Bước đầu nghiên cứu đột biến gen EGFR trên bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

Glioblastoma multiforme được xem như u nguyên bào thần kinh đệm độ IV là loại u trong sọ ác tính nhất.. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật xác định đột biến tại gen EGFR ở bệnh nhân u nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

…… ***……

NGUYỄN LÊ DUẨN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN

EGFR TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO

THẦN KINH ĐỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN Y KHOA

KHÓA 2011 – 2015

HÀ NỘI – 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

…….***……

NGUYỄN LÊ DUẨN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO

LỜI CẢM ƠN

Nhân dịp hoàn thành khóa luận này, em xin được chân thành gửi lời cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Đại học, Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein trường Đại học Y Hà Nội đã quan tâm, tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới:

PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung, người thầy đã tận tâm hướng dẫn, chỉ bảo

cũng như động viên em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Quỳnh Giao, người đã trực tiếp

dạy dỗ, dìu dắt, hướng dẫn và giúp đỡ cũng như cung cấp cho em các phương pháp thực hành trong suốt thời gian em thực hiện đề tài tại Trung tâm

Em xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô, các anh chị làm việc tại Labo Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein, Trường Đại học Y Hà Nội đã dành cho em sự giúp đỡ quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho em khi thực hiện khoá luận tốt nghiệp này

Những lời cảm ơn cuối cùng, em xin gửi tới những người thân và bạn

bè, đã luôn động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

Nguyễn Lê Duẩn

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 8

CHƯƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan u não 3

1.1.1 Tỷ lệ mắc u não 3

1.1.2 Nguyên nhân gây u não 4

1.1.3 Phân loại u não 4

1.1.4 Mô bệnh học u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma) 9

1.1.5 Triệu chứng lâm sàng 10

1.1.6 Chẩn đoán cận lâm sàng 13

1.1.7 Điều trị u não 15

1.2 Gen mã hóa EGFR và con đường khuếch đại tín hiệu 16

1.2.1 Gen mã hóa EGFR 16

1.2.2 Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) 17

1.2.3 Đột biến gen EGFR 19

1.3 Kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định đột biến gen Glioblastoma 20 1.3.1 Kỹ thuật khuếch đại gen – PCR và PCR lồng 20

1.3.3 Kỹ thuật giải trình tự gen(Sequencing) 25

CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

2.1.1 Thời gian nghiên cứu 27

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 27

2.2 Đối tượng nghiên cứu 27

2.3 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu 27

2.3.1 Thiết bị phòng nghiên cứu 27

2.3.2 Dụng cụ 28

2.3.3 Hóa chất sử dụng 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29

2.5 Quy trình kỹ thuật 30

2.5.1 Lấy mẫu mô paraffin 30

2.5.2 Tách DNA từ mẫu mô 30

2.5.3 Kiểm tra độ tinh sạch và đo nồng độ DNA 32

2.5.4 PCR khuếch đại đoạn gen EGFR 33

2.5.5 Giải trình tự gen phát hiện đột biến gen 36

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 38

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

3.1 Kết quả tách chiết DNA 39

3.1.1 Kết quả đo nồng độ và mật độ quang 39

3.1.2 Kết quả điện di DNA tổng số 41

3.2 Kết quả PCR khuếch đại exon 21 gen EGFR 41

3.3 Kết quả giải trình tự gen 42

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 44

4.1 Kết quả tách chiết DNA 44

4.2 Kết quả PCR lồng khuếch đại exon 21 45

4.3 Kết quả giải trình tự exon 21 gen EGFR 46

KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Kb Kilobase

kD Kilo Dalton

GB Glioblastoma

EGFR Epidermal Growth Factor Receptor

EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic

TE Tris EDTA

Nu Nucleotide

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonucleic Acid

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 U nguyên bào thần kinh đệm độ IV 8

Hình 1.2 U nguyên bào thần kinh đệm độ IV trên tiêu bản mô bệnh học 9

Hình 1.3 Minh họa vị trí gen EGFR 16

Hình 1.4 Cấu trúc thụ thể phát triển biểu mô và sự hoạt hóa của EGFR 17

Hình1.5 Con đường tín hiệu EGFR trong tế bào 18

Hình 1.6 Các bước cơ bản của phản ứng PCR 22

Hình3.1 Minh họa đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch DNA trên máy Nano-drop 38

