Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)

Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp. gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống (Luận án tiến sĩ)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HOÀNG NGỌC CƯƠNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG

KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP GÂY BỆNH THỐI NHŨN

TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ

MAI MỰC ỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

KHÁNH HÒA - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HOÀNG NGỌC CƯƠNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG

KHÁNG KHUẨN ERWINIA SP GÂY BỆNH THỐI NHŨN

TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH CỦA CHITOSAN TỪ

KHÁNH HÒA - 2017

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình do chính tôi thực hiện Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những lời cam đoan của mình

Nha Trang, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Hoàng Ngọc Cương

TS Huỳnh Thanh Tùng, PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, TS Khổng Trung Thắng

đã giúp đỡ, chia sẻ nhiều kinh nghiệm quí báu

Các cán bộ kỹ thuật của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Trung tâm Thí nghiệm Thực hành – Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện trọng quá trình tiến hành nghiên cứu

Cuối cùng, xin gửi tấm lòng ân tình tới gia đình, những người thân yêu luôn là nguồn động viên và chia sẻ mọi khó khăn để luận án được hoàn thành

Nha Trang, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Hoàng Ngọc Cương

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC HÌNH viii

ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xii

PHẦN MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 6

1.1 TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP ĐỂ THU NHẬN -CHITIN 6

1.1.1 Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp và phế liệu từ mực sau chế biến 6

1.1.2 Cấu trúc và thành phần hóa học của nguyên liệu mai mực ống Loligo sp 7

1.2 TỔNG QUAN VỀ β-CHITIN VÀ CHITOSAN 16

1.2.1 Cấu trúc hóa học, nguồn gốc tự nhiên và tính chất của các dạng chitin 16

1.2.2 Cấu trúc hóa học và tính chất của chitosan 20

1.2.3 Phương pháp thu nhận chitin và chitosan 23

1.2.4 Đặc tính sinh học kháng nấm, kháng khuẩn của chitosan 36

1.3 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH THỐI NHŨN TRÊN CÀ CHUA SAU THU HOẠCH 39

1.3.1 Giới thiệu chung về nguồn nguyên liệu cà chua sau thu hoạch 39

1.3.2 Tổng quan về bệnh thối nhũn (soft rot) gây hại cà chua sau thu hoạch 41

1.3.3 Giới thiệu về chủng vi khuẩn Erwinia spp gây bệnh thối nhũn 42

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

2.1 VẬT LIỆU 45

2.1.1 Mai mực ống Loligo sp 45

2.1.2 Trái cà chua Lycopersicon esculetum 45

2.1.3 Hóa chất dùng trong nghiên cứu 46

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 46

2.2.2 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thu nhận β-chitin 49

iv

2.2.3 Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện deacetyl β-chitin thu nhận chitosan 55

2.2.4 Bố trí thí nghiệm phân lập vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn 62

2.2.5 Bố trí thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch của β-chitosan ở điều kiện in vitro và in vivo 64

2.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU 71

2.3.1 Phương pháp xác định các thành phần hóa học cơ bản 71

2.3.2 Phương pháp xác định thành phần acid amin và thành phần khoáng 71

2.3.3 Phương pháp xác định tính chất của -chitin và chitosan 71

2.3.4 Phương pháp cắt mạch chitosan 72

2.3.5 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn 73

2.3.6 Phương pháp chuẩn bị mẫu dịch vi khuẩn Erwinia carotovora 74

2.3.7 Phương pháp gây bệnh nhân tạo 75

2.3.8 Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro75 2.3.9 Phương pháp đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo 75 2.3.10 Phương pháp xác định tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua 76

2.3.11 Phương pháp xử lý số liệu 76

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 77

3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MAI MỰC LOLIGO SP 77

3.1.1 Thành phần hóa học cơ bản 77

3.1.2 Thành phần khoáng 79

3.1.3 Thành phần acid amin 80

3.2 XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT -CHITIN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP 82

3.2.1 Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến quá trình khử protein trong mai mực Loligo sp 82

3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng chi tiết các yếu tố nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và sự cắt mạch của sản phẩm β-chitin 84

3.2.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản phẩm β-chitin 85

3.2.2.2 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử protein và khối lượng phân tử của sản phẩm β-chitin 88

v

3.2.2.3 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và khối lượng

phân tử của sản phẩm β-chitin 90

3.2.3 Tính chất của sản phẩm β-chitin từ mai mực ống 92

3.3 ĐIỀU KIỆN DEACETYL -CHITIN VÀ TÍNH CHẤT CHITOSAN TỪ MAI MỰC LOLIGO SP 101

3.3.1 Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của 3 yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl -chitin 101

