở các mẫu sandwiches gà Đa số các loài vi khuẩn phân lập được có hiện tượng kháng kháng sinh, đặc biệt là tetracycline và streptomycin

1.1.1.4 Ngộ độc thực phẩm do L monocytogenes

Priyanka singh và Alka Prakash (2008) [88] đã nghiên cứu sự ô nhiễm của vi

khuẩn Escherichia coli, S aureus và L monocytogenes trong các sản phẩm sữa bán

tại các cửa hàng trong khu vực Agra, Ấn Độ Trong số 116 mẫu vi khuẩn phân lập

từ phô mai, có 15 mẫu dương tính với E coli, 12 mẫu dương tính với S aureus và

02 mẫu dương tính với L monocytogenes Trong 58 mẫu phân lập từ kem sữa có 05 mẫu dương tính với E coli, 11 mẫu dương tính với L monocytogenes và không mẫu nào dương tính với S aureus

Mengesha D và cs (2009) [79] đã xác định chỉ tiêu vi khuẩn trên 711 mẫu thực phẩm thu thập ngẫu nhiên từ các siêu thị và cửa hàng tại Addis Ababa,

Ethiopia Kết quả cho thấy có 189 mẫu dương tính với Listeria spp Trong đó có 34 mẫu dương tính với L monocytogenes Tỷ lệ nhiễm Listeria spp Trong các loại

thực phẩm là: thịt lợn 62,5%; thịt bò 47,7%; thịt gà 16,0%; kem 42,7%

Meloni D và cs (2013) [78], đã thu thập 171 mẫu thịt các lò giết mổ lợn tại

Sardinia, Italia để xác định tỷ lệ nhiễm L monocytogenes Kết quả cho thấy có 33%

nhiễm S aureus được ghi nhận trong hai năm (1999 - 2000) có các sản phẩm từ sữa

(đặc biệt là pho-mát) là 32%, thịt (22%), xúc xích (15%), cá và hải sản (11%), trứng

và các sản phẩm từ trứng (11%), các sản phẩm khác từ gia cầm (9,5%)

Theo Yves L L và cs (2003) [99], tại Hoa Kỳ, trong số các trường hợp ngộ

độc thực phẩm do S aureus được báo cáo giữa các năm 1975 - 1982 thì 36% là do

tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn; 12,3% từ sa lát; 11,3% từ gia cầm; 5,1% từ bánh ngọt; 1,4% là từ các sản phẩm liên quan tới sữa và hải sản

Đỗ Ngọc Thúy (2006) [34] cho biết, tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn và các độc tố của chúng rất đa dạng, thường gặp nhất là các thực phẩm đường phố ăn ngay (46,6%), xúc xích (96,6%), bánh gato (85%), patê (83,3%)… Đáng chú ý là vi

khuẩn S aureus thường được tìm thấy trong các thực phẩm bị nhiễm khuẩn

1.1.2 Thịt tươi và các dạng hư hỏng của thịt

1.1.2.1 Thịt tươi

Theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7046:2009 [40]: Thịt tươi là thịt của gia súc,

gia cầm, chim và thú nuôi khỏe mạnh sau khi giết mổ ở dạng nguyên con, mảnh, miếng hoặc xay và được bảo quản ở nhiệt độ thường hoặc nhiệt độ từ 0oC đến 4oC, được cơ quan kiểm tra thú y có thẩm quyền cho phép sử dụng làm thực phẩm

Thành phần hóa học của thịt rất khác nhau, phụ thuộc vào các yếu tố giống, loài, lứa tuổi, độ béo gầy và điều kiện chăm sóc, nuôi dưỡng Nhìn chung, thành phần hóa học của thịt gồm:

Những hiện tượng hư hỏng của thịt thường gặp là: Thịt nhớt, thối rữa, lên men chua, có các chấm màu trên bề mặt thịt, thịt mốc (Lương Đức Phẩm, 2000 [28])

Nguyễn Thị Hiền và cs (2003) [Error! Reference source not found.] cho

biết: Vi sinh vật cũng có thể được bảo vệ bởi chính thực phẩm mà nó nhiễm vào để chống lại môi trường axit ở dạ dày

1.1.3 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn L monocytogenes gây ô nhiễm thịt

Listeria được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1924 bởi Joseph Lister và sau này tên Listeria được đặt theo tên nhà khoa học này Hiện nay, đã phát hiện được 10 loài Listeria, trong đó có L monocytogenes Năm 1981, L monocytogenes được xác

định là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm liên quan đến 41 trường hợp mắc bệnh và 18 ca tử vong, chủ yếu ở phụ nữ mang thai và trẻ em

1.1.3.1 Phân loại

Walter Chaim và David A Eschenbach (2014) [97] cho biết, trong các loài

Listeria thì chỉ có loài L monocytogenes là tác nhân gây bệnh cho con người Theo Cynthia A Roberts (2001) [57], về phân loại khoa học L monocytogenes được

xếp vào:

Theo Vũ Thị Huyền (2012) [21], L monocytogenes là vi khuẩn Gram dương thuộc giống Listeria Vi khuẩn có hình gậy, không sinh bào tử, yếm khí, kích thước khoảng 0,5 x 1,5µm Vi khuẩn L monocytogenes có kháng nguyên thân O và kháng

nguyên lông H, được chia làm 07 loại huyết thanh (từ I đến VII)

Elliot T Ryser và Elmer H Marth (2007) [61] cho biết: L monocytogenes là

trực khuẩn Gram dương, yếm khí tùy tiện, vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ từ 1 -

45oC, không tạo bào tử nhưng có chuyển động điển hình khi được cấy ở nhiệt độ 20

- 25oC và có thể phát triển trong tế bào

Theo Walter Chaim và David A Eschenbach (2014) [97], Listeria spp là vi

khuẩn hình que mảnh, kích thước khoảng 0,5 x 1 - 2 µm Phản ứng catalase dương tính Sau khi nhuộm Gram ta thấy những tế bào hình que riêng lẻ hoặc những tế bào nối với nhau thành một chuỗi tế bào

1.1.3.3 Cấu tạo tế bào

Hình 1.1 Cấu tạo tế bào L monocytogenes

1.1.3.4 Đặc tính sinh hóa

Là những trực khuẩn Gram dương, không có giáp mô, không sinh nha bào Trong bệnh phẩm, chúng nằm trong tế bào, hình thái to và ngắn Trong môi trường nuôi cấy chúng thường xếp như hàng rào và có hình thể dài hơn Tùy từng loài hay

từng kiểu huyết thanh mà Listeria spp có các biểu hiện sinh hóa khác nhau

Theo Nguyễn Quang Tuyên (2008) [42]: Vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiệm yếm khí (Yếm khí tùy tiện) Nhiệt độ thích hợp 30-370 C, pH 7,2-7,4 Phát triển trên môi trường thạch máu trong điều kiện 5-10% CO2 cho khuẩn lạc tròn bóng, màu trắng, đường kính 0,5-1mm và gây dung huyết Trên môi trường Trytose agar tạo khóm sáng, trắng mờ và có màu xanh lam (màu bluegreen) khi

quan sát dưới ánh sáng nghiêng Trên môi trường chọn lọc LSA (Listeria selective agar) tạo vòng đen quanh khóm do sự phân giải Esculin sau 24-48 giờ

Không làm tan chảy gelatin

Vi khuẩn lên men chậm các loại đường như glucose, rhamnose, salicin, levulose Không lên men mannitol, xylose, lactose, saccarose Phản ứng Catalaza dương tính

1.1.3.5 Sức đề kháng

Vi khuẩn L monocytogenes có sức đề kháng tốt hơn so với đa số các vi khuẩn gây NĐTP khác, L monocytogenes có thể tăng trưởng chậm trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C Hiện nay các nhà khoa học cho rằng con đường nhiễm L monocytogenes phổ

biến nhất là qua thực phẩm

Lado B và Yousef A E (2007) [73] cho biết: L monocytogenes phát triển

được ở pH = 4,0 - 9,6 và trong phạm vi nhiệt độ từ - 1,5 - 45oC, nhiệt độ tối ưu là 30

- 37oC và chết ở nhiệt độ trên 50oC Chính vì vậy, L monocytogenes có thể phát

triển chậm ở thực phẩm được bảo quản trong tủ lạnh

1.1.3.6 Độc tố và cơ chế gây bệnh

Theo Walter Chaim và David A Eschenbach (2014) [97] các yếu tố độc lực

của L monocytogenes bao gồm: listeriolysin O (LLO), protein ACTA,

phospholipases, metalloprotease, Protein P60, Protease CLP và ATPases

Ellin Doyle M (2001) [60] cho biết: nhiệt độ và độ pH có ảnh hưởng lớn đến

các yếu tố độc lực của vi khuẩn Listeria Listeria có thể tồn tại ở nhiệt độ thấp (4 -

25oC) và pH thấp (pH = 4,5 - 4,9) Tuy nhiên, tùy điều kiện nhiệt độ và pH có thể

làm cho Listeria giảm hoặc không sản sinh yếu tố độc lực listeriolysin O (LLO) 1.1.3.7 Phân bố

L monocytogenes phân bố rộng rãi trong môi trường đất, cát, nước Bệnh có thể lây truyền qua đường miệng và phân Đã phân lập được L monocytogenes từ

thịt gia súc, gia cầm, sữa tươi chưa thanh trùng, phomat và hải sản

L monocytogenes là vi khuẩn có mặt khắp nơi, rau củ có thể nhiễm khuẩn từ

đất hoặc từ phân bón Súc vật ở nông trại có thể nhiễm khuẩn mà không có triệu chứng gì và thực phẩm từ động vật như thịt gia súc, gia cầm và các sản phẩm sữa có thể bị nhiễm khuẩn

Trong khi vi khuẩn có thể tìm thấy ở các loại thực phẩm tươi sống như thịt chưa nấu chín, rau củ quả, sữa chưa tiệt trùng và thực phẩm từ sữa tươi, thực phẩm

đã chế biến sẵn như rau quả cắt lát có thể nhiễm khuẩn sau quy trình sản xuất

1.1.4 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn S aureus gây ô nhiễm thịt

Tụ cầu khuẩn S aureus là một trong những vi khuẩn gây bệnh được ghi nhận

sớm nhất, vào đầu những năm 1880 Năm 1880, Louis Pasteur đã phân lập được tụ

cầu Năm 1881, Ogston đã gây bệnh thực nghiệm S aureus phân bố rộng rãi trong

tự nhiên và là một loại vi khuẩn thường ký sinh trên da, lỗ mũi và đường hô hấp trên của người Theo nhiều nghiên cứu ở Việt Nam, trong các vi khuẩn Gram dương, tụ cầu vàng là loài vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và kháng lại kháng sinh mạnh nhất Đặc biệt là gây nhiễm khuẩn huyết, gây ngộ độc thức ăn và gây nhiễm trùng bệnh viện (Lê Huy Chính, 2007) [7]

Tụ cầu khuẩn (tiếng Anh: Staphylococcus có nguồn từ tiếng Hy lạp staphyle

nghĩa là chùm nho) là các cầu khuẩn Gram dương không tạo nha bào có đường kính khoảng 1μm, không di động và sắp xếp theo mọi hướng và thường tạo thành cụm (tụ) trông giống như chùm nho

Tụ cầu khuẩn là một trong những vi khuẩn được nghiên cứu sớm và quan tâm nhiều nhất Vi khuẩn này được những nhà vi khuẩn học nổi tiếng quan tâm nghiên

cứu, tỷ lệ gây bệnh rất cao, có khả năng gây nhiều bệnh nặng cũng như đề kháng kháng sinh rất mạnh Các nhà vi khuẩn học lừng danh như Robert Koch (1878) và Louis Pasteur (1880) đều rất quan tâm nghiên cứu tụ cầu khuẩn ngay từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học Ngày 9 tháng 4 năm 1880, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội Phẫu Thuật Đức một báo

cáo khoa học trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) và

trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm chính: tụ cầu có enzym coagulase và tụ cầu không có men coagulase

Tụ cầu có enzym coagulase: Nhờ coagulase này mà trên môi trường nuôi cấy

có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng Do vậy vi khuẩn này còn gọi là

tụ cầu vàng Các vi khuẩn quan trọng của nhóm này là:

- S aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng

1.1.4.3 Cấu trúc kháng nguyên

Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào Nhưng dựa vào kháng nguyên việc định loại rất khó khăn Tụ cầu

có một số kháng nguyên trên bề mặt tế bào như:

- Kháng nguyên adherin (hay yếu tố bám dính) có thể là các protein: laminin, fibronectin, collagen

Tụ cầu khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C Màu đặc trưng của các khuẩn lạc là màu trắng như sứ hoặc màu trắng ngà Khả năng tan máu của vi khuẩn được nuôi cấy cung cấp gợi ý quan trọng về tính chất của vi khuẩn này

- Trong môi trường canh thang thịt sau 5 - 6 giờ vi khuẩn đã phát triển mạnh

và làm đục đều môi trường, để lâu đáy có lắng cặn

- Trên môi trường thạch thường khuẩn lạc dạng S, đường kính 1 - 2mm, sau

24 giờ khuẩn lạc có màu vàng rơm (đối với tụ cầu vàng) hoặc có màu trắng (đối với các loại tụ cầu khác)

- Trên môi trường thạch máu tụ cầu phát triển nhanh:

+ Khuẩn lạc tụ cầu vàng dạng S, kích thước khoảng 1 - 2mm, tan máu hoàn toàn, có màu vàng

+ Khuẩn lạc tụ cầu khác: dạng S, kích thước khoảng 1 - 2mm, có màu trắng và thường không gây tan máu

Trên môi trường thạch Chapman: Tụ cầu lên men đường mannit, sau 24-48 giờ tụ cầu gây bệnh sẽ làm cho màu của môi trường chuyển từ màu hồng cánh sen sang màu vàng

+ Coagulase tự do: là loại tiết ra môi trường

+ Coagulase cố định: là loại bám vào vách tế bào

- Catalase dương tính Enzyme này xúc tác gây phân giải H202 → 0 + H20 Catalase có ở tất cả các tụ cầu mà không có ở liên cầu

- Lên men đường mannitol

- Desoxyribonuclease là enzyme phân giải ADN

- Phosphatase

1.1.4.6 Sức đề kháng

Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ cao hơn các vi khuẩn không

có nha bào khác Vi khuẩn bị diệt ở 80°C trong một giờ (các vi khuẩn khác thường

bị diệt ở 60°C trong 30 phút) Khả năng đề kháng với nhiệt độ thường phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (45°C) mà vi khuẩn có thể phát triển Tụ cầu vàng vẫn có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi trường

Tụ cầu có sức đề kháng kém với hóa chất: Axit phenic 3 - 5% diệt vi khuẩn trong

3 - 5 phút, formol 1% diệt vi khuẩn trong 1 giờ Ở nơi khô hanh và đóng băng vi khuẩn

có sức đề kháng tốt Staphylococcus chịu đựng tốt ở dung dịch NaCl 15%, dễ nhạy cảm

với thuốc nhuộm hóa học Tuy nhiên với nồng độ 7,5% NaCl được sử dụng như tác nhân tuyển chọn và tím Gentian sử dụng như chất ức chế trong môi trường

1.1.4.7 Độc tố và cơ chế gây bệnh

Tụ cầu vàng S aureus thường ký sinh ở mũi, họng và có thể cả ở trên da Vi

khuẩn sẽ gây bệnh cho người khi bị suy giảm đề kháng hoặc khi chúng được tăng cường yếu tố độc lực Tụ cầu vàng là vi khuẩn gây bệnh thường gặp nhất và có khả năng gây nhiều loại bệnh khác nhau

Theo Nguyễn Như Thanh và cs (1997) [33]: S aureus gây nên các nhiễm

trùng ở các loài gia súc, nhất là trong các cơ sở chăn nuôi tập trung có mật độ đàn gia súc lớn gây thiệt hại kinh tế đáng kể

Frost A J và Spradbrow P B (1997) [63] cho biết: Phần lớn S aureus sản

sinh ra ngoại độc tố và enzyme, tuy nhiên, vai trò của chúng trong tác nhân gây bệnh được nghiên cứu nhiều

Theo Lê Huy Chính (2003) [6], Tụ cầu vàng sản sinh ra 11 độc tố; độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc (TSST - Toxic shock syndrome toxin); độc tố exfoliatin hay độc tố epidermolitic; độc tố alpha; độc tố bạch cầu (leukcocidine); ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic); dung huyết tố (hemolysin hay staphylolysin); fribrinolysin (staphylokinase); coagulase; hyaluronidase; β - lactamase và độc tố ruột

(enterotoxin), trong đó có seb (Staphylococcal enterotoxin B)

Trần Linh Thước (2002) [36] cho biết: Đa số các S aureus có thể tổng hợp

một hay nhiều enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 15oC, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ 35 - 37oC

Hiện nay tại Việt Nam đang triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc

xác định vi khuẩn S aureus và gene mã hóa độc tố đường ruột bằng kỹ thuật PCR Kết quả cho thấy có 19/72 chủng S aureus (26,8%) chủng có khả năng sinh độc tố, trong đó độc tố sea, seb là 42%, sec là 11% và chủng mang hai gen sea và sed là

5% (Nguyễn Đỗ Phúc và cs., 2006) [29]

Phan Thị Hoàng Hảo và cs (2010) [18] đã tạo ra sản phẩm protein seb tái tổ

hợp với những thay đổi trong gene mã hóa để làm mất độc lực hoặc có độc lực thấp

mà vẫn có khả năng kích thích cơ thể sinh ra đáp ứng miễn dịch dịch thể chống lại seb

Hao D và cs (2015) [67] đã phát hiện các gene mã hóa độc tố tụ cầu vàng, trong

đó gene chiếm ưu thế là sec (38,5 %); tiếp theo là seg (19,7 %); sej (16,2 %); see (12,8

%); sea (11,1 %) và seb (10,3 %) Không phát hiện thấy gene eta, etb và tsst - 1

Ngộ độc thức ăn tụ cầu có thể do ăn uống phải độc tố đường ruột của tụ cầu, hoặc do tụ cầu vàng sinh trưởng phát triển trong ruột sản sinh ra enterotoxin gây ngộ độc Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnh nhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn bình thường của đường ruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện thuận lợi cho tụ cầu vàng (có khả năng kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng, cường độc và gây bệnh

Theo Lê Huy Chính (2007) [7], triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụ cầu thường rất cấp tính Sau khi ăn phải thức ăn nhiễm độc tố tụ cầu từ 2 đến 8 giờ, bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân và chất nôn chủ yếu là nước Do mất nhiều nước và điện giải có thể dẫn tới sốc (shock) Ngộ độc thức ăn do tụ cầu vàng là một trong những ngộ độc thức ăn rất thường gặp ở trên thế giới và tại Việt Nam (Hao D và cs., 2015 [65])

Trần Đáng (2008) [16] cho biết: S aureus sinh ra 6 type độc tố: A, B, C, D, E,

F, trong đó độc tố type A là độc tố chủ yếu gây ra NĐTP, sau đó đến type F

Theo Lâm Quốc Hùng (2009) [102]: ngộ độc thực phẩm do S aureus có thể

xảy ra với bất kỳ đối tượng nào nhưng ở người già, trẻ em và những người có hệ miễn dịch kém sẽ dễ mắc và biểu hiện triệu chứng nhiễm độc thường nặng hơn Nguyễn Hữu An và cs (2013) [1] cho biết: Từ tháng 8/2012 - tháng 8/2013,

một nghiên cứu với 143 chủng S aureus về tỷ lệ kháng kháng sinh trong 4.299 bệnh

phẩm được phân lập tại phòng vi sinh - viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cho

thấy: 93,70% S aureus kháng với penicillin G; 65,00% với erythromycin; 60,80%

với kanamycin; 58,00% với clindamycine

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nguyễn Thị Nguyệt Quế (2006) [31] khảo sát hiện trạng hoạt động giết mổ, một số chỉ tiêu vi sinh vật ô nhiễm trên thịt lợn nơi giết mổ và bày bán tại chợ trên địa bàn quận Long Biên, thành phố Hà Nội đã cho thấy hiện trạng mất vệ sinh tại các điểm giết mổ và dẫn tới sự ô nhiễm vi sinh vật vào thân thịt

Nguyễn Thị Thanh Thủy (2007) [35] khảo sát hiện trạng hoạt động giết mổ và

ô nhiễm vi sinh vật trong thịt lợn tại một số cơ sở giết mổ trên địa bàn huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội, cũng cho thấy một hiện trạng mất vệ sinh tại các điểm giết

mổ dẫn đến ô nhiễm vi khuẩn vào thân thịt

Ngô Văn Bắc (2007) [3] cũng cho biết hầu hết các điểm giết mổ phục vụ cho tiêu dùng nội địa nằm xen kẽ trong khu dân cư, quy mô nhỏ lẻ, thiết kế xây dựng không đạt tiêu chuẩn, hầu hết các điểm giết mổ không có giấy phép kinh doanh, không có hệ thống xử lý chất thải

1.2.1.1 Tình tình nghiên cứu trong nước về L monocytogenes

Đỗ Ngọc Ánh (2011) [2] cho biết: L monocytogenes là vi khuẩn gây ngộ độc

thực phẩm nguy hiểm, chúng có thể phát triển trong những điều kiện nhiệt độ mà một số vi khuẩn không phát triển được (4oC) Tuy tỷ lệ mắc bệnh không cao (khoảng 0,7 ca/100.000 người) nhưng tỷ lệ tử vong lại khá lớn chưa kể các hệ lụy sức khỏe khác; có thể tới 20 - 30% số ca mắc, đặc biệt ở phụ nữ có thai, trẻ sơ sinh,

người già bị suy giảm miễn dịch Cũng theo tác giả, phụ nữ nhiễm Listeria trong

thời gian mang thai có nhiều khả năng xảy ra các biến chứng gây nguy hại đến sức khỏe của cả mẹ và thai nhi Theo ước tính, có đến 22% tỷ lệ chết ở thai nhi và trẻ sơ

sinh có liên quan đến nhiễm khuẩn Listeria

Lê Thị Lành (2015) [24] công bố: Vàng nano dạng cầu (GNP) và vàng nano dạng thanh (GNR) đều có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn, trong đó vàng nano dạng thanh (GNR) có khả năng kháng khuẩn tốt hơn, đặc biệt là đối với 2 loại

vi khuẩn L monocytogenes và S aureus thì GNR có khả năng ức chế tốt hơn so với

kháng sinh kanamycin

Đặng Thị Mai Lan (2017) [23] cho biết: Tỷ lệ mẫu thịt lợn nhiễm L monocytogenes vào các thời điểm lấy mẫu trong ngày có sự khác nhau khá rõ rệt, tỷ

lệ thịt lợn nhiễm L monocytogenes cao nhất vào 4 - 5 giờ chiều (7,54 %), sau đó là

thời điểm 10 - 11 giờ trưa (4,19 %) và thấp nhất là 6 - 7 giờ sáng (1,40 %)

1.2.1.2 Tình tình nghiên cứu trong nước về S aureus

Đa số các dòng S aureus có thể tổng hợp một hay nhiều enterotoxin trong môi

trường có nhiệt độ trên 15oC, nhiều nhất khi chúng tăng trưởng ở nhiệt độ 35-37oC (Trần Linh Thước, 2002) [36]

Lê Minh Sơn (2003) [32] sau khi đối chiếu với TCVN 7046 : 2002 để kiểm tra

75 mẫu thịt lợn sữa và lợn choai lấy tại các cơ sở giết mổ lợn xuất khẩu tại Hải Phòng đã có đánh giá chung là 94,67 % đạt tất cả các chỉ tiêu đủ điều kiện xuất khẩu; 100 % số mẫu đạt yêu cầu về các chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí,

Salmonella spp và C perfringens; Coliform 96,60 %; E coli 97,33 %; S aureus

98,67 % Tác giả cũng cho biết thêm về tỷ lệ mẫu thịt lợn lấy tại các cơ sở giết mổ ở

các tỉnh thuộc vùng Hữu ngạn sông Hồng nhiễm Salmonella spp từ 10,91 - 16,67

% đối với lợn giết mổ tiêu dùng nội địa; 1,42 % đối với thịt lợn xuất khẩu và tỷ lệ

nhiễm S aureus là 88,98 - 96,67 %

Hoàng Khải Lập (2006) [25] cho biết: NĐTP do tụ cầu không phải là nhiễm trùng mà là nhiễm độc do độc tố đường ruột (enterotoxin) Mặc dù cầu kém bền với nhiệt nhưng ngoại độc tố của tụ cầu phải đun sôi trong 1 - 2 giờ mới bị phân huỷ, nên các cách chế biến thực phẩm không hề làm giảm độc lực của nó và con người lại rất nhạy cảm với độc tố này, có tới 90 % số người ăn thức ăn nhiễm khuẩn bị ngộ độc

Nguyễn Thị Kê và cs (2006) [22] đã khảo sát tính chất kháng kháng sinh tại

Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S aureus phân lập từ bệnh

phẩm cho thấy có đến 94,1% chủng kháng penicillin, 52,9% kháng ciprofloxacin, 52% kháng amoxillin và 12,5% kháng gentamicin

Phùng Văn Mịch (2008) [27] cho biết, số mẫu thịt lợn sau giết mổ đạt chỉ tiêu

vi khuẩn S aureus là 48,33%

Nguyễn Quang Tuyên và cs (2009) [43] cho biết: Tỷ lệ nhiễm và mức độ

nhiễm vi khuẩn S aureus, Salmonella spp và E coli ở thịt lợn trong quá trình bày

bán ở chợ tăng dần theo thời gian tồn tại ở bàn thịt Sau giết mổ 1 - 2 giờ, tỷ lệ

nhiễm S aureus là 83,30%; mức độ nhiễm 6,20 x 104 CFU/g; tỷ lệ nhiễm

Salmonella spp là 3,69%; tỷ lệ nhiễm E coli là 95,53% với mức độ là MPN/g Sau giết mổ 8 - 9 giờ, tỷ lệ nhiễm S aureus là 99,1%; mức độ nhiễm 6,20 x 104 CFU/g;

tỷ lệ nhiễm Salmonella spp là 7,4% và tỷ lệ nhiễm E coli là 100% với mức độ là

154,23 MPN/g

Theo Đặng Xuân Bình và Dương Thùy Dung (2010) [4], trong tổng số 136 mẫu thịt lợn tươi được thu thập tại các chợ khu vực Trung tâm thành phố Thái Nguyên từ 5/2009 - 4/2010 có chỉ tiêu tổng số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt chiếm 50 - 56%, cường độ nhiễm trung bình từ 1,3 x 107 - 5,2 x 107 CFU/g Trong đó, vi khuẩn

S aureus chiếm 31,0 - 38,8%; cường độ nhiễm 2,2 x 102 - 3,8 x 102 CFU/g

Phan Thị Hoàng Hảo và cs (2010) [18] đã tinh sạch thành công protein

staphylococcal enterotoxin B đột biến để sử dụng làm nguyên liệu tạo kit phát hiện

vi khuẩn tụ cầu vàng S aureus từ thực phẩm Đây là nghiên cứu có ý nghĩa lớn trong việc xác định nhanh các mẫu thực phẩm nhiễm khuẩn S aureus để phòng

tránh NĐTP

Nguyễn Thị Thu Huyền (2012) [20] đã khảo sát tình hình giết mổ lợn ở một số chợ trên địa bàn thành phố Thái Nguyên và cho biết: có 73,3 - 80,4% số mẫu thịt

nhiễm S aureus; cường độ nhiễm trung bình từ 1,3 x 103 - 5,2 x 103 CFU/g Có

33,3 - 47,7% mẫu thịt nhiễm S aureus không đạt TCVN

Cầm Ngọc Hoàng và cs (2014) [19] cho biết: Tỷ lệ mẫu thịt đạt chỉ tiêu vi sinh

vật cao nhất đối với vi khuẩn Salmonella (90,24%), tiếp theo là E coli (76,83%) và thấp nhất là chỉ tiêu S aureus (68,29%)

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Biggerstaff G K (2014) [48] cho biết: mỗi năm bệnh do thực phẩm ảnh hưởng đến khoảng 1 trong 6 người Mỹ, kết quả là 128.000 người phải nhập viện và 3.000 ca tử vong

Crim S M và cs (2014) [55] cho biết: bệnh ngộ độc thực phẩm luôn là một vấn đề lớn tại Hoa Kỳ Trong năm 2013, có 19.056 người bị ngộ độc, 4.200 trường hợp phải nằm viện điều trị và có 80 trường hợp tử vong

1.2.2.1 Tình tình nghiên cứu trên thế giới về L monocytogenes

Theo Sutherland P S và cs (2003) [94], L monocytogenes có thể phát triển

được ở cả điều kiện môi trường yếm khí và hiếu khí Tuy nhiên, trong môi trường

yếm khí L monocytogenes phát triển tốt hơn

Từ 1998 đến 2003, Ochiai Y và cs (2010) [84] đã thu thập 379 mẫu thịt tại các quầy bán lẻ ở Tokyo Kết quả cho thấy có 28% số mẫu dương tính với vi khuẩn

L monocytogenes

Meyer C và cs (2011) [80] đã thu thập 985 mẫu thịt bò và thịt lợn để xác định

tỷ lệ nhiễm khuẩn Listeria spp Kết quả cho thấy 14% số mẫu dương tính với vi khuẩn Listeria spp và 4% dương tính với L monocytogenes

Akya A và cs (2013) [45] đã thu thập 185 mẫu sữa, 187 mẫu thịt và 158 mẫu thức ăn đã chế biến tại Kermanshah, Iran để xác định tỷ lệ ô nhiễm của thực phẩm

với Listeria spp Kết quả cho thấy 12,5% số mẫu dương tính, trong đó tỷ lệ nhiễm

cao nhất là thịt (27,2%) và thấp nhất là sữa (3,8%) Tuy nhiên, chỉ có 3 mẫu (0,6%)

nhiễm L monocytogenes

Choi M.J và cs (2013) [52] đã lấy mẫu của 100 lợn thịt thương phẩm tại các lò

mổ, dây truyền chế biến, cửa hàng bán lẻ và chợ Kết quả cho thấy Bacillus cereus

và L monocytogenes là vi khuẩn được phát hiện nhiều nhất trong các mẫu thu thập

Syne M và cs (2013) [95] tiến hành một đánh giá về vi khuẩn trong không khí

và các sản phẩm thực phẩm ở các giai đoạn khác nhau trong quá trình chế biến tại một nhà máy sản xuất thịt ăn ngay (Xúc xích hun khói, thịt gà và thịt xông khói) ở Trinidad, West Indies Tác giả cho biết 16,7% (4/24) số mẫu thịt đã nấu chín nhiễm

S aureus; 50% (10/20) số mẫu hỗn hợp trước khi nấu nhiễm Listeria spp (4 mẫu nhiễm L monocytogenes)

Vally H và cs (2014) [96] tiến hành xác định tỷ lệ bệnh lây truyền qua thực

phẩm trong năm 2010 tại Australia đã kết luận: có 98 % số ca nhiễm L monocytogenes là truyền qua thực phẩm

Nimri L và cs (2014) [82] đã tiến hành đánh giá tình hình nhiễm khuẩn trên bánh mỳ kẹp thịt (sandwiches) tại miền bắc Jordan Kết quả cho thấy 28,3% số mẫu

dương tính với E coli (28,3%); 25,5% dương tính với Salmonella spp.; 15,9% dương tính với Citrobacter freundii và 8,3% dương tính với S aureus Tỷ lệ nhiễm

khuẩn cao hơn ở các mẫu sandwiches gà Đa số các loài vi khuẩn phân lập được có hiện tượng kháng kháng sinh, đặc biệt là tetracycline và streptomycin

Theo Oshima C và cs (2014) [85], L monocytogenes gây Listeriosis là bệnh có

tỷ lệ tử vong cao hơn các nguyên nhân vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm khác

Jamali H và cs (2014) [67] cho biết một số loại vi khuẩn đã kháng lại

tetracycline như: Listeria spp là 48,3%; Salmonella spp là 63,6%; Yersinia spp

Từ 20/5 - 28/6/2013 Choi M.J và cs (2014) [52] đã xác định được 05 trường

hợp nhiễm khuẩn Listeria spp do ăn pho-mat tại 4 tiểu bang của Hoa Kỳ

(Minnesota, Illinois, Indiana và Ohio) Trong 05 trường hợp có 04 bệnh nhân là nữ, trong đó có 01 người đang mang thai Sau thời gian điều trị có 01 bệnh nhân tử vong và 01 bệnh nhân sảy thai

Theo Barlik M và cs (2014) [47] Listeriosis là một bệnh do ngộ độc

thực phẩm gây ra Bệnh rất nguy hiểm với phụ nữ mang thai do tỷ lệ mắc bệnh rất cao, chiếm đến 1/3 số trường hợp mắc bệnh Phụ nữ mang thai mắc bệnh có thể bị sảy thai hoặc đẻ non và có nguy cơ lớn xảy ra các biến chứng cho thai nhi như nhiễm trùng huyết, viêm màng não hoặc viêm phổi

Martin B và cs (2014) [76] cho biết: L monocytogenes là một mối quan tâm lớn cho ngành công nghiệp chế biến thịt vì có nhiều ổ dịch listeriosis có liên quan

đến việc tiêu thụ sản phẩm từ thịt Thu thập 106 mẫu từ các bề mặt tiếp xúc với thực phẩm tại các nhà máy chế biến thịt ở Tây Ban Nha, có 36,8% thuộc serotype 1/2a; 34% thuộc serotype 1/2c; 17,9% thuộc sereotype 1/2b và 11,3% thuộc serotype 4b

Từ năm 2007 đến năm 2009, Linke K và cs (2014) [75] xét nghiệm 467 mẫu đất và 68 mẫu nước được thu thập tại 12 vùng sinh thái ở Áo để xác định

sự lưu hành của Listeria spp Kết quả cho thấy: 30% mẫu đất và 26% mẫu nước điều tra dương tính với Listeria Các loài thường gặp là L seeligeri, L innocua và

L ivanovii L monocytogenes được xác định có mặt trong 6% mẫu đất thu thập tại

các khu vực miền núi và đồng đồng bằng

Bukvički D và cs (2014) [50] đã nghiên cứu và cho biết sử dụng tinh dầu

Satureja horvatii có khả năng ức chế sự phát triển của L monocytogenes trong thịt

lợn mà không làm thay đổi màu sắc và mùi vị của thịt

Cielecka - Piontek J và cs (2014) [53] tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp Meropenem (MEM) và clavulanate potassium Kết quả cho thấy

hỗn hợp có khả năng chống lại vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, S aureus và L monocytogenes

Từ 7/2011 đến 9/2013, Althaus D và cs (2014) [46] đã xác định có 93 chủng

L monocytogenes phân lập được từ các bệnh nhân tại Thụy Sĩ Phần lớn các chủng

phân lập được thuộc serotype 1/2a (58 chủng), 28 chủng thuộc serotype 4b, 5 chủng thuộc serotype 1/2b và 2 chủng thuộc serotype 1/2c

Trong 2 năm 2012 và 2013, Dan S D và cs (2015) [58] đã thu thập 144 mẫu thịt

gà tại các quầy bán lẻ thuộc Romania để kiểm tra mức độ ô nhiễm vi sinh vật Kết quả

cho thấy: có 7 mẫu nhiễm Campylobacter jejuni (9,72%); 3 mẫu nhiễm Salmonella spp (4.17%); 11 mẫu nhiễm L monocytogenes (15,28%) và 12 mẫu nhiễm E coli (16,67%)

Shekarforoush S S và cs (2015) [93] đã sử dụng tinh dầu chiết suất từ Oregano (lá kinh giới) kết hợp với chitosan (một polysacarit mạch thẳng, được sản xuất từ quá trình xử lý vỏ các loài giáp xác với dung dịch kiềm NaOH) để

khống chế sự gia tăng số lượng vi khuẩn E coli và L monocytogenes trên thịt gà

tươi cho kết quả tốt

1.2.2.2 Tình tình nghiên cứu trên thế giới về S aureus

S aureus hay tụ cầu vàng là một loài tụ cầu khuẩn Gram dương và là nguyên

nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loài tụ cầu (Kluytmans J và

cs 1997) [71].

Ở Minas Gerais, Brazil, các chủng S aureus phân lập từ vú bò bị viêm thì có

54/127 chủng có khả năng sinh độc tố (Cardoso và cs, 1999) [51], chiếm tỷ lệ

42,5% Ở Đan Mạch, các chủng S.aureus phân lập từ vú bò bị viêm chỉ có 1/414

chủng mang gen sinh độc tố (Larsen H.D và cs, 2000) [74]

Có 10 - 50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S aureus (Bremer P.J và

cs, 2004 [49]) Tuy nhiên khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S aureus

cũng rất lớn do chúng phân bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố đường ruột

Haeghebaert S và cs (2002) [64]; Đậu Ngọc Hào (2010) [17] cho biết: Ở

Pháp, trong 2 năm từ 1999 - 2000 các vụ ngộ độc thực phẩm được xác định do S aureus và độc tố se là 32% các trường hợp là do các sản phẩm từ sữa và phomat,

Kenneth Todar (2005) [68] cho biết: S aureus không chỉ kháng thuốc kháng

sinh, mà còn biểu hiện kháng với một số chất khử trùng và chất tẩy uế (Costa W L

và cs, 2015) [54]

Hồng Lê Thọ (2007) [103] cho biết: Ở Nhật Bản, năm 1955 đã xảy ra sự kiện ngộ độc tập thể vào sáng ngày 1/3/1955 khi hơn 1.936 em học sinh của 5 trường tiểu học ở

Tokyo bị đau bụng và tiêu chảy do nhiễm tụ cầu vàng (S aureus)

Ono H K và cs (2008) [86] đã phát hiện ra 2 loại độc tố mới là ses (Staphylococcal enterotoxin S) và set (Staphylococcal enterotoxin T) cũng nằm trong nhóm những độc tố ruột do S aureus tạo ra

Theo Bruce A G và Kermit D H (2009) [100] thì seb là 1 trong các độc tố

được sinh ra bởi vi khuẩn S aureus Thông thường khi bị lây nhiễm vào cơ thể, seb

sẽ tác động chủ yếu lên các hệ thống vận chuyển ion và nước của ruột, do đó được

gọi là enterotoxin (độc tố ruột) Độc tố đường ruột seb bền với nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S aureus

Costa W L và cs (2015) [54] đã thu thập 114 mẫu thịt và cá tươi (30 mẫu gà,

30 mẫu thịt bò, 24 mẫu thịt lợn và 30 mẫu cá) tại bếp ăn của 10 bệnh viện ở

Salvador, Bahia, tại đông bắc Brazil để xác định tình hình nhiễm S aureus Kết quả cho thấy: 28,1% số mẫu thu thập dương tính với S aureus (23,3% thịt bò; 23,3%

thịt gà; 37,5% thịt lợn và 30% mẫu cá)

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Thịt bò bán tại chợ khu vực thành phố Bắc Giang

- Vi khuẩn L monocytogenes và S aureus nhiễm trên thịt bò phân lập được

2.1.2 Vật liệu, hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

- Các mẫu thịt bò thu thập tại các chợ trên địa bàn Thành phố Bắc Giang

- Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được chế biến sẵn, khi dùng pha

theo công thức hướng dẫn để nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn L monocytogenes và S aureus từ thịt bò

- Nước muối sinh lý 0,9 % dùng để pha loãng mẫu

- Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm: Tủ lạnh, nồi hấp ướt, tủ ấm, buồng cấy vô trùng, pipetman, ống durham, bình tam giác các loại, đĩa petri, cân, que cấy, bông cồn, giá đựng, ống nghiệm đựng mẫu, túi nilon, cối, chày sứ và các dụng cụ thí nghiệm khác

- Khoanh giấy kháng sinh

- Chuột bạch khỏe dòng Swiss khối lượng 18 - 22 g/con

- Máy móc, dụng cụ phòng thí nghiệm; thiết bị PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac 300 (Bio - Rad, Mỹ), máy soi DNA (Mini - transllumminatior, Bio - Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thụy Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, CHLB Đức), máy hút chân không Speed - Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Pulser, cùng với các trang thiết bị khác

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Các chợ trên địa bàn thành phố Bắc Giang

- Địa điểm xét nghiệm mẫu: Viện Khoa học Sự sống (Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên), Viện Thú y Quốc gia; Viện nghiên cứu Hệ gen, Công nghệ Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam

2.2.2 Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ tháng 8/2016 đến 8/2017

2.3 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát tình hình giết mổ và tiêu thụ thịt bò tại một số chợ trên địa bàn thành phố Bắc Giang

Xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí, chỉ tiêu vi khuẩn L monocytogenes và S aureus nhiễm trên thịt bò bán tại các chợ khu vực thành phố

Bắc Giang

Phân lập vi khuẩn L monocytogenes và S aureus nhiễm trên thịt bò bán tại

các chợ khu vực thành phố Bắc Giang

Giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của vi khuẩn L monocytogenes

và S aureus phân lập được

Xác định độc lực và khả năng sản sinh độc tố đường ruột enterotoxin của các

chủng vi khuẩn L monocytogenes và S aureus phân lập được

Xác định tính mẫn cảm với một số loại kháng sinh và hóa dược của các chủng

L monocytogenes và S aureus phân lập được

Đề xuất một số biện pháp khống chế ô nhiễm thịt bò bán tại chợ khu vực thành phố Bắc Giang

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp điều tra dịch tễ

- Điều tra bằng phương pháp phỏng vấn trực tiếp và lấy mẫu xét nghiệm

- Sử dụng phương pháp thống kê chuyên môn

- Lập phiếu điều tra, thiết lập bảng biểu thu thập số liệu về thực trạng hoạt động giết mổ tại các khu chợ

2.4.2 Phương pháp lấy mẫu thịt bò bán tại chợ

- Sử dụng phương pháp lấy mẫu được tiêu chuẩn hoá theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7925:2008 [39]

- Xét nghiệm mẫu theo phương pháp Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4833-:2002 [37] và Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4835 : 2002 [38]

- Lấy mẫu thịt theo phương pháp ngẫu nhiên từ các quầy bán thịt ở các chợ thuộc khu vực Thành phố Bắc Giang: Lau dao bằng cồn 700, sau đó dùng dao cắt lấy 100 - 200 gram thịt/mẫu; cho mẫu vào túi nilon vô trùng và ghi nhãn có các thông tin cần thiết

2.4.3 Quy định kỹ thuật đối với chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt tươi

Quy định kỹ thuật áp dụng đối với chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt tươi được áp dụng theo TCVN 7046: 2009 [40]

Bảng 2.1 Các chỉ tiêu vi sinh vật của thịt tươi

1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm 106

2 E coli, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 102

3 Salmonella, số vi khuẩn trong 25g sản phẩm 0

4 Bacillus cereus, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 102

5 S aureus, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 102

6 Clostridium perfringens, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 10

7 Clostridium botulinum, số vi khuẩn trong 1g sản phẩm 0

Quy định kỹ thuật đối với chỉ tiêu L monocytogenes được áp dụng theo Tiêu chuẩn Việt Nam 7046:2009 [40]: Quy định vi khuẩn L monocytogenes không được

phép có trong 25 gram sản phẩm

2.4.4 Phương pháp xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong thịt bò

Xác định chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí trên thịt tươi áp dụng theo Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7046:2009 [40]

- Nguyên lý: Trên môi trường thạch thường, ở điều kiện hiếu khí, ở 37oC, trong 24 giờ, mỗi khuẩn lạc phát triển riêng rẽ là một điểm xuất phát của vi khuẩn Đếm số khuẩn lạc trên đĩa thạch chính là số vi khuẩn chứa trong mẫu phân tích

- Chuẩn bị mẫu: Cân 25g thịt (loại bỏ mỡ, gân, bạc nhạc) cho vào túi P.E chuyên dụng vô trùng, bổ sung thêm 225 ml dung dịch đệm Peptone Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 1 phút Hỗn dịch thu được có tỷ lệ mẫu pha loãng

10-1, từ mỗi dịch này có thể pha loãng 10-2, 10-3… Tuỳ theo mức độ đánh giá ô nhiễm để xác định mức pha loãng

- Phương pháp nuôi cấy: Với 1 mẫu kiểm nghiệm phải nuôi cấy ít nhất 3 đậm

độ, mỗi đậm độ cấy vào 2 đĩa thạch riêng Lấy 1 ml dung dịch đồng nhất mẫu pha loãng ở những đậm độ khác nhau để chuyển vào đĩa Petri Đổ vào mỗi đĩa 12 - 15

ml môi trường thạch PCA (Plate Count Agar) hoà tan (đã được hấp vô khuẩn, để nguội 450C), trộn đều bằng cách xoay nhẹ đĩa 1 - 2 vòng theo chiều kim đồng hồ và ngược lại Để đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng nằm ngang, sau đó lật ngược đĩa chuyển vào tủ ấm 370C, trong 24 giờ đọc kết quả

- Tính kết quả: Đếm tất cả khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa thạch Để tránh nhầm lẫn cần đưa đĩa thạch lên giá kính chia ô để đếm Nếu vượt quá 300 khuẩn lạc/đĩa Petri thì loại bỏ và mẫu cần được pha loãng tiếp

Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g thịt được tính theo công thức sau:

(W1 + 0,1W2)d Trong đó:

N: Số khuẩn lạc trong 1 gram mẫu kiểm tra, N biểu thị kết quả dưới dạng thập phân giữa 1,0 - 9,0 nhân với 10w (W là chữ số mũ thích hợp của 10)

C: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

W1, W2: Số đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ nhất và thứ 2

d: Hệ số của đậm độ pha loãng đã chọn thứ nhất

2.4.5 Xác định chỉ tiêu Staphylococcus aureus trong thịt bò

Áp dụng theo TCVN 7046:2009 [40]

2.4.5.1 Nguyên tắc

S aureus được xác định dựa trên cơ sở các đặc điểm tăng trưởng và phản ứng

huyết tương của các dòng thuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập

2.4.5.2 Môi trường và thuốc thử

- Môi trường canh Mannitol Salt Broth (MSB): môi trường này được dùng để

định tính S aureus hay cũng có thể dùng trong định lượng bằng phương pháp Most

Probable Number (MPN)

- Môi trường thạch Mannitol muối - Mannitol Salt Agar (M35): Nếu không sử dụng môi trường thạch Baird - Parker, ta có thể sử dụng môi trường thạch Mannitol

muối Thành phần chính của môi trường này gồm có peptone, chất chiết từ thịt bò, Mannitol, NaCl và Phenol đỏ Nồng độ muối trong môi trường khá cao (7,5%) sẽ ức chế sự sinh trưởng của nhiều loài vi sinh vật

- Mannitol là nguồn Carbonhydrate duy nhất để vi khuẩn lên men Trên môi

trường thạch Mannitol muối, S aureus cho khuẩn lạc màu vàng, còn S epidermidis

(không lên men Mannitol) sẽ cho khuẩn lạc màu đỏ

- Môi trường thạch máu: máu được sử dụng là máu cừu hay máu bê non dưới

5 tháng tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu đã được bổ sung chất chống đông citrate Môi trường cần được pha trước 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm

- Môi trường thạch Braid Parker Agar (BPA): là môi trường chọn lọc thường

sử dụng để phát hiện S aureus Môi trường có chứa pepton và chất chiết thịt bò là

những thành phần dinh dưỡng cơ bản Glycine và sodium pyruvate có chức năng kích thích sự sinh trưởng của vi khuẩn Lithium chloride và potassium tellurite được

sử dụng để ức chế vi khuẩn Gram âm và làm chậm sự sinh trưởng của vi khuẩn Gram dương khác Lòng đỏ trứng được cho vào môi trường để phát hiện khả năng

sinh tổng hợp lycithinase của S aureus

- Lòng đỏ trứng và potassium tellurite chỉ được bổ sung vào môi trường sau khi đã khử trùng và làm nguội đến khoảng 60oC Tụ cầu sinh tổng hợp coagulase trên môi trường này sẽ có màu đen Sự sinh tổng hợp lecithinase của vi khuẩn sẽ tạo nên vòng sáng xung quanh các khuẩn lạc

- Môi trường Brain heart infusion broth (M36): thành phần cơ bản của môi trường gồm óc bê, tim bò, peptone, glucose và muối NaCl Đây là môi trường giàu dinh dưỡng được sử dụng để thúc đẩy sự sinh trưởng của nhóm vi sinh vật có nhu cầu về dinh dưỡng

- Huyết thanh thỏ có bổ sung ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), được

sử dụng để kiểm tra hoạt tính coagulase của vi khuẩn Huyết thanh thường được cung cấp ở dạng đông khô EDTA có chức năng như một tác nhân chống đông tụ Quá trình hoàn nguyên huyết thanh được thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất

2.4.5.3 Tiến hành xét nghiệm

a Phân tích định tính S aureus

- Cấy 2ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 8ml môi trường MBS, trộn đều và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ

- Dùng que cấy vòng, cấy ria dịch mẫu từ ống dương tính (môi trường chuyển

từ đỏ sang vàng) lên môi trường phân lập là thạch TGA hay thạch Baird Perker, ủ ở

37oC trong 24 giờ

- Tìm khuẩn lạc đặc trưng của S aureus trên môi trường phân lập tròn, lồi, có

tâm đen, trong suốt, đường kính 1 - 1,5 mm, có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc

- Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy vào ống môi trường BHI, ủ 370C 24 giờ

- Cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3 ml huyết tương và ủ ở 370C trong

24 giờ để thử phản ứng đông kết

- Thực hiện song song một ống đối chứng không được cấy dịch vi sinh vật

Mẫu được kết luận là có S aureus khi thử nghiệm coagulase này dương tính (nghĩa

là có sự xuất hiện của khối đông trong khi ống đối chứng thì không có)

b Định lượng S aureus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

* Đồng nhất mẫu pha loãng:

Cân chính xác 10 ± 0,1g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90 ml dung dịch pha loãng, đồng nhất bằng máy dập mẫu 30s Chuẩn bị dãy pha loãng thập phân thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa thạch Baird Parker sẽ xuất hiện khoảng 10 - 100 khuẩn lạc/đĩa

* Phân lập trên môi trường chọn lọc:

- Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker Dùng que cấy tam giác thủy tinh (thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi loại pha loãng Thực hiện tương tự với môi trường thạch máu Lật ngược đĩa, ủ ở 37 ± 10C trong 24 - 48 giờ đối với môi trường Baird Parker và 24 giờ đối với môi trường thạch máu

- Sau 24 giờ, khuẩn lạc S aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường

kính 0,5 - 1 mm, lồi, đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 - 2 mm bao quanh

- Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục

ủ 48 giờ Sau 48 giờ khuẩn lạc S aureus có đường kính khoảng 1 - 1,5 mm, có màu

đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 - 4 mm quanh

khuẩn lạc Khuẩn lạc một số dòng S aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh

khuẩn lạc như trên Cần đếm và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc

- Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi, có màu xám hay vàng nhạt, đường kính khoảng 1 - 2 µm Hầu hết S aureus có vùng tan máu, tuy nhiên một số dòng không tạo vùng tan máu này

* Tính kết quả:

- Mật độ S aureus trong mẫu được tính như sau:

Mật độ (CFU/g hay CFU/ml) = 10.(NtHt + NaHa)/( F1+F2)

- Trong đó:

+ F: Là độ pha loãng

+ Nt: Tổng số khuẩn lạc đặc trưng

+ Na: Tổng số khuẩn lạc không đặc trưng

+ Ht: Tỷ số giữa số khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với khuẩn lạc đặc trưng

+ Ha: Tỷ số giữa số khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc không đặc trưng

2.4.6 Các phương pháp phát hiện L monocytogenes

2.4.6.1 Phương pháp truyền thống

Phương pháp phát hiện L monocytogenes theo Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN

7700-1:2007

* Nguyên lý

Sử dụng phương pháp cấy đếm L monocytogenes trên môi trường nuôi cấy

chuyên biệt sau khi ủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ Chọn các khuẩn lạc nghi

ngờ xác định L monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh vật hoá học

* Tiến hành xét nghiệm

- Thu mẫu và tăng sinh

+ Bảo quãn mẫu: Mẫu được bảo quản ở 40C, trong quá trình bảo quản và vận

chuyển mẫu thì L monocytogenes vẫn phát triển được, mặc dù rất chậm ở nhiệt độ này

Tuy nhiên, nếu mẫu đã được đông lạnh, thì không nên xả đá cho đến khi phân tích + Mẫu phức hợp: Thông thường, phức hợp mẫu được chuẩn bị sao cho mẫu đại diện được bề mặt và bên trong của thực phẩm Các mẫu đã lấy đại diện trên một

thực phẩm được trộn lại và cho vào 250 ml dung dịch đệm tăng sinh Listeria có

chứa sodium pyruvate, không có chứa môi trường chọn lọc Các mẫu khác cũng thực hiện tương tự Thông thường 50g của hỗn hợp pha trộn được pha với 200 ml dung dịch đệm trước khi tăng sinh Mẫu được bảo quản trong khoảng nhiệt độ từ

00C - 50C

+ Mẫu không phức hợp: Nếu mẫu không yêu cầu phức hợp, chọn 25g mẫu thực phẩm pha vào 200 ml dung dịch đệm và thực hiện các bước tăng sinh tiếp theo + Tiền tăng sinh và tăng sinh: Ủ mẫu trong 4 giờ ở 300C, thêm các môi trường chọn lọc và tiếp tục ủ thêm 48 giờ ở 300C Nếu cycloheximide không có sẵn, thì có thể thay thế bằng pimaricin (natamycin) ở nồng độ 25 mg/l Natamycin an toàn và

dể sử dụng hơn cycloheximide

+ Liệt kê các mẫu dương tính với L monocytogenes: Dùng một số phương pháp xác định nhanh để liệt kê các mẫu dương tính với L monocytogenes, sau đó các mẫu tiếp tục được tăng sinh vì số lượng L monocytogenes có trong thực phẩm

là rất thấp (khoảng 1 cfu/25g mẫu)

- Giám định tính chất sinh vật, hoá học như bảng sau:

Bảng 2.2 Tính chất sinh vật hóa học của L monocytogenes

STT Phản ứng sinh hóa Biểu hiện của L monocytogenes

3 Khả năng di động (200 - 250C) + (Hình dù)

+ Chọn mẫu nghi ngờ có chứa L monocytogenes Có thể quan sát với ánh

sáng của các thiết bị chiếu sáng

+ Ủ mẫu ở 300C, ngâm dầu, quan sát dưới kính hiển vi để kiểm mức độ phát triển Chọn một mẫu với tốc độ tăng trưởng đủ để đạt yêu cầu xác định

+ Kiểm tra sinh hóa của các loài Listeria là catalase dương tính

+ Tiến hành nhuộm Gram (L monocytogenes là vi khuẩn Gram dương)

+ Thử nghiệm lên men đường Các mẫu dương tính được giữ lại để xác định các bước tiếp theo

+ Thử ngiệm với thạch máu cừu: một số loại L monocytogenes làm tan thạch máu L monocytogenes được cấy vào thạch máu và ủ trong 24 - 48 giờ ở 350C Cố

gắng cấy L monocytogenes vào lớp thạch sao cho gần đến lớp dưới cùng của thạch máu + Xác định các loài Listeria thông qua hiện tượng tan huyết: L monocytogenes tạo vòng lõm, L seeligeri tạo hơi, L nnocua cho thấy không có tán