Nghiên cứu thu nhận Phlorotannin từ rong mơ (Sargassum) tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa (Luận án tiến sĩ)

Nghiên cứu thu nhận Phlorotannin từ rong mơ (Sargassum) tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận Phlorotannin từ rong mơ (Sargassum) tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận Phlorotannin từ rong mơ (Sargassum) tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận Phlorotannin từ rong mơ (Sargassum) tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận Phlorotannin từ rong mơ (Sargassum) tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận Phlorotannin từ rong mơ (Sargassum) tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận Phlorotannin từ rong mơ (Sargassum) tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận Phlorotannin từ rong mơ (Sargassum) tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa (Luận án tiến sĩ)

i

i

MỤC LỤC

TRANG MỤC LỤC I DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC CÁC BẢNG IV DANH MỤC CÁC HÌNH V

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 4

1.1 RONG NÂU 4

1.2 GIỚI THIỆU VỀ PHLOROTANNIN 6

1.3 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ TINH CHẾ PHLOROTANNIN 12

1.4 CƠ CHẾ CHỐNG OXY HÓA CỦA PHLOROTANNIN 21

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ PHLOROTANNIN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 22 1.6 ỨNG DỤNG SẤY PHUN TẠO BỘT CHỨA HOẠT CHẤT CHỐNG OXY HÓA 26

1.7 KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PHLOROTANNIN TRONG ĐỒ UỐNG 27

1.8 GIỚI THIỆU MỘT SỐ QUY TRÌNH SẢN XUẤT ĐỒ UỐNG 29

1.9 GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT THANH TRÙNG 32

CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 ĐỐI TƯỢNG 34

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.2.1 Phương pháp phân tích 34

2.2.2 Phương pháp tinh chế 36

2.2.3 Phương pháp đánh giá cảm quan 37

2.2.4 Phương pháp định lượng vi sinh vật 38

2.2.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 38

2.3 HÓA CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG 54

ii

ii

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 55

CHƯƠNG III - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 56

3.1 NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHLOROTANNIN TỪ RONG MƠ S SERRATUM 56

3.1.1 Xác định dung môi chiết rút phlorotannin 56

3.1.2 Xác định nồng độ dung dịch ethanol sử dụng chiết rút phlorotannin 60

3.1.3 Xác định tỷ lệ dung dịch chiết so với nguyên liệu rong 63

3.1.4 Xác định nhiệt độ chiết 66

3.1.5 Xác định thời gian chiết 69

3.1.6 Xác định pH dung dịch chiết 72

3.2 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT PHLOROTANNIN THEO PHƯƠNG PHÁP BOX-BEHNKEN 76

3.3 NGHIÊN CỨU CÔ ĐẶC DỊCH CHIẾT PHLOROTANNIN TỪ RONG MƠ S SERRATUM 82

3.4 NGHIÊN CỨU TINH CHẾ PHLOROTANNIN BẰNG KỸ THUẬT TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ SẮC KÝ LỌC GEL SEPHADEX LH 20 84

3.5 THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PHLOROTANIN TỪ RONG MƠ S SERRATUM BẰNG KỸ THUẬT SẤY PHUN 95

3.6 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CHẾ PHẨM PHLOROTANNIN 116

3.7 THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG PHLOROTANNIN TRONG SẢN XUẤT ĐỒ UỐNG 117

3.8 SẢN XUẤT THỬ VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM ĐỒ UỐNG PHLOROTANNIN THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN 135

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 143

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 145

TÀI LIỆU THAM KHẢO 147

PHỤ LỤC 1

: tốc độ tăng trưởng hàng năm : dung môi : nguyên liệu

: 2,4-dimethoxybenzaldehyde : hoạt tính bắt gốc tự do

: khối lượng khô

: ethyl acetate : ethanol : phương pháp sử dụng áp lực thủy tĩnh cao : sắc ký lỏng cao áp

: Hiệp hội Thông tin thực phẩm quốc tế : nấm men - nấm mốc

: polyvinylpolypyrolidone : hàm lượng phlorotannin

: hoạt tính khử sắt

: chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction)