3.3.2 Ảnh hưởng chi tiết của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan 104

3.3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan 104

3.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu quả deacetyl β-chitin và sự cắt mạch chitosan 107

3.3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả deacetyl chitin và sự cắt mạch chitosan 108 3.3.3 Điều kiện deacetyl lần 2 110

3.3.4 Hiệu suất thu nhận và tính chất của sản phẩm chitosan 111

3.3.5 Đề xuất quy trình thu nhận chitin, chitosan từ mai mực ống Loligo sp 119

3.4 KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CHITOSAN 120

3.4.1 Nghiên cứu phân lập, khẳng định chủng Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch 120

3.4.2 Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vitro 127

3.4.3 Khả năng kháng khuẩn của β-chitosan ở điều kiện in vivo 131

3.4.4 Đề xuất quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng dung dịch chitosan từ mai mực Loligo sp 139

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 141

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ 143

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 144

PHỤ LỤC 158

vi

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AAS Atomic absorption

spectrophotometric

Phương pháp phổ hấp thu nguyên tử

AOAC Association of Official Analytical

Chemists

Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống

ANOVA Analysis of Variance Phân tích phương sai

-chitosan Chitosan from β-chitin Chitosan từ β-chitin

χcr Degree of crystallinity Độ kết tinh

C95 Tomato C95 Giống cà chua C95

CrI Crystalline Index Chỉ số kết tinh

DA Degree of acetyl Độ acetyl

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

DD Degree of deacetyl Độ deacetyl

DP Deproteinization Quá trình khử protein

DM Demineralization Quá trình khử khoáng

DC Decolorization Quá trình khử màu

Echr Erwinia chrysanthemi Erwinia chrysanthemi

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Ethylenediaminetetraacetic axit FTIR Fourier Transform Infrared Quang phổ hấp thụ hồng ngoại GlcN D-glucosamine D-glucosamine

GlcNAc N-acetyl glucosamine N-acetyl glucosamine

MIC Minimum Inhibitory

Mark-Houwink-Mw The average molecular weight Khối lượng phân tử trung bình NL/DM Material / solvent Nguyên liệu / dung môi

vii

Nd Not detected Không phát hiện

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

OD Optical density Độ hấp phụ quang học

Pl Pectate lyases Enzyme phân giải pectin

Pnl Pectin lyases Enzyme phân giải pectin

Pme Pectin methylesterases Enzyme phân giải pectin

PG Potato glucose Môi trường potato glucose PCR Polymerase chain reaction Phương pháp khuếch đại gen PDA Potato dextrose agar Môi trường thạch khoai tây rARN Ribosomal ribonucleic ARN riboxom

SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét

SEC-MALLS Size-exclusion

chromatography-Multi-angle static light scattering

Phương pháp sắc ký loại trừ kết hợp với phân tán ánh sáng tĩnh

đa góc

spp Species pluriel Nhiều loài

subsp Subspecies Phân loài

SPSS Statistical Package for the Social

Sciences

Phần mềm thống kê

SS Sum of Squares Tổng bình phương độ lệch

TEM Transmission Electron

Microscope

Kính hiển vi điện tử truyền qua

TpHCM Ho Chi Minh City Thành phố Hồ Chí Minh

TLTK References Tài liệu tham khảo

VASEP Vietnam Association of Seafood

Exporters and Producers

Hiệp hội chế biến và xuất khẩu Thuỷ sản Việt Nam

VNF Viet Nam Food Công ty Cp Việt Nam Food XRD X-ray powder diffraction Phổ nhiễu xạ tia X

wt.% Weight percent Phần trăm theo khối lượng

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học trong nguyên liệu của một số loại phế liệu thủy sản

thông dụng để sản xuất chitin 8

Bảng 1.2 Thành phần hóa học trong một số mai mực 9

Bảng 1.3 Thành phần khoáng của nguyên liệu mai mực 9

Bảng 1.4 Các dung môi thường sử dụng để hòa tan chitosan 21

Bảng 1.5 Tính chất của chitosan ảnh hưởng bởi độ deacetyl 22

Bảng 1.6 Thành phần và tính chất của một số loại chitosan thương mại 22

Bảng 1.7 Điều kiện khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguyên liệu khác nhau 30

