Một số phương pháp tách chất và xác định cấu trúc các hợp chất sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng tử hạt nhân NMR

Phân lập các hợp chất thiên nhiên rất quan trọng, qua việc phân lập tìm ra các hợp chất góp phần nâng cao điều kiện sống, cũng như tìm ra các lớp chất có khả năng chữa bệnh Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân có thể thấy là phương pháp đo phổ hữu hiệu và hiện đại nhất hiện nay. Cùng với các phương pháp hóa lý khác để xác định cấu trúc hợp chất, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C và phổ NMR 2 chiều đã góp phần quan trọng trong việc tìm kiếm, tổng hợp ra các hợp chất mới có nhiều tính năng ưu việt. Khi khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, sự ứng dụng của phương pháp phổ này càng được mở rộng và được cải tiến để thu được những kết quả có độ chính xác cao hơn.

MỞ ĐẦU

Các hợp chất thiên nhiên bao gồm các hợp chất được hình thành trong quá trình khởi tạo, hay quá trình duy trì sự sống của các hệ thực vật cũng như động vật Hệ thực vật cũng như hệ động vật rất phong phú, với những điều kiện sống khác nhau góp phần hình thành các lớp chất với những hoạt tính khác nhau VD như các acid amin như ɷ-3, ɷ -6, hay các Flavonoid, alkanoid… Mỗi lớp chất được ứng dụng với những vai trò khác nhau Việc phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất từ thiên nhiên là một ngành khoa học nghiên cứu thú vị đã và đang nghiên cứu từ rất lâu

Hóa học cấu trúc các hợp chất thiên nhiên đã được nghiên cứu từ rất lâu, từ những phương pháp cổ điển với nhứng hệ máy cổ điển cho tới những phương pháp được cải tiến dưới sự hỗ trợ của các thế hệ máy hiện đại Với những thế hệ máy hiện đại trong những thập niên hiện nay, việc xác định rõ ràng các hợp chất đã được làm sáng tỏ Cấu trúc với hoạt tinh sinh học cũng được nghiên cứu nhằm xác định hợp chất có tiềm năng Rõ ràng việc xác định cấu trúc của các hợp chất đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống, đặc biệt sự ứng dung của cấu trúc trong hóa học và sinh học

Với việc xã hội phát triển kèm theo những thiết yếu của cuộc sống, nhiều phương pháp xác định cấu trúc được ra đời

Trong khuôn khổ tiểu luận này, em xin trình bày về một số phương pháp tách chất và xác định cấu trúc các hợp chất sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng tử hạt nhân NMR - một phương pháp phổ hiện đại với độ xác định cấu trúc các hợp chất cao

PHẦN I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT

I.1: Các phương pháp phân tách hợp chất thiên nhiên.

Từ khi ra đời và có những bước phát triển mạnh mẽ, sắc ký đã trở thành một phương pháp hữu hiệu và không thể thay thế trong việc phân tách chất tinh khiết ra khỏi một hỗn hợp để định tính, định lượng, tinh khiết hóa cũng như phân lập các chất mong muốn Sắc ký được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghệ sinh học, hóa tổng hợp, dược liệu, hóa phân tích, kiểm nghiệm v.v…

Bên cạnh việc sử dụng để định tính, định lượng các chất (sắc ký phân tích) thì sắc ký còn dùng để phân lập, điều chế, tinh chế các chất mong muốn trong một hỗn hợp nhiều thành phần (sắc

ký điều chế hay còn gọi là sắc ký chế hóa) Đây là một ứng dụng hết sức quan trọng, đặc biệt trong hóa tổng hợp và dược liệu

I.1.1 Sắc kí bản mỏng.

Một trong những kỹ thuật sắc ký nhanh, tiện lợi, dễ thực hiện và thông dụng nhất hiện nay

đó là sắc ký lớp mỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) được dùng để định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoặc định lượng hoạt chất thuốc

Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật tách các chất được tiến hành khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã đặt hỗn hợp các chất cần tách Pha tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù hợp theo từng yêu cầu phân tích Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc

độ khác nhau Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng

Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di chuyển Rf được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

Trong đó:

Rf= a/b

a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm.