: carbon dioxide siêu tới hạn

: hoạt tính chống oxy hóa tổng

: tiêu chuẩn Việt Nam : thực phẩm chức năng : tia cực tím (UVC: bước sóng < 280 nm; UVB: 315-280 nm) : vi sinh vật

iv

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Danh mục các loài rong thu mẫu tại Vịnh Nha Trang 4

Bảng 1.2 Bảng tính chất của một số dung môi phổ biến 13

Bảng 1.3 Hoạt tính bắt gốc tự do ở một số loài rong trên thế giới 23

Bảng 1.4 Hoạt tính chống oxh hóa của một số loài rong Sargassum 23

Bảng 1.5 Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết và phân đoạn từ loài 25

Bảng 2.1 Hệ số quan trọng của các chỉ tiêu 37

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 45 Bảng 3.1 Thiết kế thí nghiệm biến mã theo mô hình Box-behnken và kết quả 76

Bảng 3.2 Thí nghiệm lặp lại ở điểm tối ưu và kết quả 76

Bảng 3.3 Sự thay đổi một số chỉ tiêu của dịch chiết phlorotannin trước và sau khi cô đặc 82 Bảng 3.4 Tóm tắt quá trình tinh sạch phlorotannin 85

Bảng 3.5 Khối lượng chuột bạch thí nghiệm sau 7 ngày nuôi ở các chế độ khác nhau.………… 116

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ xanthan gum - carrageenan đến CQTB của sản phẩm 122

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đồng hóa đến độ màu sản phẩm 127

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của điều kiện thanh trùng đến kết quả kiểm tra vi sinh ở đồ uống 129

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thời gian thanh trùng đến độ màu sản phẩm 130

Bảng 3.10 Kết quả kiểm nghiệm cảm quan sản phẩm nước giải khát phlorotannin 135

Bảng 3.11 Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của đồ uống 135

Bảng 3.12 Kết quả phân tích vi sinh và kim loại nặng trong đồ uống theo thời gian và điều kiện bảo quản 137

Bảng 3.13 Kết quả phân tích hàm lượng phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa trong đồ uống theo thời gian và điều kiện bảo quản 138

Bảng 3.14 Kết quả phân tích độ màu đồ uống theo thời gian và điều kiện bảo quản 139 Bảng 3.15 Chi phí nguyên vật liệu cho sản phẩm nước giải khát phlorotannin 141

v

v

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Một số cấu trúc của phlorotannin 9

Hình 1.2 Tái tổ hợp nhóm acetate 10

Hình 1.3 Sự tạo vòng của chuỗi triketide để hình thành phloroglucinol 11

Hình 1.4 Mô hình phlorotannin liên kết cộng hóa trị với acid alginic của màng tế bào tảo nâu 11

Hình 1.5 Một số sản phẩm giàu phlorotannin trên thị trường thế giới 28

Hình 1.6 Quy trình chung sản xuất nước giải khát có gaz 29

Hình 1.7 Sơ đồ quy trình sản xuất nước ép quả không chứa gaz 31

Hình 1.8 Sơ đồ quy trình sản xuất nước giải khát pha chế lên men 32

Hình 2.1 Vị trí nghiên cứu mùa vụ sinh trưởng của rong mơ S serratum tại Nha Trang 31

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 39

Hình 2.5 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi và phương pháp chiết đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 41

Hình 2.6 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 41

Hình 2.7 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ DM:NL đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 42

Hình 2.8 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 42

Hình 2.9 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 43

Hình 2 10 Khảo sát ảnh hưởng của pH dung môi đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 43

Hình 2.11 Khảo sát ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng chiết phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 44

Hình 2.12 Bố trí thí nghiệm nhiệt độ cô đặc dịch chiết chứa phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa 45

vi

vi

Hình 2.13 Bố trí thí nghiệm xác định chất trợ sấy 46

Hình 2.14 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ chất trợ sấy 47

Hình 2.15 Bố trí thí nghiệm xác định áp suất bơm 47

Hình 2.16 Bố trí thí nghiệm xác định tốc độ bơm 48

Hình 2.17 Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ đầu vào 48

Hình 2.18 Sơ đồ quy trình dự kiến sản xuất nước giải khát phlorotannin 49

Hình 2.19 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ đường phối trộn 50

Hình 2.20 Bố trí thí nghiệm xác định ngưỡng cảm vị đường bổ sung 50

Hình 2.21 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ acid ascorbic và acid citric kết hợp được ưa thích 51