Hình3.2 Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel 0,8% 40

Hình3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR exon 21 gen EGFR 40

Hình3.4 Kết quả giải trình tự exon 21 gen EGFR của bệnh nhân 41

của các đối tượng nghiên cứu 39

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

U nguyên bào thần kinh đệm - Glioblastoma (GB) là một trong các khối u não phổ biến nhất, chiếm 18,5% của tất cả các khối u não ở Hoa Kỳ [1] Tổ chức Y tế Thế giới phân loại Glioblastoma như một u tế bào hình sao (Astrocytoma) cấp III và IV với độ ác tính cao Glioblastoma multiforme được xem như u nguyên bào thần kinh đệm độ IV là loại u trong sọ ác tính nhất Tỷ lệ Glioblastoma là khoảng 3,19/100.000 dân, độ tuổi trung bình phát hiện là 64 tuổi và tỷ lệ này mắc ở nam là cao hơn so với nữ [2]

Glioblastoma là loại u rất ác tính, thường hình thành trong chất trắng não, phát triển nhanh chóng và có thể thành khối u lớn trước khi xuất hiện triệu chứng Do đó, biểu hiện lâm sàng đầu tiên thường bằng hội chứng tăng

áp lực nội sọ nặng, can thiệp điều trị thường không đem lại hiệu quả, thời gian sống thêm của bệnh nhân sau mổ trung bình chỉ 15 tháng [2] [3]

Hiện nay, việc chẩn đoán và phân loại u có thể dựa vào lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh, mô bệnh học Các phương pháp này rất hạn chế, thường chỉ phát hiện khi khối u đã phát triển lớn, can thiệp ít hiệu quả Vấn đề cần thiết nhất hiện nay đối với căn bệnh này là chẩn đoán sớm và điều trị sớm Do đó, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu bệnh học phân tử trong GB Sự biến đổi gen bao giờ cũng biến đổi sớm nhất, tiếp theo là sự biến đổi về protein trước khi có sự biến đổi về hình thái và chức năng tế bào trong ung thư Điều này giúp chúng ta tìm ra căn nguyên, cơ chế bệnh sinh và quá trình bệnh học ung thư để có thể can thiệp sớm và hiệu quả

Trong GB, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra sự biến đổi một số gen, trong đó EGFR là gen có tỷ lệ đột biến cao với tỷ lệ khoảng 43% [4] Các nghiên cứu đã góp phần sáng tỏ nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh trong

GB, xác định nguy cơ mắc thể ác tính này và hướng tới điều trị đích Do đó, việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen EGFR là rất

cần thiết, hỗ trợ các bác sỹ lâm sàng có thể phân loại, tiên lượng khả năng mắc thể GB của bệnh nhân u não Bên cạnh đó, trên thị trường đang phát triển rất mạnh mẽ dòng thuốc ức chế ung thư qua EGFR đã được chứng minh hiệu quả trên nhiều ung thư ở các cơ quan khác nhau liên quan đến đột biến gen EGFR Do đó, xác định đột biến gen còn hỗ trợ chỉ định điều trị đích với trường hợp đột biến EGFR bằng cách kết hợp sử dụng thuốc ức chế EGFR cùng các phương pháp điều trị khác

Hiện nay, có nhiều kỹ thuật tiên tiến để xác định đột biến gen như: PCR–RFLP, giải trình tự gen, Scorpions ARMS, SMAP (Smart Amplification Process) Trong đó, kỹ thuật giải trình tự gen hiện đang được sử dụng rất phổ biến tại các phòng thí nghiệm; Scorpion ARMS đắt tiền và chưa được áp dụng rộng rãi; SMAP còn đang trong quá trình thử nghiệm và hoàn thiện Vì vậy, trong nghiên cứu này tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen để xác định đột biến gen EGFR, với giá thành dịch vụ rẻ và quy trình kỹ thuật không quá phức tạp

Với mục đích xây dựng quy trình xác định đột biến gen chính xác, phù hợp với điều kiện bệnh nhân và kinh tế ở Việt Nam, nghiên cứu này được xây dựng với mục tiêu:

