Ứng dụng kỹ thuật reverse dot blot để xác định genotype HPV trong dịch cổ tử cung

Phương pháp sequencing giải trình tự gen - so sánh, đối chiếu với trình tự gen các type HPV được coi là tiêu chuẩn vàng nhưng giá thành cao, tốn nhiều thời gian và không xác định được đồ

Để có thể hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được sự giúp đỡ hết sức tận tình của các thầy, các cô, các anh chị kĩ thuật viên trong bộ môn Y sinh học - Di truyền và các bệnh nhân đến khám tại Bộ môn

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lương Thị Lan Anh, Phó chủ nhiệm bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội Cô đã giao đề tài, tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, động viên, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình em thực hiện và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô, anh, chị trong bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ, quan tâm, đóng góp ý kiến, chia sẻ kinh nghiệm, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo Đại học trường Đại học Y Hà Nội đã quan tâm, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Mặc dù, em đã cố gắng để hoàn thiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất, song do buổi đầu mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học cùng với nhiều hạn chế về kiến thức cũng như kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu sót nhất định mà bản thân chưa nhìn thấy được Vì vậy, em rất mong nhận được sự góp ý của quý thầy, cô để khóa luận được hoàn chỉnh hơn

Sau cùng, em muốn cảm ơn gia đình, các anh chị em, bạn bè đã giúp

đỡ, động viên em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Hà Nội, ngày tháng 6 năm 2015

Sinh viên Trần Thị Thanh Thanh

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì một công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng 6 năm 2015

Sinh viên Trần Thị Thanh Thanh

LỜI CAM ĐOAN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm chung của HPV 3

1.2 Cơ chế gây bệnh 6

1.3 Tình hình nhiễm HPV ở Việt Nam và trên thế giới 9

1.4 Các phương pháp chẩn đoán và xác định genotype HPV 10

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

Chương 3 KẾT QUẢ 27

3.1 Thông tin chung đối tượng nghiên cứu 27

3.2 Phân tích kết quả xác định genotpye HPV 28

3.3 Kết quả xác định genotype HPV trong dịch cổ tử cung 31

Chương 4 BÀN LUẬN 40

4.1 Về kết quả xác định genotype HPV bằng kĩ thuật RDB 40

4.2 Về kết quả xác định genotype HPV 43

KẾT LUẬN 50

KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Significance (Tổn thương tế bào nội biểu mô vảy không điển hình ý nghĩa chưa xác định)

HSIL High - grade Squamous Intraepithelial Lesion (Tổn

thương tế bào nội biểu mô vảy độ cao) IARC International Agency for Research on Cancer (Tổ chức

nghiên cứu ung thư quốc tế) LSIL Low - grade Squamous Intraepithelial Lesion (Tổn

thương tế bào nội biểu mô vảy độ thấp)

RDB Reverse Dot Blot (Kĩ thuật lai phân tử ngược)

Bảng 2.1 Trình tự primer MY09 - MY11 của PCR phát hiện DNA HPV 19

Bảng 2.2 Trình tự Nu của 24 probe HPV trên màng lai 24

Bảng 3.1 Phân bố nhóm tuổi 27

Bảng 3.2 Phân bố kết quả PAP test 27

Bảng 3.3 Kết quả định tính HPV bằng kĩ thuật Realtime PCR 31

Bảng 3.4 Phân bố nhiễm đơn type HPV 34

Bảng 3.5 Tỉ lệ đồng nhiễm các type HPV 35

Bảng 3.7 Kết quả PAP test và sự đồng nhiễm HPV 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh mô phỏng HPV 3

Hình 1.2 Hệ gen của HPV 4

Hình 2.1 Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 17

Hình 2.2 Kết quả Realtime PCR 20

Hình 2.3 Mẫu dương tính với genotype 11 23

Hình 3.1 Kết quả phân tích Realtime PCR định tính genotype HPV 29

Hình 3.2 Hình ảnh màng lai dương tính với type 11 30

Hình 3.3 Hình ảnh màng lai dương tính với các type 11, 16 và 18 30

Hình 3.4 Hình ảnh màng lai dương tính với type HPV ngoài 24 type trên 31

Hình 3.5 Biểu đồ tỉ lệ nhiễm HPV 32

Hình 3.6 Biểu đồ tỉ lệ nhiễm HPV theo tuổi 33

Hình 3.7 Biểu đồ tỉ lệ nhiễm HPV đơn type và đa type 33

Hình 3.8 Biểu đồ sự đồng nhiễm HPV 34

Hình 3.9 Biểu đồ phân bố các type HPV 36

Hình 3.10 Kết quả PAP test và tỉ lệ nhiễm HPV 37

Hình 4.1 Hình ảnh màng lai dương tính với các type HPV 71, 81, 18, 56 42

Hình 4.2 Hình ảnh màng lai dương tính với type HPV 11 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

Human papilloma virus (HPV) là loại virus sinh u nhú ở người, là một trong những tác nhân lây nhiễm qua đường sinh dục phổ biến Nhiễm HPV ở người thường gây ra các trạng thái tăng sinh nội biểu mô ở nhiều dạng khác nhau Dựa vào khả năng tiềm tàng gây ung thư, HPV được chia thành 2 nhóm: nhóm nguy cơ cao và nhóm nguy cơ thấp, đặc biệt nhóm nguy cơ cao

có thể biểu hiện thành các khối u điển hình như ung thư cổ tử cung (UTCTC),

u biểu mô vùng hậu môn - sinh dục (âm hộ - âm đạo, vùng trực tràng, hậu môn, dương vật) và các khối u ở vòm họng, hầu họng [1] Trong đó, UTCTC

là một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên thế giới và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu của phụ nữ ở các nước đang phát triển Do