Bảng 1.8 Nguồn nguyên liệu thủy sản, điều kiện xử lý và loại chitin 32

Bảng 1.9 Điều kiện deacetyl thu nhận chitosan từ các nguồn chitin khác nhau 34

Bảng 1.10 Khối lượng phân tử trung bình (Mw) của chitosan ở các điều kiện deacetyl khác nhau 36

Bảng 1.11 Bảng tổng hợp các chủng vi khuẩn gây bệnh thối nhũn (soft rot) 43

Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của mai mực ống Loligo sp 77

Bảng 3.2 Thành phần khoáng trong mai mực Loligo sp., các loại mực khác và vỏ tôm 79

Bảng 3.3 So sánh thành phần acid amin trong mai mực ống Loligo sp và kết quả tham khảo 80

Bảng 3.4 Tính chất của mai mực ống và sản phẩm β-chitin 94

Bảng 3.5 Thành phần khoáng trong mai mực và sản phẩm β-chitin 95

Bảng 3.6 Hàm lượng acid amin trong mai mực và sản phẩm β-chitin 95

Bảng 3.7 Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 25oC của β-chitin 100

Bảng 3.8 Hiệu suất thu hồi chitin và chitosan 112

Bảng 3.9 So sánh chất lượng của thương mại chitosan và β-chitosan 113

Bảng 3.10 Hàm lượng acid amin còn lại trong β-chitin và β-chitosan 114

Bảng 3.11 Thành phần khoáng và kim loại trong mai mực, β-chitin và β-chitosan 115

Bảng 3.12 Độ dịch chuyển hóa học của các proton trong DCl/D2O ở 70oC của β-chitosan 118

Bảng 3.13 Mẫu cà chua thu nhận từ các chợ nông sản 121

Bảng 3.14 Kết quả đánh giá đặc tính sinh hóa sinh lý của các dòng vi khuẩn 123

Bảng 3.15 Khả năng kháng khuẩn Erwinia carotovora của chitosan với khối lượng phân tử khác nhau và chitosan thương mại (C-120) 128

ix

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Thống kê giá trị xuất khẩu mực, bạch tuộc; (a) Mực ống Loligo sp (b) Mai

mực 6

Hình 1.2 Mô hình cấu trúc chitin trong mai mực nguyên liệu 10

Hình 1.3 Một kiểu mô phỏng những liên kết hóa học có thể tạo ra giữa chitin với astaxanthin và các phân tử khác trong nguyên liệu 11

Hình 1.4 Mô hình cấu trúc lớp vỏ tôm 11

Hình 1.5 Ảnh quét kính hiển vi điện tử SEM của mai mực ống 12

Hình 1.6 Quy trình thu nhận chitin/chitosan từ các nguồn nguyên liệu khác nhau 13

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học phân tử chitin 17

Hình 1.8 Sự sắp xếp của chuỗi chitin: (a) α-chitin, (b) β-chitin, (c) γ-chitin 17

Hình 1.9 Cấu trúc phân tử (a) α-chitin (b) β-chitin 18

Hình 1.10 Cấu trúc α-chitin và -chitin 19

Hình 1.11 Phổ XRD của α-chitin và β-chitin 19

Hình 1.12 Cấu trúc hóa học của chitosan 20

Hình 1.13 Sơ đồ quá trình sản xuất chitin/chitosan từ phế liệu thủy sản 24

Hình 1.14 Phản ứng deacetyl chitin thu chitosan 33

Hình 1.15 Cà chua bị bệnh thối nhũn (soft rot) 41

Hình 2.1 Nguyên liệu mai mực ống Loligo sp 45

Hình 2.2 Nguyên liệu cà chua Lycopersicon esculentum 46

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 47

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến khả năng khử protein trong mai mực ống nguyên liệu 49

Hình 2.5 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình khử protein mai mực ống 51

Hình 2.6 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của thời gian 53

Hình 2.7 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến quá trình khử protein 54

Hình 2.8 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát đánh giá ảnh hưởng các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến quá trình deacetyl -chitin 56

Hình 2.9 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến quá trình deacetyl -chitin 57

x

Hình 2.10 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố nồng độ NaOH đến quá

trình deacetyl -chitin 59

Hình 2.11 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến quá trình deacetyl -chitin 60

Hình 2.12 Sơ đồ thí nghiệm deacetyl lần 2 61

Hình 2.13 Sơ đồ phân lập vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch 63

Hình 2.14 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan 64

Hình 2.15 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp của chitosan ở điều kiện in vitro 66

Hình 2.16 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh thối nhũn của chitosan ở điều kiện in vivo 67

Hình 2.17 Sơ đồ thí nghiệm so sánh khả năng kháng bệnh thối nhũn của chitosan từ mai mực ống và chitosan thương mại 69

Hình 3.1 Hàm lượng protein còn lại sau quá trình khử protein dưới tác động của 3 yếu tố (nhiệt độ, nồng độ NaOH, thời gian) 83

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian và nồng độ NaOH đến hiệu quả khử protein và sự cắt mạch β-chitin 86

Hình 3.3 (a) Ảnh của mực ống, (b) mai mực ống và (c) sản phẩm β-chitin 92

Hình 3.4 Hình SEM chụp bề mặt cắt của (a) mai mực ống và (b) sản phẩm β-chitin 97

Hình 3.5 Phổ XRD của mai mực ống và sản phẩm β-chitin thu được từ mai mực 98

Hình 3.6 Phổ FTIR của nguyên liệu mai mực ống và sản phẩm β-chitin 99

Hình 3.7 Phổ H1 NMR của β-chitin 100

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến hiệu quả deacetyl 103

Hình 3.9 Ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, nồng độ NaOH và thời gian đến DD và Mw của chitosan 106

Hình 3.10 Ảnh hưởng của quá trình deacetyl lần 2 đến DD và Mw của chitosan 110

Hình 3.11 Sản phẩm -chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp 111

Hình 3.12 Hình SEM của (a) mai mực ống, (b) β-chitin và (c) chitosan 115

Hình 3.13 Phổ XRD của mai mực, β-chitin và β-chitosan 116

xi

Hình 3.14 Phổ FTIR sản phẩm chitosan từ (a) β-chitosan, (b) α-chitosan thương mại

và (c) β-chitin 117

Hình 3.15 Phổ H1-NMR của β-chitosan 117

Hình 3.16 Phổ SEC-MALLS của β-chitosan 118

Hình 3.17 Quy trình thu nhận β-chitin và chitosan từ mai mực Loligo sp 119

Hình 3.18 Mẫu trái cà chua bệnh thối nhũn thu nhận từ chợ nông sản 121

Hình 3.19 (a) Mẫu khuẩn lạc được chọn; (b) Mẫu vi khuẩn nhuộm Gram 122

Hình 3.20 Trình tự một đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn Erwinia carotovora 124

Hình 3.21 Hình SEM chủng vi khuẩn Erwinia carotovora 125

Hình 3.22 Vết bệnh thối nhũn trên trái cà chua 125

Hình 3.23 Sơ đồ phát triển bệnh thối nhũn trên cà chua 126

Hình 3.24 (a) Khả năng kháng khuẩn của S-655 và (b) của S-138 ở các nồng độ khác nhau C-120 là chitosan thương mại với Mw là120 kDa 129

Hình 3.25 Hình TEM của vi khuẩn Erwinia sp được xử lý trong dung dịch β-chitosan 1% (S-138) trong 60 phút (a) Vi khuẩn Erwinia carotovora; (b) xử lý sau 15 phút; (c) xư lý sau 30 phút; (d) kết quả sau 60 phút 130

Hình 3.26 Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-1740 ở điều kiện in vivo 132

Hình 3.27 Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-655 ở điều kiện in vivo 133

Hình 3.28 Khả năng kháng khuẩn của chitosan S-138 ở điều kiện in vivo 134

Hình 3.29 Kích thước vết bệnh bên trong được xử lý S-138 trong (a) 24 giờ , (b) 36 giờ 135

Hình 3.30 So sánh khả năng kháng bệnh thối nhũn ở điều kiện In vivo của S-138 và chitosan thương mại C-120 (a) kích thước vết bệnh bên ngoài và (b) kích thước vết bệnh bên trong 136

Hình 3.31 Kích thước vết bệnh bên trong và bên ngoài khi xử lý chitosan S-138 và chitosan thương mại C-120 sau 36 giờ 137

Hình 3.32 Tổng hàm lượng phenol tổng số trong trái cà chua sau khi được xử lý các loại chitosan có phân tử lượng khác nhau sau thời gian 24 và 72 giờ 138