1 Hoàn thiện quy trình kỹ thuật xác định đột biến tại gen EGFR ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

2 Bước đầu nghiên cứu xác định độ biến gen EGFR ở bệnh nhân u nguyên bào thần kinh đệm

tế (IARC), hàng năm tỷ lệ mắc u não từ 3 – 5/100.000 dân và con số này ngày càng tăng [5] Tại Hoa Kỳ, tỷ lệ mắc u não là 4,5/100.000 dân và tỷ lệ tử vong đứng hàng thứ 5 trong các bệnh ung thư [6] Cũng tại Hoa Kỳ, năm 1999, số

ca u não mới mắc là 18.000 người, cũng trong năm đó 13.100 người đã chết

vì u não nguyên phát và hơn 100.000 người chết vì u di căn não từ các khối u khác trong cơ thể [1] Những thống kê gần đây cho thấy tỷ lệ mắc u não đã tăng cao hơn rất nhiều Thống kê của CBTRUS - tổ chức chuyên nghiên cứu

về u não của Hoa Kỳ, năm 2009, tỷ lệ mắc ở Hoa Kỳ là 20,59/100.000 dân [25] Thống kê khác của hiệp hội Ung thư Hoa Kỳ, tỷ lệ mắc u não năm 2013

Tần suất mắc u não theo phân loại hình thái mô bệnh học gồm hai loại

là u nguyên phát và u thứ phát U thứ phát có nguồn gốc tứ các cơ quan khác trong cơ thể di căn vào não như vú, gan, phổi, trực tràng … U nguyên phát có nguồn gốc từ não, màng não và các tuyến trong sọ Theo một nghiên cứu, các

u tế bào thần kinh đệm thường gặp nhất lên đến 70% các khối u não; khối u

ác tính nhất và chiếm nhiều nhất là glioblastoma với 65% [8]

1.1.2 Nguyên nhân gây u não

U não đã được biết đến từ rất lâu và là một căn bệnh khá phổ biến tuy nhiên nguyên nhân gây nên các khối u vẫn chưa được hiểu rõ Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra một số yếu tố nguy cơ liên quan đến bệnh sinh u não:

1.1.3 Phân loại u não

1.1.3.1 Phân loại u não theo vị trí

Phân loại u theo vị trí được các bác sĩ quan tâm bởi nó giúp định hướng chẩn đoán và điều trị

Các u trên lều:

- Các khối u thùy não: u thùy trán, u thùy đỉnh, u thùy thía dương, u thùy

chẩm

- Các khối u vùng trung tâm: u nhân xám trung ương, u não thất bên, u

thể trai, u hố yên, u não thất III, u tuyến tùng

Các u dưới lều: bao gồm các khối u tiểu não, u góc cầu tiểu não, u thân não, u

não thất IV, u thùy giun

Các vị trí khác: u lỗ bầu dục nằm ở khe giữa tầng trên lều và dưới lều, u lỗ

chẩm nằm giữa hố sau và ống sống [9]

5

1.1.3.2 Phân loại mô bệnh học u não

Bảng 1.1: Phân loại các khối u của hệ thần kinh (WHO, 2000) [10]

U biểu mô thần kinh U tế bào thần kinh đệm hình sao

U tế bào thần kinh đệm hình ít nhánh

U tế bào thần kinh đệm hỗn hợp

U tế bào thần kinh đệm lợp ống nội tủy

U đám rối màng mạch

U tế bào thần kinh đệm không rõ nguồn gốc

U neuron và u hỗn hợp neuron – tế bào đệm

U nguyên bào thần kinh

U nhu mô tuyến tùng

U màng não U hợp bào màng não

U trung mô không phải hợp bào màng não

U tế bào sắc tố nguyên phát

U không rõ nguồn gốc

U lympho bào và u các U lympho ác tính

7

cơ quan tạo máu U tương bào

Ung thư bạch cầu hạt

Các khối u tế bào

mầm

U tế bào mầm Ung thư biểu mô nguồn gốc phôi thai

U túi noãn hoàng Ung thư nguyên bào nuôi

Các khối u di căn U di căn từ các cơ quan khác như: ung thư

phổi, ung thứ vú, ung thư dạ dày …

1.1.3.3 Phân loại theo tính phổ biến của bệnh ( theo Osborn 1996)

a) U nguyên phát: chiếm 2/3 các khối u não

- U thần kinh đệm (glioma) thường gặp nhất chiếm 45 – 50% gồm:

