Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestic và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh (Luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestic và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestic và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestic và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestic và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestic và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestic và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh (Luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chế phẩm kháng thể đa dòng nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestic và ứng dụng tạo que thử phát hiện nhanh (Luận văn thạc sĩ)

MAI THỊ THU

NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM KHÁNG THỂ ĐA DÒNG NHẬN BIẾT ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN NANG F1 CỦA VI KHUẨN DỊCH HẠCH YERSINIA PESTIS VÀ ỨNG DỤNG TẠO QUE THỬ

PHÁT HIỆN NHANH

LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Vi Sinh vật học

Mã số: 60420103

HÀ NỘI, 2017

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Quang Hòa, trưởng phòng Kỹ thuật Gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội người thầy đã luôn hướng dẫn, giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật/Viện hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, đã dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn các cấp Thủ trưởng và cán bộ phòng Sinh học, Viện Hóa học - Môi trường Quân sự nơi tôi công tác, đặc biệt là đồng chí Nguyễn

Phượng Minh, chủ nhiệm đề tài:“Nghiên cứu chế tạo test phát hiện nhanh vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis” đã cung cấp kinh phí, tạo mọi điều kiện để tôi

hoàn thành luận văn của mình

Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua!

Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017

Học viên

Mai Thị Thu

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ 5

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 7

LỜI MỞ ĐẦU 8

CHƯƠNGI: TỔNG QUAN 10

I Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch 10

I.1 Bệnh dịch hạch 10

I.2 Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam 11

I.2.1 Tình hình dịch hạch trên thế giới 11

I.2.2 Tình hình dịch hạch tại Việt Nam 12

I.3 Biểu hiện của bệnh dịch hạch 14

I.3.1 Dịch hạch thể hạch 14

I.3.2 Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết 16

I.3.3 Dịch hạch thể phổi 17

I.4 Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y pestis 18

I.4.1 Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch 18

I.4.2 Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y pestis 20

I.5 Kháng nguyên nang F1 22

I.5.1 Cấu trúc kháng nguyên nang F1 22

I.5.2 Tính chất của kháng nguyên nang F1 23

I.6 Các phương pháp phân tích chẩn đoán kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn Y.pestis 23

I.6.1 Phương pháp miễn dịch 23

I.6.2 Phương pháp sinh học phân tử 29

I.7 Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng 30

I.7.1 Định nghĩa IgY 30

I.7.2 Sự hình thành kháng thể IgY ở gà 30

I.7.3 Cấu trúc của kháng thể IgY 31

I.8.1 Khái niệm, ứng dụng của kháng thể đơn dòng 32

I.8.2 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng 33

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

II.1 Vật liệu nghiên cứu 36

II.1.1 Động vật thí nghiệm 36

II.1.2 Hóa chất và vật tư tiêu hao 36

II.1.3 Thiết bị 36

II.2 Phương pháp nghiên cứu 37

II.2.1 Sản xuất kháng thể đa dòng IgY kháng F1 37

II.2.2 Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên chuột BALB/c thuần chủng 41

II.2.3 Ứng dụng sản xuất que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện nhanh F1 44

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

III.1 Sản xuất kháng thể IgY kháng F1 từ trứng gà 46

III.1.1 Tạo kháng nguyên F1 dạng dung hợp với MBP (Maltose binding protein) làm nguyên liệu cho phản ứng ELISA 46

III.1.2 Tối ưu hóa ELISA đánh giá hiệu giá kháng thể IgY kháng F1 48

III.2 Tạo dòng tế bào lai có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng kháng F1 trên chuột BALB/c thuần chủng 52

III.2.1 Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột BALB/c thuần chủng 52

III.2.2 Kết quả tạo tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1 54

II.3 Ứng dụng chế phẩm IgY tạo que thử sắc ký miễn dịch kẹp đôi phát hiện nhanh F1 56

III.3.1 Lựa chọn kháng thể IgY in lên vị trí vạch thử nghiệm 56

III.3.2 Ảnh hưởng của các loại màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm cố định IgY 58

III.3.3 Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể lên vạch kiểm chứng 59

III.3.4 Tối ưu hóa các điều kiện in kháng thể IgY lên vạch thử nghiệm 60

III 4 Ứng dụng kháng thể đơn dòng thương mại sản xuất que thử 63

III.4.1 Ảnh hưởng nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm 63

III.4.2 Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm 64

III.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên vạch thử

nghiệm 65

III.4.4 Xác định độ nhạy của que thử với chế phẩm thương mại G20 65

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

DANH MỤC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001

Hình 1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002

Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001

Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch

Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch

Hình 1.6: Hình ảnh Y pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson

Hình 1.7: Mô hình lắp ráp các thành phần của bộ kit ICT(I) và đánh giá kết quả (II) Hình 1.8: Quá trình chuyển IgY vào lòng đỏ trứng

Hình 1.9: Cấu tạo kháng thể IgG và IgY

Hình 1.10: Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng

Hình 2.1: Gây miễn dịch trên chuột với kháng nguyên F1

Hình 3.1: Phổ điện di các phân đoạn rửa giải trong quá trình tinh sạch kháng nguyên F1 tái tổ hợp từ cấu trúc pET22b-(His)10-MBP-F1

Hình 3.2: Xác định độ pha loãng của kháng thể kháng IgY gắn HRP

Hình 3.3: Xác định độ pha loãng của kháng thể IgY kháng F1

Hình 3.4: Ảnh hưởng của thời gian thu trứng lên hiệu giá của chế phẩm IgY

Hình 3.5: Hiệu giá kháng thể của chế phẩm IgY từ trứng thu tại thời điểm 30, 35 ngày sau gây miễn dịch lần 1

Hình 3.6: Hiệu giá mẫu huyết thanh chuột trước gây miễn dịch và sau khi gây miễn dịch ở các độ pha loãng khác nhau

Hình 3.7: Hình ảnh dung nạp tạo tế bào lai có chứa kháng thể đơn dòng có ái lực F1

Hình 3.8: Que thử sàng lọc 240 dòng tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên F1

Hình 3.9: Lựa chọn mẫu IgY cần in lên vị trí vạch thử nghiệm

Hình 3.10: Ảnh hưởng của màng Nitrocellulose đến cường độ tín hiệu vạch thử nghiệm cố định IgY

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng

Hình 3.12:Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol bổ sung vào kháng thể M5899 đến cường độ tín hiệu vạch kiểm chứng

Hình 3.13:Ảnh hưởng của nồng độ IgY đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm Hình 3.14: Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

Hình 3.15: Xác định độ nhạy của que thử phát hiện F1 sử dụng chế phẩm IgY Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ G20 đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

Hình 3.17: Ảnh hưởng của pH đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

Hình 3.18: Ảnh hưởng của nồng độ Isopropanol đến cường độ tín hiệu trên vạch thử nghiệm

Hình 3.19: Xác định độ nhạy của que thử phát hiện F1 sử dụng kháng thể G20 làm kháng thể bắt cặp

Bảng 3.1: Nồng độ protein trong các phân đoạn rửa giải khi tinh sạch trên cột sắc

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide

Gel Electrophoresis HTSKMD Hệ thống sắc ký miễn dịch

LỜI MỞ ĐẦU

Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tối nguy hiểm do Yersinia pestis gây ra

Bệnh lây truyền từ động vật sang người qua trung gian truyền bệnh là bọ chét Bệnh đã được biết từ thời xa xưa và đã gây ra 3 vụ đại dịch lớn vào các thế kỉ XI, XIV và XIX với hàng trăm triệu người tử vong Tuy đã được phát hiện từ lâu nhưng hiện nay các ổ dịch vẫn còn tồn tại và đang hoạt động trong nhiều khu vực trên trái đất

Tuy dịch hạch đã được kiểm soát nhưng công tác điều tra giám sát dịch tễ học vẫn phải được tiến hành thường xuyên Bởi vì bệnh dịch hạch có thể xuất hiện bất cứ khi nào nếu gặp điều kiện thuận lợi và sẽ gây ảnh hưởng to lớn đến cuộc

sống của con người Đặc biệt vi khuẩn Yesinia pestis vẫn được coi là một trong

những tác nhân dùng để làm vũ khí sinh học

Trong bối cảnh phức tạp như hiện nay, trên thế giới, khủng bố bằng vũ khí sinh học đang được các thế lực thù địch tìm cách lợi dụng và phát triển Trong đó,

vi khuẩn gây bệnh than (Bacillus anthracis) và vi khuẩn gây bệnh dịch hạch (Y

pestis) là những đối tượng nguy hiểm nhất So với các loại vũ khí thông thường, thì

vũ khí sinh học rất khó phát hiện, nhưng lại gây chết người hàng loạt trên diện rộng; gây thiệt hại nặng nề về kinh tế và gây ô nhiễm môi trường một cách trầm trọng

Các phương pháp phân tích kháng nguyên F1 đặc hiệu cho Y Pestis đều là

các phương pháp miễn di ̣ch trong đó phổ biến nhất là ELISA và sắc ký miễn di ̣ch

kẹp đôi (Splettstoesser và đồng tác giả, 2004) Que thử phát hiện nhanh kháng nguyên F1 được tạo ra bằng phương pháp sắc ký miễn dịch kẹp đôi có quy trình phân tích rất đơn giản, không cần trang thiết bi ̣ do vâ ̣y rất thích hợp với các phép phân tích ta ̣i hiê ̣n trường; đáp ứng nhu cầu củacác phân đội lính trinh sát làm nhiệm

vụ tại các vùng rừng núi hẻo lánh

Nhiệm vụ của Phòng Sinh học/Viện Hóa học – Môi trường quân sự là nghiên cứu, chế tạo các trạng thiết bị để thực hiện nhiệm vụ trinh sát, phát hiện

nhanh kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn Y.pestis trong môi trường bằng phương

pháp sắc ký miễn dịch kẹp đôi sử dụng kháng thể đa dòng IgY từ trứng gà là nhiệm

vụ trọng tâm và rất cần thiết

Vì những lý do và nhu cầu từ thực tế trên, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo kháng thể nhận biết đặc hiệu kháng nguyên nang F1 của vi khuẩn dịch

hạch Yersinia pestis và ứng dụng sản xuất que thử phát hiện nhanh.”

Nội dung nghiên cứu chính của luận văn:

- Tối ưu hóa qui trình gây đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên nang F1 ở gà

- Tinh sạch kháng thể đa dòng IgY

- Nghiên cứu thăm dò khả năng sản sản xuất kháng thể đơn dòng IgG có ái lực cao với kháng nguyên F1

- Ứng dụng các chế phẩm kháng thể trong sản xuất que thử miễn dịch phát hiện nhanh kháng nguyên F1

CHƯƠNGI: TỔNG QUAN

I Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch

I.1 Bệnh dịch hạch

Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tối nguy hiểm thuộc diện kiểm

dịch và khai báo quốc tế do Yersinia pestis (Y.pestis) gây nên Bệnh lưu hành trong

quần thể động vật thuộc bộ gặm nhấm (Rodentia), chủ yếu là chuột và bọ chét ký sinh trên chúng, từ đó lây truyền sang các loại súc vật khác và sang người Lịch sử loài người đã ghi nhận 3 vụ đại dịch vào các thế kỷ thứ VI, XIV và XIX với hàng trăm triệu người tử vong và bệnh dịch hạch đã trở thành nỗi kinh hoàng của nhân loại

Bệnh dịch hạch được biết đến từ thời xa xưa, thời kì đầu khó có thể xác định được những thông tin chính xác cần thiết để phân biệt hoặc chứng minh dịch hạch

do vi khuẩn hay vi rút

Trong khoảng hai ngàn năm qua, các vụ dịch hạch lớn đã lây lan rộng khắp đến các quốc gia trên thế giới Đại dịch đầu tiên được ghi nhận vào thế kỷ thứ VI, vào khoảng từ năm 542 đến 546 xảy ra vụ dịch lớn bắt đầu ở Đế quốc La Mã phương Đông vào triều đại Vua Justinian 1 ở Ai Cập, lây lan sang Châu Âu, ước tính làm chết khoảng 100 triệu người ở Châu Á, Châu Phi và Châu Âu Đại dịch lần thứ hai nổi tiếng với tên “Bệnh chết đen - Black Death” vào thế kỷ XIV, khoảng từ năm 1347 đến 1350 Đại dịch lần thứ 2 ước tính làm chết khoảng 50 triệu người trên thế giới, trong đó một nửa số nạn nhân là ở Châu Âu, chiếm một phần ba dân số Châu Âu thời bấy giờ Tỷ lệ tử vong trong đại dịch này từ 70 - 80%

Cuối thế kỷ XIX, đại dịch thứ ba bắt đầu ở Canton và Hồng Kông vào năm

1894, nhanh chóng lan truyền đi khắp thế giới Trong vòng 10 năm (1894-1903), dịch đã lan đến 77 thành phố cảng trên khắp 5 châu: Châu Á: 31, Châu Âu: 12, Châu Phi: 8, Bắc Mỹ: 4, Nam Mỹ: 15 và Châu Úc: 7 Trong đại dịch này, dịch hạch lây lan mạnh mẽ ở Ấn Độ, chỉ riêng ở Bombay đã làm chết khoảng 13.000.000 người [1]

I.2 Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam

I.2.1 Tình hình dịch hạch trên thế giới

Các vùng dịch hạch lưu hành không cố định mà luôn luôn thay đổi, tuỳ thuộc vào sự thay đổi của nhiều yếu tố tự nhiên, xã hội như: khí hậu, động đất, sự

di chuyển của các quần thể gặm nhấm, di dân, Hiện nay, các ổ dịch hạch tự nhiên tồn tại ở Bắc và Nam Mỹ, Châu Phi, Châu Á và Đông Nam Châu Âu, từ 55 vĩ độ Bắc đến 40 vĩ độ Nam Tuy nhiên, trong vành đai này có những vùng không có ổ dịch hạch như các hoang mạc với một số lượng ít hoặc không có loài vật chủ gặm nhấm, vùng chí tuyến hoặc những dãy núi cao đóng băng quanh năm

Từ 1954 - 2001, Tổ chức Y tế thế giới ghi nhận có 38 quốc gia trên thế giới xảy ra bệnh dịch hạch gồm 89.651 trường hợp mắc và 7.715 bệnh nhân tử vong Nhiều nhất là năm 1967 có 6014 trường hợp và thấp nhất năm 1981 có 200 trường hợp Trong gần nửa thế kỷ qua, có 7 quốc gia trên thế giới có dịch bệnh xảy ra hàng năm là Brazil, Cộng hoà dân chủ Công Gô, Madagascar, Myanmar, Pê Ru, Hoa Kỳ và Việt Nam

Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001[1]

Thực tế tình hình dịch hạch trên thế giới cho đến nay vẫn diễn biến phức tạp,

lỏng sự giám sát dịch hạch Năm 1995 ở Madagascar bắt đầu nghiên cứu phòng chống dịch hạch toàn diện và tổ chức mạng lưới nghiên cứu vấn đề này trong các Viện Pasteur (Acip Peste) Tại Trung Quốc mặc dù tình hình dịch hạch đã được khống chế mạnh mẽ nhưng hệ thống giám sát phòng chống chủ động bệnh dịch này vẫn được đẩy mạnh và giải quyết chặt chẽ Những năm gần đây Hội nghị quốc tế

về nghiên cứu và phòng chống dịch hạch vẫn được tổ chức Y tế Thế giới tổ chức, thu hút được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về lĩnh vực này tham dự Tại hội nghị quốc tế về giám sát và phòng chống dịch hạch tổ chức ở Bangalore,

Ấn Độ từ 15 - 17 tháng 07 năm 2002, theo Tikhomirov E, chuyên gia của Tổ chức

Y tế Thế giới thì có 6 tiêu chuẩn để đánh giá tính ưu tiên trong nghiên cứu và phòng chống của một bệnh là: Tác động của bệnh đó (nguyên nhân gây mắc và chết), nguy cơ tác nhân gây nên dịch, hiệu lực trong dự phòng và điều trị bệnh, tầm quan trọng đối với quốc tế, ảnh hưởng đến kinh tế và nguy cơ sử dụng có mục đích Dịch hạch có đầy đủ 6 yếu tố trên và như vậy nên được xem là bệnh cần ưu tiên nghiên cứu và phòng chống [1]

I.2.2 Tình hình dịch hạch tại Việt Nam

Hơn 1 thế kỷ trước, bệnh dịch hạch đã có mặt ở Việt Nam, có khả năng từ Hồng Kông xâm nhập vào năm 1898 trong bối cảnh của đại dịch lần thứ ba Mầm bệnh vẫn được duy trì, lưu hành có thời kỳ bùng phát xen kẽ với những thời kỳ lắng dịu nhưng thực sự chưa bao giờ được loại trừ

Dịch hạch được ghi nhận lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1898 tại Nha Trang trong bối cảnh vụ đại dịch hạch thế giới lần thứ 3 Dịch xâm nhập chủ yếu theo hàng hóa của người Trung Hoa Sau khi xâm nhập dịch lây lan đến những nơi khác như Bắc Ninh, Hòn Gai, Phan Thiết, Phan Rang, Sóc Trăng Dịch tại những nơi xâm nhập đều có tính chất tạm thời trừ Sài Gòn và Phan Thiết có chiều hướng trở thành vùng dịch lưu hành dai dẳng Vào năm 1911 tại Châu Đốc, Long Xuyên, Thủ Dầu Một xảy ra một vụ dịch lớn với nhiều bệnh nhân dịch hạch thể phổi có

886 người tử vong

Hình1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002

Từ 1961 đến 1975: dịch bùng phát lan tràn ở Miền Nam Sau đó tiếp tục lây lan trên diện rộng ở các tỉnh ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Miền Đông Nam

Bộ Chính quyền miền Nam dưới sự trợ giúp của Mỹ thông qua chương trình quốc gia phòng chống dịch hạch đã khống chế được một phần, nhưng nhìn chung dịch vẫn tồn tại với quy mô lớn Trong giai đoạn này, hầu hết số bệnh nhân mắc phải dịch trên thế giới đều là Việt Nam

Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001

Từ 1975 đến 1990: Sau 1975 dịch bùng phát, số ca mắc - chết tăng vọt tại các vùng dịch lưu hành như ở các tỉnh ven biển Miền Trung, Tây Nguyên, Miền Đông Nam

Bộ Đặc biệt trong thời gian này, dịch hạch đã xuất hiện và gây ra một số vụ dịch nhỏ tại 9 tỉnh/thành phố phía Bắc do có sự giao lưu về lương thực hàng hóa và các

phương tiện giao thông Đặc biệt chuột và tác nhân gây bệnh Y pestis theo gạo và

lương thực từ Miền Nam xâm nhập vào Miền Bắc qua cảng biển Hải Phòng Trong giai đoạn từ năm 1991 đến 2002 số mắc - chết có chiều hướng giảm và phạm vi dịch thu hẹp dần, tập trung chủ yếu ở Miền Trung và Tây Nguyên Trong 4 năm (1999-2002), dịch chỉ còn ghi nhận tại một số địa phương 2 tỉnh Đắc Lắc và Gia Lai với diện dịch tập trung dai dẳng vào một số xã thuộc 2 huyện: Đắc Đoa, tỉnh Gia Lai và EaH’leo, tỉnh Đắk Lắk

Từ tháng 3/2003 đến nay không ghi nhận bệnh dịch hạch trên người, ca mắc gần nhất ghi nhận vào tháng 08 năm 2002 tại tỉnh Đắk Lắk Giám sát dịch động vật

tại các trọng điểm, từ tháng 4/2004 không còn phân lập được Y pestis từ vật chủ và

trung gian truyền bệnh Từ năm 2005 xét nghiệm huyết thanh động vật tìm kháng

thể kháng F1 của vi khuẩn Y pestis đều cho kết quả âm tính

I.3 Biểu hiện của bệnh dịch hạch

Tùy theo vị trí thương tổn giải phẫu bệnh lý, có thể gặp nhiều thể lâm sàng với tỷ lệ khác nhau nhưng phổ biến nhất là thể hạch Thể nhiễm khuẩn huyết và thể phổi tiên phát hiếm gặp hơn Các trường hợp nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi thứ phát

có thể xem là biến chứng của thể hạch không được điều trị sớm và tích cực Ngoài

ra còn gặp các biểu hiện khác như viêm màng não mủ, việm họng, thể xuất huyết, thể da … Tuy nhiên các biểu hiện này thường gặp trong bệnh cảnh hoặc xảy ra thứ phát sau thể hạch

I.3.1 Dịch hạch thể hạch

Thể lâm sàng của bệnh dịch hạch không hằng định và nhiều thể Tuỳ vào từng vùng và vụ dịch mà tỷ lệ gặp có khác nhau, nhưng nhìn chung thể hạch vẫn phổ biến nhất

Thống kê của một số bệnh viện ở Việt Nam như sau: Bệnh viện Chợ Quán từ năm 1977 đến 1986 gặp 94 - 98%; Bệnh viện Đắc Lắc từ năm 1976 đến 1986 gặp 97% và Bệnh viện Phú Khánh từ 1982 đến 1986 gặp 98% Ở New Mexico từ năm

1980 - 1984 gặp 74,7% là thể hạch Theo qui định của Tổ chức Y tế Thế giới, thời gian ủ bệnh trong vòng 6 ngày, thời kỳ này kéo dài hơn ở những người đã được chủng ngừa vắc xin Thời kỳ ủ bệnh không có triệu chứng gì, sau đó bệnh thường khởi phát đột ngột với hai nhóm dấu hiệu đặc trưng của bệnh dịch hạch là nhiễm khuẩn - nhiễm độc và viêm hạch

* Hội chứng nhiễm trùng - nhiễm độc

Sốt cao đột ngột là triệu chứng tương đối phổ biến và thường xuất hiện trước khi viêm hạch Nếu được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu thì nhiệt độ hạ, trong vòng 18 - 24 giờ có thể giảm đến 1,5 đến 2oC, ngày sau có thể hết sốt hoặc sốt nhẹ thêm 2 - 3 ngày rồi hết hẳn

Các dấu hiệu nhiễm trùng, nhiễm độc thần kinh biểu hiện mức độ nặng nhẹ của bệnh và là yếu tố quyết định tiên lượng bệnh Cần đặc biệt quan tâm khi thấy xuất hiện sớm trong vòng 24 giờ đầu Ở thể nhẹ, bệnh nhân mệt mỏi, biếng ăn nhưng vẫn tươi tỉnh Bệnh càng nặng, biểu hiện nhiễm độc càng rõ Mặt đỏ, kết mạc mắt xung huyết, môi khô, lưỡi bẩn, đau nhức nhiều nơi Người bứt rứt khó chịu, vẻ mặt lo âu sợ hãi, hoặc hốt hoảng, vật vã, kích động, nói nhảm hoặc lừ đừ, mắt đờ đẫn, nằm yên không cử động, không ngủ Đôi khi gặp ảo giác, trả lời chậm chạp, khi đúng khi sai, tiếng nói không rõ ràng Hiếm gặp hơn là động tác bất thường, thỉnh thoảng gồng người co giật, vã nhiều mồ hôi Có trường hợp ói mửa,

ỉa chảy Khó thở nhanh mà không có tổn thương bệnh lý ở phổi

* Viêm hạch

Viêm hạch thường xuất hiện đồng thời hoặc sau sốt vài giờ đến 24 giờ, một

số ít trường hợp nổi hạch trước sốt Viêm hạch dịch hạch là một loại viêm cấp tính với triệu chứng đau là tính chất nổi bật lên hàng đầu Đau là triệu chứng sớm nhất

và thường xuất hiện trước khi nổi hạch (87%) Đau tăng lên khi bệnh nhân cử động hay sờ nắn và bệnh nhân thường ở tư thế nhằm làm giảm sức căng lên vùng đó Thuốc giảm đau không hoặc có tác dụng rất ít Đau tự nhiên, càng nhiều và càng

sớm, đi đôi với sốt cao thường tiên lượng nặng hơn Đau giảm rõ rệt và nhanh chóng trong vòng 24 đến 48 giờ sau khi bệnh nhân được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu

Thường có một vài hạch và vị trí có hạch liên quan đến vị trí đốt của bọ chét, phổ biến nhất là vùng đùi bẹn: 62 - 80% Kế đó là: hạch nách 14 - 20%, hạch cổ, hạch dưới hàm: 15-18% Có thể gặp hai hoặc nhiều hạch xuất hiện lần lượt hoặc cùng một lúc Biểu hiện này cũng như vị trí hạch vùng cao (cổ, nách, thượng đòn

… ) thường là một biểu hiện nặng cần được chú ý

Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch

Hạch viêm tiến triển nhanh với sưng tấy, nóng, đỏ và rất đau Kích thước hạch tuỳ vào thời điểm phát hiện Ban đầu nhỏ, di động, màu da ngoài bình thường, trong vòng 1 hoặc 2 ngày đã sưng to có khi đến 10 cm nhưng thường dưới 3 cm Tổ chức xung quanh hạch bị viêm, phù nề và dính vào nhau thành 1 khối không di động, màu da bên ngoài hạch đỏ tía Trong trường hợp được điều trị sớm, đúng thì hạch giảm đau nhanh, teo nhỏ lại và “mất đi” trong vòng 2 - 3 tuần hoặc trở nên xơ hoá

để lại một khối rắn trong một thời gian dài sau khi khỏi bệnh [1,2]

I.3.2 Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết

Quan niệm về thể nhiễm khuẩn huyết có nhiều ý kiến khác nhau Theo Pollitzer, dịch hạch thể nhiễm khuẩn huyết tiên phát là do sự xâm nhập vào máu của một số lượng lớn vi khuẩn dịch hạch không qua giai đọan khu trú ở hạch Một

số tác giả khác (Girard, Dujardin, Beaumetz, Joltrain) cho rằng thể nhiễm khuẩn

huyết chỉ thứ phát sau thể hạch nằm trong sâu, thăm khám bên ngoài không sờ thấy được Các tổ chức hạch này vẫn chứa nhiều vi khuẩn[1]

Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết tiên phát là những trường hợp nhiễm khuẩn

huyết được xét nghiệm kết luận là do Y pestis mà lâm sàng không phát hiện được

triệu chứng viêm hạch Thể bệnh này không có triệu chứng viêm hạch đặc hiệu nên rất dễ bị bỏ sót và tử vong cao

Bệnh nhân đột ngột sốt cao 40 - 410C, rét run, đau đầu dữ dội, tiêu chảy và

ói mửa nhiều lần Hốt hoảng, vật vã, kích động, nói sảng, tím tái, thở nhanh nông

…sau đó đi vào sốc nhiễm trùng nhiễm độc Soi tươi các bệnh phẩm sẽ thấy vi khuẩn dạng dịch hạch Thường bệnh nhân tử vong nhanh chóng trong vòng 1 vài ngày nếu không được điều trị sớm và hồi sức tích cực ngay từ những giờ đầu của bệnh [2]

I.3.3 Dịch hạch thể phổi

Bệnh dịch hạch đáng sợ nhất là thể phổi vì tiến triển nhanh và tỷ lệ tử vong rất cao Thể tiền phát là do tác động trực tiếp của vi khuẩn trên tổ chức phổi theo đường hô hấp trên, bệnh xuất hiện dưới dạng viêm đặc thùy phổi và diễn biến rất cấp tính Thời gian nung bệnh của thể phổi thường ngắn hơn, chỉ trong một vài ngày, thậm chí chỉ trong vòng vài giờ sau khi nhiễm bệnh Sau đó bệnh khởi phát rất đột ngột với sốt cao, rét run, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, mạch nhanh, huyết

áp thấp, bệnh nhân bứt rứt Trong vòng 24 giờ sau, các dấu hiệu của tổn thương hô hấp xuất hiện nhanh chóng, có rối loạn chức năng hô hấp như đau tức ngực, thở nhanh nông, khó thở Lúc đầu ho có đờm nhầy, loãng Sau đó đờm đặc dần, có vết máu, có khi có bọt Triệu chứng thực thể ở phổi rất nghèo nàn: Gõ bình thường hoặc đục một vài nơi, âm phế bào và rung thanh không thay đổi Đôi khi tìm thấy dấu hiệu 3 giảm hoặc tiếng cọ màng phổi X quang phổi biểu hiện rất sớm, có thể thấy hình ảnh đông đặc phổi thông thường hoặc nhiều bóng mờ rải rác hoặc hình ảnh bong bóng giống viêm phổi tụ cầu[1,2] Ngoài ba thể hay gặp trên còn có các thể khác ít phổ biến hơn như: thể màng não, thể xuất huyết, thể hầu học…

I.4 Cơ chế lây lan bệnh dịch hạch và vi khuẩn Y pestis

I.4.1 Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch

Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm, lây truyền trong quần thể gặm nhấm Bệnh duy trì trong các ổ dịch thiên nhiên của các loài gặm nhấm và lây truyền qua trung gian bọ chét sống ngoại ký sinh trên chúng Phần lớn các loài động vật hoang dại đều bị nhiễm vi khuẩn dịch hạch nhưng chúng có tính đề kháng tương đối với bệnh nên không đóng vai trò quan trọng trong vật chủ bệnh dịch hạch

Trên thế giới bộ gặm nhấm (Rodentia) có khoảng 6.000 loài, trong đó họ chuột (Muridae) có 150 loài chuột Ở Việt Nam có 56 loài gặm nhấm và họ chuột

có 43 loài phân bố trên toàn lãnh thổ

Dịch hạch là bệnh của động vật, chủ yếu là các loài gặm nhấm hoang dại và chuột, người chỉ là vật chủ ngẫu nhiên, thứ yếu Có nhiều yếu tố trong cơ chế lan truyền bệnh dịch hạch, trong đó bọ chét đóng vai trò quan trọng Bọ chét phải nhiễm vi khuẩn dịch hạch khi hút máu Tiếp theo là thời gian sống phải đủ dài để quá trình nhân lên vi khuẩn đủ số lượng nhiều và sau đó lây truyền vi khuẩn dịch hạch sang vật chủ khác Bên cạnh đó, số lượng và thành phần bọ chét cũng như quần thể vật chủ cũng là yếu tố cần thiết để gây nên nhiễm trùng và lan truyền dịch bệnh Trong tự nhiên, bệnh dịch hạch lan truyền theo các con đường sau:

* Phổ biến nhất là lây truyền qua trung gian bọ chét: Theo cơ chế lây truyền này thì bệnh dịch hạch ở người thường xuất hiện sau dịch hạch ở vật chủ vài ngày đến một vài tuần Bọ chét hút máu vật chủ mắc bệnh trong đó có vi khuẩn dịch hạch, vi khuẩn nhân lên sẽ tạo thành nút nghẽn ở tiền dạ dày (proventriculus) Khi vật chủ bị bệnh chết, bọ chét bị tắc nghẽn này mất nguồn thức ăn sẽ rời bỏ vật chủ chết đi tìm ký chủ mới để hút máu nhưng vì ống tiêu hoá bị tắc nghẽn ở tiền dạ dày, máu không vào được và mỗi lần hút máu lại bị đẩy ra, vi khuẩn dịch hạch theo vết đốt vào cơ thể vật chủ này và như vậy xảy ra sự lây truyền bệnh

* Lan truyền trực tiếp từ vật chủ bệnh sang vật chủ lành không qua trung gian của bọ chét như:

- Vi khuẩn Y.pestis xâm nhập trực tiếp qua da có hoặc có thể không có tổn

thương khi tiếp xúc trực tiếp vào động vật bị bệnh, nhân viên các phòng xét nghiệm

về vi khuẩn Y.pestis hoặc do động vật nuôi trong nhà cắn hoặc cào

- Hít vào trực tiếp vi khuẩn Y.pestis tồn tại trong không khí do tiếp xúc trực

tiếp với vật chủ bị bệnh hoặc chết vì dịch hạch, nhất là dịch hạch thể phổi Đây là một phương thức lây truyền cực kỳ nguy hiểm vì xảy ra rất nhanh cho người tiếp xúc

Vi khuẩn dịch hạch xâm nhập qua da, ở nơi bọ chét đốt và theo đường bạch huyết đến hạch khu vực, sinh sản phát triển mạnh tại đó gây nên dịch hạch thể hạch Sau đó, nếu không được điều trị thích hợp vi khuẩn dịch hạch xâm nhập vào máu gây nên thể nhiễm khuẩn thứ phát Đối với thể nhiễm khuẩn huyết tiên phát hoặc thứ phát, ngoài vai trò truyền bệnh của bọ chét còn có thêm yếu tố độc lực của mầm bệnh và sức đề kháng của cơ thể vật chủ[1]

Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch

I.4.2 Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Y pestis

Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tối nguy hiểm thuộc diện kiểm

dịch và khai báo quốc tế do vi khuẩn Y pestis gây nên Bệnh lưu hành trong quần

thể động vật thuộc bộ gặm nhấm (Rodentia), chủ yếu là chuột và bọ chét ký sinh trên chúng, từ đó lây truyền sang các loại súc vật khác và sang người

Vi khuẩn dịch hạch trải qua nhiều danh pháp khác nhau, đầu tiên khi mới

được phát hiện có tên là Bacterium pestis, đến năm 1900 gọi là Bacillus pestis, sau năm 1923 đổi thành Pasteurella pestis và tại Hội nghị Sinh vật học Quốc tế lần thứ

10 vào năm 1970 mới có danh pháp như hiện nay là Y pestis

Yersinia pestis do Alexandre Yersin phát hiện ra tại Hồng Kông vào ngày 20

tháng 6 năm 1894, trong thời gian đại địch lần thứ 3 đang hoành hành ở đây

Yersinia pestis trước đây được xếp vào họ Pasteurellaceae, nhưng dựa trên

cơ sở so sánh mã di truyền bằng lai tạo DNA-DNA và RNA ribosom 16S/5S thì

tương tự như Escherichia coli nên chi Yersinia được xếp lại vào họ

Enterobacteriaceae Chi Yersinia có 11 loài nhưng chỉ có 3 loài được quan tâm vì

có khả năng gây bệnh cho người là Y pestis, Y.pseudotuberculosis và Y

enterocolitica

Yersinia pestis có hình dạng cầu trực khuẩn (0,5 x 1- 2 µm), bắt màu Gram

âm, nhuộm Wayson có màu xanh tím bắt màu ở 2 đầu, ở giữa trống nên gọi là “bắt màu lưỡng cực” Vi khuẩn không di động, không hình thành nha bào và không sinh

axít Y pestis là vi khuẩn hiếu khí, dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông

thường, mọc tốt nhất ở nhiệt độ 28 - 300C và độ pH từ 7,2 đến 7,6 Trên môi trường canh thang, khuẩn lạc mọc không làm đục môi trường Trên môi trường thạch, khuẩn lạc dạng R điển hình (lồi ở giữa, xung quanh sáng và có mép viền không đều kiểu đăng ten) Vi khuẩn lên men đường glucose và mannitol, không lên men đường rhamnose, lactose và sucrose

Hình1.6: Hình ảnh Y pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson

Dựa vào khả năng khử hóa nitrat thành axít nitric và lên men glycerin, Y

pestis được chia thành 3 type sinh học là Orientalis, Antiqua và Medievalis Ba

type này không có sự khác nhau về độc lực cũng như bệnh học đối với người và động vật, nhưng chúng có phân bố địa lý cũng như tính chọn lọc vật chủ rất khác nhau nên có vai trò quan trọng về mặt dịch tễ học [2]

Yersinia pestis thuộc nhóm vi khuẩn có sức đề kháng yếu với môi trường

bên ngoài Ánh sáng, nhiệt độ cao, làm sấy khô có thể phá hủy vi khuẩn Các chất sát trùng, tẩy uế như lysol và các chế phẩm chứa Chlorin diệt vi khuẩn trong vòng

10 phút

Yersinia pestis có cấu trúc kháng nguyên phức tạp và khả năng gây bệnh

phụ thuộc vào nhiều yếu tố, những chủng có độc lực cao có từ 16 đến 18 kháng nguyên Kháng nguyên quan trọng thường được chú ý là F1, V, W và 2 yếu tố là P

và Pu Kháng nguyên nang F1 (capsular antigen): có độc lực cao và mang tính kháng nguyên mạnh, có tác dụng bảo vệ vi khuẩn sinh trưởng chống lại thực bào; kháng nguyên thân V: là một phần của nội độc tố; kháng nguyên W: là yếu tố độc lực liên quan đến khả năng chống lại hiện tượng thực bào

Burrows và Bacon đã xác định tính kháng thực bào của Y pestis nhờ kháng

nguyên gọi là V và W có thể hoạt động liên kết hay độc lập với kháng nguyên F1

Những chủng không độc đều thiếu kháng nguyên F1 Y.pestis tạo ra cả nội độc tố

và ngoại độc tố Các độc tố dịch hạch có tác động làm tan hồng cầu, tan tơ huyết và làm đông huyết tương, những yếu tố này giúp vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể vật chủ Nội độc tố có tính chất ái thần kinh, gây nên bệnh cảm li bì, u ám, thâm nhiễm xuất huyết ở các nội mạc tĩnh mạch và những tổn thương thoái hóa của phủ tạng

Vi khuẩn dịch hạch có thể lây truyền qua cả 4 con đường: đường máu (là chủ yếu), đường tiêu hóa, đường hô hấp và đường da, niêm mạc [2]

I.5 Kháng nguyên nang F1

I.5.1 Cấu trúc kháng nguyên F1

Kháng nguyên F1 có tính đặc hiệu loài cao, chỉ có chủng Y pestis mới có kháng nguyên F1 William và cộng sự đã nghiên cứu trên 300 chủng Y pestis độc

và không độc cho thấy tất cả các chủng đều có kháng nguyên F1, bởi vậy kháng

nguyên F1 được dùng cho chẩn đoán dịch hạch [6] Ở Y pestis, quá trình tổng hợp

và tiết kháng nguyên F1 được mã hóa bởi operon F1 bao gồm 4 gen caf1, caf1M,

caf1A và caf1R nằm trên plasmid pMT1, trong đó caf1 mã hóa kháng nguyên F1, caf1M và caf1A đóng vai trò trong việc tạo cấu trúc và tiết protein ra bên ngoài tế

bào, caf1R đóng vai trò trong điều hòa quá trình phiên mã các gen trên operon Về

mặt cấu trúc, kháng nguyên F1 là chuỗi polypeptide, kích thước 17 - 17,6 kDa, điểm đẳng điện 4,1 - 4,4 F1 là protein kị nước với cấu trúc bậc hai gấp nếp β [7]

Kháng nguyên nang F1 là một dấu hiệu cụ thể để có thể xác định vi khuẩn Y pestis

Khi nuôi cấy ở 370C thì kháng nguyên F1 được hình thành nhiều nhất trên bề mặt

tế bào, dễ dàng hòa tan trong môi trường nuôi cấy

Protein F1 có cấu trúc bậc 4, tương tác kị nước, có cấu trúc bên trong kiểu hàng rào không gian 3 nhịp với các lỗ thấm có tác dụng như một màng sinh học hỗ trợ cho thành phần tế bào Kháng nguyên F1 có thành phần hóa học và cấu trúc đặc biệt nên ít chịu tác động của các nhân tố hóa lí: bền với nhiệt, đun nóng 80-100oC trong 15phút mới làm biến đổi một phần tính kháng nguyên và chỉ bị phân hủy hoàn toàn khi nung nóng 100oC trong 1 giờ Kháng nguyên F1 có tính sinh miễn dịch, có khả năng chống lại thực bào của các bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn

tính chất quan trọng khác nữa đã được Janssen và Sunrgalla nhấn mạnh là kháng

nguyên F1 trợ giúp cho Y pestis trốn được thực bào [8]

Các nghiên cứu sơ bộ đã chứng minh kháng nguyên F1 tồn tại trong mô động vật và huyết thanh của bệnh nhân dương tính dịch hạch Sử dụng kĩ thuật miễn dịch để phát hiện kháng nguyên F1 trên bệnh nhân nghi ngờ mắc dịch hạch thông qua mẫu hạch, huyết thanh, nước tiểu cho kết quả xác định được 100% các

ca nhiễm bệnh [9] Do đó kháng nguyên F1 đã được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán huyết thanh bệnh dịch hạch [10]

I.5.2 Tính chất của kháng nguyên nang F1

Kháng nguyên F1 được sử dụng để nghiên cứu trong các thí nghiệm tiếp theo của chúng tôi là kháng nguyên F1 được tạo ra bằng phương pháp tái tổ hợp

dung hợp với MBP và kháng nguyên F1được tinh sạch từ chủng Y.pestis tự nhiên

I.6 Các phương pháp phân tích chẩn đoán kháng nguyên F1 của vi

khuẩn Y.pestis

Để phát hiện kháng nguyên F1 thường sử dụng một số nhóm phương pháp chính như phương pháp sinh học phân tử, phương pháp miễn dịch (phổ biến nhất là

ELISA và sắc ký miễn di ̣ch ke ̣p đôi)

I.6.1 Phương pháp miễn dịch

I.6.1.1 Phương pháp ELISA kẹp đôi ( Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Sandwich)

Phương pháp này dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và các kháng thể (kháng thể bắt cặp và kháng thể phát hiện) Trong đó kháng thể bắt cặp được sử dụng là kháng thể đơn dòng hoặc kháng thể đa dòng, kháng thể phát hiện thường là kháng thể đơn dòng Nguyên lý của phương pháp gồm: (1) gắn kháng thể bắt cặp lên giếng; (2) bổ sung mẫu (kháng nguyên liên kết với kháng thể bắt cặp); (3) bổ sung kháng thể phát hiện (kháng thể phát hiện sẽ liên kết với kháng nguyên); (4) bổ sung kháng thể cấp hai liên kết với enzym (kháng thể này liên kết với kháng thể phát hiện); (5) bổ sung cơ chất (nhằm chuyển hóa thành dạng có thể phát hiện được nhờ enzym)

Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu phản ánh nồng độ kháng nguyên cần phát hiện Hiện nay, trên thế giới thường sử phương pháp ELISA kẹp đôi để phát

hiện kháng thể kháng F1 trong huyết thanh hoặc các dịch tiết (nước bọt, nước tiểu)

Ưu điểm cơ bản của các phương pháp ELISA kẹp đôi là có đô ̣ nha ̣y phát hiê ̣n cao

và có khả năng đi ̣nh lượng Nồng độ kháng thể kháng F1 tối thiểu có thể phát hiện được là 4 ng/ml Độ nhạy là 90,1% đối với huyết thanh và 100% đối với dịch tiết như nước bọt Phương pháp chẩn đoán kháng thể kháng F1 bằng ELISA thích hợp cho việc phát hiện sớm bệnh dịch hạch Tuy nhiên, điểm hạn chế của các phương pháp này là đòi hỏi trang thiết bi ̣ cùng trình đô ̣ kỹ thuâ ̣t cao để tránh hiê ̣n tượng dương tính giả và do đó chỉ thích hợp với các phân tích ta ̣i phòng thí nghiê ̣m, không có khả năng ứng du ̣ng ta ̣i hiê ̣n trường

I.6.1.2 Sắc ký miễn dịch kẹp đôi

Phương pháp sắc ký miễn dịch (immunochromatographic assay (ICA) dựa trên nguyên lý kết hợp kháng nguyên - kháng thể mà một trong hai thành phần này được gắn cộng hợp (conjugate) để phát hiện thành phần kia, sau đó nhờ phức hợp này chuyển dịch do tác dụng mao dẫn trên màng, để rồi được tóm bắt bằng kháng thể (hoặc kháng nguyên) đã bố trí sẵn tại vạch phát hiện (Hình 1.7) Đây là phương pháp phân tích nhanh, dễ thực hiện, được phát triển từ năm 1956 Trong 20 năm gần đây, nhờ ứng dụng công nghệ kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) và cải tiến nguyên liệu thành phần trong đó có việc sử dụng hạt nano kim loại làm thành phần cộng hợp (ví dụ: hạt vàng (Au) [14] và cải tiến chất lượng màng nitrocellulose (NC), cũng như ứng dụng tự động hóa trong sản xuất, ICA đã được ứng dụng để chế tạo nhiều sinh phẩm chẩn đoán các tác nhân gây bệnh khác nhau, bao gồm độc tố, dư lượng kháng sinh, vi sinh vật gây bệnh.Ưu điểm của sắc ký miễn dịch bao gồmtính đơn giản trong sử dụng, thời gian thực hiện nhanh, kết quả chính xác, giá thành rẻ, có thể dùng như một phương tiện lưu động, không cần máy móc quy mô và đắt tiền Có thể sử dụng sắc ký miễn dịch để phát hiện kháng

nguyên hoặc kháng thể Nguyên lý ứng dụng ICT sử dụng kháng thể phát hiện kháng nguyên được trình bày ở Hình 1.7

Hình 1.7 Mô hình lắp ráp các thành phần của bộ kit ICT(I) và đánh giá kết quả (II)

(Nguồn: Cortez Diagnostics, Inc.tại: http://www.rapidtest.com/) (Theo Nguyễn

Đình Phúc và Lê Thanh Hòa, 2008)

+ Về thứ tự sắp xếp lắp ráp

Nguyên liệu gồm có: 1) tấm nhận mẫu; 2) tấm cộng hợp (conjugate); 3) vạch phát hiện T (test line); 4) vạch đối chứng C (control line); 5) tấm hút mẫu; 6) màng nitrocellulose; 7) khung đỡ bao bọc (Hình 1.7-I) Màng nitrocellulose, nối tấm cộng hợp với tấm hút mẫu, đảm bảo cho các phân tử vật chất chuyển động theo nguyên

lý mao dẫn (Hình 1.7-II) Trên màng nitrocellulose bố trí vạch phát hiện T và vạch đối chứng C Đầu cuối của bộ sinh phẩm có tấm hút để hút huyễn dịch khi bộ kit hoạt động Tất cả được bao bọc bằng một khung nhựa tạo thành hộp, để hở ra bên ngoài là một giếng tra mẫu và một cửa sổ hình chữ nhật để đánh giá kết quả tại vạch T và C

Có 3 loại kháng thể: 1) Kháng thể 1 (KT1) là kháng thể đơn dòng kháng lại với một epitopecủa kháng nguyên cần phát hiện, sản xuất trên chuột; 2) Kháng thể

2 (KT2) là kháng thể với một epitope khác của cùng kháng nguyên cần phát hiện; 3) Kháng thể 3 (KT3) là kháng thể kháng lại IgG của loài sinh KT1, có khả năng kết hợp với bất kỳ kháng thể nào có bản chất cấu trúc là immunoglobulin IgG Ngoài ra, thành phần tham gia kit còn có vật chất cộng hợp (conjugate), đó là hạt vàng (colloidal gold particle), được gắn vào với cấu trúc KT1 Tấm nhận mẫu được xếp gối lên trên tấm cộng hợp, rồi tấm cộng hợp được xếp chồng dính với màng nitrocellulose, tại tấm cộng hợp bố trí một lượng KT1 gắn cộng hợp với hạt vàng ở dạng khô; tại vạch T bố trí cố định KT2 ở dạng khô; và tại vạch C cũng được bố trí

cố định KT3 cũng ở dạng khô, bình thường cả hai vạch này đều không nhìn thấy

được (Hình 1.7-I)

+ Về nguyên tắc hoạt động của phép thử và đánh giá kết quả

Mẫu phân tích được xử lý bằng dịch chiết phù hợp rồi được nhỏ vào giếng S (sample) lên trên tấm nhận mẫu, về nguyên tắc, toàn bộ huyễn dịch sẽ được chuyển dịch theo mao dẫn xuyên qua tấm cộng hợp, đến vạch T và vạch C và đi về phía tấm hút mẫu (Hình 1.7-II) Có 2 trường hợp kết quả sẽ xảy ra :

i) Nếu trong mẫu bệnh phẩm tra vào có kháng nguyên tương ứng (KN) thì

huyễn dịch mẫu bệnh phẩm sẽ tạo môi trường hoạt động cho KT1 + cộng hợp hạt vàng (KT1(Au)) và lúc này kháng nguyên sẽ kết hợp với một số phân tử (KT1(Au)) tạo thành phức hợp KT1(Au)+KN, tất cả đều cùng chuyển dịch đến vạch T Tại vạch T, phức hợp này kết hợp tiếp với KT2 tạo thành phức hợp KT1(Au)+KN+KT2, hay nói cách khác KT2 cố định tại vạch T đã tóm bắt được kháng nguyên có ở phức hợp KT1(Au)+KN làm cho hạt vàng cộng hợp với KT1 tích tụ lại và hiển thị Các phân tử (KT1(Au)) còn lại tiếp tục dịch chuyển đến vạch

C, tại đây, phức hợp KT3+KT1(Au) được hình thành do sự kết hợp giữa KT3 là kháng thể kháng lại IgG của chuột với KT1 có bản chất là IgG của chuột Hạt vàng cộng hợp với KT1 cũng được tích tụ lại và hiển thị, về nguyên tắc, sự hiển thị này bao giờ cũng được hình thành, cho dù bệnh phẩm có kháng nguyên hay không có kháng nguyên (Hình 1.7- II)

ii) Nếu trong mẫu tra vào không có kháng nguyên tương ứng (KN) thì huyễn

dịch dung môi trong mẫu bệnh phẩm vẫn sẽ hoạt hóa KT1 + cộng hợp vàng (KT1(Au)) và lúc này, do không có kháng nguyên để kết hợp với (KT1(Au)) nên phức hợp KN+KT1(Au) không được tạo thành KT1(Au) đi xuyên qua vạch T mà không bị KT2 tóm bắt, nên tiếp tục chuyển dịch đến vạch C Tại vạch C, phức hợp KT3+KT1(Au) được hình thành do sự kết hợp giữa KT3 là kháng thể kháng lại IgG của chuột với KT1 có bản chất là IgG của chuột, có vai trò như là một kháng nguyên, do đó, hạt vàng cộng hợp với KT1 được tích tụ lại và hiển thị (Hình 1.7-II)

Như vậy: i) khi cả hai vạch T và C hiển thị thì kết quả đánh giá là dương tính

và đã phát hiện sự có mặt của kháng nguyên trong mẫu bệnh phẩm; ii) khi chỉ có một mình vạch C hiển thị thì kết quả đánh giá là âm tính do trong mẫu bệnh phẩm không có mặt của kháng nguyên Trường hợp cả hai vạch không hiển thị, phản ứng không được đánh giá và cần thiết phải làm lại Không để phản ứng quá lâu (trên 30 phút) mới đánh giá, vì có thể phát sinh phản ứng phụ làm sai lệch kết quả

Toàn bộ thời gian thực hiện phản tích chỉ khoảng 5-30 phút Cho dù là kháng nguyên hòa tan (dạng polypeptide) hay kháng nguyên liên kết bề mặt của vi sinh vật, bộ sinh phẩm ICT đều cho phản ứng hoạt động chính xác Do vậy, bộ sinh phẩm ICT được coi là công cụ thích hợp trongchẩn đoán sàng lọc các bệnh truyền nhiễm và phát hiện các độc tố độc chất, hóa chất, hóa dược [16]

Phương pháp sắc ký miễn dịch có ưu điểm nổi bật là thời gian phân tích ngắn, giá thành rẻ, quy trình thử nghiệm đơn giản không đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao, không cần thể tích mẫu lớn, là công cụ hữu hiệu cho phân tích nhanh ở hiện trường hoặc mục đích sàng lọc với số lượng mẫu lớn, có thể bảo quản lâu dài ở điều kiện thường Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn tồn tại một số nhược điểm như độ nhạy thấp hơn so với các phương pháp sắc ký dụng cụ hay ELISA, có khả năng phản ứng chéo với các độc tố có cấu trúc tương tự độc tố cần phân tích, có khả năng xảy ra hiện tượng âm tính hoặc dương tính giả [17]

Nghiên cứ u đầu tiên phát triển que thử nhanh phát hiê ̣n kháng nguyên nang

hai kháng thể đơn dòng từ chuô ̣t, các tác giả đã ta ̣o ra được que thử cho phép phát hiện F1 với ngưỡng rất thấp là 0,5 ng/ml trong vòng 15 phút Cũng dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn di ̣ch ke ̣p đôi nhưng Tsui và đồng tác giả (2015) la ̣i sử du ̣ng hai kháng thể đa dòng từ thỏ để phát hiê ̣n F1 Ngưỡng phát hiê ̣n F1 của que thử trong nghiên cứ u này chỉ đa ̣t ở mức 50 ng/ml ứng với 105CFU/ml củ a Y pestis Trên thi ̣

trường hiê ̣n cũng có mô ̣t số loa ̣i sinh phẩm dựa trên kỹ thuâ ̣t sắc ký miễn di ̣ch cho phép phát hiê ̣n nhanh Y pestis như BADD Plague (Y pestis) Biowarfare Detection

Test Kit củ a công ty AdVnt Biotechnologies (ngưỡng phát hiê ̣n: 105CFU/ml, giá:

257 USD/10 test); Plague BioDetect™ Test Strips củ a công ty Alexeter Technologies; IMASS củ a công ty BBI cho phép phát hiê ̣n đồng thời 8 tác nhân vũ khí sinh ho ̣c bao gồm Y pestis (ngưỡng phát hiê ̣n: 108CFU/ml, giá:1200 USD/10 test); BioThreat Alert® Test Strips củ a công ty Tetracore (ngưỡng phát hiê ̣n: 105-6CFU/ml, giá: 605 USD/25 test) Có thể nhâ ̣n thấy rằng các bô ̣ sinh phẩm thương

mại có giá thành rất cao và ngưỡng phát hiê ̣n cũng ở mức trung bình khi so với công bố của Chanteau và đồng tác giả (2003)

I.6.2 Phương pháp sinh học phân tử

Các phương pháp sinh học phân tử thường sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện các gen mã hóa các độc tố F1 dựa trên các trình tự mồi chuyên biệt cho các

gen mã hóa độc tố F1 là gen caf1 Các phản ứng PCR thường dùng là Multiplex và

gần đây là real-time PCR [3] Các phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy và độ

đặc hiệu rất cao, cho phép phát hiện nhanh Y.pestis tạo độc tố với một lượng mẫu

nhỏ Tuy nhiên, hạn chế cơ bản của loại phương pháp này là nó chỉ cho biết sự có mặt hay không của các gen mã hóa cho F1 mà không cho biết sự biểu hiện của các gen này đồng thời phương pháp này đòi hỏi phải thực hiện trên các trang thiết bị hiện đại, đắt tiền và cần phải có đội ngũ kỹ thuật viên có trình độ Tại Việt Nam đã

có nghiên cứu của tác giả Đinh Thị Thu Hằng và cs 2015 [3] đã giải trình tự 3 gen

là ypo2088, pla và caf1 của chủng vi khuẩn Y pestis Yp1 phân lập ở Việt Nam và

nhận thấy chủng này có trình tự tương đồng 100% với dữ liệu trên GenBank (Nguyễn Thị Thu Hà và cộng sự, 2016)

I.7 Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng

I.7.1 Định nghĩa IgY

Kháng thể IgY (viết tắt của Yolk Immunoglobulin – có nghĩa là kháng thể lòng đỏ trứng) là một type kháng thể chủ yếu trong máu các loài chim, bò sát, cá

có mang Nó cũng được tìm thấy với hàm lượng cao trong lòng đỏ trứng gà Giống như các loại kháng thể khác, kháng thể IgY là một lớp protein được hình thành từ hệ miễn dịch khi phản ứng lại những yếu tố bên ngoài và đặc hiệu với các yếu tố đó

I.7.2 Sự hình thành kháng thể IgY ở gà

Kháng thể IgY được chuyển từ máu gà mẹ sang tích lũy ở lòng đỏ trứng như một cơ chế miễn dịch thụ động được chuyển từ gà mẹ sang bảo vệ phôi và gà con Quá trình vận chuyển này bao gồm 2 bước Bước 1: IgY được chuyển từ máu gà mái vào lòng đỏ trứng (tương tự như quá trình vận chuyển IgG qua nhau thai ở động vật có vú) Bước 2: IgY được chuyển từ lòng đỏ trứng sang phôi trong quá trình phát triển của phôi gà

Hình 1.8: Quá trình chuyển IgY vào lòng đỏ trứng

I.7.3 Cấu trúc của kháng thể IgY

Về mặt cấu trúc, kháng thể IgY tương đương với kháng thể IgG trong động vật có vú, bao gồm hai chuỗi nặng H (heavy chain) và hai chuỗi nhẹ L (light chain) liên kết với nhau bằng các cầu nối disulfua (-S-S-) Hai loại kháng thể này khác nhau cơ bản ở hai chuỗi nặng, tại đó chuỗi nặng trong kháng thể IgY có khối lượng phân tử khoảng 65 kDa, và do đó lớn hơn nhiều so với IgG Chuỗi nhẹ trong kháng thể IgY, với khối lượng mole khoảng 25 kDa Do vậy, trọng lượng phân tử của IgY (180 kDa), lớn hơn so với IgG của động vật có vú (150 kDa) Sự lớn hơn về trọng lượng phân tử của chuỗi nặng IgY là do sự tăng thêm một tiểu phần cố định (constant domain) ở chuỗi nặng và kèm theo chuỗi carbohydrate Sự khác biệt tiếp theo trong cấu trúc phân tử là vùng bản lề (hinge) của IgY ít linh hoạt hơn so với kháng thể IgG của động vật Cấu trúc protein cũng cho thấy IgY chứa nhiều thành phần phân tử kị nước (hydrophobic molecule) hơn IgG Điểm khác nữa là IgY có điểm đẳng điện ở pH 5,7 – 7,6, trong khi đối với IgG là 6,1 – 8,5 Khác với kháng thể động vật IgG, kháng thể gia cầm IgY hoàn toàn không gắn kết với bổ thể và cũng không kết hợp với các vùng cố định của kháng thể động vật (Mammalian Fc) cũng như với các thụ thể của bổ thể (Complement receptors) Kháng thể IgY không bám vào protein A, protein G cũng như rheumatoid factor, chính vì thế sẽ không có kết quả phản ứng giả như khi làm phản ứng này với kháng thể động vật IgG

Hình 1.9: Cấu tạo kháng thể IgG và IgY

I.8 Sản xuất kháng thể đơn dòng từ chuột thuần chủng BALB/c

I.8.1 Khái niệm, ứng dụng của kháng thể đơn dòng

Khái niệm: Kháng thể đơn dòng là kháng thể được sản xuất bởi một dòng tế

bào lympho B Kháng thể đơn dòng mang tính đặc hiệu có tính đồng nhất về cấu trúc và tính chất Trong công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng được tạo ra bởi 2 dòng tế bào lai là tế bào ung thư myolema với tế bào lympho B của hệ miễn dịch

Ứng dụng của kháng thể đơn dòng:

Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu y sinh học cơ bản, trong chẩn đoán bệnh, và trong điều trị các bệnh như bệnh nhiễm trùng và ung thư

+ Ưu điểm của kháng thể đơn dòng (KTĐD):

- Là những chế phẩm tinh khiết có tính đặc hiệu cao đối với một yếu tố quyết định duy nhất của kháng nguyên

- Khả năng nhanh, nhạy cảm trong chẩn đoán bệnh

+ Nhược điểm của kháng thể đơn dòng (KTĐD):

- Hệ thống miễn dịch của con người nhận diện KTĐD (được sản xuất từ tế bào B của chuột) như là protein lạ nên tạo ra các kháng thể chống lại chúng, thậm chí trung hòa chúng, làm hiệu quả của chúng suy giảm đáng kể Hơn nữa, một số KTĐD khi tiếp cận và bám được vào các kháng nguyên, chúng không trung hòa hoặc phá hủy được các kháng nguyên gây bệnh

- Thành phần kết hợp với KTĐD được đưa vào cơ thể bệnh nhân có thể bị tách ra và đi khắp nơi, gây nên các phản ứng phụ và hậu quả khó lường Ngoài ra, với một số khối u được bao bọc chắc chắn bởi các lớp mạch máu nuôi dưỡng, KTĐD rất khó thâm nhập vào bên trong để phá hủy

- Giá thành đắt

Để khắc phục những hạn chế trên, các nhà khoa học đã nghiên cứu đưa tế

hệ thống miễn dịch của bệnh nhân sẽ chấp nhận như là của mình Các nghiên cứu mới đây còn dùng công nghệ gene và thay thế chuột bằng các vi khuẩn để tạo các KTĐD nhỏ hơn, hoạt động hữu hiệu hơn, gắn chặt các vật mang hơn, thâm nhập các khối u dễ dàng hơn và đặc biệt là giá thành rẻ hơn

I.8.2 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng

Năm 1975 hai nhà khoa học là Kohler – Milstein đã đưa ra kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng ngoài cơ thể người dựa trên nguyên tắc lai tế bào u tủy (Myeloma) với tế bào lympho B đã hoạt hóa, sau này được các tác giả Karsten và Rudolph cải biên vào năm 1985 Qui trình, công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng

Hình 1.10: Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng

Nguyên lý của qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng (Monoclonal

hybridoma giữa tế bào lympho B và tế bào u tủy myeloma ii) Nhân các tế bào lai phát triển để tạo thành một dòng tế bào mà sẽ sản xuất ra KTĐD mong muốn

Tạo dòng tế bào lại hybridoma thực hiện qua các bước sau:

Bước 1: Gây kích ứng miễn dịch cho thú, thường là chuột BALB/c thuần chủng 3 tuần tuổi

Bước 2: Sàng lọc chuột để sản xuất kháng thể

Sau một vài tuần gây miễn dịch các mẫu máu thu được từ chuột được định lượng kháng thể trong huyết thanh Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh được xác định bằng nhiều kỹ thuật khác nhau ví dụ như ELISA hay đếm dòng tế bào Nếu như hiệu giá kháng thể cao việc dung hợp tế bào có thể được thực hiện Nếu như hiệu giá quá thấp người ta có thể áp dụng các phản ứng mạnh trên chuột cho đến khi hiệu giá đạt được đầy đủ ví dụ như lấy mẫu máu nhiều lần Khi hiệu giá kháng thể đủ cao, chuột được thúc đẩy bằng cách tiêm kháng nguyên mà không có chất bổ trợ hoặc tiêm vào các tĩnh mạch (thông qua các tĩnh mạch đuôi) 3 ngày trước khi dung hợp và sau 2 tuần từ đợt gây miễn dịch trước đó Sau đó những con chuột này được gây chết và tách lấy lá lách để sản xuất các tế bào hybridoma trong ống nghiệm

Bước 3: Chuẩn bị các tế bào myeloma

Tế bào lá lách sản xuất các tế bào dung hợp có tuổi thọ hạn chế so với các tế bào bất tử có nguồn gốc từ khối u của tế bào lympho (u tủy) cho kết quả là tạo ra các hybridoma có khả năng tăng trưởng không giới hạn Tế bào myeloma là các tế bào bất tử đựơc nuôi cấy với 8-azaguanine để chắc chắn độ nhạy của nó với HAT, môi trường được lựa chọn sử dụng sau khi dung hợp tế bào Một tuần sau khi dung hợp tế bào, tế bào myeloma được nuôi cấy trong 8-azaguanine Các tế bào này phải

có tính khả thi cao và tăng trưởng nhanh chóng Môi trường HAT cho phép chỉ có các tế bào dung hợp mới tồn tại được

Bước 4: Dung hợp tế bào myeloma với tế bào lá lách (tế bào lympho B)

Tế bào lá lách đơn thu được từ các con chuột gây miễn dịch được dung hợp với các tế bào myeloma chuẩn bị trước Quá trình dung hợp được thực hiện bằng đồng ly tâm thu các tế bào lá lách và tế bào myeloma trong polyethylene glycol, một chất có khả năng làm dung hợp màng tế bào Như đã chú ý ở bước 3, chỉ có các tế bào dung hợp mới có khả năng phát triển trong môi trường chọn lọc đặc biêt Các tế bào này sau đó được chia vào 96 giếng có các feeder cell lấy từ màng bụng của chuột Trong các feeder cell này cung cấp các yếu tố cần thiết cho sự phát triển của tế bào hybridoma Các chế phẩm thương mại thu được là kết quả từ việc sưu