đó, việc phòng bệnh cũng như điều trị UTCTC ngày càng được quan tâm [2], [3]

HPV được phát hiện ở trên 95% số trường hợp mắc UTCTC [4] Khả năng diễn tiến đến UTCTC ở trường hợp nhiễm HPV kéo dài gấp 250 lần so với người không bị nhiễm [5] Trên toàn thế giới, có khoảng 50 ÷ 80% phụ nữ

có quan hệ tình dục bị nhiễm HPV ít nhất một lần trong đời, nhưng bệnh ít được biết đến vì sự nhiễm bệnh hầu như không gây ra triệu chứng lâm sàng đáng phải quan tâm [6], [7] Quá trình nhiễm virus là lâu dài, trung bình từ giai đoạn loạn sản (giai đoạn tổn thương có thể hồi phục) đến giai đoạn ung thư xâm nhập (việc điều trị đem lại ít hiệu quả) là từ 8 ÷ 10 năm [8] Vì vậy, sàng lọc trong nhóm nguy cơ cao để phát hiện và điều trị ở giai đoạn sớm tổn thương tiền ung thư là hết sức cần thiết

Việc xác định các genotype HPV (type HPV) có vai trò vô cùng quan trọng trong việc đánh giá nguy cơ UTCTC cũng như điều trị sớm

Có nhiều phương pháp phát hiện sớm sự có mặt của HPV Phương pháp PAP smear (xét nghiệm tế bào học cổ tử cung) cho biết sự thay đổi hình

thái tế bào bị nhiễm HPV, có tỉ lệ âm tính giả dao động từ 1,1 ÷ 29,7% [8], tuy nhiên không xác định được type HPV [9] Phương pháp Ts - PCR (Type specific - PCR) phải qua bước phát hiện sản phẩm PCR, điện di agarose sử dụng Ethidium bromide Phương pháp sequencing (giải trình tự gen - so sánh, đối chiếu với trình tự gen các type HPV) được coi là tiêu chuẩn vàng nhưng giá thành cao, tốn nhiều thời gian và không xác định được đồng nhiễm Kĩ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (RDB) sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phân biệt sự khác nhau giữa các alen ở vị trí một nucleotide (Nu) So với các

kĩ thuật trên, kĩ thuật Reverse Dot Blot đã khắc phục được một số nhược điểm, đồng thời có thể xác định sự nhiễm và đồng nhiễm các type HPV trên cùng một mẫu bệnh phẩm Song ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về kĩ thuật này được thực hiện

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Ứng dụng kĩ thuật Reverse Dot Blot để xác định genotype HPV trong dịch cổ tử cung”

với mục tiêu:

1 Phân tích được kết quả xác định genotype HPV bằng kĩ thuật Reverse Dot Blot

2 Mô tả các genotype HPV trong dịch cổ tử cung xác định được bằng

kĩ thuật Reverse Dot Blot

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm chung của HPV

1.1.1 Cấu trúc phân tử

HPV có kích thước nhỏ, đường kính 55 nm, không có vỏ bọc ngoài cùng Dưới kính hiển vi điện tử, HPV giống quả bóng golf Cấu trúc đối xứng hình khối gồm 72 capsomer, protein cấu trúc capsid gồm 2 lớp: lớp 1 (kí hiệu

là L1 - protein bề mặt) là lớp vỏ lớn, cấu trúc hình khối từ các đơn vị 5 góc cạnh; lớp 2 (kí hiệu là L2 - protein cấu trúc) là lớp vỏ bé gồm nhiều đơn vị

Hình 1.2 Hệ gen của HPV

Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Human-papilloma-virus

Chú thích: Long control region: vùng điều hòa lớn E1, E2, E4, E5, E6, E7: các gen vùng sao chép sớm

L1, L2: các gen vùng sao chép muộn

Phân vùng thứ 1: vùng điều hòa lớn (long control region - LCR) là

vùng chứa DNA không mã hóa, dài 400 ÷ 1.000 bp, có chức năng điều hòa sao chép, gồm chuỗi p97 là tiểu phần khởi động (p97 core promoter), các tiểu phần kích hoạt và một số chuỗi gen “câm” [10]

Phân vùng thứ 2: vùng sao chép sớm (early region - E) gồm các gen:

E1, E2, E4, E5, E6, E7 Sản phẩm protein của chúng trợ giúp cho sự nhân lên của DNA virus, tham gia cơ chế hình thành khối u cổ tử cung

Phân vùng thứ 3: vùng sao chép muộn (late region - L), gồm các gen

tổng hợp protein L1, L2 - những protein cấu trúc capsid của virus, được sản xuất muộn hơn

1.1.2 Phân loại

Hầu hết các Papilloma Virus (PV) gây bệnh, có biểu hiện lâm sàng ở động vật và người, đều thuộc siêu nhóm A (PV thích ứng đường sinh dục và niêm mạc) hoặc B (PV gây u xơ cứng biểu mô sùi) Siêu nhóm C và D gồm các PV gây khối u xơ papilloma và khối u đích thực do PV gây ra Siêu nhóm

E chưa được phân loại chính xác, là hỗn hợp PV thích ứng và gây khối u ở da HPV là virus sinh u nhú ở người thuộc siêu nhóm A, chủ yếu gồm virus gây UTCTC ở người gồm 12 nhóm phụ từ A1 ÷ A12, trong đó các type HPV thuộc nhóm A9 là các virus có khả năng gây UTCTC cao

PV được phân chia tiếp tục thành các genotype, gọi tắt là các type Đối với HPV, được coi là cùng type nếu gen L1 không khác nhau > 10% Tuy nhiên có nhiều trường hợp, phân type HPV không hoàn toàn dựa vào chênh lệch % Nu trong gen L1 mà còn xem xét thêm đặc tính gây bệnh các type [11], [12]

Hiện nay, HPV có khoảng 100 type khác nhau đã được xác định, mỗi type có hàng chục phân type (subtype), mỗi phân type lại có hàng chục biến thể (variant) khác nhau gọi là chủng virus Các chủng virus thường được đặt tên theo các địa danh, nhân danh, tuy nhiên nếu phân tích về mặt di truyền, nhiều chủng có tên khác nhau lại rất có thể thuộc một biến thể Do sự biến động và đa dạng này nên việc định type và định chủng của HPV khá phức tạp, đòi hỏi kĩ thuật cao và chính xác Việc định type và chủng của HPV dựa vào kết quả phân tích và xác định mức độ giống nhau của thành phần Nu cũng như mức độ tương đồng giữa các thành phần Nu của các gen E6, E7 và L1

Một mẫu virus HPV mới phân lập sẽ được gọi là cùng type với một type HPV đã xác định trước đó nếu thành phần của các chuỗi E6, E7 và L1 có mức độ đồng nhất > 90% [13]

Những mẫu virus khác nhau trong cùng một type lại được chia thành các phân type (biến thể/chủng) trên cơ sở phân tích sự biến đổi Nu và acid amin của các gen sao chép sớm (E) và sao chép muộn (L) Về nguyên tắc, một virus HPV được coi là đồng phân type (đồng chủng) nằm trong một type HPV nào đó nếu như thành phần Nu và acid amin của chúng có mức độ tương đồng từ 90 ÷ 98% Một biến thể độc lập của virus HPV phải có sai khác ít nhất là 2% so với biến thể khác Khi so sánh, nếu sự sai khác < 2%, chúng được coi là cùng biến thể Tuy có sai khác ít về hệ gen nhưng có một số biến thể HPV trong tự nhiên lại có đặc tính sinh học và hóa sinh học khác nhau, đặc biệt là khả năng gây ung thư và cơ chế hình thành khối u cổ tử cung [14]

Dựa trên tổn thương mô học (khả năng gây UTCTC), mà người ta chia

ta thành 3 nhóm [15], [16]:

Nguy cơ cao: gồm các type HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,

58, 59, 68, 73, 82 và HPV 26, 53, 66: gây tổn thương tiền ung thư và ung thư

Nguy cơ thấp: gồm các type HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72,

81, 89 và CP6108: gây mụn cóc và các khối u lành tính

Nhóm chưa xác định được nguy cơ: gồm các type HPV 2a, 3, 7, 10, 13,

27, 28, 29, 30, 32, 34, 55, 57, 62, 67, 69, 71, 74, 77, 83, 84, 85, 86, 87, 90, 91: chưa xác định được khả năng gây ung thư

Tuy nhiên có một số type như type 7, 10, 71, theo nghiên cứu được thực hiện năm 2004 của nhóm tác giả Ethel - Michele de Villiers và cộng sự, lại xếp vào nhóm nguy cơ thấp [17]

1.2 Cơ chế gây bệnh

Cơ chế HPV gây UTCTC đã được Massimi và Banks [18] giải thích như sau: ở người và động vật có 2 loại protein điều chỉnh sự phân chia và mức độ phát triển tế bào là RB (retinoblast) và p53 (protein điều hòa khối u) Khi 2 gen E6 và E7 của HPV tổng hợp protein, các protein này tiếp xúc với

RB và p53 gây cản trở quá trình điều chỉnh sự phân chia tế bào, kết quả là tế bào bị nhiễm HPV sinh sản tự phát, không có sự kiểm soát, thay đổi cấu trúc, gen không thể sửa chữa được và phát triển thành ung thư Trong giai đoạn sớm, những tế bào cổ tử cung bị nhiễm có thể chỉ thay đổi nhỏ về hình dáng

và kích thước, dẫn đến bị biến dạng, rối loạn trật tự cấu trúc, phá hủy biểu mô

bề mặt cổ tử cung Những thay đổi này sẽ gây loạn sản hoặc hình thành khối tân tạo hoặc ung thư trong biểu mô cổ tử cung [9], [19]

HPV lây truyền chủ yếu qua đường tình dục và có thể lây truyền khi tiếp xúc trực tiếp từ da qua da HPV có khả năng thích ứng ở biểu mô sừng và niêm mạc gây tăng sinh tế bào biểu mô và biến đổi tế bào dẫn đến ung thư qua các bước sau [20], [21]:

(1) Xâm nhập chuỗi gen của HPV vào tế bào chủ: bộ gen HPV xâm

nhập vào chuỗi gen của vật chủ ở dạng episome (DNA dạng vòng ở ngoài nhiễm sắc thể vật chủ) đối với nhóm “nguy cơ thấp” hoặc tích hợp DNA vào nhiễm sắc thể vật chủ đối với nhóm “nguy cơ cao” Ở dạng episome, vùng gen mã hóa E2 không bị biến đổi Nồng độ protein E2 tăng lên cùng với sự tăng sinh sao chép DNA HPV, gây hiện tượng tăng sinh tế bào đồng thời ức chế giải mã gen sớm kìm chế hoạt động của E6 và E7 Khi E6 và E7 bị kìm chế, sẽ hoạt hóa con đường p53 và yếu tố ức chế hình thành u của protein RB, giúp tế bào hoặc sửa chữa hoặc chết theo chương trình, phụ thuộc mức độ của

sự tác động phá hủy Do đó, có hiện tượng tăng sinh một số lượng lớn tế bào nhưng vẫn dưới sự kiểm soát của p53 và protein RB

