Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh bạc lá trên cây lúa (Luận văn thạc sĩ)

NGÔ BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH VẬT ĐỐI

KHÁNG VỚI VI KHUẨN Xanthomonas oryzae pv.oryzae GÂY

BỆNH BẠC LÁ TRÊN CÂY LÚA

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

NĂM 2017

Chuyên ngành: Động vật học

Mã số: 60 42 01 03 Hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hòa

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành tốt Khóa luận tốt nghiệp, tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thị Hòa - Trưởng phòng Nghiên cứu Triển khai, Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường đã trực tiếp tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cũng như giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp để có thể thu được kết quả tốt nhất như mong muốn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm khoa học công nghệ và môi trường, các anh, chị phòng Nghiên cứu triển khai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại Trung tâm

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy Cô giáo đã truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm bổ ích cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Viện Sinh Thái và Tài Nguyên sinh vật

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè

đã luôn ở bên cạnh, luôn ủng hộ, động viên để tôi có thể hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp của mình

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2017

Học viên

Ngô Bích Ngọc

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU 6

DANH MỤC HÌNH ẢNH 9

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 11

Phần 1 MỞ ĐẦU 12

1 Đặt vấn đề 12

2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 13

2.1 Mục tiêu 13

2.2 Nội dung 13

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14

1 Bệnh bạc lá lúa 14

1.1 Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa 16

1.2 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá lúa 17

1.2.1 Sử dụng thuốc hóa học 18

1.2.2 Chọn giống lúa kháng bệnh 18

1.2.3 Biện pháp sinh học 22

2 Sử dụng vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh bạc lá trên cây lúa 23

2.1 Xạ khuẩn 24

2.1.1 Giới thiệu chung về xạ khuẩn 24

2.1.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn 26

2.2 Vi khuẩn Bacillus 28

2.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus 28

2.2.2 Khả năng sinh hoạt chất của vi khuẩn 31

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

1 Vật liệu và hóa chất 34

1.1 Vật liệu 34

1.2 Hóa chất và dụng cụ 34

1.3 Môi trường nghiên cứu 35

2 Phương pháp nghiên cứu 36

2.1 Phương pháp phân lập Bacillus 36

2.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật 37

2.3 Phương pháp đánh giá khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn

37

2.4 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật tuyển chọn 38

2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 38

2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 38

2.4.3 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 39

2.5 Bố trí thí nghiệm 39

2.5.1 Đánh giá khả năng đối kháng của chế phẩm với các chủng vi khuẩn Xoo 39

2.5.2 Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa 40

2.6 Đánh giá độc tính của chế phẩm 41

2.6.1 Phương pháp thử độc cấp 41

2.6.2 Phương pháp thử độc tính bán trường diễn 42

2.7 Sản xuất chế phẩm 43

Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

1 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae pv.oryzae 44

1.1 Đánh giá tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae của các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn 45

1.2 Đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 47

1.2.1 Đặc điểm hình thái các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 47

1.2.2 Đặc điểm hình thái các chủng Bacillus tuyển chọn 50

1.3 Đánh giá khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 51

2 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật tuyển chọn 54

2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển

chọn 54

2.1.1 Ảnh hưởng của pH 54

2.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 57

2.1.3 Khả năng chịu mặn 60

2.2 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng và sinh chất đối kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 63

2.2.1 Nguồn Cacbon 63

2.2.1.1.Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 64

2.2.1.2.Xác định nồng độ cacbon cần thiết cho các chủng vi sinh vật tuyển chọn 67

2.2.2 Nguồn Nitơ 70

2.2.2.1.Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 70

2.2.2.2.Xác định nồng độ nitơ cần thiết cho các chủng vi sinh vật tuyển chọn 73

2.2.3 Nguồn khoáng 74

2.2.3.1.Ảnh hưởng của nguồn khoáng đến sự sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 75

2.2.3.2.Xác định nồng độ khoáng cần thiết cho các chủng vi sinh vật tuyển chọn 78

3 Sản xuất và ứng dụng chế phẩm phòng trừ bệnh bạc lá qui mô phòng thí nghiệm 81

3.1 Sản xuất chế phẩm vi sinh vật kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae 81 3.2 Đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sản phẩm 85

3.3 Đánh giá hiệu quả phòng trừ bệnh bạc lá của chế phẩm ở qui mô phòng thí nghiệm 87

3.3.1 Đánh giá khả năng đối kháng của chế phẩm với vi khuẩn Xoo trong môi trường lỏng 87

3.3.2 Đánh giá khả năng phòng trừ bệnh bạc lá trên lúa ở quy mô phòng thí nghiệm 88

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 91

1 Kết luận 91

2 Đề nghị 91

TÀI LIỆU THAM KHẢO 93

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 93

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 97

WEBSITE 98

Bảng 4 3 Khả năng kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae của các chủng vi khuẩn 46

Bảng 4 4 Sinh khối các chủng vi sinh vật tuyển chọn trong nuôi cấy đồng sinh trưởng 53 Bảng 4 5 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng xạ khuẩn XKBL2 và chủng XKBL3

trên môi trường Gauze và ISP 49

Bảng 4 6 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn tuyển chọn 51 Bảng 4 7 Ảnh hưởng của pH đến các chủng vi khuẩn tuyển chọn 56 Bảng 4 8 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng và kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn 57

Bảng 4 9 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trưởng và sinh chất kháng của các

vi khuẩn tuyển chọn 59

Bảng 4 10.Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và sinh hoạt tính

kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn 61

Bảng 4 11 Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh trưởng và sinh hoạt tính

kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 63

Bảng 4 12 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng và hoạt tính kháng khuẩn

Xanthomonas oryzae pv oryzae của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 65

Bảng 4 13 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv

oryzae của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 67

Bảng 4 14 Ảnh hưởng của nồng độ cacbon tới các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 68

Bảng 4 15 Ảnh hưởng của nồng độ cacbon tới các chủng vi khuẩn tuyển chọn 69

Bảng 4 16 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng và hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 71

Bảng 4 17 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 72

Bảng 4 18 Ảnh hưởng của nồng độ nitơ tới hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 73

Bảng 4 19 Ảnh hưởng của nồng độ nitơ tới các chủng vi khuẩn tuyển chọn 74

Bảng 4 20 Ảnh hưởng của nguồn khoáng đến sinh trưởng và hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae pv oryzae của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 76

Bảng 4 21 Ảnh hưởng của nguồn khoáng đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 77

Bảng 4 22.Ảnh hưởng nồng độ khoáng tới các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 79

Bảng 4 23 Ảnh hưởng nồng độ khoáng tới các chủng vi khuẩn tuyển chọn 80

Bảng 4 24 Các thông số trong quá trình sản xuất 83

Bảng 4 25 Kết quả phân tích một số chỉ tiêu vi sinh vật của chế phẩm (Phân tích tại Phòng thử nghiệm sinh học của Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) 84

Bảng 4 26 Số lượng chuột chết, biểu hiện bên ngoài của chuột khi uống chế phẩm 85

Bảng 4 27 Sự thay đổi khối lượng của chuột thí nghiệm khi cho uống chế phẩm 86

Bảng 4 28 Khả năng đối kháng của chế phẩm dạng lỏng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae 87

Bảng 4 29 Khả năng sinh trưởng và tỷ lệ mắc bệnh bạc lá ở quy mô phòng thí nghiệm

sau 4120h gieo cấy 89

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2 1 Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae 15

Hình 2 2 Khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Xanthomonas oryzae 16

Hình 2 3 Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn 26

Hình 4 1 Hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn có trong các mẫu 45

Hình 4 2 Hoạt tính đối kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 47

Hình 4 3 Sợi khuẩn ty khí sinh của chủng XKBL2 (A,C,E) và chủng XKBL3 (B,D,F) tại thời điểm 7 – 14 – 21 ngày 48

Hình 4 4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng vi khuẩn tuyển chọn 50

Hình 4 5 Khả năng đồng sinh trưởng của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 52

Hình 4 6 Khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 52

Hình 4 7 Khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 53

Hình 4 8 Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của 2 chủng xạ khuẩn tuyển chọn 55

Hình 4 9 Ảnh hưởng của pH đến các chủng vi khuẩn tuyển chọn 55

Hình 4 10 Sự sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn ở 200 C, 30 0 C, và 45 0 C 58

Hình 4 11 Sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ở 200 C và 30 0 C khi đánh giá bằng phương pháp cấy đường zizac trên môi trường MPA sau 1 ngày 60

Hình 4 12 Đồ thị biểu thị khả năng chịu muối của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 62

Hình 4 13 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 64

Hình 4 14 Sự phát triển của xạ khuẩn sau 120h nuôi cấy khi bổ sung các nguồn cacbon 65

Hình 4 15 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến sinh trưởng các chủng vi khuẩn tuyển chọn 66 Hình 4 16 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 70

Hình 4 17 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sinh trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển

chọn 72

Hình 4 18 Ảnh hưởng của nguồn khoáng đến sinh trưởng của hai chủng xạ khuẩn tuyển

chọn 75

Hình 4 19 Hoạt tính kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzae của chủng xạ khuẩn XKBL2

khi bổ sung các nguồn khoáng 76

Hình 4 20 Ảnh hưởng của nguồn khoáng đến sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn

tuyển chọn 78

Hình 4 21 Ảnh hưởng của nồng độ KH2 PO 4 đến hoạt tính kháng Xanthomonas oryzae

của hai chủng xạ khuẩn tuyển chọn 79

Hình 4 22 Thí nghiệm sau 48h nuôi ở tủ ổn nhiệt 300 C 88

Hình 4 23 Hình ảnh lúa trồng ở phòng thí nghiệm 90

Phần 1 MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Cây lúa là một trong ba cây lương thực quan trọng ở Việt Nam, đồng thời cũng là nguồn thức ăn chính cho một nửa dân số thế giới Lúa gạo là nguồn thu ngoại tệ lớn của nền nông nghiệp xuất khẩu và cũng là nguồn thức ăn chính của hơn 90 triệu dân số trong nước Miền Bắc nước ta với lợi thế về điều kiện thời tiết khí hậu và đất đai là vựa lúa lớn thứ 2, sau đồng bằng sông Cửu Long về cung cấp lúa gạo cho cả nước Cùng với trình độ thâm canh của nông dân ngày một cao nên năng suất lúa ở miền Bắc khá cao và ổn định.Tuy nhiên, một trở ngại lớn nhất của ngành sản xuất lúa là thiệt hại do sâu bệnh gây ra, đặc biệt là bệnh bạc lá làm giảm năng suất lúa 25 - 50 %, thậm chí mất trắng Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn

Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra là một trong những bệnh gây hại

nghiêm trọng nhất hiện nay

Dân số ngày càng tăng cao kéo theo đòi hỏi về nhu cầu lương thực ngày càng cấp thiết Vì thế, năng suất lúa luôn là mối quan tâm hàng đầu tại Việt Nam Năm

2012, diện tích lúa bị bệnh bạc lá ở các địa phương nước ta tăng từ 35 - 70% so với những năm trước Một trong những giải pháp quan trọng nhất phòng trừ bệnh bạc

lá lúa hiện nay là sử dụng các dòng lúa mang gen kháng bệnh Tuy nhiên, để ra được một giống lúa có khả năng chống chịu như vậy thì nguồn kinh phí khá lớn và hết sức khó khăn, các dòng lúa chỉ mang một vài gen kháng đơn lẻ, được nuôi

trồng liên tục trên diện rộng dẫn đến tình trạng các chủng Xoo có khả năng gây

bệnh ngay cả khi có các gen kháng đó [9] Mặt khác, hướng phát triển nông nghiệp thân thiện với môi trường ngày càng được ưu tiên Chính vì vậy, việc kiểm soát bệnh bạc lá lúa bằng biện pháp sinh học đang thu hút được sự chú ý của nhiều nhà nghiên cứu [20]

Xuất phát từ cơ sở đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu sản xuất chế

phẩm vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây

bệnh bạc lá trên cây lúa”

2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1 Mục tiêu

Sản xuất chế phẩm vi sinh vật đối kháng thân thiện với môi trường phòng

bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae, phục vụ sản xuất an toàn

2.2 Nội dung

- Tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

- Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật tuyển chọn

- Sản xuất và ứng dụng chế phẩm ở qui mô phòng thí nghiệm

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá lúa - hay còn gọi là bệnh cháy bìa lá là một trong những bệnh phổ biến trong các nước trồng lúa Bệnh bạc lá lúa được phát hiện lần đầu ở vùng Fukuoko, Kyushu, Nhật Bản ngay từ những năm 1884 [25], và trở nên phổ biến ở tất cả các nước trồng lúa trên thế giới trong khoảng từ cuối thập kỷ 60 đến đầu thập

kỷ 80, đặc biệt là các nước trồng lúa châu Á như Ấn Độ (1940), Indonexia (1950), Philippin (1957), Trung Quốc (1957), Pakistan (1976) Ngoài ra, người ta còn quan sát được bệnh này ở châu Phi (1975) và châu Mỹ la tinh (1979) [40]

Hiện nay, bệnh bạc lá đã xảy ra trên rất nhiều quốc gia, đặc biệt ở châu Á Ở nhiều nước châu Á, căn bệnh này đã trở thành đại dịch trên lúa Bệnh có thể làm giảm sản lượng ở mức độ khác nhau, tùy thuộc vào giai đoạn nhiễm bệnh của cây, mức độ nhạy cảm của giống lúa và ảnh hưởng của môi trường Ở một số nước châu

Á và Đông Nam Á, bệnh bạc lá lúa thường làm giảm năng suất 10 - 20 % nhưng có thể lên đến 50% [17] Ở Nhật Bản, thiệt hại năng suất ước tính là 20 - 30% thậm chí đến 50% Việc giảm sản lượng chủ yếu là do giảm số lượng bông và trọng lượng hạt [29]

Ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa được phát hiện từ sau hoà bình lập lại (1954), trên các giống lúa địa phương cao cây, nhưng mức độ gây hại không nghiêm trọng Khi phong trào thâm canh lúa phát triển, mở đầu bằng việc gieo trồng các giống lúa cải tiến, chịu phân, cho năng suất cao, kết hợp với việc sử dụng nhiều phân bón, đặc biệt là phân đạm thì bệnh bạc lá thực sự trở nên nghiêm trọng và thường xuyên gây hại trong vụ mùa Bệnh đã phát triển thành dịch lớn ở một số tỉnh Đồng bằng sông hồng trong vòng từ năm 1968 - 1975 [43] Những năm gần đây, bệnh bạc lá

có xu hướng tăng lên và gây hại ở cả vụ xuân Điều này do nhiều nguyên nhân gây

nên, trong đó phải kể đến việc gieo trồng và sử dụng rộng rãi các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc, chưa qua khâu đánh giá tính chống bệnh Phần lớn các giống này có phản ứng nhiễm vừa đến nhiễm nặng đối với các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở Việt Nam Theo số liệu thống kê của cục Bảo vệ Thực vật, từ năm 1999 -

2003 diện tích lúa bị hại do bệnh bạc lá gây ra trong cả nước là 108.691,4 ha (miền Bắc là 86.429,2 ha; miền Nam là 22.262,2 ha), trong đó diện tích bị hại nặng nhất

là 156,76 ha và diện tích mất trắng là 80 ha Từ năm 2010 đến năm 2011 diện tích cây mắc bệnh tăng nhẹ và đột ngột tăng cao trong giai đoạn từ năm 2011 đến năm

2012 Diện tích lúa bị mắc bệnh năm 2012 là 90,543 nghìn ha, cao gấp gần 4 lần so với năm 2011 (26 nghìn ha) đến năm 2013 diện tích lúa bị mắc bệnh đã tăng đến 135,4 nghìn ha Trong đó diện tích lúa bị nhiễm nặng là hơn 9,5 nghìn ha

Bệnh bạc lá phát sinh trong suốt thời kỳ lúa chín nhưng các triệu chứng bệnh điển hình thường xuất hiện từ thời kỳ đẻ nhánh đến thời kỳ trổ và chín, đạt đỉnh ở giai đoạn ra hoa [17] Nếu xảy ra trong thời kỳ đẻ nhánh sớm sẽ dẫn đến mất mùa một phần hoặc hoàn toàn, bệnh lây lan dễ dàng hơn ở vùng khí hậu ấm áp và ẩm

Hình 2 1 Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

1.1 Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa

Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa là vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) Trước đây, vi khuẩn này còn được gọi bằng rất nhiều tên khác như: Bacillus Oryzae Hori et Boruka, Pseudomonas Oryzae Uyeda et Ishiyama, Xathomonas Oryzae, Dowson [42]

Vi khuẩn này có tế bào hình que với đầu tròn, với chiều dài từ 0,8 - 1 µm chiều rộng 0,4 đến 0,7 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy Đây là loại vi khuẩn Gram âm và không sinh bào tử, khuẩn lạc hình tròn, lồi, bề mặt nhẵn, màu vàng [3] Vi khuẩn này chủ yếu xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn rồi dẫn đến nhiễm trùng toàn thân cây lúa Những chất dinh dưỡng ở dạng phức tạp sẽ được chuyển thành dạng đơn giản, nhờ hệ thống men của vi khuẩn trước khi được hấp thụ [35] Ngoài ra vi khuẩn còn có thể xâm nhập qua lỗ thùy khổng ở mép lá, đầu mút lá dễ dàng gây tổn thương dọc theo gân lá [23,48]

Hình 2 2 Khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae

Xoo là một loại vi khuẩn Gram âm sản sinh lượng lớn polysaccharide ngoại

bào (EPS) Các chủng đột biến thiếu EPS không có khả năng gây bệnh bạc lá lúa

[30] Xoo chỉ có thể tồn tại trong đất từ một đến hai tháng, ngoài ra Xoo có thể tồn

tại trong hạt giống của các cây lúa bị nhiễm, hay trong rơm rạ Các vi khuẩn gây bệnh bạc lá xâm nhập vào cây qua các vết thương xây xát ở trên lá do mưa bão gây

ra và qua các lỗ khí khổng, sau đó sẽ gây bệnh trên các mô và từ đó sẽ nhân và lây lan toàn bộ cây dẫn đến nhiễm trùng toàn thân [14] Vi khuẩn lây lan thông qua nước tưới, mưa và gió

Ở một số nước nhiệt đới, do thói quen xén đầu lá mạ trước khi cấy vô tình đã tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào bên trong và gây hại [38] Ngoài con đường xâm nhập qua lá, vi khuẩn còn có thể xâm nhập vào hệ thống mạch nhựa ở rễ qua phần rễ bị đứt trong quá trình nhổ mạ cấy Khi vi khuẩn xâm nhập qua rễ, cây lúa thường biểu hiện triệu chứng Kresek, làm lá và toàn bộ cây bị héo

rũ

Sự sinh sản độc tố của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae:

Theo Ogawa và cộng tác viên (1996) lần đầu tiên đã tách, chiết được Phenylacetic axit thô trên môi trường Wakimoto nuôi cấy vi khuẩn sau đó sử dụng dịch chiết để xử lí mạ Kết quả cho thấy Phenylacetic axit có khả năng gây héo mạ non, ức chế sự phát triển của cây mạ sau 3 ngày xử lí

Puruthosaman và Prasad (1972) đã tách chiết được phenolic trong môi trường

nuôi cấy vi khuẩn Xoo sau đó xử lý lá lúa non và cho kết quả lá bị héo rất nhanh chỉ

sau 12h, trong khi đó, đối chứng xử lí bằng nước cât vô trùng sau 4 ngày lá lúa mới bắt đầu vàng úa nhưng không có hiện tượng héo như khi xử lý dịch chiết vi khuẩn

Xoo[39]

1.2 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá lúa gây tổn thất nặng nề và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất lúa gạo, do vậy đòi hỏi phải có chiến lược quản lý nhằm chống lại sự bùng phát của dịch bệnh Bước đầu cần thực hiện để kiểm soát bệnh bạc lá lúa là làm

giảm tác nhân gây bệnh và ngăn chặn phát triển của tác nhân gây bệnh trên cây chủ Điều này có thể được thực hiện thông qua việc sử dụng các hóa chất, giống kháng bệnh, và tác nhân sinh học

1.2.1 Sử dụng thuốc hóa học

Thuốc hóa học được sử dụng để giết chết hoặc ức chế sự nhân lên của các tác nhân gây bệnh bằng cách ngăn chặn con đường trao đổi chất của vi khuẩn Một số hóa chất được sử dụng để kiểm soát bệnh bạc lá lúa như Bordeaux có hoặc không

có đường, hỗn hợp đồng xà phòng, thuốc diệt nấm và đồng thủy ngân, dịch phun oxychloride Ở Ấn Độ, sử dụng bột Clo trong xử lý nước cũng làm giảm bệnh [5] Một số chất hữu cơ tổng hợp diệt khuẩn cũng đã được sử dụng như niken dimethyl dithiocarbamate, dithianone, phenazine và phenazine N- oxit Ngoài ra, thuốc diệt

nấm dithiocarbamate cũng ức chế sự phát triển của Xoo bằng cách ngăn chặn quá

trình sinh tổng hợp acid béo và lipid [33] Một vài loại thuốc kháng sinh như streptocycline và các thuốc diệt nấm như zineb, carbendazim cũng được chứng

minh là có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh in vitro Một số chất diệt khuẩn như

kagucamycin, phenazin và streptomycin có thể ngăn chặn được các vi khuẩn gây bạc lá lúa, nhưng lại có nhược điểm là giá thành đắt và không thân thiện với môi trường Việc sử dụng các thuốc hóa học luôn mang lại hậu quả rất nặng nề đối với môi trường Đồng thời, cũng chưa có phương thức kiểm soát bằng hóa chất nào mang lại hiệu quả cao bởi vì khả năng tồn tại và phát triển của các chủng kháng thuốc

(Xa) đã được công bố (bảng 2.1), [21] Các đoạn mồi cũng đã được thiết kế để phát hiện các gen Xa trên các giống lúa khác nhau (bảng 2.2), [7]

Bảng 2 1 Đặc điểm và nguồn gốc của các gen Xa kháng bệnh bạc lá lúa

Giống, dòng lúa đại diện

Xa12-h Xa-kgh NST 4 IR28, IR29, IR30

Xa13 Xa-13 NST 5 BJ1, Chinsura Boro II

Xa17 Xa-as(t) NST 4 Asominori

Xa22 (t)b Xa-22 (t) NST 11 Zachanglong

Xa23 (t)b Xa-23 (t) NST 11 WBB1

Bảng 2 2 Trình tự các đoạn mồi đặc hiệu để phát hiện gen Xa trên lúa

Xa 21 R 5'- CGA - TCG - GTA - TAA- CAG-CAA-AAC-3'

Gen Xa21 lần đầu tiên được phát hiện trong một giống lúa hoang dại Oryza longistaminata và đã được chuyển vào giống lúa IR24 để tạo ra giống lúa kháng

bệnh IRBB21 [11] Ở Ấn Độ và Philippin, giống lúa này đã được chứng minh là có

khả năng kháng với hầu hết các chủng Xoo

Trong công tác chọn tạo giống, chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc

lá ở Miền Bắc của Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội dùng phương pháp thu thập mẫu bệnh, ứng dụng công nghệ sinh học để phân lập, nuôi cấy và phân biệt

gen kháng bệnh bằng PCR đã xác định 16 chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh khác nhau Các dòng chỉ thị IRBB5 (Xa5), IRBB7 (Xa7), IRBB21 (Xa2) có tính kháng đa số

các chủng vi khuẩn gây bệnh

Viện nghiên cứu lúa Đồng bằng sông Cửu Long dùng phương pháp chỉ thị marker kết hợp với chọn giống truyền thống, thanh lọc và đánh giá kiểu hình, kiểu

gen các giống lúa mùa địa phương xác định gen kháng bạc lá Xa5, Xa13 trên nhiểm

sắc thể số 5, 8 và việc liên kết các gen mục tiêu làm tăng tính kháng rộng của giống lúa [21]

Phan Thanh Tùng và nhóm tác giả Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, sử dụng 11 mẫu vi khuẩn ở miền Bắc Việt Nam, được phân lập bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo và 9 isolate mới được thu thập vào vụ mùa 2007 ở một số vùng tại miền Bắc Việt Nam (ký hiệu 2, 4, 5 ); 11 dòng lúa đẳng đơn gen (gen kháng bệnh bạc lá), 1 giống đối chứng mẫn cảm là IR24 Ngoài phương pháp nghiên cứu và phân lập, tác giả còn sử dụng phương pháp nuôi cấy vi khuẩn; chiết tách ADN tổng

số và xác định Xoo bằng PCR; xác định đa dạng di truyền Xoo, lây nhiễm nhân tạo

Gần đây nhất, các nhà chọn tạo giống của Trường Đại học Nông nghiệp I đã thành

công trong việc chuyển gen Xa21 vào giống lúa Bác ưu 903 nhập từ Trung Quốc,

có năng suất cao và đặc biệt có khả năng kháng bệnh bạc lá rất tốt

Tại Viện Di truyền Nông Nghiệp, tác giả Vũ Đức Quang và nhóm tác giả đã thu thập được một số giống nhận gen trong các tổ hợp lai, dòng NILs mang đơn

gen kháng Xa21; Xa4; Xa5; Xa7, chọn được 15 nòi vi khuẩn có độc tính cao và

đánh giá được một số đặc tính nông học của các mẫu giống [49]

Việc sử dụng liên tục và trên diện rộng các gen kháng bệnh đơn lẻ đã dẫn đến

sự chọn lọc các dòng vi khuẩn gây bệnh có khả năng phá vỡ sức kháng bệnh của

cây Cho đến nay một số chủng Xoo ở một số vùng của châu Á đã được phát hiện là

có thể vượt qua được gen kháng Xa21 trong giống lúa IRBB21 [9] Vì thế, việc

chuyển tổ hợp các gen kháng được cho là giải pháp lâu dài cho việc làm chậm lại

sự xuất hiện các dòng vi khuẩn gây bệnh với các dòng lúa có gen kháng bệnh Các gen khác nhau kháng các dòng, các chủng, các dạng sinh học của vi khuẩn gây bệnh khác nhau Tổ hợp các gen đó làm rộng phổ tác động kháng lại sự đa dạng của

các chủng Xoo gây bệnh Hơn nữa, bằng cách tổ hợp các gen chính và các gen phụ

kháng bệnh bạc lá lúa sẽ làm kéo dài sức kháng bệnh ở cây lúa [2] Do vậy, các nghiên cứu hiện nay đang tìm cách chuyển nhiều gen kháng vào một giống lúa tạo tính kháng ổn định cao Ở nước ta, Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp đã tiến hành lây nhiễm nhân tạo đối với 1164 giống trong tập đoàn các giống lúa địa phương Kết quả đã phát hiện có: 597 giống chống bệnh cao, 299 giống chống trung bình, còn lại là nhiễm [46]

1.2.3 Biện pháp sinh học

Các thuốc hóa học đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh bạc lá lúa nhưng không được ứng dụng rộng vì những biến đổi khó lường của các tác nhân gây bệnh Sự xuất hiện các quần thể kháng thuốc đặt ra mối đe dọa nghiêm trọng cho chiến lược kiểm soát hóa học lâu dài Đồng thời, các chất hóa học thường rất độc hại đối với người sử dụng, gây ảnh hưởng đến các loài sinh vật khác, và tích lũy qua thời gian dài sẽ gây ảnh hưởng trầm trọng lên hệ sinh thái Việc chọn tạo giống kháng bệnh cũng đã được áp dụng nhưng các nhóm quần thể kháng lại gen kháng bệnh cũng phát triển nhanh chóng Do đó, kiểm soát sinh học

được cho là một giải pháp sinh thái có hiệu quả cho việc ngăn ngừa bệnh bạc lá lúa

Vì thế khống chế sinh học kết hợp với các biện pháp kể trên có thể là giải pháp tốt hơn để điều trị bệnh bạc lá lúa Islam và Bora (1998) đã đưa ra biện pháp phòng trừ

bệnh trên lúa bằng việc sử dụng 2 chủng vi khuẩn Rhizobacterial vào việc khử

trùng hạt giống Kết quả cho thấy việc xử lý hạt giống không chỉ có tác dụng làm giảm ảnh hưởng của bệnh bạc lá mà còn có tác dụng làm tăng năng suất lúa [15] Ngoài ra, các nghiên cứu của Gnanamanickam và các cộng sự của ông ở Ấn

Độ và Philipin đã tìm thấy chủng Pseudomonas fluorescens và một số chủng Bacillus được phân lập từ các mẫu vùng rễ lúa, có khả năng ức chế sự phát triển của Xoo trong phòng thí nghiệm [8] Năm 2008, Ji và cộng sự công bố chủng Lysobacter antibioticus được phân lập từ rễ cây lúa ở tỉnh Yunnan, Trung Quốc, có

khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm và vi khuẩn gây bệnh thực vật,

trong đó có Xoo [16]

2 Sử dụng vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh bạc lá trên cây lúa

Một trong những phương pháp kiểm soát sinh học được tập trung nghiên cứu

đó là sử dụng các chủng vi khuẩn, xạ khuẩn Các chủng vi sinh vật có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật bằng cách tác động trực tiếp ví dụ như thải ra sắt, photpho hòa tan và sản sinh các hormone thực vật hoặc gián tiếp như ức chế tác nhân gây bệnh hoặc cảm ứng các cơ chế kháng của thực vật chống lại mầm bệnh Trước đây, các nghiên cứu về khống chế sinh học để kiểm soát các bệnh trên lúa chưa được chú ý nhiều, nhưng gần đây, đã có một vài thành tựu có ý nghĩa

Chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi sinh vật đối kháng có tác dụng tích cực đối với nông nghiệp, ưu việt hơn so với việc dùng thuốc hóa học Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật đối kháng để diệt nấm gây hại trên cây trồng sẽ mang lại những lợi ích lâu dài cho người sản xuất như: làm tăng năng suất của cây trồng, giảm chi phí đầu tư, làm đất không bị bạc màu, thân thiện với môi trường

sinh thái, không ảnh hưởng đến sức khỏe của người và vật nuôi, góp phần quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp hữu cơ bền vững và hiệu quả

2.1 Xạ khuẩn

2.1.1 Giới thiệu chung về xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỷ lệ GC trong ADN cao hơn 55% Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có

khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn [6] Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria,

bộ Actinomycetales, 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Xạ khuẩn phân bố chủ

yếu trong đất và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong

tự nhiên Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất Trong đất xạ khuẩn chiếm từ 9% - 45% tổng số vi sinh vật, số lượng trung bình khoảng 106 - 108 tế bào/g đất Số lượng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ của thực vật Đất giàu chất dinh dưỡng hữu cơ, khoáng và lớp đất trên bề mặt (đến

40 cm) thường có số lượng xạ khuẩn lớn Trong 1g đất canh tác có thể có tới 5.106

tế bào xạ khuẩn, trong khi đó đất vùng sa mạc, nóng, khô, độ ẩm thấp, nghèo chất dinh dưỡng, có số lượng xạ khuẩn thấp hơn 10 - 100 lần, dao động trong khoảng

104 - 105 tế bào/g đất Sự phân bố của xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc nhiều vào

độ pH của môi trường, thường có nhiều trong lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu, trong khoảng pH 6,0 - 8,0 Xạ khuẩn không có nhiều trong lớp đất kiềm hay axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm Số lượng xạ khuẩn trong đất cũng

thay đổi theo thời gian trong năm [45]

Khuẩn lạc của xạ khuẩn không trơn ướt như ở vi khuẩn và ở nấm men mà thường rắn chắc, thô ráp, dạng vôi, dạng nhung tơ, hay dạng mang dẻo, không trong suốt Kích thước khuẩn lạc thay đổi tuỳ loại xạ khuẩn và tuỳ điều kiện nuôi cấy, đường kính khuẩn lạc trung bình 0,5 - 2 mm Khuẩn lạc của xạ khuẩn có nhiều

màu sắc khác nhau như đỏ, da cam, vàng, lam, hồng, nâu, tím Màu sắc của xạ khuẩn cũng được coi là một trong những đặc điểm phân loại quan trọng [37]

Trên môi trường đặc, đa số xạ khuẩn có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) và khuẩn ty cơ chất (substrate mycelium) Nhiều loại chỉ có

khuẩn ty cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí

sinh Giữa khuẩn lạc thường thấy có nhiều bào tử màng mỏng gọi là bào tử trần (conidia hay conidiospores) Nếu bào tử nằm trong bào nang (sporangium) thì được gọi là nang bào tử hay bào tử kín (sporangiospores) Bào tử ở xạ khuẩn được sinh

ra ở đầu một số khuẩn ty theo kiểu hình thành các vách ngăn (septa) Các chuỗi bào

tử trần có thể chỉ là 1 bào tử (như ở Thermoactinomyces, Saccharomonospora, Promicromonospora, Micromonospora và Thermomonosspora), có thể có 2 bào tử (như ở Microbispora), có thể là chuỗi ngắn (như ở Nocardia, Pseudonocardia,

Streptoalloteichus, Glycomyces, Amycolata, Amycolatopsis, Catellatospora,và Microellobosporia), có thể là chuỗi dài (như ở Streptomyces, Saccharopolyspora, Actinopolyspora, Kibdelosporangium, Kitasatosporia, Saccharothrix, nhiều loài ở Nocardia, Nocardioides, Pseudonocardia, Amycolatopsis và Streptoverticillium),

có thể các bào tử trần nằm trên bó sợi (synnema), tương tự bó sợi của nấm (như ở

Actinosynnema và Actinomadura) Các chuỗi bào tử có thể thẳng, xoắn hoặc lượn

sóng, có thể mọc đơn hay mọc vòng Các cuống sinh bào tử (sporophore) và cuống sinh nang bào tử (sporangiophorres) có thể riêng rẽ hoặc phân nhánh Các đặc điểm hình thái này rất quan trọng khi tiến hành định tên xạ khuẩn Tuy nhiên, xạ khuẩn hoàn toàn khác biệt so với nấm ở những đặc điểm sau: Xạ khuẩn không có nhân thật, đường kính khuẩn ty và bào tử nhỏ hơn so với ở nấm, khuẩn ty không có vách ngăn, xạ khuẩn là đích tấn công của các phage, không nhạy cảm với các chất kháng sinh kháng nấm như các polyen, không chứa kitin và cellulose [41]

Hình 2 3 Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn

(A) Actinoplanes brasiliensi (VTCC - A - 2908) (B) XKBL2 (Coste)

2.1.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh Trong số 5500 chất kháng sinh hiện nay có 4000 chất có nguồn gốc từ

xạ khuẩn Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng rộng, kìm hãm và ức chế được nhiều loại vi sinh vật khác nhau [19]

Rất nhiều chất kháng sinh được sinh ra bởi xạ khuẩn đang được sử dụng rộng

rãi trong thực tế hiện nay như:

- Streptomycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces griseus có khả năng kháng

các vi khuẩn Gram dương khá mạnh, được sử dụng để diều trị các bệnh dịch hạch,

ho gà và quan trọng hơn cả là bệnh lao [26]

- Neomycin: Là chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, được phát hiện từ chủng

xạ khuẩn Streptomyces fradiae, có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram dương và

Gram âm, đặc biệt chống được nhiều loại vi khuẩn kháng penicillin và streptomycin [13]

- Gentamycin: Có nguồn gốc từ Micromonospora purpurea, có phổ kháng

sinh rộng, có tác dụng chống lại vi khuẩn Gram dương như tụ cầu, phế cầu đã kháng lại penicillin và Gram âm như màng não cầu, lậu cầu Trong y học hiện nay,

Gentamycin chủ yếu dùng để diều trị các bệnh nhiễm Pseudomonas [10]

- Tetracyclin: Là kháng sinh được tách chiết từ một số chủng xạ khuẩn thuộc

chi Streptomyces Loại kháng sinh này có phổ rộng, chống lại được cả vi khuẩn

Gram dương lẫn Gram âm Ngoài được sử dụng trong y học, Tetracyclin còn được

sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm [1]

- Cloramphenicol: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezueae, có

phổ kháng sinh rộng với vi khuẩn Gram dương và Gram âm [28]

- Erythromycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces erythreus, có phổ kháng sinh

rộng đối với các vi khuẩn Gram dương, được sử dụng để điều trị viêm phổi do Mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn [31]

- Novobiocin: Có nguồn gốc từ Streptomyces spheroides và Streptomyces niverus, có hoạt tính mạnh với các vi khuẩn Gram dương, đặc biệt có khả năng

chống các tụ cầu đã kháng penicillin và một số chất kháng sinh khác [18]

- Amphoterycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces nodosus, được dùng để điều trị các bệnh ngoài da do nấm Candida abbicans gây ra [4]

- Actinomycin: Có nguồn gốc từ Streptomyces antibiticus có hoạt tính kìm

hãm sự phát triển của các khối u ác tính, được dùng để điều trị một số bệnh ung thư [32]

- Daunorubixin: Có nguồn gốc từ Streptomyces coeruleorubidus, được dùng

để điều trị các bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin [27]

Tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, TS Phan Thị Phương Hoa và cộng sự đã sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn đang được lưu giữ tại Bảo tàng giống

chuẩn Vi sinh vật (VTCC) và tìm được 167 chủng được lựa chọn với khả năng

kháng cao nhất cả hai chủng kiểm định Micrococcus luteus NBRC 13867 và Escherichia coli NBRC 14237 [9] Các chủng xạ khuẩn này được tiếp tục sàng lọc khả năng kháng 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 và R10 do PGS TS Phan Hữu

Tôn (Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội) và cộng sự phân lập Trong số 167

chủng xạ khuẩn này, 17 chủng xạ khuẩn có khả năng kháng cả 10 chủng Xoo Để nghiên cứu khả năng kháng đặc hiệu đối với Xoo của các 17 chủng xạ khuẩn, các chủng vi sinh vật Bacillus subtilis NBRC 3134, Saccharomyces cerevisiae NBRC 10217, Azotobacter sp VTCC - B - 106 và Pseudomonas putida VTCC - B

- 657 được sử dụng 5 chủng VN06 - A -353, VN08 - A - 306, VN08 - A - 352,

VTCC - A - 99, VN10 - A - 44 và VN08 - A12 có tính đặc hiệu cao với Xoo, chúng

chỉ ức chế một loại vi sinh vật kiểm định Trong số đó, chủng VN08 - A12 sinh

trưởng tốt nhất và không gây ức chế những vi sinh vật có lợi như Azotobacter sp (VTCC - B - 106) và Pseudomonas putida (VTCC - B - 657) Những thử nghiệm ngoài đồng ruộng trên 2 giống lúa Oryza sativa L SS1 và Oryza sativa L KD18

cho thấy dịch nuôi cấy của chủng VN08 - A12 làm giảm đáng kể tổn thương do

Xoo gây ra trên lá lúa [9]

2.2 Vi khuẩn Bacillus

2.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là vi khuẩn Gram dương, thuộc chi Bacillaceae, có dạng

hình que, thường được tìm thấy trong đất Đây là một vi khuẩn hiếu khí, có khả

năng sinh bào tử Bacillus có ở mọi nơi trong tự nhiên và khi điều kiện sống khó

khăn, chúng có khả năng tạo ra bào tử gần như hình cầu, để tồn tại trong trạng thái

"ngủ đông" trong thời gian dài dưới các điều kiện khắc nghiệt Loại sinh vật này có cực kỳ nhiều loài khác nhau, trong đó đa số là vô hại

Qua Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những

chiếc que này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng

Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ

sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol Hầu hết chúng là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 – 450C, nhưng cũng có loài ưa nhiệt tối ưu lên tới 650C [24]

Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH=7, một số phù hợp với pH=9-10 (Bacillus alcalophillus), có loại phù hợp với pH=2-6 (Bacillus acidocaldrius) Bacillus có

khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, ) nên chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường,

Một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:

Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được nhà khoa học Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm

1872 [50] Chúng là vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ (3-5).0,6µm, sinh trưởng tốt nhất

ở 36-500C, tối đa là 600C Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào, khuẩn lạc khô, không màu hoặc xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo lớp màng mịn trên về mặt thạch, bám chặt vào môi trường Là ưa nhiệt cao, bào tử cũng chịu

nhiệt tốt Bào tử của Bacillus subtilis: hình bầu dục 0,6-0,9µm Phân bố không theo

nguyên tắc chặt chẽ nào Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống tới vài chục năm thậm chí 200-300 năm [45] Chúng phân hủy pectin và polysacharit ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây bị u Phần lớn thông tin chúng ta có được về đặc điểm sinh hóa, di truyền của vi khuẩn Gram

dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis [50]

Bacillus thurringiensis

Bacillus thurringiensis là vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng do nhà khoa học

Nhật Bản Ishitawa phát hiện năm 1901 khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn thuộc chi

Bacillus Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto Bacillus thurringiensis là vi

khuẩn sinh bào tử, hô hấp hiếu khí không bắt buộc, có khả năng chuyển động Chúng có khả năng sinh nội bào tử giúp tăng khả năng chống chịu với điều kiện khắc nghiệt

Bacillus thurringiensis (Bt) là một trực khuẩn gram dương, hiếu khí không bắt

buộc, có kích thước 3-6µm có phủ tiêm mao không dày, tế bào đứng riêng lẻ và xếp thành từng chuỗi Nhu cầu dinh dưỡng của chúng không cao, chất dinh dưỡng chủ yếu là protein động vật Sinh trưởng tốt trong điều kiện 12-140C, nhiệt độ tối

ưu là 27-350C, thích hợp với pH kiềm từ 6-8

Bacillus thurringiensis là chủng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều nhất

trong sản xuất chế phẩm phòng, trị bệnh sử dụng trong nông nghiệp

Bacillus amyloliquefaciens

Bacillus amyloliquefaciens có hình thái khuẩn lạc và tế bào tương tự Bacillus subtilis nhưng khác nhau về đặc tính sinh hóa, có khả năng lên men đường lactose nhanh và lên men glucose chậm, thành phần G + C của Bacillus subtilis khoảng 41,5% - 43,5% còn trong chủng Bacillus amyloliquefaciens là 43,5 – 44,9%

Chúng phân bố phổ biến trong đất, nước Do có khả năng sinh tổng hợp mạnh các enzyme như amylase, protease, lipase , phytase, xenlulase và xylanase nên được ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyme, công nghiệp thuộc da

Ngoài ra, Bacillus amyloliquefaciens còn được ứng dụng trong các lĩnh vực khác

như nông nghiệp, y học bởi khả năng sinh các chất chuyển hóa như vitamin,

nucleoside purine (inosine, guanosine), chất kháng khuẩn (bacteriocin), chất kháng nấm (bacimin), hoocmon tăng trưởng thực vật IAA

Đặc biệt, nhiều nghiên cứu cho thấy các chế phẩm probiotic từ Bacillus amyloliquefaciens đã góp phần cải thiện chất lượng môi trường nước, tăng cường

các phản ứng miễn dịch, kiểm soát sự phát triển quá mức của VSV gây bệnh cho tôm, cá,…[37]

Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis là vi khuẩn hoại sinh, bào tử hình ovan, phát tán

chủ yếu trong đất, kể cả đất nghèo dinh dưỡng như đất hoang hay sa mạc Khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục, bề mặt nhăn nheo Tế bào chuyển động nhờ tiêm mao và loài này kỵ khí không bắt buộc

2.2.2 Khả năng sinh hoạt chất của vi khuẩn

Nhờ vào khả năng sinh hoạt chất các chủng Bacillus được nghiên cứu và ứng

dụng rất nhiều trong nhiều lĩnh vực sản xuất khác nhau để phục vụ đời sống con

người Bacillus là một tác nhân sinh học đầy tiềm năng trong việc phòng trừ bệnh

hại cây trồng Chúng có khả năng đối kháng các loại vi nấm gây bệnh với phổ tác

động rộng, không gây hại cho con người và cây trồng Mặt khác, Bacillus còn

tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất hữu cơ khó phân hủy thành những chất hữu cơ đơn giản cho cây trồng dễ sử dụng, giúp cải tạo đất, khống chế và tiêu diệt một số loại vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng bởi các chức năng sinh học chuyên biệt của chúng:

- Bacillus subtilis có dạng hình que, ngắn, phân hủy pectin và polysacarit ở mô

thực vật, nhỏ có khả năng sinh enzyme đặc biệt là α amylase và protease kiềm có giá trị cao

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Bacillus subtilis nói riêng và các dòng Bacillus

sp có khả năng tiết ra kháng sinh tiêu diệt hoặc gây ức chế tác động tới các loại vi

sinh vật gây bệnh, gây hại khác nhằm cạnh tranh nguồn dinh dưỡng và không gian

sống trong môi trường Các loại kháng sinh do Bacillus sp tiết ra được ghi nhận và

có mục đích kháng vi sinh vật gây hại có tới hơn 20 loại khác nhau như: subtilin, bacillibactin, iturin, subtilosin, bacilysin, mysobaccillin, ericin, mersacidin… Hầu hết các chất được tiết ra trong ruột, trên bề mặt vật chủ hay tiết ra môi trường gây

ức chế các vi sinh vật gây bệnh Các chất kháng sinh này có tác dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau Tăng cường hệ miễn dịch cho môi trường đặc biệt là môi trường nước nuôi trồng thủy sản

Khi bổ sung một lượng lớn Bacillus vào môi trường nước thải, nước ao nuôi

hoặc cơ chất chúng sẽ bắt đầu thích nghi với môi trường, sử dụng các chất hữu cơ

và vô cơ có trong nước thải để phát triển tạo thành quần thể vi sinh vật hữu ích từ

đó hình thành bùn hoạt tính Bacillus có khả năng tiết ra enzyme protease nên góp

phần phân hủy nhanh các chất hữu cơ, enzyme lecitinase thủy phân các chất béo phức hợp và enzyme cenllulase biến đổi cellulose thành đường, cạnh tranh nguồn

dinh dưỡng và oxy hòa tan với các vi sinh vật gây thối Do đó Bacillus thường

được dùng để phân hủy chât hữu cơ, ủ phân và khử mùi thôi từ quá trình phân huỷ.2

- Bacillus thuringiensis có khả năng tổng hợp protein gây tệ liệt ấu trùng của

một số loài côn trùng gây hại, trong đó có sâu đục quả bông, các loài sâu đục thân ngô, đều là sâu hại thực vật phổ biến, có khả năng gây ra những sự tàn phá nghiêm trọng Chúng tiết ra các ngoại độc tố α,ngoại độc tố β, ngoại độc tố γ (là các enzyme) và hình thành tinh thể độc gây phân huỷ mô trong cơ thể côn trùng bị tác động, hoặc kìm hãm nucleotide/DNA polymerase phá hủy mô tế bào

Nhờ nghiên cứu các đặc tính này thuốc trừ sâu sinh học Bt được sản xuất Ở

Việt Nam, chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis var.) đã được nghiên cứu từ năm

1971 Hơn 20 chế phẩm Bt nhập khẩu và nội địa đã cho kết quả tốt trong phòng thí nghiệm và ngoài đồng đối với một số sâu hại chính trên đồng ruộng như sâu xanh bướm trắng, sâu xám, sâu tơ, sâu hại bông, sâu đo Các lọai sản phẩm thương mại

có trên thị trường khá nhiều như Vi-BT 32000WP, 16000WP; BT Xentary 35WDG, Firibiotox P dạng bột; Firibiotox C dạng dịch cô đặc

- Bacillus cũng được sử dụng một cách hiệu quả trong việc tạo ra nhiều chế

phẩm probiotic giúp phòng và điều trị một số bệnh đường tiêu hóa ở gia súc-gia cầm,…Có thể kể đến những nghiên cứu sau đây:

 Năm 2001 này, Phan Ngọc Kính sử dụng chế phẩm EM trong chăn nuôi heo thịt cho thấy chênh lệch tăng trọng so với đối chứng tăng từ 20-34%, tỉ lệ thịt xẻ tăng 1,3%, tỉ lệ nạc tăng 4,5%

 Năm 2002, Nguyễn Thị Minh Chiến bổ sung probiotic cho heo con theo mẹ với liều 0,8; 1,0 và 1,2 tỷ CFU/kg thức ăn cho kết quả khả quan trong việc làm giảm tỷ lệ tiêu chảy, tỷ lệ chết và nâng cao tăng trọng heo con lúc cai sữa

 Năm 2003, Nguyễn Như Pho và Trần Thị Thu Thủy đã nghiên cứu sử dụng

probiotic (Oganic Green) trong việc phòng ngừa tiêu chảy do E.coli trên heo con sau cai sữa đã cho kết quả làm giảm số lượng E.coli thải qua phân, giảm tỉ lệ tiêu

chảy, cải thiện tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn

 Năm 2009, Trần Quốc Việt và cộng sự thuộc Viện Chăn nuôi Việt Nam đã nghiên cứu sản xuất probiotic và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi Kết quả đã tìm ra 2 quy trình sản xuất và 2 chế phẩm probiotic làm tăng ST vật nuôi 10%, tăng hiệu quả sử dụng thức ăn 10%, hạn chế 15% tỉ lệ bệnh đường tiêu hóa ở vật nuôi

Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu và hóa chất

1.1 Vật liệu

- Các mẫu đất thu thập tại vùng trồng lúa của huyện Đông Anh - Hà Nội; Kim Bảng - Hà Nam (6 mẫu)

- Các vi khuẩn kiểm định: Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá

(của trung tâm Coste)

1.2 Hóa chất và dụng cụ

 Hóa chất:

- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4 7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4.7H2O, (NH4)2SO4, NaHPO4.12H2O, Ca(NO3)2.4H2O

- Cao thịt, cao nấm men, peptone

- Các loại hóa chất khác như thạch, tinh bột tan, casein, đường saccarose

 Dụng cụ:

- Bình tam giác và ống đong 100 ml, 250 ml, 500 ml

- Nồi khử trùng ướt (ALP) (Đài Loan)

- Tủ sấy khô (Sellab – Mỹ)

- Tủ ấm ổn nhiệt (Sellab – Mỹ)

- Máy đo pH (Nhật Bản)

- Máy lắc ổn nhiệt (Sellab – Mỹ)

- Tủ cấy vô trùng (Singapo)

- Cân phân tích (Nhật Bản)

- Máy li tâm lạnh (Mikro – Đức)

- Kính hiển vi quang học (Hàn Quốc)

Các dụng cụ vi sinh: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, que trang, đèn cồn, giấy lọc, giá đỡ ống nghiệm, phễu lọc

1.3 Môi trường nghiên cứu

- Môi trường Wakimoto (Wakimoto Medium, 1995) (1 lít):

2 Phương pháp nghiên cứu

2.1 Phương pháp phân lập Bacillus

Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp (10-3; 10-4; 10-5…) Xử lý sốc nhiệt các ống mẫu đã pha loãng bằng cách: nhúng các ống mẫu đã pha loãng vào bình ổn nhiệt ở 80oC trong 10 phút, lấy ra và đặt ngay vào khay nước đá trong vòng 5 phút Phân lập trên môi trường MPA

2.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật

Phương pháp giếng thạch

Trang đều dịch nuôi vi khuẩn Xanthomonas trên toàn bộ bề mặt đĩa thạch

chứa môi trường Wakimoto Sau đó, 3-4 giếng trên đĩa thạch được tạo bằng khoan đục lỗ, lấy 100 µl dịch nuôi vi khuẩn, xạ khuẩn nhỏ vào mỗi giếng Ủ trong tủ lạnh 4-60C trong 2h để dịch khuếch tán đều vào môi trường Sau đó chuyển các đĩa thạch trên sang tủ ấm ở 300C trong 24h đối với vi khuẩn hoặc 120h đối với xạ khuẩn Khả năng ức chế được đánh giá bằng khả năng tạo vòng kháng xung quanh giếng thạch:

DKK = D - d

Trong đó: DKK: Đường kính vòng kháng Xoo (mm)

D: đường kính vòng kháng (mm)

d: đường kính khoanh thạch chứa VSV đối kháng (mm)

2.3 Phương pháp đánh giá khả năng đồng sinh trưởng của các chủng vi sinh vật được tuyển chọn

Mục đích của thí nghiệm này nhằm đánh giá những chủng VSV có khả năng tương thích (không đối kháng lẫn nhau) Chỉ có những VSV tương thích mới có thể được sử dụng kết hợp lại trong cùng một hỗn hợp

Phương pháp đường vuông góc:

Môi trường dinh dưỡng được khử trùng và đổ đĩa petri Sau đó dùng que cấy khử trùng, cấy các chủng vi sinh thành các đường vuông góc giống như bàn cờ,sau

đó ủ ấm ở 300C trong 24h đối với vi khuẩn hoặc 120h đối với xạ khuẩn Quan sát

và đánh giá tính kháng tại các điểm giao nhau, các chủng có tính kháng nhau thì ở điểm giao cắt VSV sẽ không sinh trưởng

Phương pháp nuôi trong môi trường dịch thể:

Các chủng vi sinh vật tuyển chọn được nuôi chung trên môi trường Gauze lỏng bổ sung cao thịt 5g/l Sau 3 ngày kiểm tra kết quả Dịch nuôi vi sinh được phân lập trên 2 loại môi trường dinh dưỡng chuyên biệt dành cho vi khuẩn, xạ khuẩn là ISP4 và MPA

2.4 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy các chủng vi sinh vật tuyển chọn

2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

Từ các môi trường dinh dưỡng cơ bản thay đổi, bổ sung thêm các yếu tố dinh dưỡng khác nhau: nguồn cacbon (cám gạo, rỉ đường, bột giấy, ); nguồn nitơ (cao nấm men, bột đậu tương, cao thịt ); nguồn khoáng (muối, CaCl2, KH2PO4, MgSO4 ) chọn ra điều kiện tối ưu khi mật độ/sinh khối tế bào VSV là cao nhất và

hoạt tính sinh học ổn định, dịch nuôi cấy sau ly tâm được thử hoạt tính kháng Xoo

theo phương pháp giếng thạch [45]

2.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

Môi trường nuôi cấy tối ưu đã được lựa chọn từ phương pháp trên, tỷ lệ cấp giống là 10%, pH trung tính, lên men 24h (vi khuẩn) hoặc 120h (xạ khuẩn), lắc

150 vòng/phút Nhiệt độ trong quá trình lên men được điều chỉnh ở các mức

150C, 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C, 550C Nhiệt độ lên men sinh khối tối ưu khi mật độ/sinh khối tế bào VSV là cao nhất và hoạt tính sinh học ổn

định, dịch nuôi cấy sau ly tâm được thử hoạt tính kháng Xoo theo phương pháp

giếng thạch [45]

2.4.3 Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng vi sinh vật tuyển chọn

Môi trường lên men được điều chỉnh pH ở các mức 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0 pH môi trường tối ưu khi mật độ/sinh khối tế bào VSV cao nhất và hoạt tính sinh học của VSV phải ổn định Điều kiện nuôi cấy 300C,lắc 150

vòng/phút, dịch nuôi cấy sau ly tâm được thử hoạt tính kháng Xoo theo phương

pháp giếng thạch [45]

2.5 Bố trí thí nghiệm

2.5.1 Đánh giá khả năng đối kháng của chế phẩm với các chủng vi khuẩn Xoo

Để xác định liều lượng sử dụng chế phẩm trong các thí nghiệm đánh giá hiệu

quả phòng trừ bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo gây ra các thí nghiệm được bố trí như

sau:

Bước 1: Chuẩn bị dịch huyền phù Xoo (có mật độ khoảng 108CFU/ml)

Bước 2: Chuẩn bị chế phẩm dạng dịch thể (mật độ 108CFU/ml)

Bước 3: Chuẩn bị các bình thí nghiệm có chứa 100 ml môi trường Wakimoto Bước 4: Tiến hành thí nghiệm