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đườn đi của vết, tính bằng cm

Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1

I.1.2 Sắc kí cột

Nguyên lí tách của sắc kí cột cũng như của các loại sắc kí khác: một mẫu thử được nạp lên một cột chứa chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxyt).Cột chứa chất hấp phụ này đóng vai trò

là một pha tĩnh Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử, do các cấu tử này có độ phân cực khác nhau nên ái lực của chúng với pha tĩnh cũng khác nhau

I.1.3 Sắc kí cột nhanh.

Sắc ký cột nhanh, còn được biết là sắc ký cột với áp lực trung bình, được ứng dụng đầu tiên bởi Clark Still ở trường đại học Columbia và được mô tả trong J.Org Chem 43, 2923 (1978)

Sắc ký cột nhanh khác các kỹ thuật truyền thống khác ở 2 điểm:

 Sử dụng các phân tử silica gel nhỏ 250-400 mesh

 Vì giới hạn dòng chảy của dung môi gây bởi những phân tử silica gel nhỏ, do đó, khí nén (áp lực từ 10-15 psi) được sử dụng để đẩy dung môi qua cột pha tĩnh Do đó quá trình sắc ký nhanh, có độ phân giải cao

I.1.4 Sắc kí cột chân không.(Vacuum liquid chromatography-VLC).

Sắc kí cột chân không (VLC) là 1 dạng sắc kí cột cải tiến Hệ thống hoạt động nhờ áp suất hút dưới vòi cột, dung môi chảy xuyên qua hệ thống với lưu lượng lớn

Mục đích là tách 1 mẫu phức tạp thành vài phân đoạn có độ phân cực khác nhau

Đây là 1 dạng sắc kí hấp phụ, có khả năng tách trung bình

I.1.5 Sắc kí lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography-HPLC).

HPLC - High Performance Liquid Chromatography là phương pháp sắc ký phân tích có tốc độ nhanh và hiệu suất cao, dùng để phân tích định tính (xác định thành phần của hỗn hợp) và định lượng (xác định nồng độ của các chất) các hợp chất hữu cơ trong một số lĩnh vực như: hóa công nghiệp, hóa thực phẩm, hóa dược,…

HPLC được phân ra:

 sắc kí dùng để phân tích định tính và định lượng

 sắc kí điều chế

Đây là hệ thống sắc kí với các hệ máy hiện đại nhât với nhiều hệ thống kết nối với nhau

Hệ thống HPLC bao gồm : Hệ thống dung môi, bơm, kim tiêm, cột, detecto, và máy tính

Về nguyên tắc phân tách hợp chất thì HPLC cũng như sắc kí cổ điển cũng như sắc kí cột, chỉ khác sắc ki lỏng cao áp có hệ thống bơm và hệ thống cột (Cột dùng trong sắc ký lỏng thường là một ống làm bằng thép không rỉ hoặc thủy tinh đặc biệt) và hơn thế nữa là hệ thống detector kết nối với máy tính ghi nhận tín hiệu pic HPLC cũng tồn tại rất nhiều loại dung môi khác nhau cũng như các loại cột và các detecto khác nhau Tùy mục đích sử dụng

và phương pháp áp dụng mà chọn lựa các điều kiện thích hợp để tách chất

Ngoài việc định tính, định lượng, HPLC điều chế còn được ứng dụng trong phân tách các hợp chất sử dụng hệ thống cột điều chế và Fraction Collecto

I.1.6 Sắc kí khí (Gas chromatography-GC).