Khi chuỗi gen HPV xâm nhập vào nhiễm sắc thể vật chủ sẽ phá vỡ gen E2 và giải phóng sự kìm chế hoạt động của E6 và E7 Hai oncogen E6, E7 có khả năng gắn và làm giảm chức năng của p53 và protein RB, đây là điều kiện quan trọng để gây biến đổi gen của tế bào chủ [22]

(2) Gây bất tử hóa tế bào: protein E6, E7 của các genotype HPV nhóm

“nguy cơ cao” còn có khả năng kết hợp với protein ras Protein ras là phân tử truyền thông tin trong tế bào, khi protein ras được hoạt hóa làm tế bào phát triển, biệt hóa và duy trì sự sống Gen mã hóa protein ras được coi là gen gây ung thư phát hiện đầu tiên Cơ chế của protein E6 gây bất tử tế bào đã được chứng minh bằng khả năng bất hoạt p53, bộc lộ hTERT (human telomerase reverse transcriptase) và tăng hoạt động telomerase [22]

(3) Bất ổn định gen tế bào chủ: bất thường quá trình phân bào có thể

gây ra bởi protein E6 và E7 của các genotype nhóm “nguy cơ cao” mà không gặp ở genotype nhóm “nguy cơ thấp”, gây mất alen ở một số gen nhất định

mà các gen này liên quan đến sự xuất hiện và tiến triển của ung thư E6 gây bất ổn định gen do khả năng ức chế chức năng p53 dẫn đến rối loạn quá trình sửa chữa ADN bình thường và hậu quả gây thay đổi gen E7 gây bất ổn định gen thông qua sự bất hoạt của protein RB và tác động lên quá trình tổng hợp trung thể, hậu quả gây biến đổi sự chia tách DNA trong quá trình phân bào [23]

(4) Biến đổi đáp ứng với phá hủy DNA: gen E6 và E7 có thể gây mất

khả năng đáp ứng của cơ thể với sự phá hủy DNA Khi có sự phá hủy DNA,

cơ thể đáp ứng bởi hoạt hóa p53 tạo ra protein điều hòa quá trình nghỉ giữa hai chu trình nhân lên của tế bào E6 và E7 có khả năng ức chế quá trình nghỉ giữa phân bào được điều khiển bởi p53 E6 chỉ kết hợp và bất hoạt p53, trong khi E7 không chỉ gây rối loạn chức năng của yếu tố điều hòa chu trình tế bào, pRB mà còn bất hoạt p21 là chất ức chế enzym kinase phụ thuộc cycline, yếu

tố do p53 hoạt hóa [24]

(5) Tăng sinh và biệt hóa tế bào: HPV nhân lên theo quá trình biệt hóa

của tế bào đáy dưới dạng episome, đồng thời trong các tế bào lớp trên tế bào

đáy, chúng nhân lên và thoát khỏi chu trình nhân lên của tế bào nhờ vai trò tái thiết lập chương trình tổng hợp DNA ở tế bào sừng bị nhiễm E6, E7 HPV [25]

1.3 Tình hình nhiễm HPV ở Việt Nam và trên thế giới

1.3.1 Trên thế giới

Bắt đầu có sự nghiên cứu về HPV từ năm 1974 - 1976 và HPV được chứng minh là nguyên nhân gây UTCTC nhưng mãi đến những năm 1980, ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử đã xác định sự có mặt của HPV trong

mô bệnh phẩm ung thư [26], [28] Hai type HPV được tìm ra đầu tiên là HPV

16, 18 [26], [27] Gần 200 type được biết đến, nhưng chỉ xác định được khoảng 100 type bao gồm khoảng 40 type có khả năng lây truyền qua đường sinh dục [29]

Năm 1983, Hausen Z H và cộng sự đã tìm ra mối liên quan giữa HPV

và UTCTC Năm 2008, ông đã được nhận giải thưởng Nobel về y học

Vaccine HPV được Frazer I cùng cộng sự tìm ra năm 2005 Hiện nay, vaccine HPV được sử dụng rộng rãi ở các quốc gia, chế phẩm Gardasil được cấp phép bởi Cục quản lí thực phẩm và dược phẩm Mỹ năm 2006 và Cervarix được phê duyệt 3 năm sau đó [30], [31], [32]

Năm 2010, Ronco G và cộng sự đã báo cáo về thử nghiệm ngẫu nhiên trên hơn 40.000 phụ nữ sàng lọc bằng tế bào và sàng lọc bằng test HPV, cho thấy sàng lọc bằng test HPV hữu hiệu hơn sàng lọc bằng tế bào trong dự phòng ung thư xâm lấn [33]

Năm 2013, Lauren E W và cộng sự nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch

tự nhiên chống lại tác nhân gây ung thư HPV trong phân loại ASCUS - LSIL [34]

Về tần suất nhiễm HPV, theo kết quả báo cáo của Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC), trên toàn thế giới có khoảng 6,6% phụ nữ độ tuổi từ

15 ÷ 74 bị nhiễm HPV và khoảng 80% phụ nữ nhiễm HPV ít nhất một lần trong suốt đời sống tình dục của họ [35]

1.3.2 Ở Việt Nam

Tại Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu về HPV được tiến hành

Năm 2005, Nguyễn Thị Ánh Hồng nghiên cứu về sử dụng kĩ thuật PCR phát hiện virus gây ung thư cổ tử cung (HPV) ở một số bệnh nhân tại Hà Nội [14]

Năm 2006, Vũ Thị Nhung khảo sát tình hình nhiễm các type HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh bằng kĩ thuật PCR [36]

Năm 2009, Lê Trung Thọ và Trần Văn Hợp nghiên cứu tỉ lệ nhiễm HPV ở cộng đồng phụ nữ Hà Nội và một số yếu tố liên quan [37]

Năm 2014, Hoàng Thị Thanh Huyền xác định tỉ lệ nhiễm và genotype của Human Papilloma Virus trên gái mại dâm tại Hải Phòng [38]

Về dịch tễ học, theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Trọng Hiếu tỉ lệ nhiễm HPV trong cộng đồng dân cư nữ từ 2% đến 10,9% thay đổi theo vùng địa lý, miền Nam Việt Nam có tỉ lệ nhiễm cao hơn miền Bắc Việt Nam [39]

1.4 Các phương pháp chẩn đoán và xác định genotype HPV

1.4.1 Phương pháp tế bào học (PAP smear/PAP test)

Năm 1943, Papanicolaou cùng cộng sự đã giới thiệu kết quả nghiên cứu của mình trong một bài báo nổi tiếng “Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear” (chẩn đoán ung thư bằng phết tế bào âm đạo) Từ đó đến nay, phương pháp này đã có nhiều cải tiến để tăng tính chính xác và hiệu quả, hiện nay đang được sử dụng rộng rãi

PAP smear hay còn gọi là PAP test, là xét nghiệm tế bào học cổ tử cung Biểu hiện của nhiễm HPV là sự có mặt của tế bào “rỗng” Koilocyte hay

“tế bào bóng” đặc trưng với hình ảnh màng tế bào dày lên do sự cô đặc của

bào tương, protein đặc lại ở sát màng tế bào Tế bào Koilocyte điển hình có vùng sáng trong bào tương, quầng sáng quanh nhân và nhân thường nằm lệch

Những bất thường của tế bào biểu mô do HPV bao gồm sự biến đổi tế bào từ giai đoạn mới ASCUS (tổn thương tế bào nội biểu mô vảy không điển hình ý nghĩa chưa xác định), LSIL (tổn thương tế bào nội biểu mô vảy độ thấp) tới các tổn thương tiền ung thư HSIL (tổn thương tế bào nội biểu mô vảy độ cao) và ung thư biểu mô vảy tại chỗ hoặc xâm nhập [40]

Theo phân loại mới của hệ thống Bethesda 2001, các dạng tổn thương

tế bào trên PAP test: ASCUS, LSIL, HSIL có đặc điểm sau [46]:

ASCUS (Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance): tổn thương tế bào nội biểu mô vảy không điển hình ý nghĩa chưa xác định, đôi khi

do HPV

LSIL (Low - grade Squamous Intraepithelial Lesion): tổn thương tế bào nội biểu mô vảy mức độ thấp, thường gặp, nhất là ở phụ nữ trẻ, thường được coi là tổn thương do HPV, đa số tự khỏi sau vài tháng đến vài năm

HSIL (High - grade Squamous Intraepithelial Lesion): tổn thương tế bào nội biểu mô mức độ cao Tổn thương này có kích thước và hình dạng tế bào khác nhiều so với tế bào bình thường, là tổn thương nặng, có thể tiến triển thành ung thư nếu không được điều trị đúng và kịp thời

Phương pháp PAP smear được sử dụng để sàng lọc vì đơn giản, dễ thực hiện Tuy nhiên, nó chỉ cho biết sự thay đổi hình thái tế bào bị nhiễm HPV, không xác định được type HPV, có tỉ lệ âm tính giả dao động từ 1,1 ÷ 29,7% [6], [8]

1.4.2 Chẩn đoán HPV bằng các kĩ thuật sinh học phân tử

1.4.2.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR do Karry Mullis và cộng sự phát minh năm 1983 là một phương pháp tổng hợp DNA in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào Ngày nay,

PCR đã trở thành một trong những kĩ thuật đầu tiên và được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực sinh học phân tử

PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của enzym DNA - polymerase chịu nhiệt Để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotid (có độ dài từ 6 ÷ 30 Nu) Đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép dưới tác dụng của enzym DNA - polymerase để tổng hợp nên một đoạn DNA đặc thù

PCR trong trường hợp này phải sử dụng các cặp mồi (primer) chung cho nhiều type HPV, nhưng chỉ riêng cho HPV mà không chung cho các virus khác Cặp mồi cổ điển nhất được thiết kế là MY09 - MY11, có khả năng nhân lên được đoạn DNA có độ dài 450 cặp nucleotide, nằm trong gen L1 là gen cấu trúc vỏ capsid của HPV Cặp mồi thứ hai là GP5 - GP6 cũng được sử dụng để thu nhận một đoạn DNA nằm bên trong giới hạn của vùng DNA do MY09 - MY11 nhân lên [41]

Có khoảng 7% số lượng phản ứng PCR với cặp mồi MY09 - MY11 không cho kết quả phát hiện DNA HPV, có thể do không có DNA của virus HPV trong tế bào ung thư của mẫu nghiên cứu hoặc DNA - HPV đã nhập gen vào tế bào cổ tử cung và do vậy virus không còn tồn tại trong bệnh phẩm [42]

Nhiều phương pháp nghiên cứu được sử dụng để định type HPV sau khi nhân một đoạn gen bằng kĩ thuật PCR với các cặp mồi chung Cặp mồi chung của PCR hoạt động trên hệ gen HPV của nhiều type, nhưng không cho biết sản phẩm PCR là của type nào Do vậy, việc xác định type chỉ có thể thành công sau khi phân tích sản phẩm Trong nhiều cách phân tích, người ta thường sử dụng phương pháp giải trình tự (sequencing) và so sánh đối chiếu các chuỗi Nu và acid amin của sản phẩm hoặc sử dụng phương pháp phân tử với các mẫu dò DNA đã biết

1.4.2.2 Realtime PCR

Kĩ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỉ bản sao dựa vào các chu kì nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được Realtime PCR là phương pháp khuếch đại đích có độ nhạy cao, thường được sử dụng trong định tính và định lượng DNA HPV

Phát hiện HPV bằng phương pháp Realtime PCR có nhiều ưu điểm hơn

so với PCR - điện di: có thao tác đơn giản và thời gian ngắn hơn, độ nhạy và

độ đặc hiệu cao hơn, không phải trải qua bước điện di trên thạch agarose sử dụng Ethidium bromide có tính độc, đồng thời tránh được ngoại nhiễm sản phẩm PCR dẫn đến dương tính giả

1.4.2.3 Ts - PCR (Type specific - PCR)

Phương pháp Ts - PCR đặc hiệu theo type là phương pháp PCR phát hiện riêng cho từng type HPV khác nhau dựa vào sự khác nhau trên vùng gen E6 và E7, đây là các gen “độc”, quyết định độc lực của HPV (tính gây bệnh của HPV) và chúng có mức độ biến đổi khác nhau Hiện nay, đã có 14 cặp mồi đặc hiệu cho PCR, sử dụng một cách đặc hiệu và nhạy, nhân đoạn gen có

độ dài 100 bp trong gen E7, phát hiện HPV thuộc các type 16, 18, 31, 33, 35,

1.4.2.4 Sequencing

Năm 1975, Frederick Sanger đã phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng enzym Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực bởi tính chính xác của nó

Phương pháp sequencing là phương pháp giải trình tự gen, so sánh, đối chiếu với trình tự gen các type HPV, được sử dụng để định genotype HPV với các mẫu đã có kết quả PCR dương tính Phương pháp này được coi là tiêu chuẩn vàng nhưng giá thành cao, tốn nhiều thời gian và không xác định được đồng nhiễm

1.4.2.5 Kĩ thuật RDB

RDB là một kĩ thuật lai phân tử Kĩ thuật lai phân tử sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một bộ lọc hay màng theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (Dot Blot) được Kafatos và cộng sự (1979) đưa ra Với kĩ thuật này, các trình tự đích được cố định trên màng lai sau đó được lai với mẫu dò (thường là trình tự acid nucleic đã đánh dấu) Saiki và cộng sự (1989) đã cải tiến kĩ thuật lai phân tử theo một cách khác, đó là kĩ thuật RDB, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và sau đó lai với các trình tự đích

Lai theo phương pháp RDB là phương pháp sàng lọc nhanh thường được thực hiện với những mẫu dò đặc hiệu (ASO: allele - specific oligonucleotid) để phân biệt sự khác nhau giữa các alen ở vị trí một Nu Phương pháp này không cần điện di trên thạch mà thấm trực tiếp từ đó để xác định những đoạn Nu khác nhau, thao tác đơn giản, cho kết quả nhanh, độ nhạy, độ đặc hiệu cao

Xác định các genotype HPV bằng kĩ thuật lai phân tử tiên tiến RDB có thể xác định chính xác sự nhiễm và đồng nhiễm của các genotype HPV trên cùng một mẫu bệnh phẩm, bộ kit thường sử dụng hiện nay xác định được 24

type (gồm 16 type nguy cơ cao: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58,

59, 66, 68, 82 và 8 type nguy cơ thấp: 6, 11, 42, 43, 61, 70, 71, 81), đây là những lợi thế so với phương pháp giải trình tự gen Đồng thời, kĩ thuật được thực hiện trên những mẫu có kết quả Realtime PCR dương tính, làm tăng thêm độ nhạy của xét nghiệm này

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Gồm 50 bệnh phẩm được lấy từ dịch cổ tử cung của 50 bệnh nhân nữ,

độ tuổi từ 20 ÷ 69, đã được làm xét nghiệm tế bào học - PAP test có những thay đổi bất thường của tế bào biểu mô ở các mức độ khác nhau

Các bệnh nhân được khám lâm sàng và làm xét nghiệm tế bào học tại Bệnh viện Phụ sản trung ương và phòng khám số 1 Bệnh viện Đại học Y Hà Nội

Xét nghiệm xác định genotype HPV được tiến hành tại bộ môn Y sinh học - Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Loại hình nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang

2.2.2 Thời gian

Từ tháng 9/2014 đến tháng 3/2015

2.2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu

Lấy mẫu và bảo quản mẫu: để bảo đảm xét nghiệm genotype HPV được chính xác, quy trình lấy mẫu và bảo quản mẫu của bác sĩ lâm sàng được thực hiện theo các bước hướng dẫn của phòng sinh học phân tử, Bộ môn Y sinh học - Di truyền (được trình bày ở phần 2.2.3.1)

- Thu thập thông tin, làm bệnh án theo mẫu (phụ lục)

- Thu nhận và xử lí bệnh phẩm: ghi tên tuổi bệnh nhân, ngày xét nghiệm, bảo quản mẫu theo tiêu chuẩn…

- Tách chiết DNA của HPV

- Thực hiện Realtime PCR định tính HPV

- Mẫu dương tính với HPV sẽ được đem lai, xác định genotype HPV bằng kĩ thuật RDB

- Đọc và phân tích kết quả lai

Hình 2.1 Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu

2.2.3.1 Cách lấy mẫu và bảo quản mẫu

- Dụng cụ lấy mẫu: tăm bông vô trùng và dịch bảo quản mẫu

- Cho que tăm bông vô trùng vào lỗ cổ tử cung (vùng ranh giới giữa cổ trong và cổ ngoài) xoay nhẹ vài lần và giữ khoảng 1 phút, sau đó lấy tăm

bông ra (chú ý: khi lấy tăm bông ra tránh để chạm vào thành âm đạo)