Hình 3.33 Quy trình bảo quản cà chua sau thu hoạch bằng chitosan 139

xii

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: Nghiên cứu thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia

sp gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan

Người hướng dẫn: PGS.TS Trang Sĩ Trung

PGS.TS Nguyễn Anh Tuấn

Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang

Nội dung:

1 Đã xác định được thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai mực Loligo sp

thải ra sau quá trình chế biến tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo

2 Đã xác định được điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại Sản phẩm -chitin thu được có khối lượng phân tử trung bình lớn (Mw) và

là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực

kỹ thuật cao Điều kiện thu nhận có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn

3 Đã xác định được điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và khối lượng phân tử lớn Sản phẩm chitosan thu được là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các oligo chitosan và các chế phẩm từ chitosan có thể ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao như y dược, y sinh và công nghệ thực phẩm Điều kiện deacetyl có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn

4 Đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái

cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng chitosan có khối

lượng phân tử khác nhau Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong bảo quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan

NGHIÊN CỨU SINH Hoàng Ngọc Cương

1

KEY FINDINGS

Thesis title: Preparation and characterization of chitosan from squid pens and its

antibacterial activity against Erwinia sp caused soft rot on tomato fruits

Speciality : Aquatic Products Technology

Code : 62540105

Ph.D Student : Hoang Ngoc Cuong

Course : 2011

Supervisors : 1 Assoc Prof PhD TRANG SI TRUNG

2 Assoc Prof PhD NGUYEN ANH TUAN

Intitution : Nha Trang University

Key findings:

- The data of chemical composition of the Loligo sp squid pens in Kien Giang

province will be reported that can be used for futher studies and improve seafood processing

- The extraction conditions of -chitin with commercial standard from squid pens will be reported The obtained -chitin with a high molecular weight can be used

to prepare chitosan with a high purity and high molecular weight for various applications Those extraction conditions can be applied in large scale production

- The deacetylation conditions of -chitin for chitosan with commercial standard (Mw > 6338 kDa, DD >90%) will be reported The obtained chitosan can be used for biomedicine, biopharmacy, and food technology applications Those deacetylation conditions can be applied in large scale production

- The antibacterial activity of chitosan against Erwinia carotovora caused soft rot on tomato fruits in vitro and in vivo will be reported The low moleculer weight of

chitosan is used, the high activity is observed

Ph.D Student Hoang Ngoc Cuong

2

PHẦN MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam, cùng với sự phát triển nhanh chóng của ngành công nghiệp chế biến và xuất khẩu thủy sản, hằng năm đã thải ra hàng chục ngàn tấn phế liệu sau chế biến Tuy nhiên, hầu hết các phế liệu này chỉ được bán thô hoặc chế biến để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế thấp gây lãng phí tài nguyên, trong khi đây là nguồn nguyên liệu có thể sản xuất ra các sản phẩm có giá trị gia tăng và chất lượng cao Trong đó, hướng nghiên cứu thu nhận và ứng dụng các polyme sinh học tách chiết từ nguồn phế liệu thủy sản đang rất được quan tâm của các nhà quản lý, nhà khoa học và doanh nghiệp

Trong số nhiều sản phẩm có giá trị gia tăng từ phế liệu thủy sản, chitin và chitosan (sản phẩm của quá trình deacetyl chitin) là 2 polyme sinh học được chứng minh có nhiều tính chất đặc biệt như khả năng tương thích sinh học cao, khả năng tạo màng, tạo gel, tính phân giải chậm, tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn Do

đó, chitin và chitosan đã và đang được nghiên cứu thu nhận và ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y dược, y sinh, công nghệ thực phẩm, xử lý môi trường, dệt nhuộm, công nghệ sinh học Ước tính mỗi năm có khoảng 10.000 tấn chitin và chitosan đã được sản xuất, sử dụng trên toàn thế giới nhưng hầu hết được thu nhận từ vỏ tôm, vỏ cua, vỏ ghẹ Tuy nhiên, α-chitin/chitosan thường có độ rắn cao, khối lượng phân tử thấp và độ tinh sạch chưa cao vì bản chất của nguồn nguyên liệu thu nhận là vỏ giáp xác có chức năng bảo vệ cơ thể sinh vật bên trong nên được cấu tạo rất phức tạp và rắn chắc Hơn nữa trong nguyên liệu vỏ giáp xác ngoài thành phần chitin còn chứa nhiều khoáng, protein và chất màu nên quá trình sản xuất cần qua nhiều công đoạn tách chiết, sử dụng nhiều hoá chất gây ô nhiễm

Mai mực ống có chứa hàm lượng khoáng thấp, lượng β-chitin khá cao (> 35%), chitin này có khối lượng phân tử lớn gấp 3 lần α-chitin và hầu như không chứa các kim loại nặng như Pb, Hg, As nên có độ tinh khiết cao [36, 79, 95] Do đó, đây là nguồn nguyên liệu cần thiết để sản xuất ra loại β-chitin/chitosan có khối lượng phân tử lớn và độ tinh khiết cao để ứng dụng trong lĩnh vực như tạo gel trong mỹ phẩm, màng kháng viêm, màng phân giải thuốc, chỉ khâu cấy ghép trong phẫu thuật, kỹ thuật mô cấy ghép da nhân tạo [54, 89, 151] Ngoài ra, β-chitin/chitosan đã được chứng minh có

độ rắn thấp, độ xốp cao nên dễ dàng deacetyl và được ứng dụng trong nuôi cấy mô, cố định tế bào và enzyme, phân giải thuốc chậm mà các tính chất này vượt trội so với α-

3

chitin/chitosan Tại Việt Nam, nguồn phế liệu mai mực thải ra sau quá trình chế biến ước tính đạt khoảng 10-15 tấn/tháng [58, 8] Tuy nhiên, nguồn phế liệu này chủ yếu là phơi khô, bán thô với giá thành thấp, do đó gây lãnh phí tài nguyên Trong khi, đây là nguồn nguyên liệu quý để thu nhận chitin/chitosan chất lượng cao Hơn nữa theo chúng tôi tìm hiểu thì chưa có một nghiên cứu chính thức và có hệ thống đầy đủ nào được công

bố tại Việt Nam về quy trình thu nhận, đánh giá tính chất và ứng dụng β-chitin/chitosan tách chiết từ mai mực ống

Xuất khẩu nông sản Việt Nam giai đoạn 2012-2016 ước đạt 15 tỷ USD/năm, góp phần đáng kể phát triển nền kinh tế Tuy nhiên, công nghệ sau thu hoạch chưa được áp dụng hiệu quả nên chất lượng nông sản còn thấp, hạn chế khả năng xuất khẩu,

tỷ lệ thất thoát sau thu hoạch ở mức cao Trong đó, bệnh thối nhũn trên trái cà chua

gây ra bởi vi khuẩn Erwinia sp đã và đang gây thiệt hại 10-30% tổng sản lượng sau

thu hoạch [25, 77, 9] Các hóa chất thường dùng để kháng bệnh này là thủy ngân clorua, dung dịch formaldehyde, dung dịch natri hypocloric 12%, hydroxymercurinitrophenol 12% và hydromercurichloride phenol 2% [24, 25, 9] Đây là các hóa chất độc hại đối với người nông dân và người tiêu dùng nếu không được kiểm soát chặt chẽ Ngoài ra, một

số kỹ thuật di truyền để kiểm soát bệnh trước và sau thu hoạch cũng được áp dụng Tuy nhiên, các kỹ thuật này có giá thành cao và khó triển khai thực tế ở qui mô lớn

Do đó, những phương pháp sử dụng các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên và an toàn như chitosan là rất cần thiết Thực tế, chitosan điều chế từ α-chitin đã được nghiên cứu

và sử dụng để kháng khuẩn và kháng nấm có hiệu quả trong quá trình bảo quản sau thu hoạch trên nhiều đối tượng như bơ, xoài, nho và ớt [25, 9] Các kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan thu được từ β-chitin có tính kháng khuẩn và kháng nấm cao hơn so với thu được từ α-chitin [79, 134] Do đó, chitosan này được kỳ vọng sẽ có hiệu quả kháng

khuẩn cao đối với vi khuẩn Erwinia sp gây ra bệnh thúi nhũn trên trái cà chua

Từ những vấn đề thực tế được nêu, luận án này tiến hành nội dung “Nghiên cứu

thu nhận và đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên cà chua sau thu hoạch của chitosan từ mai mực ống” Đây là vấn đề cần thiết làm cơ sở

khoa học để thu nhận các sản phẩm β-chitin và chitosan có giá trị cao từ mai mực ống ở Việt Nam và nâng cao giá trị kinh tế của nguồn phế liệu mực ống Đồng thời, chứng minh và bổ sung đầy đủ hơn về khả năng kháng khuẩn của chitosan từ -chitin làm đa dạng hóa các ứng dụng của chitosan trong sản xuất nông nghiệp bền vững

4

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Thu nhận -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại từ nguồn phế liệu mai mực

Loligo sp thải ra sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu

2 Sản xuất chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại từ -chitin thu nhận ở trên

3 Đánh giá hiệu quả kháng khuẩn của chitosan đối với bệnh thối nhũn trên trái

cà chua sau thu hoạch do vi khuẩn Erwinia sp gây ra

Đối tượng nghiên cứu: Luận án nghiên cứu trên đối tượng phế liệu mai mực Loligo

sp được thu nhận tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang thải ra sau quá trình chế biến mực ống xuất khẩu ở dạng tươi, có chiều dài từ 12-15 cm, rộng 1,0-1,5 cm và độ dày trung bình 0,4 - 0,5 mm

Phạm vi và nội dung nghiên cứu: Để đạt được 3 mục tiêu nghiên cứu, luận án tập

trung nghiên cứu, đánh giá làm rõ 4 nội dung:

1 Xác định thành phần hóa học cơ bản, các acid amin và kim loại của nguồn phế

liệu mai mực Loligo sp

2 Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nồng độ HCl, nhiệt độ và thời gian đến quá trình khử protein, khử khoáng để thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch -chitin trong quá trình thu nhận

3 Khảo sát, đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố nồng độ NaOH, nhiệt độ và thời gian đến quá trình deacetyl -chitin để thu nhận sản phẩm chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại và hạn chế đến mức thấp nhất quá trình cắt mạch chitosan trong quá trình deacetyl

4 Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà

chua sau thu hoạch tại các chợ đầu mối nông sản Khảo sát, đánh giá khả năng kháng khuẩn của -chitosan với khối lượng phân tử khác nhau đối với vi khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua ở điều kiện in vitro và in vivo

5

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài:

1 Luận án đã xác định được thành phần hóa học của nguồn phế liệu mai mực Loligo

sp tại các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh Kiên Giang, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo

2 Luận án đã xác định được điều kiện thu nhận sản phẩm -chitin đạt tiêu chuẩn thương mại Sản phẩm -chitin thu được có khối lượng phân tử lớn và là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất chitosan tinh khiết dùng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao Điều kiện thu nhận có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn

3 Luận án đã xác định được điều kiện deacetyl -chitin thu nhận chitosan đạt tiêu chuẩn thương mại, sản phẩm chitosan có độ deacetyl cao và khối lượng phân tử lớn Sản phẩm chitosan thu được là nguồn nguyên liệu tiềm năng để sản xuất các oligo chitosan và các chế phẩm từ chitosan có thể ứng dụng trong các lĩnh vực kỹ thuật cao như y dược, y sinh và công nghệ thực phẩm Điều kiện deacetyl có thể ứng dụng sản xuất ở qui mô lớn

4 Luận án đã đánh giá khả năng kháng khuẩn Erwinia sp gây bệnh thối nhũn trên trái cà chua sau thu hoạch ở điều kiện in vitro và in vivo khi sử dụng -chitosan có khối lượng phân tử khác nhau Kết quả nghiên cứu sẽ là cơ sở ứng dụng chitosan trong bảo quản nông sản sau thu hoạch và cơ sở khoa học cho các nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của chitosan

6

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TIỀM NĂNG SỬ DỤNG PHẾ LIỆU MAI MỰC ỐNG LOLIGO SP ĐỂ THU

NHẬN -CHITIN

1.1.1 Giới thiệu về nguyên liệu mực ống Loligo sp và phế liệu từ mực sau chế biến

Ở Việt Nam, hiện có khoảng 25 loài mực ống thuộc bộ Teuthida, tập trung

nhiều nhất ở vùng nước sâu khoảng 30-50 m Mùa vụ khai thác từ tháng 6 đến tháng 9 (vụ Nam) và tháng 12 đến tháng 4 năm sau (vụ Bắc), trong đó chủ yếu có 4 loài được

đánh bắt với số lượng chiến trên 96% tổng sản lượng, bao gồm: Loligo japonica,

Loligo chinensis, Loligo beka và Todarodes pacificus

Mực ống Loligo sp (Hình 1.1a) được phân loại [58]:

Luận án đầy đủ ở file: Luận án full