Hình 2.22 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ xanthan gum bổ sung 51

Hình 2.23 Bố trí thí nghiệm ngưỡng cảm quan xanthan gum bổ sung 52

Hình 2.24 Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ carrageenan và xanthan gum kết hợp được ưa thích 52

Hình 2.25 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng phlorotannin 53

Hình 2.26 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ và thời gian đồng hóa thích hợp 53

Hình 2.27 Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thanh trùng thích hợp 54

Hình 3.1 Ảnh hưởng của dung môi và phương pháp chiết đến hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa của chất chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 56

Hình 3.2 Ảnh hưởng của dung môi và phương pháp chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của chất chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 57

Hình 3.3 Ảnh hưởng của dung môi và phương pháp chiết đến hoạt tính khử sắt của chất chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 57

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng phlorotannin chiết từ rong mơ S serratum 60

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hoạt tính oxy hóa tổng của dịch chiết từ rong mơ S serratum 60

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết từ rong mơ S serratum 61

vii

vii

Hình 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng phlorotannin

của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 63

Hình 3.8 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 63

Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 64

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng phlorotannin của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 66

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết phlorotannin thu nhận từ rong mơ S serratum 66

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết phlorotannin thu nhận từ rong mơ S serratum 67

Hình 3.13 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng phlorotannin thu nhận từ rong mơ S serratum 69

Hình 3.14 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 69

Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 70

Hình 3.16 Ảnh hưởng pH dung môi chiết đến hàm lượng phlorotannin thu nhận từ rong mơ S serratum 73

Hình 3.17 Ảnh hưởng pH dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 73

Hình 3.18 Ảnh hưởng pH dung môi chiết đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết thu nhận từ rong mơ S serratum 73

Hình 3.19 Mô hình minh họa 3D 77

Hình 3.20 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng phlorotannin của dịch chiết 80

Hình 3.21 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết 80

Hình 3.22 Ảnh hưởng của số lần chiết đến hoạt tính khử sắt của dịch chiết 80

viii

viii

Hình 3.23 Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn

dịch cô đặc bằng các dung môi khác nhau 85

Hình 3.24 Sắc ký đồ dịch phlorotannin từ rong mơ S serratum cô đặc qua cột lọc gel Sephadex LH 20, cột 2x25cm, 10ml/phân đoạn 85

Hình 3.25 Dịch chiết ethanol trên sắc ký bản mỏng trước khi phun thuốc thử 88

Hình 3.26 Dịch chiết ethanol trên sắc ký bản mỏng sau khi phun thuốc thử 88

Hình 3.27 Phân đoạn ethyl acetate trên sắc ký bản mỏng sau khi phun thuốc thử 88

Hình 3.28 LC/MS của dịch chiết 89

Hình 3.29 LC/MS của phân đoạn n-hexan 89

Hình 3.30 LC/MS của phân đoạn chloroform 89

Hình 3.31 LC/MS của phân đoạn 89

Hình 3.32 LC/MS của phân đoạn 89

Hình 3.33 LC/MS của phân đoạn nước còn lại sau cùng 90

Hình 3.34 Sơ đồ quy trình tinh chế phlorotannin từ rong mơ S serratum 93

Hình 3.35 Ảnh hưởng của chất trợ sấy đến hàm lượng phlorotannin có trong chế phẩm sau sấy 95

Hình 3.36 Ảnh hưởng của chất trợ sấy đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của chế phẩm sau sấy 96

Hình 3.37 Ảnh hưởng của chất trợ sấy đến hoạt tính khử sắt của chế phẩm sau sấy 96

Hình 3.38 Ảnh hưởng của tỷ lệ maltodextrin bổ sung đến hàm lượng phlorotannin của chế phẩm bột phlorotannin sau sấy 99

Hình 3.39 Ảnh hưởng của tỷ lệ maltodextrin bổ sung đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của chế phẩm bột phlorotannin sau sấy 100

Hình 3.40 Ảnh hưởng của tỷ lệ maltodextrin bổ sung đến hoạt tính khử sắt của chế phẩm bột phlorotannin sau sấy 100

Hình 3.41 Ảnh hưởng của tỷ lệ maltodextrin bổ sung đến hoạt tính khử sắt của chế phẩm bột phlorotannin sau sấy 100

Hình 3.42 Ảnh hưởng của áp suất bơm đến hàm lượng phlorotannin của chế phẩm phlorotannin sau sấy 104

ix

ix

Hình 3.43 Ảnh hưởng của áp suất bơm đến hàm lượng phlorotannin của chế phẩm phlorotannin sau sấy 104 Hình 3.44 Ảnh hưởng của áp suất bơm đến hoạt tính khử sắt của chế phẩm phlorotannin sau sấy 105 Hình 3.45 Ảnh hưởng của áp suất bơm đến hoạt tính bắt gốc tự do của chế phẩm phlorotannin sau sấy 105 Hình 3.46 Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu tới hàm lượng phlorotannin của chế phẩm phlorotannin sau sấy phun 107 Hình 3.47 Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu tới hoạt tính chống oxy hóa của chế phẩm phlorotannin sau sấy phun 108 Hình 3.48 Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu tới hoạt tính khử sắt của chế phẩm phlorotannin sau sấy phun 108 Hình 3.49 Ảnh hưởng của tốc độ bơm nhập liệu tới hoạt tính bắt gốc tự do của phlorotannin trong chế phẩm sau sấy phun 108 Hình 3.50 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến hàm lượng phlorotannin của bột chế phẩm phlorotannin thu được sau sấy phun 111 Hình 3.51 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của bột chế phẩm phlorotannin thu được sau sấy phun 111 Hình 3.52 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến hoạt tính khử sắt của bột chế phẩm phlorotannin thu được sau sấy phun 111 Hình 3.53 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào đến hoạt tính bắt gốc tự do của bột chế phẩm phlorotannin thu được sau sấy phun 112

Hình 3.54 Quy trình sấy phun thu nhận bột phlorotannin từ dịch chiết rong mơ S serratum 115

Hình 3.55 Ảnh hưởng của tỷ lệ acid citric đến tổng điểm cảm quan chung 118 Hình 3.56 Ảnh hưởng của tỷ lệ đường bổ sung đến tổng điểm cảm quan chung của sản phẩm 119 Hình 3.57 Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp acid citric - acid ascorbic bổ sung đến tổng điểm cảm quan chung của sản phẩm 120

x

x

Hình 3.59 Ảnh hưởng của tỷ lệ phlorotannin bổ sung đến chất lượng cảm quan của

sản phẩm đồ uống 124

Hình 3.60 Ảnh hưởng của hàm lượng phlorotannin bổ sung đến hoạt tính chống

oxy hóa của sản phẩm đồ uống 124

Hình 3.61 Ảnh hưởng của thời gian đồng hóa đến tổng điểm cảm quan chung của sản phẩm 126

Hình 3.62 Ảnh hưởng của nhiệt độ đồng hóa đến tổng điểm cảm quan chung của sản phẩm 126

Hình 3.63 Ảnh hưởng của thời gian đồng hóa đến hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm 127

Hình 3.64 Ảnh hưởng của nhiệt độ đồng hóa đến hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm 128

Hình 3.65 Ảnh hưởng của thời gian thanh trùng đến tổng điểm cảm quan chung của

1

MỞ ĐẦU

Rong nâu (Phaeophyta) là loại rong giàu các chất có hoạt tính sinh học như

lamilaran, fucoidan, alginate, phlorotannin, … Các chất này có nhiều hoạt tính sinh học, trong đó đáng chú ý là hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm…

Ngành rong nâu (Phaeophyta) có nhiều họ như: Alariaceae, Fucaceae và

Sargassaceae Ở Việt Nam, chi rong mơ (Sargassum) thuộc họ rong mơ

(Sargassaceae) được biết là chi rong có sản lượng lớn và có giá trị cao, do chi rong

này có chứa nhiều hoạt chất sinh học có giá trị như fucoidan, laminaran, alginate, phlorotannin,… Trong đó đáng chú ý là phlorotannin - một hợp chất chuyển hóa thứ cấp kiểu hỗn hợp phenolic Phlorotannin có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như: hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, chống khối u, ngừa ung thư,… Hoạt tính chống oxy hóa của phlorotannin là một trong những hoạt tính được nghiên cứu nhiều nhất và phlorotannin được biết đến là chất chống oxy hóa không độc tính và an toàn với con người cũng như có khả năng ngăn ngừa bệnh tim mạch Ngày nay do sự phát triển của xã hội, con người ngày càng phải đối mặt với nhiều mối nguy như ô nhiễm môi trường, stress,… làm phát sinh các gốc tự do trong cơ thể gây ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe Do vậy, con người có xu thế tìm kiếm, khai thác và sử dụng các chất tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa, có khả năng hỗ trợ cơ thể đào thải các gốc tự do giúp tăng cường sức khỏe Do vậy, phlorotannin từ rong mơ đã được các nhà nghiên cứu quan tâm

Vùng biển Nha Trang có nguồn lợi rong mơ Sargassum phong phú và đa dạng

về số lượng, chủng loại Mặt khác, rong mơ ở vùng biển Nha Trang được cho rằng

có chứa các hoạt chất sinh học như fucoidan, phlorotannin, alginate,… với hàm

lượng cao Do vậy việc nghiên cứu “Nghiên cứu thu nhận phlorotannin từ rong

mơ Sargassum serratum tại Nha Trang và thử nghiệm sử dụng trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa” là cần thiết

Mục tiêu của Luận án:

- Nghiên cứu thu nhận phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ

2

(Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa

- Thử nghiệm sử dụng phlorotannin trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa

Nội dung của Luận án:

1) Nghiên cứu tách chiết và tối ưu hóa quá trình thu nhận phlorotannin từ rong mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa 2) Bước đầu phân đoạn và tinh sạch phlorotannin thu nhận từ rong mơ (S serratum) 3) Nghiên cứu sấy phun để thu nhận bột phlorotannin từ dịch chiết rong mơ S serratum 4) Đánh giá độc tính của phlorotannin thu từ rong mơ S serratum

5) Thử nghiệm sử dụng phlorotannin trong đồ uống có hoạt tính chống oxy hóa

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của luận án

Ý nghĩa khoa học

Lần đầu tiên nghiên cứu một cách toàn diện về phlorotannin của rong mơ

(Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa từ nghiên cứu

tối ưu hóa quá trình tách chiết đến tinh sạch, thử nghiệm độc tính trên chuột, nghiên cứu sấy phun để tạo bột chế phẩm phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa cao và thử nghiệm sản xuất đồ uống phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa Do vậy, kết quả nghiên cứu của Luận án có ý nghĩa khoa học cao Kết quả này góp phần khẳng định giá trị của nguồn lợi rong biển Việt Nam Mặt khác, kết quả của luận án còn là tài liệu tham khảo phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy trong lĩnh vực nghiên cứu

các chất tự nhiên từ rong biển

Ý nghĩa thực tiễn của luận án

Kết quả nghiên cứu của luận án là cơ sở để các doanh nghiệp sản xuất thực phẩm phát triển thương mại hóa một số sản phẩm từ phlorotannin thu nhận từ rong

mơ (Sargassum serratum) thu hoạch ở vùng biển Nha Trang

Tính mới của luận án

- Luận án lần đầu tiên nghiên cứu thu nhận và đánh giá được hàm lượng

phlorotannin với hoạt tính chống oxy hóa từ rong mơ (Sargassum serratum) thu

3

hoạch ở vùng biển Nha Trang

- Luận án lần đầu phân đoạn và tinh sạch đƣợc phlorotannin từ rong mơ

(Sargassum serratum) với độ tinh sach lên tới 92%

- Luận án lần đầu áp dụng kỹ sấy phun và sử dụng các chất mang trong sấy

phun để sản xuất bột chế phẩm phlorotannin từ rong mơ (Sargassum serratum) cũng nhƣ sử dụng chế phẩm phlorotannin thu đƣợc trong sản xuất đồ uống chống

oxy hóa

4

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 RONG NÂU

Hiện nay, trên thế giới rong nâu đã xác định được khoảng 6.000 loài, chia làm

03 ngành rong chính là rong lục (Chlorophyta), rong nâu (Phaeophyta) và rong đỏ

(Rhodophyta) [64] Trong các loại rong kể trên thì rong nâu là một trong số các loài thực vật biển có thể tự tái tạo và là nguồn tài nguyên có thể cung cấp các chất có hoạt tính sinh học quý báu như fucoidan, laminaran, polyuromannan, alginate,… và các chất chuyển hóa thứ cấp như alkaloid, phlorotannin, acetogenin và terpene Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, có điều kiện tự nhiên thuận lợi cho rong biển phát triển Theo thống kê, nước ta có khoảng 794 loài rong biển, phân bố ở vùng biển phía Bắc 310 loài, miền Nam 484 loài và 156 loài tìm thấy ở cả hai miền [10] Trong đó, 24 loài đã được sử dụng cho sản xuất các chế phẩm công nghiệp,

18 loài dùng làm dược liệu, 30 loài làm thực phẩm, 10 loài làm thức ăn gia súc Các

đối tượng quan trọng là: rong Câu (Gracilaria), rong mơ (Sargassum), rong Đông (Hypnea), và rong Bún (Enteromorpha) Rong mơ Sargassum được phân loại:

Hiện tại ở vùng biển Nha Trang có 20 loài rong nâu Sargassum (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Danh mục các loài rong thu mẫu tại Vịnh Nha Trang [17]

Rong nâu Sargassum serratum được lựa chọn nghiên cứu có đặc điểm phân

loại và đặc điểm sinh học như sau:

Sargassum serratum N H Dai - Mơ gai

Loài rong này đã được công bố và định danh bởi Nguyễn Hữu Đại và Nguyễn Hữu Trí (2002) [13], Nguyễn Hữu Đại (2007) [14]

Rong mịn mọc thành bụi cao 40-80 cm trên một đĩa bám hình nón, nhỏ 5-6

mm nhưng rất chắc Trụ chính hình trụ, trơn, cao 2-4 mm, mang 3-7 nhánh chính Nhánh chính hình trụ 0,5-1 mm đường kính

Lá trên thân chính thường dài khoảng 0,7-1,5 mm, rộng 5-7mm Mép lá có nhiều răng cưa to, nhọn không đều, gân lá không rõ, huyệt rõ và nằm rải rác Lá trên các nhánh bên và nhánh chót chỉ dài 0,5-1 cm, rộng 1,5-3 mm, có hình mũi mác,

nhiều răng cưa nhọn

Phao rất nhiều, nhỏ hình xoan, kích thước 1-2 mm, thường mang 1 đến vài gai trên đầu hay cánh nhỏ (Hình 1.1)

6

Rong khác gốc Cây đực có đế đực

hình trụ, có u, phân nhánh, dài 0,5-2 cm

Cây cái có đế ngắn hơn 3-5 mm, hình trụ

dẹp, phân nhánh, có gai Rong khô có

màu nâu đậm

Sinh học và sinh thái: Rong mọc thành

quần thể dày, trên đá tảng và trên san hô

chết từ vùng triều thấp trở xuống, là loài

phân bố cao nhất trong các quần thể

rong mơ ở các bãi triều đáy cứng Rong

trưởng thành rất sớm từ tháng 3-4

Khoảng giữa tháng 8 đã thấy xuất hiện

1.2 GIỚI THIỆU VỀ PHLOROTANNIN

1.2.1 Đặc điểm cấu trúc phlorotannin

Phlorotannin được tìm thấy trong rong nâu có các đơn vị cơ bản là phloroglucinol (1,3,5-trihydroxybenzene) [172], [189] Kích thước phân tử của chúng dao động trong khoảng 126 Da - 650 kDa [174] Phlorotannin có khối lượng phân tử thấp, trung bình và cao đều chứa các đơn vị phenyl và phenoxy [74], [174] Theo Singh và cộng sự (2006) các phân tử phlorotannin chứa các đơn vị phloroglucinol với các kiểu liên kết khác nhau và phổ biến ở các loài sinh vật biển, nhất là trong rong nâu và rong đỏ [174] La Barre S và cộng sự (2010) cho rằng các kiểu liên kết đặc trưng xuất hiện trong cấu trúc của phlorotannin như: liên kết ether, liên kết phenyl, liên kết ether và liên kết phenyl, liên kết dibenzodioxin [104]

1.2.2 Phân loại

Dựa trên đặc điểm liên kết trong cấu trúc của phlorotannin, người ta chia phlorotannin thành 4 nhóm sau: fuhalol and phlorethol (phlorotannin với liên kết ether), fucol (với liên kết phenyl), fucophloroethol (với liên kết ether và liên kết phenyl) và eckol (với liên kết dibenzodioxin) [104]

7

* Phlorotannin với liên kết ether

Phlorotannin thuộc lớp này chủ yếu bao gồm fuhalol và phlorethol Ragan và Jamieson sử dụng phương pháp khối phổ để phân tích cấu trúc của phlorotannin và nhận thấy các đơn vị cơ bản của fuhalol và phlorethol được liên kết với nhau thông qua liên kết ether [146] Hiện các nhà khoa học đã thu nhận được một số hợp chất

fuhalol, phlorethol và hydroxyphlorethol từ rong nâu Carpophyllum spp (C mascalocarpum và C angustifolium) và Sargassum spp (S spinuligerum và S muticum) Triacetate của phloroglucinol được phát hiện ở rong nâu Himanthalia elongata [155]

Phlorotannin mạch thẳng như acetate của 2-hydroxyphloroglucinol, diphlorethol, bifuhalol, trifuhalol A, hydroxytetraphlorethol, hydroxypentaphlorethol và hydroxyhexaphlorethol Những hợp chất này đã được

tìm thấy từ loài C mascalocarpum Diphlorethol và trifuhalol tồn tại ở trong các loài Halidrys siliquosa và Laminaria ochroleuca Phlorotannin mạch thẳng như

hydroxytrifuhalol A, dihydroxytetraphlorethol A và dihydroxytetraphlorethol B có

nguồn gốc từ rong nâu Sargassum spinuligerum [155]

Phlorotannin mạch nhánh chẳng hạn như các dạng acetate của trifuhalol C, trifuhalol D, trifuhalol A, pentaphlorethol A, hexafuhalol A, deshydroxyheptafuhalol A, heptafuhalol A, octafuhalol A và nonafuhalol A, các

hợp chất này được tìm thấy từ C mascalocarpum; hydroxypentafuhalol B,

hydroxyheptafuhalol A, hydroxytrifuhalol B (596), deshydroxytetrafuhalol B (597), hydroxyheptafuhalol B (598), heptafuhalol B (599), hydroxypentafuhalol A (600), pentafuhalol B (601), deshydroxyfuhalol B (602), nonafuhalol B (603),

pentaphlorethol A (604) thu nhận từ loài S spinuligerum và trifuhalol B thu nhận từ loài S muticum chứa (615) [155]

Loài Carpophyllum mascalocarpum chứa các chất thuộc nhóm phlorethofuhalol như pentafuhalol A, phlorethopentafuhalol A,

phlorethopentafuhalol B và diphlorethopentafuhalol A Loài C angustifolium chứa

8

hỗn hợp trihydroxyphlorethol như trihydroxyheptaphlorethol A (620),

trihydroxyoctaphlorethol A (621) và trihydroxyoctaphlorethol B (622) [155]

Ngoài fuhalol và phlorethol, pseudofuhalol cũng là nhóm hợp chất được biết

Pseudofuhalol được tách chiết từ loài S spinuligerum, được mô tả như isomer của fuhalol với nhóm chức khác nhau Loài Bifurcaria bifurcata có chứa bifuhalol và pentafuhalol Những phân đoạn dịch chiết của loài Chorda filum đã acetyl hóa đều

chứa isofuhalol Triphlorethol và những chất tương tự đã được chlorin hóa đều được

xác định có nguồn gốc từ loài Laminaria ochroleuca [155]

* Phlorotannin với liên kết phenyl

Phlorotannin có liên kết phenyl chủ yếu là các chất thuộc nhóm fucol Các đơn vị phloroglucinol của fucol liên kết với nhau thông qua liên kết phenyl Loài

Himanthalia elongata và một số loài rong nâu có chứa difucol (656) Difucol được sulfat hóa là difucol-2-O-sulfate (657) và difucol-4,4-di-O-sulfate (658), những chất này có nguồn gốc từ Pleurocarpus gardneri Trifucol (659) và trifucol đã sulfat hóa

là trifucol-2-O-sulfate (660) và trifucol-2,2- di-O-sulfate (661), chúng có nguồn gốc

ở nhiều loại rong khác nhau, như Analipus japonicus, Bifurcaria bifurcata, Fucus vesiculosus và Himanthalia elongata Tetrafucol A (662) và tetrafucol đã halogen

hóa là 5-chlorotetrafucol A (663) và 5 - bromotetrafucol A (664), chúng được phân

lập từ Analipus japonicus [155]

* Phlorotannin với liên kết ether và phenyl [155]

Các hợp chất phlorotannin chứa liên kết ether và phenyl chủ yếu là

fucophlorethol Các loài Fucus vesiculosus, Cystoseira baccata và Analipus japonicus có chứa fucophlorethol A, fucophlorethol B và fucophlorethol C Loài Cystoseira baccata có chứa fucodiphlorethol B và fucodiphlorethol D và loài Laminaria ochroleuca chứa fucodiphlorethol C

Fucoheptaphlorethol A và fucopentaphlorethol A có nguồn gốc từ loài

Cystoseira granulata Loài Carpophyllum maschalocarpum có chứa fucophlorethol

Hydroxyfucodiphlorethol, bisfucotriphlorethol, hydroxybisfucotriphlorethol,

9

terfucopentaphlorethol, terfucohexaphlorethol, hydroxyterfucophlorethol, quaterfucononaphlorethol và bisfucopentaphlorethol A đều tồn tại trong loài

Himanthalia elongata

* Phlorotannin với liên kết dibenzodioxin [155]

Phlorotannin chứa liên kết đặc trƣng dibenzodioxin trong cấu trúc phân tử là

các chất thuộc nhóm eckol và carmalol [1], [4] Loài Eisenia arborea có chứa eckol

(681), 4-bromoeckol (682), 4-iodoeckol (683), 7-hydroxyeckol (684), 3-phloroeckol (685), bromo-3- phloroeckol (686) và iodo-3-phloroeckol (687) Hỗn hợp 681 phân

lập từ Ecklonia kurome Loài Eisenia arborea có chứa bieckol nhƣ 9,9-bieckol (688) và 7,7-dihydroxy-7,9-bieckol (689) Loài E kurome có chứa 2-phloro-6,6 - bieckol (690) Những eckol khác bao gồm dioxinodehydroeckol (691), 7,7-bieckol

(692), 7,9-bieckol (693), 8,4-dieckol (694), 7,2-bieckol (695) và fucofuroeckols A–

C (696–698) có nguồn gốc từ Eisenia arborea

Phloroglucinol Tetrafuhalol A Tetraphlorethol B Tetrafucol A

[118]

Hình 1.2 Một số cấu trúc của phlorotannin [147]

Nhóm hydroxyl của phlorotannin là nguồn cung cấp hydrogen rất lớn cho các phản ứng oxy hóa khử Hydrogen đƣợc giải phóng từ nhóm hydroxyl của

10

phlorotannin sẽ tương tác với oxygen và nitrogen hoạt động của chất oxy hóa, làm phá vỡ chu trình sản sinh gốc tự do mới Sự tương tác giữa nhóm hydroxyl của phlorotannin với electron π của vòng benzen tạo ra tính chất đặc trưng của phân tử

phlorotannin

1.2.3 Sinh tổng hợp phlorotannin

Phlorotannin được hình thành bằng cách polyme hóa các đơn vị cơ bản là phloroglucinol (1,3,5-tryhydroxybenzene) thông qua con đường acetate-malonate [172], [189] Con đường acetate-malonate (polyketide) có thể được thực hiện do hỗn hợp enzyme sinh tổng hợp kiểu polyketide [40] Con đường chính xác cho sự sinh tổng hợp phlorotannin hiện chưa được biết rõ [35] Bước đầu tiên của quá trình sinh tổng hợp phlorotannin được cho là 2 phân tử acetyl coenzyme A kết hợp với carbon dioxide thành malonyl coenzyme A (Hình 1.3)

Hình 1.3 Sự sinh tổng hợp nhóm acetate [211]

Chuỗi polyketide được biến đổi bằng cách khép vòng giữa các phân tử và loại bỏ nước để tạo ra hệ thống vòng hexacyclic (Hình 1.4) Triketide là sản phẩm của quá trình tạo vòng nhưng không ổn định và bị chuyển hóa thành các chất thơm

có tính ổn định hơn - phloroglucinol Phloroglucinol thuộc nhóm phenol và chúng

có chứa 3 nhóm hydroxy [211] Những nhân tố được sinh ra trong quá trình sinh tổng hợp sau này là chưa được biết đến

Luận án đầy đủ ở file: Luận án full