- Cho tăm bông đã lấy vào tube eppendorf sạch chứa dung dịch bảo quản

TE

- Dùng tay bẻ phần đầu dụng cụ lấy mẫu cho lọt hẳn vào trong tube

- Đậy nắp eppendorf thật chặt sau khi cho mẫu vào (không để tăm bông nhô lên miệng tube làm hở nắp gây đổ mẫu)

- Bảo quản mẫu trong ngăn đá tủ lạnh hoặc ở -200C cho đến khi tiến hành xét nghiệm

2.2.3.2 Tách chiết DNA HPV

- Đánh dấu các tube 1,5 ml vô trùng bằng kí hiệu mẫu

- Vortex eppendorf chứa bệnh phẩm

- Kết tủa DNA:

Thu 600 µl dịch nổi có chứa DNA vào 1 tube vô trùng có sẵn 600 µl dung dịch isopropanol Trộn đều, để yên trong 10 phút Ly tâm 13.000 vòng/phút trong vòng 10 phút

Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh (hoặc hồng) Cho từ từ 900 µl dung dịch ethanol 70% vào Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút

Loại bỏ dịch nổi, thu cặn Để khô ở 600C trong 10 ÷ 15 phút Cho vào

100 µl dung dịch TE 1X Trước khi sử dụng dùng pipet trộn đều cho đến khi phần cặn tan hoàn toàn

- Bảo quản mẫu DNA ở -200C

Mỗi mẫu DNA được chiết tách từ dịch cổ tử cung được thực hiện với 3 phản ứng PCR: phản ứng của mẫu, phản ứng của chứng dương, phản ứng của chứng âm Trong thành phần của phản ứng gồm có: DNA mẫu, mồi, chứng nội và các thành phần cho phản ứng PCR (Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, H2O)

Chu kì luân nhiệt: 40 chu kì luân nhiệt (95oC - 5 phút/50oC - 30 giây/720C - 30 giây)

Tiến hành

- Bật máy Realtime PCR trước 15 phút, bật máy tính và cài đặt chương trình

- Cho 10 µl chứng (+) hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube, ly tâm

và chuyển ngay các tube vào máy Realtime PCR

- Chạy Realtime PCR

Đọc kết quả:

Chọn chế độ huỳnh quang tương ứng với trình tự phát hiện HPV (chế

độ màu FAM trên máy tính) rồi đến tín hiệu huỳnh quang tương ứng trình tự chứng nội (chế độ màu HEX trên máy tính)

Những mẫu dương tính chỉ cần chọn màu FAM để phân tích, không cần quan tâm đến chứng nội, chứng nội có thể dương hoặc âm Những mẫu

âm tính, chứng nội (màu HEX) phải dương tính thì kết luận mẫu âm tính thật

sự

Thí nghiệm đạt yêu cầu và tiếp tục các bước phân tích kết quả nếu: chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc thẳng và không vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính), chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính

Phân tích mẫu: chọn màu FAM Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng bắt đầu từ chu kì thứ 36 trở về trước, kết luận “mẫu dương tính” Mẫu có đường biểu diễn dương tính không rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kì 36, kết luận “mẫu nghi ngờ” và đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hiện lại xét nghiệm sau 1 ÷ 3 tháng Mẫu có đường biểu diễn âm tính, kết luận “không tìm thấy virus trong mẫu”

Hình 2.2 Kết quả Realtime PCR

Sản phẩm PCR dương tính, kể cả dương tính dưới ngưỡng được sử dụng trực tiếp cho định type HPV

2.2.3.4 RDB xác định genotype HPV

Sử dụng bộ kit RDB của hãng Việt Á xác định 24 type HPV (gồm 16 type nguy cơ cao: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 82

và 8 type nguy cơ thấp: 6, 11, 42, 43, 61, 70, 71, 81)

Đây là kỹ thuật lai trên pha rắn, trong đó các đầu dò (probe) đặc hiệu cho các trình tự đích được cố định trên màng lai thành từng điểm Màng lai được đem lai với sản phẩm PCR đã được đánh dấu biotin Phản ứng lai xảy ra khi các trình tự này gặp nhau ở chuyển động nhiệt trong dung dịch lai ở nhiệt

độ thích hợp Phân tử lai được phát hiện nhờ phản ứng hiện màu

Trình tự 24 probe HPV được thống kê trong bảng 2.2

Tiến hành

- Trộn đều các dung dịch trước khi sử dụng Đánh dấu các hộp chứa màng lai bằng kí hiệu mẫu

- Dung dịch biến tính (DB1): NaOH 2M; EDTA 0,002M

- Dung dịch SSPE (DB2): NaCl 3M; NaH2PO4 0,2M; EDTA 0,02M

- Dung dịch SDS 0,1% (DB3)

- Dung dịch Anti - Alkaline phosphatase (DB4)

- Dung dịch hiện màu (DB5): Tris 0,1M pH 9,5; MgCl2 0,05M; NaCl 0,1M, 2% NBT/BICP (cơ chất phát hiện)

- Dung dịch DB6 (25 ml): 2,5 ml dung dịch DB2 + 22,5 ml nước cất + 0,25 ml dung dịch DB3

- Cho 50 µl dung dịch DB1 tube chứa sản phẩm PCR, trộn đều thật kĩ bằng pipet hoặc bằng vortex, để yên 30 phút ở nhiệt độ phòng Chuẩn bị dung dịch DB6

- Cho 100 µl dung dịch DB6 vào tube chứa dung dịch DB4, trộn đều rồi cho vào mỗi hộp nhỏ chứa màng lai đã cho sẵn 1,8 ml dung dịch DB6, trộn đều, cho sản phẩm PCR trong dung dịch DB1 vào, lắc ủ 3h ÷ 4h ở 400C

- Đổ bỏ dung dịch trong hộp màng lai Cho 5 ml dung dịch DB6, lắc rửa

3 lần ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 30 giây

- Đổ bỏ dung dịch trong hộp màng lai Cho 1,5 ml dung dịch DB5, ủ 15

÷ 45 phút ở 370C trong điều kiện tối, không được lắc

- Đổ bỏ dung dịch trong hộp màng lai, lắc rửa màng lai trong 30 giây với

5 ml nước cất

- Đổ bỏ hết nước cất, đọc kết quả

Màng lai gồm có 25 vị trí gắn 25 probe Trong đó, 1 probe ở vị trí chứng dương xác định sự có mặt của HPV (probe MY11 hoặc MY09), và 24 probe tương ứng với 24 type HPV (gồm 16 type nguy cơ cao: 16, 18, 31, 33,

35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 82 và 8 type nguy cơ thấp: 6, 11, 42,

43, 61, 70, 71, 81) được phân bố như sau:

Hình 2.3 Hình ảnh vị trí các probe trên màng lai Đọc kết quả:

Phân tích mẫu:

- Thực hiện lai thành công với mẫu dương tính là trên màng lai xuất hiện tín hiệu tròn xanh tại vị trí chứng dương (+)

- Mẫu dương tính với các genotype được xác định: tín hiệu tròn xanh sẽ xuất hiện tại vị trí + và vị trí các genotype tương ứng Tín hiệu tròn xanh xuất hiện tại vị trí tương ứng với genotype nào thì kết luận mẫu nhiễm genotype

đó, một mẫu có thể đồng nhiễm nhiều genotype

- Những mẫu chỉ xuất hiện tín hiệu tròn xanh tại vị trí +, ta kết luận mẫu nhiễm HPV genotype khác ngoài 24 genotype của bộ kit đang dùng

- Tín hiệu tròn xanh dương tính có thể xanh đậm hoặc rất nhạt tương ứng với mức độ nhiễm bệnh, tín hiệu này rất đặc trưng, nằm ngay tại vị trí tương ứng với genotype và có thể nhìn thấy rõ ràng từ cả 2 mặt của màng lai

- Những tín hiệu dương tính mạnh có thể thấy rõ ràng trong hộp, những tín hiệu dương tính yếu có thể đưa lên trước bóng đèn huỳnh quang để thấy tín hiệu tốt nhất

Ghi lại kết quả: chụp hình màng lai của mỗi mẫu và lưu lại thành file trên máy vi tính Chèn hình vào trang trả kết quả, chú thích các vị trí “Chứng dương”, “Các genotype dương tính”

a b Hình 2.3 Mẫu dương tính với genotype 11

Chú thích: a Sơ đồ vị trí các genotype trên màng lai

b Tín hiệu tròn xanh tại vị trí + và vị trí genotype 11

Bảng 2.2 Trình tự Nu của 24 probe HPV trên màng lai

2.2.4 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất

Dụng cụ, trang thiết bị:

- Máy Realtime PCR CFX 96 - BioRad và hệ thống máy tính

- Máy li tâm dùng cho tube 1,5 ml; tube 0,2 ml

- Hóa chất tách chiết DNA:

Dung dịch trizol pH 8,0: trizol, phenol, guanidium thiocyanate, natri citrate Dung dịch TE 1X: tris - HCl, EDTA

- Hóa chất cho Realtime PCR:

Enzym Tag DNA polymerase và dung dịch đệm dATP, dTTP, dGTP, dCTP,

MgCl2 Chất đánh dấu DIG

- Hóa chất cho RDB:

Màng lai Biodyn C, NaCl, NaH2PO4, EDTA, NaHCO3, SDS (sodium doecyl sulphate), NaOH, MgCl2, EDAC, AntiDIG - Alkaline phosphatase, Streptavidine - Alkaline phosphatase, NBT/BCIP

2.2.5 Các chỉ số nghiên cứu

- Tuổi

- Tỉ lệ nhiễm HPV: đơn type, đa type

- Kết quả PAP test và kết quả xác định genotype HPV

2.2.6 Xử lí số liệu

Sử dụng phương pháp thống kê y sinh học, phân tích kết quả theo Microsoft Excel 2007

2.2.7 Đạo đức nghiên cứu

- Tất cả những thông tin liên quan đến bệnh nhân đều được giữ bí mật

- Các kết quả chỉ được dùng trong nghiên cứu khoa học, không dùng với bất kỳ mục đích nào khác

- Đề tài đã được bộ môn Y sinh học - Di truyền thông qua đề cương và đồng ý thực hiện

-

Chương 3 KẾT QUẢ 3.1 Thông tin chung đối tượng nghiên cứu

Trong 50 bệnh nhân đến làm xét nghiệm xác định genotype trong độ tuổi

từ 20 - 69, chúng tôi chia thành 5 nhóm tuổi theo như cách chia của các tác giả Lê Trung Thọ và Trần Văn Hợp [37] Ở nghiên cứu của chúng tôi, nhóm tuổi từ 40 - 49 và 30 - 39 có số lượng đến xét nghiệm PAP test và xác định genotype HPV nhiều nhất

Bảng 3.1 Phân bố nhóm tuổi Nhóm tuổi Số lượng (người) Tỉ lệ (%)

Bảng 3.2 Phân bố kết quả PAP test Kết quả PAP test Số lượng (người) Tỉ lệ (%)