- U tế bào hình sao (astrocytoma) 35-40%

- U tế bào thần kinh đệm ít nhánh 2%

- U màng não (eperdynoma) 3%

- U đám rối mạch mạc <1%

- U màng não (meningioma) 15%

- Adenome tuyến yên 10%

- U nguyên bào tủy (medulloblistoma) 6%

- U bao rễ thần kinh (Schwannoma) 6%

- U sọ hầu 6%

- U tuyến tùng 1%

- U lympho 1%

- Các u khác 5 – 10%

b) U thứ phát: chiếm 1/3 các khối u não

- Ung thư phổi 45%

- Ung thư vú 15%

- Ung thư hắc tố 10 – 15%

- Ung thư tiêu hóa 10 – 15%

- Ung thư các cơ quan khác [11]

1.1.3.4 Phân loại theo mức độ ác tính của khối u

Một cách phân loại u não thường được các bác sỹ trên lâm sàng sử dụng đó là phân chia theo độ ác tính của nó Nhờ các công cụ chẩn đoán, việc phân loại dựa trên các tiêu chí: số lượng tế bào u phân chia, tỷ lệ phần trăm tế bào u không biệt hóa, biên độ hoại tử, mức độ tăng sinh mạch, nhân phân chia, tỷ lệ bất thường nhân Từ đó các khối u được phân độ theo độ ác tính tăng dần (I, II, III, IV) tùy theo mức độ không biệt hóa Cách phân độ này rất

ý nghĩa trong tiên lượng và điều trị bệnh

Theo cách phân loại này, các khối u tế bào hình sao của hệ thần kinh được phân độ như sau:

- U tế bào hình sao thể lông: lành tính (độ I)

- U tế bào hình sao lan tỏa (độ II)

- U tế bào hình sao giảm biệt hóa (độ III)

- U nguyên bào thần kinh đệm: ác tính (độ IV) [12]

9

1.1.4 Mô bệnh học u nguyên bào thần kinh đệm (Glioblastoma)

Các tế bào của u nguyên bào thần kinh đệm được chia thành hai loại dựa vào nguồn gốc phát sinh là u phôi thai tiên phát và u thứ phát từ tế bào hình sao

Hình ảnh đại thể của u nguyên bào thần kinh đệm khá điển hình với ranh giới hình vòng cung rõ rệt, cắt ngang u có thể gặp màu xám hay hồng, có điểm hoại tử màu vàng hoặc có màu nâu sẫm nếu có xuất huyết Thành mạch máu trong u tăng sinh dày Có thể gặp u thể nang hay nhiều ổ, u thường có mật độ mềm và chỉ cứng khi xâm lấn dính vào màng não, gây chảy máu

Hình 1.1: U nguyên bào thần kinh đệm độ IV

(Nguồn: studyblue.com)

Hình ảnh vi thể của các khối u nguyên bào thần kinh đệm rất khác nhau Khối u luôn dày đặc tế bào, nhưng có thể đồng dạng hoặc đa hình với nhiều giai đoạn trung gian giữa hai loại tế bào Tính biệt hóa thấp, giảm thiểu các nhánh bào tương và nhân bắt màu đậm, đa hình thái

Hình 1.2: U nguyên bào thần kinh đệm độ IV trên tiêu bản mô bệnh học

(Nguồn: brain – surgery.com)

Quan sát các tế bào của khối u nguyên bào thần kinh đệm, thấy rõ tính chất đa hình thái với sự bất thường của tế bào và nhân Màng tế bào nhiều nếp gấp khúc, ty thể tăng, có những sợi thần kinh trong bào tương là biểu hiện của loạn sản Các tế bào giảm biệt hóa khi chỉ có ít các bào quan nội bào như ty thể, lưới nội bào, ribosome tự do; nhân lớn, hình dạng kì dị, chia nhiều thùy

và tỷ lệ nhân/bào tương rất lớn Thường gặp hình ảnh phân bào của tế bào u,

đa phần là phân chia không điển hình mà biểu hiện là vùng trung tâm nhiễm sắc thể dài ra và teo nhỏ trung thể