Sắc kí khí là phương pháp sắc kí mà pha động lỏng được thay bằng một dòng khí liên tục chạy qua pha tĩnh Các chất được tách ra khỏi hỗn hợp bởi tương tác khác nhau của chúng với pha tính Do khả năng hòa tan rất kém của chất khí, hay dòng khí này không đóng vai trò là pha động thực sự trong hệ thống sắc kí Nó chỉ làm nhiệm vụ lôi cuốn các chất trong pha hơi chạt dọc theo pha tĩnh để chúng có thể tương tác trong pha tĩnh Dòng khí này được gọi là khí mang

Hệ thống ghi nhận dữ liệu cũng giống sắc kí lỏng, sau khi qua detector sẽ được ghi nhận bằng máy tính

Do đặc điểm của sắc kí khí mà nó được chỉ được áp dụng cho các chất có khả năng bay hơi ở nhiệt độ tiến hành sắc kí Ứng dụng của sắc kí khí rất lớn có thể phân tách xác định các loại tinh dầu, ngoài ra có một ứng dụng rất đáng quan tâm ở đây là việc phân tích

dư lượng chất bảo vệ thực vật còn dư trên dược liệu, dioxin…

Trên đây chỉ là một số phương pháp phân tách các hợp chất được đề cập, việc phân tách luôn phải đi kèm với việc xác định cấu trúc các hợp chất

I.2 Xác định cấu trúc các hợp chất sử dụng phổ NMR.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phổ CHTHN) viết tắt của tiếng Anh là NMR (nuclear Magnetic Resonance) là một phương pháp vật lý hiện đại nghiên cứu cấu tạo của các hợp chất hữu cơ, nó có ý nghĩa quan trọng để xác định cấu tạo các phân tử

phức tạp như các hợpchất thiên nhiên Phương pháp phổ biến được sử dụng là NMR-1H và phổ NMR -13C

Hệ thống máy NMR

I.2.1 Cơ sở vật lý học

I.2.1.1 Hạt nhân trong từ trường

- Hạt nhân của mỗi đồng vị của một nguyên tử được đặc trưng bởi số lượng tử spin I

và số lượng tử từ m

I: số lượng tử của spin hạt nhân (I = 0, ½, 1, 3/2, 5/2… )

mI : số lượng tử từ hạt nhân mI= (2I+1) có các giá trị khác nhau là -I, -I +

1, cho đến +I

- Thực nghiệm cho thấy mỗi hạt nhân nguyên tử có một số lượng tử spin I hạt nhân nhất định, phụ thuộc vào số khối của nguyên tử A và số thứ tự của nguyên tử là Z:

Các hạt nhân của nguyên tử tích điện dương, luôn luôn tự quay quanh trục của nó, khi quay như vậy, nó sinh ra một mômen quán tính gọi là momen spin hạt nhân P và momen từ µ Mặt khác, khi hạt nhân nguyên tử quay quanh trục của nó thì điện tích hạt nhân sẽ chuyểnđộng trên một vòng tròn quanh trục quay, làm xuất hiện một dòng điện Mỗi một dòng điện bao giờ cũng kèm theo m ột từ trường nên khi hạt nhân quay cũng xuất hiện một từ trường cómômen từ µ và hạt nhân trở thành một nam châm vĩnh cửu Mômen spin hạt nhân P tỷ lệ thuận với momen từ µ:

µ = γ P Trong đó: µ - mômen từ có giá trị tuyệt đối là µ

P - mômen spin hạt nhân có giá trị tuyệt đối là P

γ: hệ số từ thẩm đặc trưng cho mỗi hạt nhân nguyên tử

Giá trị tuyệt đối của momen spin hạt nhân P tính theo I:

P=(h/2π)/I)/I Giá trị tuyệt đối của momen từ µ tính theo I:

µ = γ (h/2π)/I).I I: số lượng tử spin hạt nhân, I = 0 thì µ = P = 0, I ≠ 0 thì µ ≠ 0 và P ≠ 0: hạt nhân được gọi là hạt nhân từ Đây là điều kiện để có cộng hưởng từ

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân phụ thuộc vào % đồng vị và momen từ µ Khi µ càng lớn thì độ nhạy càng cao

I.2.1.2 Hạt nhân ngoài từ trường

Khi không ở trong từ trường, các hạt nhân có cùng µ đều ở mức năng lượng bằng nhau Khi đặt một hạt nhân từ vào trong một từ trường ngoài có cường độ Bo thì các momen từ

µ của hạt nhân từ sẽ xoay theo hướng có đường sức từ của từ trường ngoài Hạt nhân nguyên tử từ khi ở trong một từ trường ngoài khác với một kim nam châm trong từ trường của trái đất: hạt nhân từ không phải tiếp nhận bất kỳ một vị trí nào của từ trường bên ngoài mà nó chỉ

ở một số vị trí nhất định trong không gian tương ứng với một số trạng thái năng lượng xác định nghĩa là năng lượng của hạt nhân từ được thể hiện qua giá trị của cosθ:

cosθ = m/I I: số lượng tử của spin hạt nhân (I = 0, ½, 1, 3/2, 5/2…)

mI : số lượng tử từ hạt nhân (m = -I đến +I) có 2I + 1 giá trị

∆E=h.ν= (h/2π)/I).γ.Bo

Vậy ν = (1/2π)/I).γ.B0.

Ở đây, ∆E là năng lượng cộng hưởng, ν là tần số cộng hưởng, Bo là cường độ của từ trường nam châm, γ là hệ số từ thẩm, mỗi hạt nhân có giá trị khác nhau như γ (1H) ~ 4γ(13C)

Do vậy Muốn xảy ra hiện tượng cộng hưởng phải chiếu vào hạt nhân một từ trường B1 có tần

số cộng hưởng là ν1 sao cho B1 vuông góc với Bo

Khi đó h.ν1 = ∆E = h.ν = (h/2π)/I).γ.Bo => ν1 = (1/2π)/I).γ.Bo.

ν1 là tần số cộng hưởng từ (tương ứng với năng lượng cần kích thích hạt nhân chuyển

từ mức thấp lên mức cao nằm trong vùng sóng vô tuyến 108 – 106 Hz

I.2.1.3 Hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân

Khi cho một từ trường Bo tác dụng lên các phân tử có chứa hạt nhân thì sẽ dẫn tới sự tách mức năng lượng và dẫn đến sự phân bố các hạt nhân theo cân bằng Boltzmann

Trong từ trường B0, các hạt nhân không nằm yên mà ở trạng thái cân bằng động Nếu muốn phá vỡ trạng thái c ân bằng động này cần phải cung cấp năng lượng từ ngoài vào bằng cách cho một từ trường khác có cường độ B1 tác dụng vào các phân tử này Điều đó sẽ làm thay đổi lại sự phân bố các hạt nhân giữa hai mức năng lượng trên Một số hạt nhân sẽ hấp thụ năng lượng của từ trường B1 để nhảy từ mức năng lượng thấp lên mức năng lượng cao và ngược lại, một số hật nhân ở mức năng lượng cao sẽ bức xạ năng lượng để chuyển xuống mức năng lượng hấp Năng lượng cần thiết để cung cấp cho quá trình thay đổi đó đúng bằng ∆E =

năng lượng cộng hưởng từ nhân Quá trình hấp thụ năng lượng ∆E để phân bố lại cân bằng động trong từ trường B1 gọi là hiện tượng cộng hưởng từ nhân Hiện tượng cộng hưởng từ xảy ra khi hạt nhân hấp thụ các năng lượng có tần số bằng ν0được gọi là tần số cộng hưởng từ

I.2.1.4 Độ chuyển dịch hoá học

A, Hằng số chắn và từ trường hiệu dụng

Hằng số chắn xuất hiện do hai nguyên nhân:

- Hiệu ứng nghịch từ: các điện tử bao quanh nguyên tử sinh ra một từ trường riêng, ngược chiều với từ trường ngoài nên làm giảm tác dụng của nó lên hạt nhân nguyên tử Lớp

vỏ điện tử càng dày đặc thì từ trường riêng ngược chiều với từ trường ngoài càng lớn tức hằng số chắn càng lớn

Vì vậy, các proton nằm trong các nhóm có nguyên tử hay nhóm nguyên tử gây hiệu ứng –

I (Cl, Br, I, NO2…) sẽ có hằng số chắn nhỏ, trái lại khi các nhóm nguyên tử gây hiệu ứng +I (CH3, C2H5…) sẽ có hằng số chắn lớn

- Hiệu ứng thuận từ: bao quanh phân tử là lớp vỏ điện tử, các điện tử này chuyển động sinh ra một dòng điện vòng, do đó xuất diện một từ trường riêng có hướng thay đổi ngược hướng hoặc cùng hướng với từ trường ngoài

B, Độ chuyển dịch hoá học

Đối với các hạt nhân trong phân tử càng phức tạp trong nguyên tử do ảnh hưỏng của các đám mây electron của các nguyên tử bên cạnh Do hiệu ứng chắn từ khác nhau nên các hạt nhân 1H và13C trong phân tử có tần số cộng hưởng khác nhau Đặc trưng cho các hạt nhân 1H

và13C trong phân tử là giá trị độchuyển dịch hoá học δ

I.2.1.6 Tương tác Spin-Spin.

Đối với mỗi hạt nhân hoặc 1 nhóm hạt nhân người ta nhận được tín hiệu đặc trưng chỉ có một đỉnh hoặc một nhóm 2, 3, 4, 5 đỉnh khác nhau Nguyên nhân của sự xuất hiện nhiều đỉnh trên là do mỗi hạt nhân có I = ½ đã sinh ra hai từ trường riêng Hai từ trường riêng này tác dụng lên hạt nhân

bên cạnh làm phân tách mức năng lượng chính của nó thành 2 mức năng lượng khác nhau Trường hợp 2, 3 hạt nhân cùng tác động từ trường riêng của mình lên cùng một hạt nhân khác thì năng lượng cộng hưởng của hạt nhân đó bị phân tách thành nhiều mức năng lượng khác nhau mà mỗi năng lượng cộng hưởng này cho một đỉnh trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân Thực nghiệm cho thấy

sự phân tách đỉnh hay mức năng lượng tuân theo tam giác pascal

Ngoài ra khoảng cách giữa hai đỉnh liền nhau ở mỗi nhóm được đo bằng Hertz (Hz)

và được gọi là hằng số tương tác spin-spin J Đây là một thông số phổ quan trọng như độ chuyển dịch hoá học

I.2.2.Các phổ có trong NMR.

Bộ phổ 1 chiều :

1 H-NMR và 13 C-NMR (với chương trình DEPT): Brucker AM 400, Brucker DRX 500 và

Brucker AMX 600

Phổ 1 H-NMR: Trong phổ này, độ chuyển dịch hóa học (δ) của các proton được xác định

trong thang ppm từ 0 – 14 ppm, tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phần Dựa vào những đặc trưng của độ chuyển dịch hóa học và tương tác spin mà xác định cấu trúc phân tử của hợp chất

Độ dịch chuyển hóa học của 1 H-NMR.

Phổ 13 C-NMR: Phổ này cho tín hiệu vạch phổ cacbon Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng

hưởng ở trường khác nhau và cho các tín hiệu phổ khác nhau Thang đo của phổ này là 0 - 230 ppm

Độ dịch chuyển hóa học của 13 C-NMR.

Phổ DEPT: Phổ này cho ta tín hiệu để phân loại các loại cacbon khác nhau Trên phổ

DEPT, tín hiệu cacbon bậc bốn biến mất, ở phổ DEPT 135, tín hiệu của CH và CH3 nằm về một phía, CH2 nằm về một phía; Phổ DEPT 90 chỉ xuất hiện tín hiệu CH

Bộ phổ 2 chiều: