Sán lá phổi paragonimus heterotremus và paragonimus westermani ở việt nam hình thái, phân tử, sinh học và chuẩn đoán miễn dịch tt

Xác định được phương pháp xét nghiệm cua suối tốt nhất để thu metacercaria và xác định tình hình nhiễm metacercaria của SLP ở cua suối tại tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Quảng Trị... Xác định đư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LẦM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

LƯU ANH TÚ

SÁN LÁ PHỔI PARAGONIMUS HETEROTREMUS VÀ

PARAGONIMUS WESTERMANI Ở VIỆT NAM: HÌNH THÁI,

PHÂN TỬ, SINH HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH

Chuyên ngành: Ký sinh trùng học

Mã số: 62.42.01.05

Hà Nội, 2018

Luận án được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS Phạm Ngọc Doanh

2 TS Bùi Khánh Linh

Người phản biện 1:

Người phản biện 2:

Người phản biện 3:

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Học Viện

Họp tại: Học viện Khoa học và Công nghệ

Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia

- Thư viện Học viện Khoa học và công nghệ

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Sán lá phổi (SLP) thuộc giống Paragonimus gây bệnh SLP có

ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của người và động vật Nguyên nhân nhiễm bệnh do ăn phải metacercaria ở vật chủ trung gian thứ hai (VCTG 2) hoặc sán non từ vật chủ chứa Triệu chứng bệnh SLP dễ bị chẩn đoán nhầm với lao phổi hoặc các bệnh phổi khác, gây khó khăn cho chẩn đoán và trị bệnh (Blair et al., 1999)

Ở Việt Nam, SLP và bệnh SLP được quan tâm nghiên cứu trong hơn 20 năm qua (Cao Văn Viên và cs., 1994; Nguyễn Văn Đề và cs., 1998-2003; Doanh et al., 2005-2013) Đến nay, 7 loài SLP đã được

phát hiện (Doanh et al., 2013), trong số đó có loài P heterotremus phổ biến ở các tỉnh miền Bắc và loài P westermani phổ biến ở các

tỉnh Bắc Trung Bộ, cả 2 loài gây bệnh cho người Nhiều vấn đề về 2 loài SLP này chưa được nghiên cứu Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề

tài nghiên cứu “Sán lá phổi Paragonimus heterotremus và Paragonimus westermani ở Việt Nam: hình thái, phân tử, sinh học và

chẩn đoán miễn dịch”

2 Mục tiêu của đề tài:

Mục tiêu chung của đề tài là hiểu biết về hai loài SLP

P heterotremus và P westermani, cung cấp cơ sở khoa học cho việc

chẩn đoán và phòng trị bệnh SLP, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng

Với các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Xác định được phương pháp xét nghiệm cua suối tốt nhất để thu metacercaria và xác định tình hình nhiễm metacercaria của SLP ở cua suối tại tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Quảng Trị

2 Xác định được sự đa dạng hình hình thái metacercaria và đa dạng

di truyền phân tử của hai loài P heterotremus và P westermani

3 Xác định được một số đặc điểm sinh học của hai loài

P heterotremus và P westermani

4 Thiết lập được phản ứng dot-ELISA chẩn đoán nhanh bệnh SLP

tại thực địa, giúp điều trị bệnh kịp thời

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Xác định phương pháp xét nghiệm cua tốt nhất để thu

metacercaria và điều tra tình hình nhiễm metacercaria ở cua

suối tại Lào Cai, Yên Bái và Quảng Trị

3.2 Nghiên cứu đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử

của loài P heterotremus và P westermani

3.3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học hai loài sán lá phổi

- Xác định vật chủ trung gian 1 và vật chủ chính ngoài tự nhiên

- Sự phát triển của sán lá phổi ở vật chủ chính và vật chủ chứa

- Nghiên cứu sức sống của metacercaria

3.4 Thiết lập phản ứng dot-ELISA chẩn đoán bệnh sán lá phổi

- Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng dot-ELISA

- Xác định nồng độ kháng nguyên của phản ứng

- Xác định thời gian phản ứng ở điều kiện nhiệt độ khác nhau

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học: Đề tài cung cấp các thông tin khoa học về

hình thái metacercaria, di truyền phân tử và một số đặc điểm sinh

học của 2 loài P heterotremus và P westermani ở Việt Nam

4.2 Ý nghĩa thực tiễn: Đề tài cung cấp cơ sở khoa học khuyến cáo

phòng tránh nhiễm bệnh SLP và thiết lập được phản ứng dot-ELISA

chẩn đoán nhanh bệnh SLP ở thực địa, góp phần bảo vệ sức khỏe

cộng đồng

5 Những đóng góp mới của đề tài

5.1 Phát hiện metacercaria P heterotremus ở miền Trung và

P westermani ở miền Bắc Mô tả sự đa dạng hình thái

metacercaria của 2 loài SLP này

5.2 Phân tích đa dạng di truyền của P heterotremus và

P westermani Xác định P westermani ở Việt Nam là dạng 2n

5.3 Xác định chính xác VCTG 1 và ấu trùng cercaria của 2 loài SLP

nghiên cứu Ngoài ra, xác định VCTG 1 của loài P proliferus

5.4 Xác định vật chủ chính ngoài tự nhiên của SLP ở Da Krong là

mèo rừng (Prionailurus bengalensis)

5.5 Xác định chó nhà không bị nhiễm P westermani Mèo nhà bị

nhiễm P westermani với mức độ mẫn cảm thấp hơn so với

P heterotremus

5.6 Xác định chuột đóng vai trò là vật chủ chứa trong vòng đời của

loài P heterotremus và P westermani ở Việt Nam

5.7 Sức sống của metacercaria SLP không chỉ phụ thuộc vào dung

dịch nuôi, nhiệt độ, mà còn phụ thuộc vào mật độ metacercaria

5.8 Thiết lập được kỹ thuật dot-ELISA, xác định được thời gian thực

hiện ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau có thể áp dụng để chẩn

đoán nhanh bệnh SLP ở thực địa

6 Cấu trúc luận án

Luận án gồm 111 trang, mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 21 trang,

đối tượng, vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 15 trang, kết quả

nghiên cứu và thảo luận 54 trang, kết luận và kiến nghị 03 trang, đóng góp

mới và danh mục công trình công bố 2 trang, tài liệu tham khảo 13 trang

Luận văn có 21 bảng, 56 hình ảnh và biểu đồ, 132 tài liệu tham khảo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về sán lá phổi

Đến nay, hơn 50 loài SLP thuộc giống Paragonimus đã được mô

tả Vòng đời phát triển của SLP cần 3 đến 4 vật chủ Vật chủ chính là thú hoang và động vật nuôi, đặc biệt là họ mèo và chó VCTG 1 là ốc nước ngọt VCTG 2 là cua và một số loài tôm nước ngọt (Blair et al., 1999) Vật chủ chứa (Paratenic host) là động vật ăn cua

Các phương pháp chẩn đoán bệnh SLP bao gồm bốn nhóm: ký sinh trùng học, huyết thanh học/miễn dịch học, chẩn đoán hình ảnh

và các phương pháp phân tử

1.2 Tình hình nghiên cứu về hai loài Paragonimus heterotremus

và Paragonimus westermani trên thế giới

1.2.1 Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus heterotremus

Loài P heterotremus phân bố ở các nước Nam Á, Đông Nam Á,

phía Nam Trung Quốc, và gây bệnh cho người ở các vùng phân bố này VCTG 1 là ốc thuộc họ Assimineidae và Pomatiopsidae VCTG

2 là 6 loài cua thuộc họ Potamidae Vật chủ chính là mèo và sóc ở Thái Lan, động vật thí nghiệm là chó, mèo, chuột và thỏ Chuột đóng

vai trò vật chủ chứa của loài P heterotremus (Blair et al 1999)

1.2.2 Tình hình nghiên cứu loài Paragonimus westermani

Paragonimus westermani phân bố rộng ở châu Á, rất đa dạng về hình thái, di truyền phân tử, sinh học P westermani chủ yếu có 2

dạng triploid (3n) và diploid (2n) Vòng đời cần 3-4 loài vật chủ

VCTG 1 là ốc thuộc giống Brotia và Semisulcospirus VCTG 2 là 8

loài tôm và 40 loài cua Vật chủ chính là nhiều loài động vật có vú

Sự mẫn cảm của động vật với P westermani khác nhau rõ rệt giữa các quần thể địa lý Đáng chú ý, người bị nhiễm loài P westermani

chỉ giới hạn ở Đông Á và Philiipines Vật chủ chứa ngoài tự nhiên là lợn, lợn rừng, hươu (Blair et al 1999; Yoshida et al 2016)

1.3 Tình hình nghiên cứu sán lá phổi ở Việt Nam

Bệnh SLP được quan tâm nghiên cứu từ năm 1994, sau đó phát hiện bệnh SLP ở 10 tỉnh phía Bắc Đến nay, 7 loài SLP được phát

hiện ở các tỉnh miền Bắc và Trung Trong số đó, 3 loài (P heterotemus, P westermani và P skrjabini) có khả năng gây bệnh cho người Loài P skrjabini mới tìm thấy ở cua suối tại Thanh Hóa với tỷ lệ nhiễm thấp; loài P heterotremus phổ biến ở miền Bắc; loài

P westermani phổ biến ở miền Trung (Doanh et al 2013) Nhiều vấn

đề về 2 loài P heterotremus và P westermani chưa được làm sáng tỏ

(Doanh et al., 2013) Hơn nữa, các ca bệnh SLP mới vẫn được tiếp tục phát hiện Vì vậy, cần có những nghiên cứu chẩn đoán nhanh, đơn giản có thể chẩn đoán ở thực địa để trị bệnh kịp thời, góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng Đề tài sẽ giải quyết những vấn đề này

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

SLP P heterotremus và P westermani

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Xã Lương Sơn (huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai) và An Lạc (huyện Lục Yên, tỉnh Yên Bái) - nơi có tỷ lệ nhiễm metacercaria của

P heterotremus cao và 4 xã thuộc huyện Quảng Trị là: Hướng Sơn

và Tân Thành (huyện Hướng Hóa), và xã Da Krong và Tà Long

(huyện Da Krong) - là nơi có tỷ lệ nhiễm P westermani ở vật chủ

trung gian 2 rất cao

2.1.3 Thời gian nghiên cứu: từ 10/2014 đến 10/2017

2.2 Phương pháp tiếp cận và thiết kế thí nghiệm

Metacercaria ở VCTG2 là chỉ thị nhanh và chính xác nhất để xác định vùng phân bố của SLP Vì vậy, tại các điểm nghiên cứu, đề tài xét nghiệm cua suối trước để xác định các địa điểm có tỷ lệ nhiễm

metacercaria của 2 loài P heterotremus và P westermani cao nhất

để tiếp tục điều tra xác định vật chủ chính, VCTG 1 ngoài tự nhiên Kết hợp cả phương pháp định loại hình thái và phân tử để định danh

cả loài SLP cũng như vật chủ chính và VCTG 1 của SLP Đồng thời thu metacercaria để sử dụng cho các nội dung nghiên cứu khác về

hình thái, di truyền và sinh học

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xét nghiệm cua thu metacercaria của SLP

Xác định thời gian lắng cặn của phương pháp giã lọc cua: Lấy một cá thể cua suối bắt ở vùng không nhiễm SLP Loại bỏ mai cua, dùng chày giã nhuyễn trong cối giã cua

Đếm 50 metacercaria của loài P westermani nhỏ vào cối cua

đã giã nhuyễn, cho thêm 250 ml nước, khuấy đều và lọc qua lưới lọc kích thước 1 x 1 mm vào cốc nhựa thể tích 300 ml Để lắng trong thời gian thử nghiệm, sau đó gạn ½ phần dung dịch phía trên sang một cốc khác Tiếp tục cho thêm đầy nước vào phần cặn Tiến hành gạn-lọc đến khi phần cặn trong có thể xem dưới kính hiển vi soi nổi Thử nghiệm thời gian lắng cặn giữa các lần lọc là: 3 phút, 2 phút và

1 phút bằng cách dùng đồng hồ bấm giờ Thí nghiệm với mỗi thời gian lắng cặn lặp lại 3 lần Đem phần cặn cuối cùng kiểm tra dưới kính hiển vi soi nổi tìm metacercaria SLP

Thời gian lắng cặn thích hợp nhất là thời gian ngắn nhất vẫn thu lại đủ 50 metacercariae ở phần cặn của lần lọc cuối cùng Làm

tương tự như vậy với metacercaria của loài P heterotremus

- So sánh 2 phương pháp giã-lọc cua và ép cua giữa 2 tấm kính về thời gian xét nghiệm và số lượng metacercaria thu được

2.3.2 Điều tra tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria sán lá phổi

Bắt cua ở các khe suối, mỗi địa điểm xét nghiệm ít nhất 50 con cua suối Định loại cua dựa vào hình thái theo khóa định loại cua

ở Việt Nam theo Đặng Ngọc Thanh và Hồ Thanh Hải, 2012

Xét nghiệm cua theo phương pháp tốt nhất đã được xác định,

từ đó xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm

2.3.3 Nghiên cứu hình thái metacercaria: dựa vào hình dạng, kích

thước và độ dày vỏ Định loại theo Doanh et al., 2013

2.3.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền phân tử SLP

Chọn gen nghiên cứu: đối với loài P heterotremus chọn đoạn chèn ITS2 và gen ty thể CO1, đối với loài P westermani chọn

đoạn chèn ITS2 và gen 16S, vì gen này có thể phân biệt dạng 2n hay

3n của loài P westermani.

Tách chiết DNA tổng số, thực hiện phản ứng PCR để nhân bản trình tự đích với cặp mồi lựa chọn, tinh khiết sản phẩm PCR, đọc trình tự trực tiếp So sánh trình tự thu được và vẽ cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm MEGA6

2.3.5 Gây nhiễm cho vật chủ chứa và vật chủ chính:

Gây nhiễm 2 loài SLP cho 10 cá thể chuột nhắt trắng với số lượng 50 metacercaria/chuột Sau 1-2 tháng, mổ khám chuột thí nghiệm thu sán non, gây nhiễm chuyển tiếp cho mèo nhà

Gây nhiễm loài P westermani cho 4 chó và 8 mèo nhà với số

lượng 30-50 metacercaria/vật chủ Theo dõi động vật thí nghiệm, định kỳ xét nghiệm phân để tìm trứng sán bằng phương pháp gạn lọc, xác định thời gian phát triển của sán ở động vật

2.3.6 Nghiên cứu hình thái SLP trưởng thành: Làm tiêu bản cố

định bằng cách nhuộm carmine alumine Đo vẽ kích thước sán và các

cơ quan (giác bụng, giác miệng, tinh hoàn, buồng trứng)

2.3.7 Xác định vật chủ tự nhiên của loài SLP

- Xác định VCTG 1: Thu các loài ốc ở nơi cua nhiễm metaceracria cao, định tên loài ốc theo Đặng Ngọc Thanh và cs,

2006 Sheding và ép ốc giữa 2 tấm kính để thu cercaria của SLP, định loài cercaria bằng phân tích trình tự ITS2 Vật chủ ốc bị nhiễm

ấu trùng SLP được thẩm định lại bằng phân tích trình tự gen CO1

- Xác định vật chủ chính: Xét nghiệm phân chó nhà và phân động vật hoang tìm trứng SLP Mẫu trứng sẽ được định loài bằng phân tích trình tự ITS2 Những mẫu phân vật chủ có trứng SLP được định loài vật chủ qua phân tích trình tự vùng D-Loop của hệ gen ty thể

2.3.8 Nghiên cứu sức sống của metacercaria:

- Metacercaria của mỗi loài được nuôi trong nước sinh lý, ở các

C ở các mật độ 5,

50, 100, 200 metacercaria/ 2ml Định kỳ quan sát dưới kính hiển vi soi nổi để xác định sự thoát nang và sự sống của metacercaria

2.3.9 Thiết lập phản ứng dot-ELISA

- Kháng nguyên chất tiết của P heterotremus và P westermani

- 30 mẫu huyết thanh bệnh nhân nhiễm SLP, 30 mẫu bệnh nhân nhiễm sán lá gan lớn, sán lá gan nhỏ, lao phổi và huyết thanh người bình thường được sử dụng để kiểm tra mức độ phản ứng chéo

- Kỹ thuật dot-ELISA theo Ito and Sato 1990 Thử phản ứng ở các nồng độ kháng nguyên, nhiệt độ, thời gian khác nhau để đưa ra điều kiện tối ưu nhất

2.4 Phương pháp xử lý số liệu: bằng phần mềm Excell, SPSS

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả xác định phương pháp xét nghiệm cua để thu metacercaria và tình hình nhiễm metacercaria ở cua suối

3.1.1 Phương pháp xét nghiệm cua tìm ấu trùng SLP

3.1.1.1 Xác định thời gian lắng cặn củ p ư n p áp -lọc cua

Với phương pháp giã-lọc cua, thời gian metacercaria lắng hết

xuống đáy của loài P westermani là sau 2 phút, loài P heterotremus

là 3 phút Metacercaria của loài P heterotremus nhỏ nhất so với các

loài SLP khác (Doanh et al., 2015), vì vậy với phương pháp giã-lọc cua thời gian lắng giữa các lần lọc 3 phút là thích hợp

3.1.1.2 o án p ư n p áp n ệm cua

Thời gian xét nghiệm một cá thể cua bằng phương pháp ép giữa hai tấm kính hết 76-85 phút (TB 80,3 phút , nhanh hơn so với

phương pháp giã-lọc cua mất 33-38 phút (TB 35,3 phút (P<0,005)

Từ 10 cá thể cua thu ở Yên Bái, phương pháp giã-lọc cua thu được 902 metacercaria, nhiều hơn so với phương pháp ép cua thu

được 252 metacercaria (P<0,001)

3.1.2 Tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria SLP ở cua suối

Tại các điểm nghiên cứu đã thu được 3 loài cua suối: loài

Indochinamon tannanti ở tỉnh Yên Bái và Lào Cai, và 02 loài Vietopotamon aluoiense và Donopotamon haii ở tỉnh Quảng Trị

Cả 3 loài cua suối đều bị nhiễm ấu trùng SLP Tỷ lệ và cường độ

nhiễm được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Tỷ lệ và cường độ nhiễm metacercaria của SLP ở cua suối

Địa điểm nghiên cứu Loài

cua

Số xét nghiệm (con)

Số con nhiễm (%)

Cường độ nhiễm (nang sán/cua) Tỉnh Huyện Xã

Tà Long V aluoiense 50 48 (96,0) 12-608 (80,0) Hướng

Hóa

Hướng

Tân Thanh

Ở Quảng Trị tìm thấy metacercaria của 4 loài SLP

(P westermani, P bangkokensis, P proliferus và P heterotremus),

trong đó tỷ lệ nhiễm P westermani cao nhất Tại 2 xã (An Lạc và

Lương Sơn ở 2 tỉnh miền Bắc phát hiện metacercaria của 4 loài SLP

P heterotremus, P vietnamensis, P westermani và P bangkokensis,

trong đó tỷ lệ nhiễm P heterotremus cao nhất (bảng 3.5)

Bảng 3.5 Tỷ lệ và cường độ nhiễm các loài sán lá phổi ở cua suối

An Lạc I tannanti 6,0

(1-2)

69,2 (1-360)

1,5 (2-2)

13,8 (1-33)

6,0 (1-2)

78,0 (1-78)

96,0 (12-608) Hướng

Sơn

V

aluoiense

4,0 (1-3)

100,0 7-500

4,0 (1) Tân

Thanh

V

aluoiense

2,0 (1)

10,0 (1-5)

(1-3)

Ghi chú: số trong ngoặc đ n là d o độn cườn độ nhiễm

3.2 Đa dạng hình thái metacercaria và di truyền phân tử

3.2.1 Loài Paragonimus westermani

Metacercaria P westermani thu từ Yên Bái tương đối đồng đều

về hình thái Metacercaria từ tỉnh Quảng Trị khác nhau về hình dạng

và kích thước (P<0,001), được chia thành 5 dạng (hình 3.5 a-e)

Hình 3.5 P westermani metacercaria thu từ cua suối tại Quảng Trị Trình tự ITS2 của P westermani ở Việt Nam khác nhau 1-2

(0,2-0,4%) vị trí nucleotid, làm thành 1 nhóm (hình 3.6) Trình tự 16S của các mẫu thu tại Quảng Trị và Yên Bái khác nhau 1,1-1,4%, làm thành 2 nhóm trong cùng 1 nhánh (hình 3.7) Các trình tự

P westermani của Việt Nam đều thuộc dạng 2n

3.2.2 Loài Paragonimus heterotremus

Metacercaria của P heterotremus thu ở Yên Bái và Lào Cai có sự

đa dạng về kích thước (hình 3.8) Ở Quảng Trị mới thu được 2 metacercaria có hình oval, kích thước 226-252 x 218-236 µm

Hình 3.8 Metacercaria P heterotremus

thu từ Yên Bái và Lào Cai

Phân tích phân tử cho thấy 2 mẫu P heterotremus từ Quảng Trị

hoàn toàn tương đồng (100%) nhau về trình tự ITS2 và CO1 và tương đồng cao với các mẫu thu từ miền Bắc (hình 3.10; 3.11)