Sự phát triển của khối u làm thay đổi các mạch máu trong u và vùng lân cận rất rõ Biến đổi hình thái quan trọng nhất là tăng sản nội mô mạch máu nhỏ nuôi u, đặc biệt có thể gặp các búi những tế bào nội mô xếp cụm lại Nhân tế bào nội mô trải rộng và hay gặp phân chia, có thể dày lòng mạch [13] [14]

11

Đau đầu: tính chất đau đầu trong u não là đau thường xuyên và có xu hướng ngày một tăng thêm, phát sinh khi xúc cảm mạnh, khi ho, khi đỡ bệnh nhân ngồi dậy quá mạnh, đôi khi đau tăng hoặc giảm phụ thuộc vào tư thế đầu

Đau đầu cục bộ được giải thích do yếu tố cơ học chèn ép vào các dây thần kinh sọ não hoặc các xoang tĩnh mạch gây ra phản xạ co thắt các mạch máu của não và màng não Đau đầu toàn thể là do tăng tăng áp lực nội sọ, sự kích thích các thụ cảm thể được thực hiện thông qua tăng tăng áp lực nội sọ

Phù gai thị: phù hoặc teo gai thị giác là triệu chứng khách quan khi tăng tăng áp lực nội sọ sẽ đè ép vào các bó mạch của dây thần kinh thị giác dẫn đến ứ máu tĩnh mạch và phù gai thị Phù nề gai thị sẽ dẫn đến teo gai thị giác, cho nên cần phải khám và phát hiện sớm hội chứng tăng tăng áp lực nội sọ để tránh di chứng về mắt

Rối loạn tâm thần: người bệnh thờ ơ, lãnh đạm, giảm trí nhớ, giảm tri giác [15] [16]

Các triệu chứng chẩn đoán định khu:

a) U trên lều

- U thùy trán:

Giảm trí nhớ và biểu hiện rối loạn tâm thần thường gặp như: khoái cảm châm chọc, cười không duyên cớ, đôi lúc thô bạo, có thể mất khứu giác và teo dây thần kinh thị giác

Biểu hiện đặc trưng của u thùy đỉnh là rối loạn cảm giác và rối loạn vận động; giảm cảm giác, xúc giác, mất khả năng định vị vị trí không gian

Nếu u đè ép vào hồi móc sẽ gây nên ảo khứu, ảo thính và ảo thị, rối loạn ngôn ngữ Nếu u ở đáy sọ chèn ép dây thần kinh vận nhãn chung gây sụp

mi, giãn đồng tử

Biểu hiện giảm thị lực, nếu u to lều tiểu não bị kéo căng và đẩy xuống thì các triệu chứng tiểu não xuất hiện có thể mất phản xạ giác mạc và tổn thương dây VI

Ở não thất III và IV triệu chứng điển hình là đau đầu thành cơn và đau

dữ dội, biểu hiện tăng tăng áp lực nội sọ sớm, buồn nôn, phù gai thị và gây ra tình trạng tràn dịch não thất

Rối loạn nội tiết là triệu chứng cơ bản của u tuyến yên bao gồm:

 Loạn dưỡng-phì-thiểu năng sinh dục

13

b) U sọ hố sau (dưới lều)

Các u ở góc cầu tiểu não hay gặp:

U dây thần kinh thính giác (u dây VIII), bệnh gặp nhiều ở phụ nữ nhiều hơn nam giới

U màng não phát triển ở bờ trên xương đá

Triệu chứng của u góc cầu tiểu não: ù tai, chóng mặt, giảm thính lực Nếu có biểu hiện tê ở mặt và lưỡi là do u chèn ép vào dây V

Có thể gặp ở thùy giun hoặc ở bán cầu tiểu não

Triệu chứng: đau đầu, xu hướng ngày một tăng hội chứng tăng áp lực nội sọ rõ, buồn nôn và nôn; rối loạn dáng đi, đi không vững, lảo đảo do rối loạn thăng bằng, người bệnh hay bị té ngã

