Nghiên cứu chế tạo, thử nghiệm Auto vắc xin phòng bệnh viêm khớp, viêm phổi ở lợn do Streptococcus suis gây ra tại tỉnh Thái Nguyên (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu chế tạo, thử nghiệm Auto vắc xin phòng bệnh viêm khớp, viêm phổi ở lợn do Streptococcus suis gây ra tại tỉnh Thái Nguyên (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế tạo, thử nghiệm Auto vắc xin phòng bệnh viêm khớp, viêm phổi ở lợn do Streptococcus suis gây ra tại tỉnh Thái Nguyên (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế tạo, thử nghiệm Auto vắc xin phòng bệnh viêm khớp, viêm phổi ở lợn do Streptococcus suis gây ra tại tỉnh Thái Nguyên (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế tạo, thử nghiệm Auto vắc xin phòng bệnh viêm khớp, viêm phổi ở lợn do Streptococcus suis gây ra tại tỉnh Thái Nguyên (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế tạo, thử nghiệm Auto vắc xin phòng bệnh viêm khớp, viêm phổi ở lợn do Streptococcus suis gây ra tại tỉnh Thái Nguyên (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế tạo, thử nghiệm Auto vắc xin phòng bệnh viêm khớp, viêm phổi ở lợn do Streptococcus suis gây ra tại tỉnh Thái Nguyên (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế tạo, thử nghiệm Auto vắc xin phòng bệnh viêm khớp, viêm phổi ở lợn do Streptococcus suis gây ra tại tỉnh Thái Nguyên (Luận văn thạc sĩ)

ĐỖ HỒNG ANH

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO, THỬ NGHIỆM AUTO VẮC XIN PHÒNG BỆNH VIÊM KHỚP, VIÊM PHỔI

Ở LỢN DO STREPTOCOCCUS SUIS GÂY RA

TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐỖ HỒNG ANH

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO, THỬ NGHIỆM AUTO VẮC XIN PHÒNG BỆNH VIÊM KHỚP, VIÊM PHỔI

Ở LỢN DO STREPTOCOCCUS SUIS GÂY RA

TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của chúng tôi Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ

rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 8 năm 2017

Tác giả luận văn

Đỗ Hồng Anh

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt 2 năm học tập, với nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, đến nay luận văn của tôi đã được hoàn thành Nhân dịp này, cho phép tôi được tỏ lòng biết ơn

và cảm ơn chân thành tới:

Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Khoa Chăn nuôi Thú y cùng toàn thể cán bộ, giảng viên trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo điều kiện trong suốt quá trình tôi học tập và nghiên cứu tại trường

Lãnh đạo, cán bộ Phòng Vi trùng, Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương; cán bộ Thú y, đồng nghiệp đang làm việc trong lĩnh vực Chăn nuôi, Thú y của tỉnh Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Với lòng biết ơn chân thành, tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, nhân dân tại các địa điểm tiến hành thí nghiệm, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình đã tạo điều kiện giúp

đỡ, động viên, khích lệ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn

Thái Nguyên, tháng 8 năm 2017

Học viên

Đỗ Hồng Anh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vi khuẩn Streptococcus suis và bệnh do chúng gây ra ở lợn 3

1.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus suis 3

1.1.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra 12

1.3 Những nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn S suis gây bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn 18

1.3.1 Nghiên cứu ngoài nước 18

1.2.2 Nghiên cứu trong nước 20

1.2 Một số loại vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn 21

Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu 23

2.2 Nội dung nghiên cứu 23

2.2.1 Điều tra tình hình lợn mắc viêm phổi, viêm khớp tại các địa điểm nghiên cứu 23

2.2.2 Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Streptococcus suis

gây bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn 23

2.2.3 Ứng dụng chế tạo Auto vắc xin phòng bệnh viêm phổi, viêm khớp và thử nghiệm trong phòng thí nghiệm 24

2.2.4 Đánh giá hiệu lực của Auto vắc xin phòng bệnh viêm phổi, viêm khớp trên thực tế diện hẹp 24

2.3 Vật liệu nghiên cứu 24

2.4 Phương pháp nghiên cứu 25

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ 25

2.4.2 Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Streptococcus suis gây bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn 26

2.4.3 Phương pháp chế tạo Auto vắc xin từ giống vi khuẩn Streptococcus suis 31

2.4.4 Phương pháp kiểm tra, đánh giá chất lượng Auto vắc xin trong phòng thí nghiệm 33

2.4.5 Phương pháp tính LD50 của vi khuẩn S suis trên chuột 35

2.4.6 Phương pháp đánh giá Auto vắc xin ngoài thực địa 35

2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 38

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Kết quả điều tra lợn mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp tại các địa điểm nghiên cứu 39

3.2 Kết quả nghiên cứu phân lập, xác định một số đặc tính gây bệnh của vi khuẩn S suis gây viêm phổi, viêm khớp ở lợn 41

3.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn S suis từ mẫu bệnh phẩm lợn nghi mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp tại Thái Nguyên 41

3.2.2 Kết quả phân lập vi khuẩn S suis từ mẫu bệnh phẩm lợn nghi mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp theo các lứa tuổi 43

3.2.2 Kết quả giám định một số đặc tính sinh học của các chủng vi

khuẩn S suis phân lập được 46

3.3 Kiểm tra đánh giá chất lượng Auto vắc xin trong phòng thí nghiệm 56

3.4 Thử nghiệm an toàn và hiệu lực Auto vắc xin trên chuột thí nghiệm 61

3.5 Thử nghiệm an toàn Auto vắc xin trên lợn thí nghiệm 63

3.6 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lợn tiêm Auto vắc xin sau 1,2,3,4 tháng 64

3.6.1 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lợn tiêm Auto vắc xin sau 1 tháng 64

3.6.2 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lợn tiêm Auto vắc xin sau 2 tháng 65

3.6.3 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lợn tiêm Auto vắc xin sau 3 tháng 67

3.6.4 Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lợn tiêm Auto vắc xin sau 4 tháng 68

3.7 Đánh giá khả năng bảo hộ lợn thí nghiệm của Auto vắc xin với chủng S suis phân lập 70

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 73

1 Kết luận 73

2 Đề nghị 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Trình tự các cặp mồi dùng để xác định các serotype 1, 2, 7 và

9 của vi khuẩn S suis 29

Bảng 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả bảo hộ của Auto vắc xin trên thực địa 36

Bảng 3.1 Tỷ lệ lợn mắc và chết do bệnh viêm phổi, viêm khớp tại các địa điểm nghiên cứu 39

Bảng 3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn S suis từ mẫu bệnh phẩm lợn nghi mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp tại Thái Nguyên 42

Bảng 3.3 Kết quả phân lập vi khuẩn S suis từ mẫu bệnh phẩm lợn nghi mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp theo lứa tuổi 44

Bảng 3.4 Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng S suis phân lập được 47

Bảng 3.5 Kết quả xác định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được bằng hệ thống API 20 Strep 49

Bảng 3.6 Kết quả xác định serotype của các chủng S suis phân lập được 51

Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được trên chuột bạch 56

Bảng 3.8 Kết quả kiểm nghiệm chất lượng Auto vắc xin trong phòng thí nghiệm 57

Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra độ thuần khiết của 3 lô canh trùng sử dụng chế tạo Auto vắc xin 58

Bảng 3.10 Kết quả kiểm tra vô trùng 3 lô Auto vắc xinchế tạo thử nghiệm 60

Bảng 3.11 Kết quả thử nghiệm an toàn của Auto vắc xin trên chuột bạch 61

Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm hiệu lực của Auto vắc xin trên chuột bạch 62

Bảng 3.13 Kết quả thử an toàn Auto vắc xin ở lợn thí nghiệm 63

Bảng 3.14 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của

lợn tiêm Auto vắc xin sau 1 tháng 64Bảng 3.15 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của

lợn tiêm Auto vắc xin sau 2 tháng 66Bảng 3.16 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của

lợn tiêm Auto vắc xin sau 3 tháng 67Bảng 3.17 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của

lợn tiêm Auto vắc xin sau 4 tháng 69Bảng 3.18 Kết quả bảo hộ lợn thí nghiệm bằng Auto vắc xin 71

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Biểu đồ tỷ lệ mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp của lợn

tại các địa điểm nghiên cứu 41

Hình 3.2: Kết quả phân lập vi khuẩn S suis từ mẫu bệnh phẩm lợn nghi

mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp tại Thái Nguyên 42

Hình 3.3: Biểu đồ tỷ lệ phân lập vi khuẩn S.suis từ lợn nghi mắc bệnh

viêm phổi, viêm khớp theo lứa tuổi 46

Hình 3.4: Kết quả xác định serotype của các chủng S suis phân lập được 52 Hình 3.5: Kết quả phản ứng PCR xác định serotype của vi khuẩn S suis 54

Extracellular factor Glycogen

Hồng cầu kháng nguyên Acid Hippuric

Kháng nguyên Lactose

Leucine Amino Peptidase Lipoteibic acid

M- Assotated Protein Muramidase released protein Indirect Haemaglunation test Alkaline Phosphatase Passive Mouse Protection test Raffinose

Relative Risk Ribose

Suilysin Serua Oparty Factor Sorbitol

Sơ sinh Thành phố Trehalose

Vi khuẩn

Voges Proskauer

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm qua, Thái Nguyên đã thực hiện nhiều chính sách phát triển nông nghiệp, xóa đói giảm nghèo Nhờ vậy, nông nghiệp đã có nhiều thành tựu góp phần thực hiện nhiệm vụ xây dựng đất nước Ngành chăn nuôi ngày càng có vị trí quan trọng trong nền kinh tế, tổng đàn gia súc ngày càng tăng, nhiều giống mới được nhập vào nuôi thuần hóa để cải tạo đàn gia súc có hiệu quả

Tuy nhiên, chăn nuôi lợn tập trung theo quy mô vừa và nhỏ ở các huyện

đã và đang gặp rất nhiều khó khăn, đặc biệt là dịch bệnh, làm ảnh hưởng lớn tới năng suất chăn nuôi Trong vài năm gần đây, bệnh viêm phổi, viêm khớp

đã xuất hiện rất phổ biến trên đàn lợn của tỉnh Thái Nguyên gây thiệt hại lớn

về kinh tế do bệnh thường kéo dài, chi phí thuốc thú y cao, làm tổn thất nặng

nề về kinh tế, gây hoang mang cho người chăn nuôi

Bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn do nhiều nguyên nhân gây ra, có thể do một hay nhiều nguyên nhân kết hợp với nhau hoặc do nguyên nhân thứ phát gây ra làm cho đặc điểm của bệnh đường hô hấp rất đa dạng Trong số đó, phải kể đến bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn do vi khuẩn

Streptococcus suis (S suis) gây ra Lợn bệnh thường sốt cao 420C, ủ rũ, bỏ

ăn, run rẩy, thở dốc hoặc khó thở do viêm phổi, có biểu hiện thần kinh, liệt hai chân sau, co giật dẫn đến chết trong vòng 3 tuần tuổi sau cai sữa Lợn mắc viêm khớp có biểu hiện khớp nóng và đau dẫn đến mất thăng bằng, đi khập khiễng, run và bại liệt Mổ khám bệnh tích thấy khớp có nhiều dịch,

mủ, phổi, gan, thận sung huyết, viêm sùi van tim, viêm màng ngoài tim

Nghiên cứu về bệnh viêm phổi, viêm khớp do S suis gây ra ở lợn tại tỉnh

Thái Nguyên, ứng dụng thử nghiệm Auto vắc xin trong phòng và chống bệnh là một vấn đề cần thiết, đáp ứng với yêu cầu sản xuất hiện nay và từ

đó xác định được giải pháp phòng chống bệnh có hiệu quả và đem lại hiệu quả kinh tế cao nhất cho người chăn nuôi

Xuất phát từ thực tiễn trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu chế tạo, thử nghiệm Auto vắc xin phòng bệnh viêm khớp, viêm phổi

ở lợn do Streptococcus suis gây ra tại tỉnh Thái Nguyên"

2 Mục tiêu của đề tài

- Điều tra tình hình lợn mắc viêm phổi, viêm khớp từ đó phân lập và

tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Streptococcus suis gây bệnh viêm khớp,

viêm phổi ở lợn

- Chế tạo và thử nghiệm Auto vắc xin phòng bệnh viêm phổi, viêm khớp

do S suis gây ra cho lợn

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

- Bổ sung tư liệu khoa học về đặc điểm của vi khuẩn S suis gây bệnh

viêm phổi, viêm khớp ở trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên

Nghiên cứu, chế tạo và thử nghiệm Auto vắc xin từ các chủng

Streptococcus suis phân lập được tiêm phòng cho lợn nuôi tại tỉnh Thái

Nguyên phòng bệnh viêm khớp, viêm phổi

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở khoa học phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo như phục vụ cho công tác bào chế các chế phẩm sinh học phòng bệnh (vắc xin, kháng thể…), đồng thời đóng góp thêm tư liệu tham khảo cho nghiên cứu và giảng dạy, cho cán bộ thú y cơ sở và người chăn nuôi;

- Ứng dụng thử nghiệm Auto vắc xin phòng bệnh viêm khớp, viêm phổi

ở lợn tăng hiệu quả kinh tế chăn nuôi, góp phần phát triển bền vững nghề chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn Streptococcus suis và bệnh do chúng gây ra ở lợn

1.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus suis

* Hình thái, kích thước và đặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn S suis thuộc giống Streptococcus, họ Streptococcaceae, bộ

Lactobacillales, lớp Bacilli

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2005) [4], Streptococcus là vi khuẩn Gram

dương, hình cầu hoặc hình trứng đường kính nhỏ hơn 1μm, chúng thường đứng riêng lẻ, xếp thành đôi hoặc thành từng chuỗi ngắn như chuỗi hạt, có độ dài ngắn không đều nhau Chiều dài của chuỗi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường

Vi khuẩn bắt màu dễ dàng với một số loại thuốc nhuộm thông thường, thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, phát triển trong điều kiện hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện và không di động Vi khuẩn không sinh nha bào, nhưng có khả năng hình thành giáp mô Sự hình thành giáp mô có thể xác định được khi chúng sinh sống trong các mô hoặc phát triển trong các môi trường nuôi cấy có chứa huyết thanh Vi khuẩn được nuôi cấy sau 18 giờ chủ yếu là có dạng hình cầu, kích thước 0,5 - 1 μm, đứng thành dạng chuỗi 5-10 tế bào Trong canh trùng già, sau 30 giờ nuôi cấy, vi khuẩn có thể thay đổi tính chất bắt màu, chuỗi cũng thấy dài hơn Đặc biệt, khi nuôi cấy trong môi trường dạng lỏng, hình thái các chuỗi được nhìn thấy rõ nhất Khi làm tiêu bản trực tiếp từ bệnh phẩm lấy từ động vật, có thể quan sát thấy vi khuẩn có hình cầu, nhưng ở môi trường phân lập ban đầu, có thể nhầm với trực khuẩn ngắn

Vi khuẩn S suis là những vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy tiện,

gây bệnh thích hợp ở nhiệt độ 370C và phát triển tốt trên nhiều loại môi trường như:

Môi trường nước thịt: Vi khuẩn S suis hình thành hạt hoặc những bông,

rồi lắng xuống đáy ống Sau 2 giờ nuôi cấy môi trường trong, đáy ống có cặn

Môi trường thạch thường: Vi khuẩn S suis hình thành khuẩn lạc dạng S,

khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám

Trên môi trường đặc: Có thể quan sát thấy khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy với kích thước khoảng 1 - 2 mm Sau 72 giờ thì kích thước khuẩn lạc lớn nhất, có thể đạt tới 3 - 4 mm Nếu được nuôi trong điều kiện có 5 - 10% CO2thì khuẩn lạc sẽ phát triển nhanh hơn và rộng hơn Khuẩn lạc thường tạo chất nhầy mạnh, độ nhầy càng rõ và tăng nếu như vi khuẩn được nuôi cấy vài giờ vào môi trường 32 nước thịt có bổ sung huyết thanh trước khi cấy sang môi trường đặc hoặc thạch máu Dạng khuẩn lạc trên môi trường thạch thường nhỏ và khô hơn trên môi trường có bổ sung dinh dưỡng

Vi khuẩn S suis mọc trên các môi trường nuôi cấy giàu chất dinh dưỡng

như môi trường thạch máu, thạch Chocolate, nhưng mọc tốt nhất trên môi trường Columbia, nhiệt độ thích hợp 370C, nhưng có thể phát triển được ở một khoảng nhiệt độ rất rộng 10 – 450C, pH thích hợp 7–7,2 Sau 24 giờ, ở

370C, vi khuẩn mọc tạo những khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bờ đều, màu xám hoặc trong suốt, hơi nhầy

Trên môi trường thạch máu: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc tròn, gọn, hơi vồng, sáng trắng, mịn, dung huyết sau 24 giờ nuôi cấy Có thể quan sát thấy các kiểu dung huyết gồm:

Dung huyết kiểu α: vùng dung huyết xung quanh khuẩn lạc thường có màu xanh (dung huyết từng phần hay dung huyết không hoàn toàn)

Dung huyết kiểu β: Bao quanh khuẩn lạc là một vùng tan máu hoàn toàn trong suốt, có bờ rõ ràng do Hemoglobin được phân huỷ hoàn toàn

Dung huyết kiểu  (hay còn gọi là không dung huyết): không làm biến đổi thạch máu

Trịnh Phú Ngọc và cs (1999) [6]; Nguyễn Như Thanh và cs (2001) [19]; Phạm Sỹ Lăng và cs (2005) [4] khi nghiên cứu đặc tính sinh vật học của vi

khuẩn Streptococcus suis cho biết trên môi trường MacConkey, vi khuẩn mọc

tốt, sau 24 giờ nuôi cấy, hình thành các khuẩn lạc nhỏ bằng đầu đinh ghim

Trịnh Phú Ngọc và cs (1999) [6] đã tiến hành nghiên cứu tính chất vi

khuẩn học của các chủng Streptococcus phân lập từ lợn ở các tỉnh phía Bắc

Việt Nam và cho kết quả cho thấy:

Trên môi trường thạch thường: khuẩn lạc mọc yếu, khuẩn lạc trắng, trong, tròn Trên thạch máu: mọc tốt, khuẩn lạc trắng, hơi lồi, tròn, gọn, mịn, dung huyết Trên thạch huyết thanh: khuẩn lạc nhỏ, trắng, hơi lồi, trong mịn, gọn,

có ánh xanh trong Trên thạch Edward: khuẩn lạc nhỏ mịn, ướt, trò gọn, trong, mặt hơi lồi, màu hơi tím Trên thạch Shapman: không mọc màu đỏ tươi Trên nước thịt 5% huyết thanh: mọc tốt, hơi đục

* Đặc tính sinh hóa

Vi khuẩn S suis có khả năng lên men đường: glucose, lactose, succrose,

inulin, trehaloza, maltoza, fructoza Vi khuẩn không có khả năng lên men đường: ribose, arabinose, sorbitol, mannitol, dextrose và xylose Các phản ứng sinh hóa khác: catalase âm tính, oxidase âm tính, indol âm tính, coagulase

âm tính (Trịnh Phú Ngọc 2002 [7])

* Sức đề kháng

Theo Trịnh Phú Ngọc và cs (1999) [6] S suis có sức đề kháng kém với

nhiệt độ và hoá chất Trong phân, ở 00C vi khuẩn có thể sống 104 ngày, ở 90C

vi khuẩn sống được 10 ngày, ở 22- 250C vi khuẩn có thể sống được 8 ngày Ở

700C vi khuẩn chết trong 35- 40 phút, ở 1000C vi khuẩn chết trong 1 phút; vi khuẩn sống trong bụi 25 ngày ở 90C nhưng không phân lập được vi khuẩn ở bụi trong nhiệt độ phòng (18- 200C)/ 24 giờ Vi khuẩn bị diệt dưới ánh sáng mặt trời sau 40 - 60 phút

Lê Văn Tạo (2005) [16] cho biết S suis dễ bị diệt bởi nhiều chất sát

trùng như phenol, iod, hypochlorid, acid phenic 3 - 5% diệt vi khuẩn trong vòng 3- 15 phút, formol 1% diệt vi khuẩn trong vòng 60 phút, cồn 700 diệt vi khuẩn trong vòng 30 phút

S suis type 2 còn được tìm thấy trên xác những con lợn đã thối rữa trong

các trang trại với thời gian tồn tại là trong 6 tuần ở 4oC và 12 ngày ở 22-25oC Đây chính là nguồn lây nhiễm bệnh quan trọng một cách gián tiếp thông qua các động vật truyền bệnh trung gian như chim, mèo, chuột hoặc chó (Clifton Hadley và cs 1986b [28])

Vi khuẩn tồn tại lâu trong đờm, chất bài xuất có protein Tuy nhiên, vi khuẩn có thể tồn tại ở trên hạch amidan lợn mang trùng hơn 1 năm, ngay khi các yếu tố thực bào, kháng thể và bổ sung kháng sinh phù hợp trong thức ăn

* Cấu trúc kháng nguyên

Streptococcus có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp Có rất nhiều

kháng nguyên đã được tìm thấy:

Kháng nguyên polyozit hay kháng nguyên “C” do Lancefield phát hiện năm 1928, đây là một kháng nguyên thân Kháng nguyên này có ý nghĩa quan

trọng trong việc quyết định độc lực của S suis Thành phần kháng nguyên

thân có ý nghĩa quan trọng, quyết định đến tính độc lực của vi khuẩn

Streptococcus và nó nằm ở thành vi khuẩn (Cell wall) Thành tế bào vi khuẩn

S suis gồm 3 lớp: lớp ngoài có chứa acid và protein gọi là kháng nguyên M,

T, R, , Map (M - Assotated Protein), SOF (Serua Oparty Factor), phía ngoài cùng của lớp này thường chứa các fimbriae; lớp giữa chứa polysaccharide;

lớp trong cùng là peptidoglycan Những Streptococcus khác nhau có cấu tạo chất “C” khác nhau, dựa vào đó người ta chia Streptococcus thành các nhóm:

A, B, C, D, , R, trong đó Streptococcus type A, B thuộc loại tan máu type β

Kháng nguyên protein M là yếu tố độc lực chống lại quá trình thực bào

và là kháng nguyên đặc hiệu của Streptococcus type A Người ta đã xác định

có khoảng 42 type trong đó có 12 type quan trọng và thường hay gây bệnh

Các mucopeptit: làm cho vách tế bào của Streptococcus cứng rắn và còn

có khả năng gây độc

Kháng nguyên bám dính: Vai trò của kháng nguyên bám dính của S

suis còn chưa được biết đến một cách rõ ràng, nhưng có ý kiến cho rằng

fimbriae có lipoteibic acid (LTA) giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào biểu mô

và ở tế bào lympho đa nhân có điểm tiếp nhận (receptor) tương ứng với LTA trong quá trình thực khuẩn (Nguyễn Như Thanh và cs 1997) [18] Vi khuẩn

S suis là một trong số ít các loại vi khuẩn Gram dương có mang cấu trúc này

So với các loại vi khuẩn khác thì kháng nguyên bám dính của S suis có cấu

trúc mỏng, ngắn, đường kính khoảng 2m, và dài có khi tới 200 m (Jacques

và cs 1990 [44])

Hiện nay vi khuẩn S suis có 20 nhóm huyết thanh và 25 serotype khác

nhau Phần lớn các vi khuẩn gây bệnh trên lợn đều thuộc type 1 và type 2 Vi

khuẩn S suis thuộc nhóm D có 9 serotype; nhóm R và nhóm S có 2 serotype gây

ra các thể bệnh viêm họng, nhiễm trùng huyết và viêm khớp ở lợn Vi khuẩn S

suis thuộc nhóm E có 6 serotype, trong đó serotye 2, 4, 1, 6, 7 gây các thể bệnh

apxe hạch và các nội quan khác Vi khuẩn S suis thuộc nhóm L và C gồm 11

serotype gây các thể bệnh nhiễm trùng huyết, viêm nội tâm mạc và viêm đa khớp ở lợn Các chủng thuộc các serotype gây ra các thể bệnh khác nhau Thậm chí các chủng vi khuẩn thuộc cùng một serotype cũng có thể gây ra các thể bệnh khác nhau do vùng địa lý mà chúng phân bố Một số serotype không có độc lực

và có thể được phân lập từ lợn khỏe mạnh, không có triệu chứng lâm sàng như các serotype 17; 18; 19 và 21 (Higgins và Gottschalk, 2002) [40] Đỗ Ngọc Thúy

và cs (2009) [23] khi xác định serotype trong 211 chủng S suis phân lập được

từ lợn tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam cho biết số chủng thuộc serotype 2 chiếm

tỷ lệ cao nhất 14/211 chủng (6,6%); serotype 9 có 10/211 chủng (4,7%); serotype 9, 31, 32 có 7/211 chủng (3,3%); các serotype 7, serotype 17 và serotype 21 có tỷ lệ tương đương là 1,4%; serotype 8 chiếm 0,9%

* Các yếu tố độc lực của vi khuẩn S suis

Những hiểu biết về các yếu tố độc lực của vi khuẩn S suis còn rất hạn

chế Phần lớn những nghiên cứu được tiến hành với các chủng thuộc serotype

2 Các nhà khoa học đều có chung quan điểm: có sự tồn tại của chủng độc và

không độc của vi khuẩn S suis type 2 Thành phần polysaccharide của giáp mô

(capsular polysaccharide - CPS) được chứng minh là yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn này vì các chủng đột biến không có giáp mô đều thể hiện là không có độc tính và nhanh chóng bị loại bỏ khỏi hệ thống tuần hoàn của lợn

và chuột trong các thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm Tuy vậy không phải tất cả các chủng có giáp mô đều là chủng độc

Các yếu tố độc lực khác, ngoài polysaccharide của giáp mô cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn, bao gồm:

Yếu tố gây dung huyết, hay còn gọi là “suilysin” có trọng lượng phân

tử 65 kDa và có độ phóng xạ riêng là 0,7x106 Units/ mg Suilysin (SLY) thuộc về nhóm độc tố với những đặc điểm chung là: dễ bị oxy hoá, dễ bị hoạt hóa bởi một số hóa chất khử, dễ bị ức chế bởi cholesterol với nồng độ loãng, ức chế tính hoạt động của một số lượng ít, gốc N- của chuỗi amino acid của suilysin giống với perfringolysin O, streptolysin O, listeriolysin O,

alveolysin, pneumolysin Trong điều kiện in vivo, chuột và lợn đã được

chứng minh là có khả năng tạo ra miễn dịch khi được tiêm vắc xin chứa

suilysin để kháng lại S suis serotype 2 gây bệnh Suilysin là yếu tố độc lực quan trọng của S suis vì sự trung hoà của yếu tố này đủ để bảo vệ chuột thí nghiệm chống lại các tác động có hại của S suis type 2 (Gottschalk và cs

1998 [36]) Tuy nhiên, yếu tố gây dung huyết dường như không phải là yếu

tố độc lực quan trọng đối với các chủng phân lập được ở Bắc Mỹ, ngược lại, rất nhiều chủng có nguồn gốc từ lợn bệnh ở châu âu lại có hoạt tính này Hoạt tính của suilysin không thể phân biệt được bằng các phương

pháp sinh hoá và miễn dịch thông thường, vì vậy, một số nghiên cứu đã cho rằng suilysin có thể là yếu tố độc lực quan trọng của một số chủng vi

khuẩn Mặc dù vậy, một số chủng S suis serotype 2 không có khả năng

dung huyết vẫn đã được chứng minh rằng có độc lực cao

Hai loại protein: protein giải phóng muramidase (Muramidase-released protein - MRP) có trọng lượng phân tử 136 kDa và protein giải phóng yếu tố ngoại bào (Extracellular factor - EF) đã được xác định là các yếu tố độc lực

quan trọng trong sinh bệnh học của S suis type 2 gây bệnh ở lợn và người

Các nghiên cứu về gây bệnh thực nghiệm trên lợn cũng đã cho thấy các chủng

vi khuẩn có mang 2 yếu tố gây bệnh này (MRP+ EF+) đã được phân lập từ các phủ tạng của lợn sau khi gây nhiễm với các triệu chứng điển hình của bệnh, trong khi đó các chủng không mang các yếu tố gây bệnh này (MRP- EF-) có thể phân lập được thường xuyên trong amidan của lợn khỏe và không

có khả năng gây bệnh cho lợn thí nghiệm Tuy nhiên, quy luật này lại không

đúng với trường hợp các chủng S suis serotype 2 phân lập được từ lợn và

người bị bệnh tại Canada và Bắc Mỹ vì hầu hết các chủng đều không gây dung huyết và không mang các yếu tố gây bệnh MRP và EF khác biệt hoàn toàn với các chủng phân lập được từ châu Âu, kể cả về cấu trúc di truyền (Gottschalk và cs 1998 [36])

Ở Việt Nam, các chủng S suis phân lập được của lợn ở các tỉnh phía Bắc

Việt Nam đều mang hình thái, tính chất mọc trên môi trường, tính chất sinh hóa giống như các chủng chuẩn đã được mô tả trong các tài liệu trước đây Trong 449 chủng phân lập có 67,03% có khả năng gây dung huyết và 32% không gây dung huyết Trong số gây dung huyết có 46% gây dung huyết kiểu

β, 32,22% kiểu γ và 21,59% kiểu α (Trịnh Phú Ngọc và cs 1999[6])

Theo Đỗ Ngọc Thúy và cs (2009) [23] trong 211 chủng S suis phân lập

được từ lợn tại các tỉnh miền bắc Việt Nam có 7 tổ hợp gen mã hóa các yếu tố độc lực được xác định

* Phương thức lây truyền và cơ chế sinh bệnh của vi khuẩn S suis

Khả năng gây bệnh của S suis phụ thuộc vào nhiều yếu tố như sức đề

kháng của con vật, điều kiện vệ sinh môi trường, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng, thời tiết khí hậu và tính chất kháng nguyên độc lực của vi khuẩn

Austrian (1976) [24] cho thấy 30 - 70% số con vật khoẻ mạnh phân lập

được Streptococcus spp từ đường hô hấp trên Khi hàng rào bảo vệ của cơ thể

bị suy giảm hoặc phá vỡ thì vi khuẩn sẽ xâm nhập vào đường hô hấp dưới và gây viêm phổi Tại đây, vi khuẩn theo hệ thống tuần hoàn gây nhiễm trùng huyết, sau đó tràn vào nội và ngoại tâm mạc, màng não, xoang khớp để gây

ra các thể bệnh ở đó Vi khuẩn Streptococcus spp gây dung huyết khi vào máu

và đến các cơ quan sẽ gây ra các ổ áp xe thứ phát, dẫn đến viêm tuỷ xương, viêm khớp, viêm van tim, viêm nội tâm mạc, thận, gan, hạch lympho và đường sinh dục

Việc lây truyền bệnh giữa các đàn với nhau chủ yếu là do sự di chuyển của các lợn khỏe mạnh mang trùng Việc nhập lợn khỏe mạnh nhưng mang trùng (lợn hậu bị, lợn đực giống, lợn cai sữa) vào đàn không có mầm bệnh thường dẫn tới hậu quả là phát sinh bệnh ở lợn đã cai sữa hoặc lợn vỗ béo Lợn con có thể bị nhiễm mầm bệnh từ lợn mẹ thông qua đường hô hấp (Clifton Hadley và cs 1986a [27], 1986b [28])

Bệnh có thể bị lây nhiễm từ trại này sang trại khác thông qua vật chủ

trung gian là ruồi Enright (1987) [30] đã cho thấy ruồi có thể mang S suis

type 2 tới 5 ngày và có thể làm nhiễm mầm bệnh vào thức ăn mà chúng đậu phải ít nhất là trong vòng 4 ngày

Sự tồn tại của xác chết mang vi khuẩn S suis trong chuồng nuôi cũng

là một cách để truyền S suis (Higgins và cs 2002 [40])

Vi khuẩn có thể tồn tại trong phân, bụi bẩn, xác lợn và ở cả những con ruồi trong một thời gian dài Bệnh có thể truyền qua đường hô hấp, các chất

bài tiết, máu của lợn bệnh, lây lan thông qua tiếp xúc trực tiếp hoặc lây qua kim tiêm nhiễm trùng Lợn con có thể bị lây nhiễm từ lợn mẹ qua đường hô

hấp, đường tiêu hoá và đường máu Vi khuẩn S suis lây truyền theo đường hô

hấp xâm nhập vào hạch amidan, vòm họng, từ đó di chuyển theo hệ lâm ba tới hạch dưới hàm, cư trú ở các mô; lúc này, cơ thể chưa có dấu hiệu về lâm sàng của bệnh Ở các tổ chức cư trú, chúng sống và nhân lên trong tế bào monocyt rồi chuyển vào xoang dịch não tuỷ, gây nên viêm màng não, có thể thông qua con đường nhiễm trùng huyết để xâm nhập vào màng não, khớp xương và các

mô khác (Lê Văn Tạo, 2005 [16])

Theo Trần Văn Bình (2008) [2] sau khi tiếp xúc với niêm mạc đường hô hấp hoặc đường tiêu hóa, liên cầu khuẩn nhanh chóng xâm nhập vào máu, ức chế đại thực bào và gây nhiễm trùng huyết cho lợn bệnh Chúng sinh ra ngoại độc tố phá hủy nội mô mạch máu làm cho hồng cầu chảy ra, hậu quả gây xuất huyết nặng ở niêm mạc

Vi khuẩn S suis là một trong số các tác nhân gây bệnh quan trọng ở lợn,

là nguyên nhân gây ra bệnh ở các thể cấp tính như bại huyết, viêm não, viêm màng trong tim, viêm khớp, viêm phổi, thường dẫn đến chết ở lợn, đặc biệt là giai đoạn lợn đã cai sữa và lợn trưởng thành Bệnh do vi khuẩn này gây ra từ lâu đã và đang được coi là một bệnh thu hút được nhiều sự chú ý trong ngành chăn nuôi lợn Bên cạnh đó, tác nhân gây bệnh cũng là nhân tố quan trọng, là nguy cơ tiềm tàng gây các bệnh ở người như viêm não, viêm màng trong tim

và nhiễm trùng máu

Vi khuẩn S.suis là mối nguy hiểm nghề nghiệp đặc biệt quan trọng với

những người trực tiếp làm công tác chăn nuôi, thú y, những người làm nghề giết mổ và bán thịt lợn Gần đây nhất (tháng 7 và 8/2005), một vụ dịch lớn nhất, chưa từng gặp trong lịch sử ngành chăn nuôi lợn đã xảy ra tại tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc gây chết 644 con lợn, gây nhiễm bệnh cho 208 người,

trong đó có 39 người đã tử vong (Wang và cs 2007) [61] Các nhà khoa học Trung Quốc đã tiến hành các nghiên cứu cơ bản trong phòng thí nghiệm và đã chế tạo được một loại vắc xin vô hoạt với kháng nguyên là chính các chủng vi khuẩn phân lập được tại ổ dịch để tiêm phòng cho toàn bộ lợn nuôi trong vùng Các ghi nhận cho thấy kết quả bước đầu là rất khả quan, dịch bệnh đã tạm dừng, không thấy lợn và người bị nhiễm bệnh và chết

1.1.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra

Clifton Hadley (1983) [26] nghiên cứu ở lợn gây bệnh thực nghiệm và quan sát lợn trong các ổ dịch tự nhiên thấy: lợn từ 1- 3 tuần tuổi thường mắc thể viêm não và viêm màng não với các triệu chứng như: ủ rũ, kém ăn, sưng hầu, khó nuốt, đi lại khó khăn, lông khô, dựng đứng, sốt, da mẩn đỏ Lợn hoạt động khó khăn, đi lại loạng choạng, khi nằm có biểu hiện tư thế như bơi chèo,

tê liệt Biểu hiện viêm não chính là căn cứ chính để chẩn đoán bệnh vì triệu

chứng này ít gặp hơn ở lợn trưởng thành Vi khuẩn S suis serotype 1 thường

gây ra các thể bệnh cho lợn ở lứa tuổi này Thể viêm khớp thường xảy ra ở lợn cai sữa và lợn trưởng thành Lợn mắc bệnh có hiện tượng viêm 1 khớp, khớp viêm thường là khớp bẹn, đầu gối hoặc khớp bàn chân Các tổn thương đầu tiên bao gồm thủy thũng, sưng khớp, màng khớp xung huyết, dịch khớp đục Bệnh

có thể tiến triển nặng hơn với hiện tượng xơ hóa và áp xe các tổ chức trong khớp, khớp bị thoái hóa, viêm khớp có mủ ở lợn con Bệnh xảy ra đối với hệ thống xương thường là thoái hóa ở các đốt sụn Sau 15- 30 ngày mắc bệnh, có thể thấy các đốt sụn bị hoại tử Ngoài ra, các triệu chứng như viêm não, viêm phổi, bại huyết, viêm nội tâm mạc, viêm teo mũi, sảy thai, viêm âm đạo cũng

có thể quan sát thấy, tùy thuộc vào serotype của chủng vi khuẩn gây bệnh Lợn mắc bệnh có thể chết do khó thở, tím tái, hoặc kiệt sức Các serotype khác nhau

của S suis đều có thể gây bệnh cho lợn ở lứa tuổi này

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2005) [4], bệnh do vi khuẩn S suis gây ra ở

lợn hay còn gọi là bệnh liên cầu ở lợn xảy ra ở lợn mọi lứa tuổi, nhưng phổ biến ở lợn con một vài tuần tuổi đến sau cai sữa vài tuần Đặc trưng lâm sàng của bệnh là nhiễm trùng huyết, viêm màng não, viêm khớp và viêm phế quản

phổi Đặc biệt S suis type 2 có thể gây bệnh cho người Thể nhiễm trùng

huyết và viêm não có dịch (thường thấy ở lợn từ 2 - 3 tháng tuổi); thể viêm đường hô hấp (ở lợn từ 2 tuần tuổi đến 2 tháng tuổi); thể viêm âm đạo, tử cung (ở lợn cái hậu bị và lợn mang thai); thể viêm vú (ở lợn đang nuôi con); thể viêm hạch (ở lợn sau cai sữa và vỗ béo)

Triệu chứng và bệnh tích: thời gian nung bệnh từ 6 giờ đến 3 ngày, tuỳ thuộc số lượng vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể, lứa tuổi và sức đề kháng của cơ thể Các thể bệnh thường thấy:

Thể nhiễm trùng huyết: lợn bệnh sốt rất cao 41 – 420C, chảy nước mắt,

ly bì, nằm bệt, niêm mạc đỏ sẫm, da đỏ tím từng mảng, lợn bệnh chết trong khoảng 1 - 3 ngày, tỷ lệ chết lên đến 100% Bệnh tích: da đỏ tím từng mảng,

tụ huyết và xuất huyết ở một số phủ tạng (lách, thận, hạch lâm ba)

Thể viêm não tuỷ: sốt cao, bỏ ăn, đi lại siêu vẹo, run rẩy, co giật, nôn mửa, hôn mê và chết sau 2 - 3 ngày Bệnh thường thấy ở lợn sau cai sữa, lợn

từ 2 - 3 tháng tuổi Tỷ lệ chết 100 % Bệnh tích: màng não tụ huyết và xuất huyết, dịch não và tủy vẩn đục

Thể viêm họng, viêm phế quản phổi: sốt cao, chảy nước mắt, dịch mũi, họng sưng, bỏ ăn, thở khó, thở nhanh; da tụ huyết từng mảng Thường thấy ở lợn con đang theo mẹ và sau cai sữa Tỷ lệ chết 60 - 70 % Bệnh tích: họng và amidan sưng, tụ máu, niêm mạc phế quản tụ huyết, niêm mạc mũi có màng giả, tiểu phế quản và phế nang viêm có dịch thẩm xuất, có mủ và bọt khí; hạch phổi sưng thũng, tụ huyết

Thể viêm hạch: sốt cao, hạch hầu và hạch mang tai sưng thũng, sau thành apxe mủ, lâu thành bã đậu Bệnh thấy ở lợn vỗ béo, diễn biến 5 - 8 ngày, tỷ lệ chết 20 - 30% Bệnh tích: hạch hầu, hạch trước vai, trước đùi sưng

tụ huyết ở giai đoạn đầu, giai đoạn cuối viêm bã đậu

Chẩn đoán:

Theo Devriese và cs (1991) [29] nếu phòng thí nghiệm có thể tiến hành xác định được serotype thì chỉ cần làm 2 xét nghiệm đối với các chủng vi khuẩn phân lập được từ lợn là: phản ứng amylase dương tính và Voges-Proskauer (acetoin) âm tính

Phương pháp xác định serotype vẫn đóng một vai trò quan trọng trong chẩn đoán bệnh do vi khuẩn này gây nên Có thể thực hiện bằng nhiều kỹ thuật khác nhau, nhưng phương pháp ngưng kết nhanh hiện vẫn đang được sử dụng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới Vì phần lớn các serotype gây bệnh đều thuộc các serotype 1- 8 và 1/2 nên chỉ cần tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh với các kháng huyết thanh này và gửi các chủng không xác định được đến các phòng thí nghiệm tham chiếu để có kết quả chính xác (Higgins và Gottschalk 1996 [39])

Việc chẩn đoán bệnh do vi khuẩn S suis gây ra thường dựa vào tuổi mắc

bệnh, các triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể, tác nhân gây bệnh và bệnh tích vi thể của con vật mắc bệnh Điều cần lưu ý khi chẩn đoán là phải tiến hành phân lập vi khuẩn từ một vài cơ quan phủ tạng khác nhau của cùng một lợn mắc bệnh và từ vài lợn bệnh trong cùng một đàn để tìm ra serotype gây bệnh chính (Higgins và cs 2002 [40])

Cần lưu ý khi chẩn đoán, phải tiến hành phân lập vi khuẩn từ một vài cơ quan phủ tạng khác nhau của cùng một lợn mắc bệnh và từ vài lợn trong cùng một đàn để tìm ra serotype gây bệnh chính Các kỹ thuật sinh học phân tử là

công cụ hữu ích giúp phân biệt các chủng S suis phân lập được, xác định

nguồn gốc lây nhiễm trong đàn, giúp khống chế ổ dịch hoặc tìm ra đúng

chủng để bổ sung vào vắc xin Gần đây nhiều phòng thí nghiệm đã phát triển

kỹ thuật PCR để giám định vi khuẩn S suis, xác định các yếu tố độc lực và

serotype của chủng vi khuẩn gây bệnh đã được ứng dụng rộng rãi

Đỗ Ngọc Thúy và cs (2009) [23] đã thiết lập thành công các phản ứng PCR dùng để giám định vi khuẩn, xác định các yếu tố độc lực và serotype của

chủng vi khuẩn S suis tại phòng thí nghiệm bộ môn Vi trùng, Viện Thú y

Phòng bệnh:

Phòng bệnh bằng vệ sinh, chăm sóc, nuôi dưỡng và quản lý:

Thường xuyên quét dọn vệ sinh, phun thuốc tiêu độc, tẩy uế chuồng trại bằng các loại thuốc sát trùng

Chú trọng công tác chăm sóc nuôi dưỡng và quản lý đàn Xác định những lợn mang mầm bệnh, tách riêng điều trị, hoặc loại thải

Bổ sung kháng sinh vào thức ăn để giảm tỷ lệ lợn khoẻ mang trùng Khi

có dịch xảy ra, phải cách ly những con bệnh ra khu vực nuôi cách ly để tránh lây lan

Theo dõi và điều trị kịp thời những con bị bệnh Với những con không

có khả năng chữa khỏi thì tiến hành loại thải nhằm mục đích thu hẹp và thanh toán được đàn lợn bị bệnh Trong quá trình theo dõi, phải cách ly tuyệt đối không được nhập đàn mới vào, phải tiến hành thường xuyên phun thuốc tiêu độc, tẩy uế chuồng trại bằng các thuốc sát trùng

Không được vận chuyển lợn từ vùng có dịch sang vùng khác Đối với các vùng chăn nuôi tập trung và các trang trại, biện pháp tốt nhất là tự sản suất lấy con giống Trong trường hợp cần phải nhập con giống từ nơi khác về thì nhất thiết phải tiến hành kiểm dịch, cán bộ chuyên môn phải đến tận nơi có lợn bán kiểm tra việc tiêm phòng cho đàn lợn trước khi đưa về Khi nhập lợn

về phải nuôi cách ly tại khu vực nuôi cách ly ít nhất 15 ngày Sau đó kiểm tra thấy lợn khoẻ mạnh bình thường và không có dấu hiệu gì về bệnh thì mới tiến hành cho nhập đàn

Phòng bệnh bằng vắc xin: Các nhà khoa học đã nghiên cứu và đưa vào chế tạo thử nghiệm nhiều loại vắc xin khác nhau như: vắc xin toàn khuẩn, vắc xin sống nhược độc, vắc xin tiểu phần (chế từ kháng nguyên giáp mô hoặc các protein thành tế bào, protein là các yếu tố độc lực), Tuy nhiên, miễn dịch bảo hộ ở chuột hoặc lợn thí nghiệm được tiêm các loại vắc xin này cũng rất thất thường và không ổn định

Trong một số trường hợp khẩn cấp, việc lựa chọn dùng vắc xin vẫn là phương thức tối ưu nhất để bảo vệ sức khoẻ đàn lợn Tại Trung Quốc, năm 1994

đã dùng vắc xin chế từ chủng nhược độc của vi khuẩn S suis chủng ST.171

đông khô tiêm cho lợn từ cai sữa đến trưởng thành và nái có chửa ở thời kỳ đầu Khi sử dụng cho thêm nước muối sinh lý có bổ trợ keo phèn 20% hoà thành huyễn dịch tiêm dưới da hoặc tiêm bắp với liều 1ml/con Sau khi tiêm 7 ngày đã sinh miễn dịch, miễn dịch cao nhất sau 14 ngày và thời gian miễn dịch kéo dài được 6 tháng (Lê Văn Tạo và Đỗ Ngọc Thuý, 2006) [17]

Vi khuẩn S suis mẫn cảm với nhiều loại kháng sinh, nhưng cũng rất dễ

kháng lại với các loại kháng sinh này Vì vậy, trong quá trình sử dụng kháng sinh để phòng và điều trị bệnh phải hết sức thận trọng

Điều trị: Chẩn đoán phát hiện sớm bệnh do vi khuẩn S suis gây ra và điều

trị bằng kháng sinh thích hợp là biện pháp nhằm tăng khả năng sống sót cho đàn lợn Với lợn con trước cai sữa và ở giai đoạn đầu của bệnh, nếu sử dụng penicillin và dexamethasone sẽ mang lại hiệu quả rất cao Trong thực tế, khi sử

dụng penicillin điều trị bệnh do S suis gây ra, điều trị từng cá thể kết hợp với

chăm sóc và nuôi dưỡng tốt có thể khỏi bệnh hoàn toàn, tránh được tử vong

Ngoài ra có thể sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh do S suis gây ra

Nguyễn Ngọc Nhiên và cs (1994) [9] khi điều trị bệnh đường hô hấp trong chăn nuôi lợn tập trung đã dùng Tylosin để điều trị Dùng kháng sinh tiêm kết hợp với vắc xin tiêm phòng được chế từ các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập được ở lợn mắc bệnh viêm đường hô hấp trong đó có các chủng

Streptococcus đã thu được kết quả rất tốt

Trương Quang Hải và cs (2012) [3] xác định khả năng mẫn cảm với

kháng sinh của 25 chủng vi khuẩn S suis phân lập được ở lợn mắc bệnh viêm phổi tại tỉnh Bắc Giang cho kết quả: các chủng vi khuẩn S suis mẫn cảm cao

với ceftiofur (92,0%), florfenicol (88,0%), amoxicillin (88,0%), oxfloxacin (72,0%), amikacin (72,0%) và kháng lại mội số kháng sinh như streptomycin (72,0%), neomycin (64,0%), colistin (60,0%), tetracycline (56,0%) và penicillin G (48,0%)

Trong thực tế, khi sử dụng kháng sinh có độ mẫn cảm cao để điều trị cho

lợn mắc bệnh do vi khuẩn S suis gây ra đã mang lại hiệu quả Tuy nhiên, sử

dụng kháng sinh để điều trị phải dùng sớm và chỉ có hiệu quả tốt khi con vật chưa có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nặng hay chưa có biểu hiện quá ủ rũ,

bỏ ăn Điều trị muộn thì hiệu quả sẽ rất kém hoặc không có hiệu quả

Bên cạnh đó, nhiều nước trên thế giới đã sử dụng kháng huyết thanh đặc

hiệu để điều trị bệnh và mang lại kết quả tốt Các nhà nghiên cứu Tiệp Khắc

(cũ) đã chế tạo thành công kháng huyết thanh đặc hiệu dùng điều trị bệnh cho lợn và bò Kháng huyết thanh được lấy từ những con bò được miễn dịch bằng

kháng nguyên Streptococcus gây bệnh và được cố định bằng phenol, dùng để

điều trị bệnh, hoặc được dùng phối hợp với vắc xin để chống lại sự cảm

nhiễm vi khuẩn Streptococcus đối với những động vật tiếp xúc với mầm bệnh

Điều trị cho lợn lớn với liều 2ml/kg thể trọng (sau khi tiêm kháng huyết thanh được 3 tuần thì tiêm tiếp vắc xin tụ cầu với liều 2ml/con) Khi sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu để điều trị bệnh thường giá thành rất cao, vì vậy trong thực tế ít sử dụng

Theo Trịnh Phú Ngọc (2002) [7] chỉ sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu

để điều trị trong những trường hợp cần thiết và với những động vật quý hiếm

có giá trị kinh tế cao

1.3 Những nghiên cứu trong và ngoài nước về vi khuẩn S suis gây bệnh

viêm phổi, viêm khớp ở lợn

1.3.1 Nghiên cứu ngoài nước

Vi khuẩn S suis là một trong số các tác nhân gây bệnh quan trọng và gây

ra những thiệt hại đáng kể trong chăn nuôi lợn công nghiệp Các thông báo

đầu tiên về bệnh do S suis gây ra ở lợn đã được chính thức xác nhận lần đầu

tiên ở Hà Lan vào năm 1951 (Jansen và Van Dorssen 1951) [43] và ở Anh vào năm 1954 (Field và cs 1954) [32] Kể từ đó, bệnh đã được thông báo là xảy ở hầu khắp các nước trên thế giới - nơi có ngành chăn nuôi lợn phát triển (Higgins và Gottschalk 2002) [40]

Ở Anh, bệnh do S suis type 2 chủ yếu là gây ra các triệu chứng như bại

huyết và viêm não ở lợn cai sữa (Windsor và Elliott, 1975) [61] Trong khi

đó, ở các nước Bắc Mỹ, các báo cáo đều chỉ ra rằng S suis là vi khuẩn chủ

yếu phân lập được từ những lợn bị viêm phổi (Koehne và cs 1979 [46], Sanford và Tilker 1982 [54], Erickson và cs 1984 [31])

Bệnh do vi khuẩn S suis gây ra ở lợn mọi lứa tuổi, nhưng thường gặp

nhất ở giai đoạn 3 - 16 tuần tuổi do lợn thời kỳ sau cai sữa trở nên đặc biệt

mẫn cảm với vi khuẩn này (Lamont và cs 1980) [47] Vi khuẩn S suis là

nguyên nhân gây ra các thể bệnh như viêm phế quản - phổi, viêm màng phổi

và viêm phổi ở các lứa tuổi của lợn (Sanford và Tilker, 1982 [54], Erickson

và cs 1984 [31])

Các chủng S suis thuộc các serotype khác (không phải type 2) cũng đã

phân lập được từ lợn bị viêm phổi - màng phổi tại Đan Mạch (Perch và cs

1983 [49]), Hà Lan (Vecht và cs 1985 [59]), Bỉ (Hommez và cs 1986 [42]), Phần Lan (Sihvonen và cs 1988 [57]), Australia (Gogolewski và cs 1990 [33]), Canada (Higgins và cs 1990 [38], Gottschalk và cs 1991a [34], 1991b [35] và Mỹ (Reams và cs 1994 [50])

Ngoài ra, vi khuẩn còn có thể phân lập được trong các trường hợp lợn bị

viêm teo mũi và sảy thai Các chủng thuộc S suis type 2 thường gây ra bệnh

cho lợn giai đoạn sau cai sữa và vỗ béo (4-16 tuần tuổi) với rất nhiều thể bệnh như viêm não, viêm nội tâm mạc, ngoại tâm mạc, cơ tim hoại tử, viêm phổi, viêm khớp và bại huyết (St John và cs 1982 [58], Vetcht và cs 1985 [59], Sanford, 1987a [55], 1987b [56] và Gogolewski và cs 1990 [33]) Bệnh thường xảy ra sau khi lợn khoẻ được nuôi hoặc nhốt chung với lợn bệnh và thường gây chết đột ngột với các triệu chứng như sốt, thần kinh và viêm

khớp Tại Hà Lan, tỷ lệ S suis type 2 có liên quan đến viêm phổi chiếm 42%

các trường hợp mắc bệnh, tiếp đến là viêm não (18%), viêm nội tâm mạc (18%), và viêm đa thanh mạc (10%) (Vecht và cs 1985 [59]) Kataoka và cs

(1993) [45] nghiên cứu ở Nhật Bản đã cho biết kết quả là 38% số chủng S

suis phân lập được từ lợn bị viêm não và 33% từ lợn bị viêm phổi

Các triệu chứng của bệnh do vi khuẩn này gây ra ở lợn có sự sai khác nhau giữa các quốc gia (Higgins và Gottschalk, 2002) [40] và rất đa dạng, bao gồm như viêm não, nhiễm trùng máu, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, viêm đa thanh mạc, viêm màng bụng, viêm phổi, và thường dẫn đến chết đột ngột (Higgins và Gottschalk, 2002 [40]; Wang và cs 2007 [60])

Những nghiên cứu về dịch tễ học cho thấy S suis type 2 có thể lây từ

đàn này sang đàn khác do sự di chuyển của một số cá thể nào đó trong đàn Ngay trong cùng một đàn, sự lây lan chủ yếu là do tiếp xúc giữa các cá thể với nhau hoặc với chất thải nhiễm vi khuẩn Ngoài ra, các vật chủ trung gian

cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền lây S suis Enright và cs (1987) [30] đã chứng minh được rằng ruồi có thể mang S suis type 2 trong

vòng ít nhất là 5 ngày và có thể gây nhiễm thức ăn và nguyên liệu mà chúng đậu vào trong vòng ít nhất là 4 ngày Bởi vậy, chính ruồi đóng vai trò quan trọng trong việc làm lây lan dịch bệnh giữa các cá thể trong cùng một đàn và

giữa các đàn Vai trò của các loài động vật khác, kể cả chim như là nguồn lây nhiễm vẫn còn đang được tiến hành nghiên cứu Chính con người cũng có thể

là nguồn mang trùng (Sala và cs 1989 [53])

Trong khi đó, vi khuẩn S suis type 1 thường gây bệnh cho lợn con đang

theo mẹ (1 - 3 tuần tuổi), có khi tới 6 tuần tuổi và thường ở thể bại huyết hoặc các nhiễm trùng tại chỗ như viêm màng não, viêm não, viêm khớp, viêm nội tâm mạc, đặc biệt là lợn con từ 1-7 ngày tuổi (Cook và cs 1988 [25])

Đôi khi, nhóm vi khuẩn thuộc type 2 cũng gây bệnh cho lứa tuổi này, nhưng thường ít gặp hơn Lợn con bị nhiễm bệnh là do lợn mẹ truyền qua đường hô hấp, đường tiêu hoá (do tiếp xúc với phân, các chất thải hoặc các chất tiết khác), đường máu (do tiếp xúc trực tiếp hoặc qua kim tiêm nhiễm trùng) Với một số cá thể, hiện tượng nhiễm khuẩn chỉ biểu hiện ở dạng nhiễm khuẩn qua máu và không bao giờ phát bệnh Tuy nhiên, với một số cá thể khác, vi khuẩn sẽ gây bệnh và biểu hiện bằng hiện tượng nhiễm trùng máu hoặc vi khuẩn di chuyển đến hệ thần kinh trung ương, gây viêm màng não và đây chính là biểu hiện bệnh lý quan trọng nhất Những năm sau đó, các nghiên cứu từ Anh lại kết luận rằng vi khuẩn này là nguyên nhân chính gây bại huyết, viêm não và viêm đa khớp, ít khi gây viêm phổi (MacLennan và cs

1996 [48], Heath và cs 1996 [37]); trong khi đó, các bệnh tích ở phổi vẫn là chủ yếu trong các trường hợp lợn bị bệnh tại Bắc Mỹ (Reams và cs 1994 [50], 1996 [51], Hogg và cs 1996 [41])

1.2.2 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Nội và Nguyễn Ngọc Nhiên (1993) [11] về vi khuẩn đường hô hấp của 162 lợn bị bệnh ho thở

truyền nhiễm cho thấy tỷ lệ nhiễm vi khuẩn S suis là 74% Tại báo cáo khoa học Viện Thú y 1998 về kết quả phân lập vi khuẩn S suis gây bệnh đường hô

hấp của lợn một số tỉnh phía Bắc tỷ lệ phân lập ở phổi, hạch phổi 72%, dịch

ngoáy mũi 43% (Cù Hữu Phú và cs 1998 [12]) Tuy nhiên, các tác giả mới chỉ dừng lại ở bước phân lập và giám định các đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn phân lập được, nhưng vẫn chưa xác định được chính xác serotype của chúng nên thông tin về mức độ lưu hành của các serotype thông thường gây bệnh cho lợn tại Việt Nam là chưa được biết đến một cách

rõ ràng

Từ các kết quả nghiên cứu về bệnh cầu khuẩn ở lợn, Khương Thị Bích Ngọc (1996) [5] đã chế tạo vắc xin cầu khuẩn chết có bổ trợ keo phèn tiêm phòng cho lợn nái, đạt hiệu quả bảo hộ cao Cù Hữu Phú (1998) [12] đã phân

lập được vi khuẩn S suis từ bệnh phẩm của lợn ốm chết nghi do vi khuẩn S suis

gây ra ở cả 2 phương thức chăn nuôi là rất cao, trong đó chăn nuôi tập trung chiếm 93,9%, chăn nuôi hộ gia đình chiếm 95,3% Năm 2005, chính Trung

Quốc cũng đã kiểm soát dịch bệnh do S suis gây ra ở lợn bằng vắc xin vô hoạt chế từ các chủng S suis serotype 2 (Lê Văn Tạo, Đỗ Ngọc Thuý, 2006) [17]

Ở nước ta, trong những tháng gần đây, số bệnh nhân nhiễm liên cầu khuẩn lợn nhập viện Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương (số 78, Đường Giải Phóng, Đống Đa, Hà Nội) tăng đột biến Tính trong tháng 5/2012 có 14

ca mắc, đến ngày 18/8/2012 có 44 ca mắc liên cầu lợn Đặc biệt đã có một ca

tử vong do bị sốc nhiễm khuẩn quá nặng, gây suy đa phủ tạng Gần đây nhất ngày 22/5/2016 tại Phú Thọ đã có một trường hợp tử vong do nhiễm liên cầu lợn sau khi ăn tiết canh vào ngày 19/5/2016 Những người bị nhiễm bệnh đều

đã được xác nhận là có tiếp xúc trực tiếp với lợn bị bệnh hoặc tham gia giết

mổ hoặc bán thịt lợn [62]

1.2 Một số loại vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn gây ra ở lợn

Hiện nay, các loại vắc xin được sử dụng để phòng bệnh do S suis gây ra

cho lợn chủ yếu là các vắc xin chuồng (autogenous vắc xin) và hiệu quả bảo

hộ của các loại vắc xin này cũng chưa được xác định một cách rõ ràng

(Higgins và cs 2002 [40]) Có thể liệt kê ra một số nguyên nhân của hiện tượng này như: sự thoái hoá của kháng nguyên bảo hộ hoặc vi khuẩn bị mất tính kháng nguyên do quá trình xử lý bằng nhiệt hoặc formalin, do tính miễn dịch yếu của giáp mô của vi khuẩn, do sự sản sinh kháng thể đối với các kháng nguyên mà không có liên quan đến độc lực của vi khuẩn và sự thiếu hụt của các chủng hay serotype liên quan đến quá trình sinh bệnh học (Higgins và cs 2002 [40])

Các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu và đưa vào chế tạo thử nghiệm nhiều loại vắc xin khác nhau như: vắc xin toàn khuẩn, vắc xin sống nhược độc, vắc xin tiểu phần (chế từ kháng nguyên giáp mô hoặc các protein thành tế bào, protein là các yếu tố độc lực), .Tuy nhiên, miễn dịch bảo

hộ ở chuột hoặc lợn thí nghiệm được tiêm các loại vắc xin này cũng rất thất thường và không ổn định

Ở Việt Nam, Nguyễn Văn Phan và Hoàng Tuấn Lộc (1962 – 1963) dùng vắc xin nhược độc để phòng bệnh thối loét da thịt truyền nhiễm ở lợn, kết quả thu được rất tốt và ổn định Nguyễn Thị Nội (1989) đã chế tạo vắc xin Salsco

đa giá, vô hoạt, bổ trợ keo phèn, bao gồm các chủng vi khuẩn đường ruột

là Salmonella, E coli và Streptococcus, tiêm cho lợn con lúc 21 ngày tuổi để

phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con Kết quả thu được rất khả quan, tỷ lệ bảo hộ được 70 – 80% Vắc xin đã được áp dụng rộng rãi và thường xuyên cho các

cơ sở chăn nuôi Khương Bích Ngọc (1996) qua nghiên cứu bệnh cầu khuẩn ở lợn đã chế tạo vắc xin cầu khuẩn chết có bổ trợ keo phèn tiêm phòng cho lợn nái, đạt tỷ lệ bảo hộ cao

Vào năm 2005 tại Trung Quốc dịch bệnh do liên cầu khuẩn xảy ra và các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu cơ bản trong phòng thí nghiệm và đã chế tạo ra một loại vắc xin vô hoạt với kháng nguyên là các chủng vi khuẩn được phân lập tại ổ dịch để tiêm phòng cho toàn bộ lợn trong vùng Các ghi nhận cho thấy kết quả bước đầu là rất khả quan, bệnh đã tạm dừng, không thấy lợn nhiễm bệnh và chết (Lê Văn Tạo và cs 2005 [16])

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian, địa điểm nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu

- Lợn nghi mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp tại Thái Nguyên

- Vi khuẩn S suis gây bệnh viêm khớp, viêm phổi ở lợn phân lập được

- Các chủng vi khuẩn được lựa chọn có đủ tiêu chuẩn để chế tạo auto vắc xin

* Thời gian nghiên cứu: 7/2016 – 7/2017

* Địa điểm nghiên cứu:

- Đề tài được thực hiện ở một số địa điểm tại tỉnh Thái Nguyên

- Địa điểm xét nghiệm mẫu: + Trung tâm chẩn đoán Thú y, Cục Thú y + Trung tâm Nghiên cứu và bảo tồn giống vắc xin – Công ty Cổ phần thuốc Thú y Marphavet

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Điều tra tình hình lợn mắc viêm phổi, viêm khớp tại các địa điểm nghiên cứu

- Điều tra tỷ lệ lợn mắc viêm phổi, viêm khớp tại các địa điểm nghiên cứu

- Điều tra tỷ lệ lợn mắc và chết do viêm phổi, viêm khớp theo lứa tuổi

2.2.2 Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn Streptococcus suis gây bệnh viêm phổi, viêm khớp ở lợn

- Phân lập xác định một số đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được

- Xác định serotype, yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được

- Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn S suis phân lập được

2.2.3 Ứng dụng chế tạo Auto vắc xin phòng bệnh viêm phổi, viêm khớp và thử nghiệm trong phòng thí nghiệm

2.2.4 Đánh giá hiệu lực của Auto vắc xin phòng bệnh viêm phổi, viêm khớp trên thực tế diện hẹp

- Xác định hàm lượng kháng thể của lợn được tiêm vắc xin sau 1,2,

- Các chủng vi khuẩn S suis phân lập được

- Auto vắc xin chế tạo từ các chủng vi khuẩn S suis phân lập được

* Mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm được lấy bao gồm máu tim, dịch khớp, dịch não tủy, phổi của các con lợn ốm hoặc chết có triệu chứng, bệnh tích nghi mắc bệnh viêm phổi, viêm khớp

* Động vật dùng trong nghiên cứu:

- Lợn từ 14 ngày tuổi trở lên, khỏe mạnh, đủ điều kiện thí nghiệm, chưa được tiêm vắc xin phòng viêm phổi, viêm khớp chế từ vi khuẩn S suis

- Chuột bạch khoẻ mạnh đủ điều kiện thí nghiệm, có trọng lượng trung bình từ 18 - 20g/con

* Dụng cụ, thiết bị và hóa chất:

- Các loại môi trường dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn do hãng Oxoid (Anh) và Merck (Pháp) sản xuất: môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate,

- Các loại môi trường, hóa chất dùng để giám định, xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: môi trường đường các loại, dung dịch Kovac’s, dung dịch H2O2 3%, giấy thử Oxidase, nước muối 6,5%,

- Kính hiển vi quang học, kính lúp, cân điện tử

- Tủ bảo quản (tủ ấm, tủ lạnh), ống nghiệm, kim tiêm, máy li tâm

- Lọ đựng hoá chất, lamen, lam kính, đĩa petri, chậu thủy tinh, cốc thủy tinh, ống đong

- Các hoá chất và dụng cụ phòng thí nghiệm khác dùng trong nghiên

cứu vi khuẩn

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ

* Chọn mẫu điều tra

- Chọn mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên, mẫu chùm nhiều bậc: số bậc trong mẫu chùm, phụ thuộc vào số bậc đơn vị mẫu trung gian

- Trực tiếp quan sát để phát hiện lợn mắc bệnh viêm khớp, viêm phổi Những lợn có triệu chứng điển hình mắc bệnh viêm khớp, viêm phổi được mổ khám mà chưa sử dụng thuốc kháng sinh điều trị đều được sử dụng lấy mẫu

để phân lập vi khuẩn gây bệnh

Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive

study), dịch tễ học phân tích (Analytic study) và dịch tễ học thực nghiệm (Nguyễn Như Thanh, 2001 [20])

* Các tỷ lệ đo lường trong dịch tễ

Tỷ lệ lợn mắc bệnh viêm phổi (%) = Số con mắc bệnh x 100

Tổng số con theo dõi

Tỷ lệ lợn mắc viêm phổi theo độ tuổi (%) =

Số con mắc viêm phổi theo độ tuổi

x100 Tổng số con theo độ

tuổi được theo dõi

Tỷ lệ chết do viêm phổi (%) = Số con chết do viêm phổi x 100

Tổng số con mắc viêm phổi

Tỷ lệ lợn mắc bệnh viêm khớp (%) = Số con mắc bệnh x 100

Tổng số con theo dõi

Tỷ lệ lợn mắc viêm khớp theo độ tuổi (%) =

Số con mắc viêm khớp theo độ tuổi

x100 Tổng số con theo độ

tuổi được theo dõi

Tỷ lệ chết do viêm khớp (%) = Số con chết do viêm khớp x 100

2.4.1.2 Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn

Quy trình nuôi cấy, phân lập, tuyển chọn và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy trong phòng thí nghiệm của

Bộ môn Vi trùng, Trung tâm Chẩn đoán Thú Y Trung ương, Hà Nội

* Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hoá và khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn phân lập được

Xác định một số đặc tính sinh học của S suis được thực hiện theo các

quy trình thường qui trong phòng thí nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y, Hà Nội

- Thử phản ứng Oxydase

- Thử phản ứng Catalase

- Thử phản ứng sinh Indol

- Thử phản ứng lên men đường

* Phương pháp thực hiện các phản ứng nhận biết cấp I đối với S Suis

Xác định các phản ứng nhận biết cấp I đối với S suis được thực hiện

theo các quy trình thường qui trong phòng thí nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán thú y trung ương, Cục Thú y, Hà Nội

- Kiểm tra khả năng dung huyết

- Phản ứng với KOH

- Phản ứng Catalase

- Kiểm tra khả năng phát triển trong môi trường NaCl 6.5%

* Phương pháp thực hiện hệ thống API 20 Strep đối với S suis

Sau khi thực hiện phản ứng nhận biết cấp I, chỉ các chủng vi khuẩn được

kết luận là S suis mới được tiến hành các phản ứng với hệ thống định danh

API 20 Strep Việc thực hiện hệ thống API 20 Strep với các chủng vi khuẩn

đã được xác định là S suis nhằm các mục đích: định danh và giám định vi khuẩn S suis; nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hoá học của chúng

Cách tiến hành như sau: mỗi chủng vi khuẩn cần kiểm tra được cấy thành một lớp dày đặc trên mặt đĩa thạch máu Columbia, nuôi cấy ở 37 0C/24

giờ (5% CO2) Dùng tăm bông vô trùng thu hoạch vi khuẩn từ đĩa thạch, rồi hòa tan vào 2 ml nước cất vô trùng để đạt được độ đục tương đương với ống

số 4 của dãy so độ đục chuẩn McFarland Trong khay nhựa đã có chứa các l huyễn dịch này vào mỗi lỗ đối với loại thuốc thử, tiến hành nhỏ khoảng 100 các phản ứng từ VP đến ADH Phần huyễn dịch còn lại được trộn đều với 1 ampule môi trường API GP có sẵn trong bộ kit thử và nhỏ vào các lỗ còn lại,

từ ADH đến GLYG Toàn bộ khay nhựa có chứa các phản ứng được đặt vào một giá nhựa có chứa khoảng 5 ml nước cất bên dưới để làm ẩm Ủ ở tủ ấm

37 0C Sau 4 giờ, tiến hành nhỏ các thuốc thử thích hợp: VP 1 và VP 2 đối với phản ứng VP, NIN đối với phản ứng HIP, ZYM A và ZYM B đối với các phản ứng PYRA, βGUR, αGAL, αGAL, PAL và LAP, rồi tiến hành đọc kết quả sau 10 phút Đối với một số phản ứng, nếu kết quả chưa rõ ràng thì có thể đọc lại sau 24 giờ

Cách đọc kết quả: các phản ứng được đánh giá là dương tính hay âm tính dựa vào một bảng so màu sẵn được cung cấp bởi nhà sản xuất, được tính điểm và mã hóa bằng các chữ số Kết quả của mỗi chủng vi khuẩn, cuối cùng

sẽ được hiển thị bằng một dãy số gồm 7 chữ số Tiến hành tra bảng nhận biết

để có thể kết luận là chủng vi khuẩn kiểm tra thuộc loại vi khuẩn nào

* Phương pháp xác định serotype của vi khuẩn S suis bằng kỹ thuật PCR

Các serotype 1, 2, 7 và 9 của vi khuẩn S suis thường gặp gây bệnh

nhiều nhất ở lợn được xác định bằng phản ứng Multiplex PCR Các cặp mồi

dùng để xác định các serotype 1, 2, 7 và 9 của S suis được lựa chọn dựa vào

chuỗi gen mã hoá quá trình sinh tổng hợp thành phần polysaccharide của giáp

mô (cps), gồm 4 cặp mồi: cps 1J-F và cps 1J-R để xác định serotype 1, cps

2J-F và cps 2JR để xác định serotype 2, cps 7H-2J-F và cps 7H-R để xác định serotype 7, cps 9HF và cps 9H-R để xác định serotype 9 Trình tự các cặp mồi

và các sản phẩm tương ứng của chúng được trình bày ở bảng

cps1J- R

5'-TGG CTC TGT AGA TGA TTC TGC T -3' 5'-TGA TAC GTC AAA ATC CTC ACC A-3'

637

cps2J- R

5'-TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG-3' 5'-TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC -3'

Nước khử ion vừa đủ để đạt được thể tích cuối cùng cho một phản ứng là 25µl cho một phản ứng