Ngoài ra còn có u các dây thần kinh sọ gồm các u dây thần kinh thị giác, giao thoa thị giác, dây thần kinh thính giác [9] [10]

- Điện não đồ

Đo điện não có thể phát hiện được những sóng chậm delta, bêta ở một khu vực nào đó nếu kết hợp với các triệu chứng lâm sàng đúng đắn có thể giúp ta chẩn đoán định khu của u não

- Siêu âm

Siêu âm đường giữa, nếu có sự dịch chuyển của đường giữa từ 1-1,5cm

là có giá trị chẩn đoán Siêu âm hai chiều hay còn gọi là siêu âm Doppler, được áp dụng trong việc chẩn đoán bệnh não ở trẻ sơ sinh thóp còn hở, phương pháp siêu âm hai chiều thuận lợi và rẻ tiền trong chẩn đoán u não đối với trẻ em

Đối với người lớn có thể khoang một lỗ sọ để chẩn đoán như trên

Đây là phương tiện chẩn đoán u não trong những thập niên 70, lần đầu tiên do Egas Monis thực hiện năm 1927 qua hai đường từ động mạch cảnh trong (CAG) và động mạch đốt sống (VAG)

Ngoài ra người ta cũng chụp được động mạch não bằng kỹ thuật Seldinger (1953) bằng chọc kim vào động mạch đùi và luồn cathéter lên động mạch đốt sống

Sự tăng sinh và xô đẩy mạch máu trong não là hình ảnh gián tiếp của khối choán chỗ

Hình ảnh vi tính cho phép xác định được vị trí, kích thước của tổ chức học u não

- Chụp cộng hưởng từ (IRM)

Định vị được vị trí của u não

Đánh giá sự tương quan 3 chiều của thương tổn với tổ chức lân cận

Mục tiêu cuả việc phẫu thuật là loại bỏ u và không gây tổn thương đến

tổ chức não lành Tuy nhiên mục tiêu đó đạt được hay không còn phụ thuộc vào vị trí u nông hay sâu, u có giới hạn rõ hay không Liên quan với u, khối lượng u và trình độ chuyên khoa của phẫu thuật viên Nhờ chụp cắt lớp vi tính và kính hiển vi phẫu thuật người ta có thể lấy bỏ u một cách triệt để hơn Tuy nhiên không phải loại u nào cũng có thể lấy bỏ triệt để được, u màng não có giới hạn rõ nhưng đôi khi cũng chỉ lấy được một phần

U não ở sâu, ở hành não, thân não, ở các mạch máu lớn, ở nền sọ thì việc lấy bỏ u sẽ rất khó khăn vì gần trung khu hô hấp, tim mạch và khó cầm máu

Tia phóng xạ trước hết được dùng để diệt những tế bào ác tính còn lại sau khi cắt bỏ hoặc những u ác tính ở sâu mà người ta chỉ phẫu thuật tối thiểu Stereotaxy với kết quả giải phẫu bệnh kèm theo Người ta còn dùng để ngăn không cho các u lành tính hoặc tương đối lành tính tái phát như Adenoma tuyến yên hoặc Craniopharynoma Nói chung trong những năm qua điều trị các u não bằng tia phóng xạ đã có những bước tiến đáng kể do sự tiến bộ của trang thiết bị máy móc Hiện nay, người ta dùng dao gamma điều trị u não, phẫu thuật an toàn, hiệu quả cao

- Điều trị hoá chất

Hiện nay kết quả điều trị u ác tính bằng hoá chất rất đáng khích lệ, nhưng đối với u của mô não chưa thay đổi rõ rệt về tiên lượng Người ta khuyên chỉ nên dùng các hoá chất trong những trường hợp u ác tính phát triển nhanh, cụ thể đối với các loại Glioblastoma, Astrocytoma độ III và độ

IV Nhiều tác giả đã cho rằng hoá chất đã làm cho kết quả điều trị tốt hơn

Các hoá chất được dùng trong điều trị u não có thể kể một vài loại sau: Cyclophosphamide, 5 Fluoro-Uracyle (5FU), Methotrexate (Aethopterin), Vincristine, Mythramycine (Mithrancin), Doxorabicine

Hoá chất dùng sau tia phóng xạ, cả hai phương pháp này dùng điều trị

bổ sung sau phẫu thuật

Điều trị corticoid và điều trị bằng miễn dịch cũng được đề cập đến trong u não Mục đích của điều trị corticoid là ngăn ngừa tình trạng phù não quanh u và điều trị miễn dịch là một hướng điều trị còn ở thời kỳ nghiên cứu

Tóm lại, một u não lành tính thì việc điều trị có hiệu quả nhất là cắt bỏ triệt để nhưng còn phụ thuộc vào vị trí giải phẫu, mối liên quan về chức năng

và khối lượng của khối u Các u não ác tính khi phẫu thuật cố gắng lấy bỏ tối

đa khối lượng của chúng kèm theo điều trị phối hợp phóng xạ và hoá chất để đạt hiệu quả cao hơn [11] [16]

1.2 Gen mã hóa EGFR và con đường khuếch đại tín hiệu

1.2.1 Gen mã hóa EGFR

Gen EGFR là đoạn DNA dài 110kb nằm trên nhánh ngắn NST số 7, tại

vị trí 7p12 Gen EGFR gồm 28 exon và được xếp vào nhóm gen tiền sinh ung thư (proto – oncogen) [17]

17

Hình 1.3: Minh họa vị trí gen EGFR

(Nguồn: ghr.nlm.nih.gov)

1.2.2 Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR)

EGFR là một họ các protein đóng vai trò thụ thể liên kết bề mặt tế bào trong nhóm các yếu tố tăng trưởng biểu bì ở tế bào biểu mô, trung mô và thần kinh EGFR gồm 4 loại HER-1(ErbB1), HER-2(ErbB2), HER-3(ErbB3), HER-4(ErbB4) Những thụ thể này đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào

Phân tử EGFR có cấu trúc gồm 3 phần: phần ngoài màng là vùng giàu cystein có vai trò tiếp nhận, gắn kết với các phối tử đặc hiệu của EGFR; phần xuyên màng đặc hiệu nắm trong vùng phân cực của lớp phospholipid màng; phần trong là protein của các Tyrosine, nơi xảy ra các phản ứng tự phosphoryl hóa của EGFR [18] [19]

Hình 1.4: (a) Cấu trúc thụ thể phát triển biểu mô (EGFR); (b) Sự hoạt hóa

của EGFR [20]

Khi thụ thể EGFR tiếp nhận các phối tử EGF kích thích đặc hiệu thì con đường tín hiệu tyrosine kinase trong tế bào được hoạt hóa Có hai con đường tín hiệu chính được EGFR kích hoạt là:

 RAS RAF MEK ERK

 PI3K AKT

Một số con đường khác như STAT, PKC Khi đó vùng nội bào của EGFR sẽ tự phosphoryl hóa, khởi động mạnh mẽ quá trình khuếch đại tín hiệu lan tỏa trong khắp tế bào gây kích thích các phản ứng tổng hợp DNA, các con đường tổng hợp phiên mã và nhân lên của tế bào, tăng sinh mạch máu, ức chế chết theo chương trình [17]

19

Hình1.5: Con đường tín hiệu EGFR trong tế bào

(Nguồn: Nature.com)

1.2.3 Đột biến gen EGFR

Trong sinh lý bình thường của các tế bào, EGFR có vai trò quan trọng,

sự hoạt hóa EGFR cần thiết cho quá trình tăng sinh và biệt hóa tế bào Tuy nhiên khi các thụ thể này hoạt động quá mức sẽ dẫn đến tế bào nhân lên không kiểm soát kích hoạt quá trình hình thành khối u Một số cơ chế dẫn tới hoạt động bất thường của EGFR như sự biểu hiện quá mức của thụ thể, sự khuếch đại gen EGFR và sự đột biến gen EGFR

Đột biến gen EGFR gây ra sự hoạt động bất thường của thụ thể dẫn tới hình thành các khối u, điều này đã được làm sáng tỏ trong một số bệnh như ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư biểu mô vảy đầu cổ, ung thư đại trực tràng, ung thư vú [4] [17] [20]

Nhiều nghiên cứu về gen EGFR cho thấy đột biến tại exon 21 được biết đến là nguyên nhân quan trọng dẫn tới bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ với tỷ lệ đột biến cao, như một nghiên cứu năm 2006 là 42,7% [27], hay một nghiên cứu 2010 là 40,7% [28] Nhiều dạng đột biến ở exon 21 được phát hiện như: đột biến điểm L858R chiếm tỷ lệ lớn nhất, đột biến điểm L861Q, đột biến xóa đoạn C.2499-C.2521 del 23, đột biến thêm đoạn C.2554/2555 ins ACA [27], [28]

Tuy nhiên các nghiên cứu về gen EGFR trong bệnh u nguyên bào thần kinh đệm chưa cho thấy sự liên quan với đột biến tại exon 21, mà các đột biến dẫn tới GB xảy ra chủ yếu tại các exon 2-7 và số ít tại các exon 1, exon 9 Tại Việt Nam chưa có nghiên nào về mối tương quan giữa đột biến exon 21 gen EGFR và bệnh u nguyên bào thần kinh đệm, do đó nghiên cứu này được thực hiện vừa nhằm hoàn thiện quy trình kỹ thuật xác định đột biến gen vừa phần nào làm rõ mối liên hệ giữa đột biến exon 21 gen EGFR và bệnh u nguyên bào thần kinh đệm tại Việt Nam

1.3 Kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định đột biến gen Glioblastoma

1.3.1 Kỹ thuật khuếch đại gen – PCR và PCR lồng

1.3.1.1 Kỹ thuật PCR

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp), nó được coi như một “máy photocopy” trong y sinh học

Phương pháp PCR được Kary mullis và cộng sự phát minh năm 1983,

từ đây nó đã mở ra một trang mới cho sự phát triển của ngành y sinh học nói riêng và đóng góp to lớn cho sự phát triển khoa học của nhân loại PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại một đoạn DNA trong ống nghiệm mà vẫn tuân theo các nguyên tắc nhân lên tự nhiên

21

Nguyên tắc:

Nguyên tắc của phản ứng khuếch đại gen này dựa vào hoạt tính của các DNA polymerase có khả năng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotid Phản ứng này đòi hỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tự DNA khuôn PCR gồm 3 giai đoạn dựa trên sự thay đổi của nhiệt độ của phản

ứng : giai đoạn biến tính, giai đoạn gắn mồi và giai đoạn kéo dài

Mồi là những đoạn oligonucleotid có chiều dài khoảng 15-30 nucleotid

Để thực hiện nhân một đoạn DNA bằng phản ứng PCR, cần có một cặp mồi

thích hợp, gồm mồi xuôi và mồi ngược bắt cặp đặc hiệu với DNA khuôn

- Các nucleotide tự do:

Gồm 4 loại deoxynucleotid triphosphate (dNTPs): dATP, dTTP, dGTP

và dCTP, được dùng làm cơ chất tổng hợp DNA Khi hàm lượng dNTP tự do quá ít sẽ dẫn tới sản phẩm PCR hạn chế không đủ để phát hiện Ngược lại

nồng độ dNTP cao thì phản ứng PCR khó thực hiện

- Enzym DNA polymerase:

Là yếu tố đóng vai trò quyết định hiệu quả của phản ứng PCR Enzym thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase, được phân lập từ vi khuẩn

Thermus aquaticus sống ở nhiệt độ cao Hàm lượng enzym ảnh hưởng rất lớn

đến hiệu quả PCR

- Dung dịch đệm cho phản ứng PCR:

Dung dịch đệm của phản ứng PCR cần đảm bảo các thành phần cần thiết cho hoạt động của enzym DNA polymerase như MgCl2, KCl, Tris-HCl…Trong đó, Mg2+ là thành phần ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả phản ứng PCR do ion Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạnh khuôn

Các bước của phản ứng PCR

Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), phân tử DNA được biến

tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94oC

- 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút

Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp cho

phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài khoảng 30 giây - 1 phút

Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ được

tăng lên 72oC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất

Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự chuỗi DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút