Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và một số yếu tố nguy cơ của ung thư biểu mô vảy amidan

Ung thư amiđan thường được xếp trong nhóm ung thư vùng họng miệng gồm: amiđan, màn hầu, đáy lưỡi, thành sau họng do chúng có những điểm tương đồng về đặc điểm dịch tễ, nguyên nhân, các y

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư amiđan là bệnh phát sinh do sự biến đổi ác tính của tế bào biểu

mô phủ amiđan hoặc các mô liên kết trong cấu trúc amiđan Ung thư amiđan thường được xếp trong nhóm ung thư vùng họng miệng gồm: amiđan, màn hầu, đáy lưỡi, thành sau họng do chúng có những điểm tương đồng về đặc điểm dịch tễ, nguyên nhân, các yếu tố nguy cơ, triệu chứng, sự xâm lấn, thái

độ điều trị, cũng như tiên lượng bệnh Chẩn đoán sớm ung thư vùng họng miệng nói chung và ung thư amiđan nói riêng không quá khó do thăm khám

dễ dàng, các triệu chứng của bệnh xuất hiện tương đối sớm (cảm giác vướng, khó chịu ở vùng họng) Song do nhiều nguyên nhân khác nhau nên chẩn đoán ban đầu dễ nhầm với các bệnh khác biểu hiện tại amiđan như: viêm đặc hiệu (lao, giang mai), viêm amiđan quá phát…nên dẫn tới thái độ điều trị bệnh

không đúng Ngoài ra, do thái độ chủ quan, thiếu hiểu biết về bệnh ung thư

cũng như các yếu tố nguy cơ của nó, sự thiếu quan tâm đến bệnh tật nên khi đến bệnh viện thường muộn, dẫn đến hạn chế kết quả điều trị, tiên lượng bệnh

và tỷ lệ bệnh ngày một tăng cao trong cộng đồng

Cấu tạo mô học của amiđan bao gồm biểu mô phủ và tổ chức liên kết Nên các khối u ác tính amiđan cũng được chia thành hai loại là ung thư biểu

mô và ung thư tổ chức liên kết Nghiên cứu của chúng tôi giới hạn ở ung thư biểu mô vảy, loại ung thư phổ biến nhất của amiđan

Từ trước tới nay, chưa có một nghiên cứu cụ thể nào chỉ ra chính xác nguyên nhân gây nên ung thư ở vùng họng miệng nói chung và amiđan nói riêng Nhưng các nhà khoa học có thể khẳng định các yếu tố nguy cơ gây nên ung thư vùng họng miệng như thuốc lá, rượu bia… và gần đây là virut sinh u nhú HPV (Human papiloma virus) Trên thế giới, một số nghiên cứu đã khẳng định vai trò, quan hệ nhân quả của HPV với một số u bướu ở đường tiêu hóa

và hô hấp trên Tại Châu Âu, qua các nghiên cứu về ung thư hầu họng, Mork

và Maden đã nhận thấy có sự liên quan giữa HPV và sự gia tăng của loại ung thư này [1] [2] Tuy nhiên tại một số trung tâm tiến hành nghiên cứu vấn đề này, đã nhận thấy sự khác biệt rõ rệt về tỷ lệ nhiễm HPV Cụ thể: sự nhiễm HPV type 16 ở Bắc Mỹ và Châu Á cao hơn hẳn ở Châu Âu [3] Ngoài ra, ở Châu Âu tỷ lệ nhiễm HPV trong ung thư tổ chức lympho hầu họng cũng rất khác biệt từ 8.3% - 100% ở các vùng khác nhau [4] Song ở Việt Nam, chưa

có một nghiên cứu cụ thể nào chỉ ra mối liên quan giữa ung thư vùng hầu họng nói chung và ung thư amiđan nói riêng với HPV

Để phục vụ cho việc chẩn đoán sớm, chính xác, nâng cao chất lượng điều trị, và tiên lượng bệnh cũng như hiểu rõ hơn về yếu tố nguy cơ của bệnh

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và một số yếu tố nguy cơ của ung thư biểu mô vảy amiđan” với

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ GIẢI PHẪU, MÔ HỌC VÀ SINH LÝ AMIĐAN

1.1.1 Giải phẫu

1.1.1.1 Sơ lược về giải phẫu amiđan [5]

Amiđan là một cấu trúc bạch huyết thuộc vòng waldayer Vòng waldayer

gồm có:

- Amiđan vòm, chỉ có một khối nằm ở vòm họng

- Amiđan lưỡi, chỉ có một khối nằm ở đáy lưỡi

- Amiđan vòi, gồm 2 amiđan, nằm ở hai bên phải và trái, quanh lỗ vòi tai

trong hố Rosenmuller

- Amiđan khẩu cái (thường gọi là amiđan) + Amiđan khẩu cái là tổ chức bạch huyết lớn nhất của vòng Waldayer,

nằm trong hố amiđan Hố amiđan là một tam giác đứng, được bao bọc bởi trụ

trước, trụ sau và rãnh lưỡi amiđan Trụ trước là một cái nẹp mỏng gồm có

niêm mạc và cơ lưỡi màn hầu Còn trụ sau khá dầy, gồm cơ họng - màn hầu

và niêm mạc Amiđan là một tổ chức lympho có vỏ bọc Giữa amiđan và

thành họng có một lớp tổ chức tế bào xốp rất dễ bóc tách Trên mặt tự do của

amiđan có nhiều lỗ lấm tấm, đó là các khe ăn sâu vào trong amiđan Trong

trường hợp viêm mạn tính các khe này chứa đầy mủ đặc trắng như bã đậu Ở

cực trên amiđan có một khe to gọi là khe lớn amiđan

Đáy của hố amiđan: chính là rãnh lưỡi amiđan, có khi cực dưới kéo dài

tới tận đáy lưỡi như liên tiếp với vùng amiđan lưỡi

+ Mạch máu: cung cấp máu cho amiđan từ động mạch thuộc hệ động mạch cảnh ngoài

Động mạch amiđan: xuất phát từ động mạch khẩu cái lên hoặc trực tiếp

từ động mạch mặt, đây là động mạch chính

Động mạch họng lên cho nhánh phụ

 Có khi từ động mạch cảnh ngoài trực tiếp cho nhánh vào amiđan

+ Bạch huyết: thu nhận bạch mạch cả vùng amiđan có từ 4 tới 6 cái thoát qua thành họng cạnh cơ trâm lưỡi, trâm móng, đổ vào hạch dưới cơ nhị thân (Kuttner), nằm ở sau dưới góc hàm Đó là hạch đầu tiên bị xâm nhập trong ung thư amiđan

Sau đó hạch lại đổ vào các hạch ngực và ống ngực Điều này giải thích cho sự lan tràn theo đường bạch mạch của ung thư amiđan, đặc biệt là ung thư Sarcoma

Ngoài ra một số tác giả còn mô tả các đường bạch mạch đổ vào dãy cảnh ngoài, hạch sau họng, mà ít được công nhận trong ung thư amiđan

Hình 1.1 Hình ảnh giải phẫu amiđan [6]

Amiđan

- Nhóm cổ bên: gồm có 3 nhóm chính

+ Nhóm cảnh trong, là nhóm quan trọng nhất, gồm những hạch nằm ở mặt ngoài và bờ trước tĩnh mạch cảnh trong, từ khoảng dưới tuyến mang tai sau đến sau nền cổ Trong nhóm đáng chú ý nhất là nhóm hạch nằm giữa cơ nhị thân và thân giáp lưỡi mặt Ở đây có hạch "Kuttner”, hạch này được coi như một hạch chính Tất cả mạng lưới bạch huyết vùng sau họng, vùng vòm mũi họng, vùng amiđan, hạch dưới hàm, hạch dưới cằm đều đổ về dãy hạch cảnh trong

- Nhóm hạch gai: tiếp nhận những bạch mạch của các hạch ở dưới cơ nhị thân, hạch chẩm đổ về dãy cổ ngang

+ Nhóm cổ ngang: tiếp nhận bạch huyết của nhóm gai, chi trên và một

số bộ phận trong lồng ngực

+ Nhóm thượng đòn: liên quan ít đến vùng đầu cổ nên ít bị di căn hơn Tuy nhiên, hiện nay phân vùng hạch cổ được chia thành từng vùng có liên hệ với lâm sàng Nhóm tác giả Memorial Sloan - Kettery Center đã đưa

ra cách phân loại theo vùng hạch cổ, được sử dụng rộng rãi trên thế giới Hạch cổ được chia ra 6 nhóm

- Nhóm I: nhóm hạch dưới cằm và dưới hàm, trong đó:

+ Ia: tam giác dưới cằm được giới hạn bởi bụng trước cơ nhị thân và xương móng

+ Ib: tam giác dưới hàm được giới hạn bởi xương hàm dưới, bụng trước

và bụng sau cơ nhị thân

- Nhóm II: nhóm hạch cảnh trên được giới hạn bởi:

+ Phía trước: bờ ngoài cơ ức móng

+ Phía sau: bờ sau cơ ức đòn chũm

+ Phía trên: nền sọ

+ Phía dưới: ngang mức xương móng

- Nhóm III: nhóm hạch cảnh giữa được giới hạn bởi:

+ Phía trước: bờ ngoài cơ ức móng

+ Phía sau: bờ sau cơ ức đòn chũm

+ Phía trên: ngang mức xương móng

+ Phía dưới: ngang mức khớp giáp nhẫn hoặc cơ vai móng

- Nhóm IV: nhóm hạch cảnh thấp, được giới hạn bởi

+ Phía trước: bờ ngoái cơ ức móng

+ Phía sau: bờ sau cơ ức đòn chũm

+ Phía trên: ngang mức khớp giáp nhẫn

+ Phía dưới: xương đòn

Nhóm IV lại được chia thành:

+ Nhóm IVa: gồm các hạch của nhóm IV nằm dọc theo tĩnh mạch cảnh trong và nằm sâu dưới đầu của cơ ức đòn chũm

+ Nhóm IVb: gồm các hạch nhóm IV nằm sâu dưới đầu đòn của cơ ức đòn chũm

- Nhóm V: nhóm tam giác cổ sau được giới hạn bởi

+ Phía trước: bờ sau cơ ức đòn chũm

+ Phía sau: bờ trước cơ thang

+ Phía dưới: xương đòn

Nhóm V lại chia thành:

+ Nhóm Va: gồm các hạch ở phần trên tam giác cổ sau, các hạch chạy dọc thần kinh phụ

+ Nhóm Vb: gồm các hạch chạy dọc theo động mạch cổ ngang

Hai nhóm này được phân ra bởi bụng dưới của cơ vai móng

- Nhóm VI: nhóm hạch Delphian, nhóm hạch trước khí quản, trước sụn nhẫn, quanh khí quản hay còn gọi là khoang cổ trước, được giới hạn bởi:

+ Phía ngoài: động mạch cảnh

+ Phía trên: hõm ức

+ Phía dưới: quai động mạch chủ

Hình 1.3 Phân nhóm hạch cổ [9]

1.1.1.3 Giải phẫu họng và các khoang cạnh họng [10]

Hình 1.4 Thiết đồ đứng dọc giữa đầu và cổ [6]

Cấu tạo của họng

Họng là một ống cơ và màng ở trước cột sống cổ Đi từ mỏm nền tới đốt sống cổ thứ IV, là ngã tư của đường ăn và đường thở, nối liền mũi ở phía trên, miệng ở phía trước với thanh quản và thực quản ở phía dưới Giống như một cái phễu phần trên loe rộng, phần dưới thu hẹp Thành họng được cấu trúc bởi lớp cân, cơ, niêm mạc

Họng chia làm 3 phần:

- Họng mũi (tỵ hầu): ở cao nhất, lấp sau màn hầu, ở sau dưới của hai lỗ mũi sau Trên nóc có amiđan vòm Hai thành bên có loa vòi Eustachi thông lên hòm nhĩ và hố Rosenmuler Phía dưới họng mũi được mở thông vào họng miệng

- Họng miệng (khẩu hầu): phía trên thông với họng mũi, phía dưới thông với họng thanh quản, phía trước thông với khoang miệng và được màn hầu phân cách Thành sau họng miệng liên tiếp với thành sau họng mũi và bao gồm các lớp niêm mạc, cân và các cơ khít họng

Hai thành bên có amiđan họng hay amiđan khẩu cái nằm trong hốc amiđan

- Họng thanh quản (thanh hầu): đi từ ngang tầm xương móng xuống đến miệng thực quản, có hình như cái phễu, miệng to mở thông với họng miệng, đáy phễu là miệng thực quản phần họng dưới

Thành sau liên tiếp với thành sau họng miệng Thành trước phía trên là đáy thanh quản hợp với thành bên họng tạo nên máng họng - thanh quản hay xoang lê

Khoang quanh họng

Quanh họng có các khoang chứa các tổ chức cân, cơ, mạch máu, thần kinh, hạch bạch huyết và các khoang này có liên quan mật thiết với họng

Khoang bên họng (Sébileau): các cơ trâm họng, trâm lưỡi, trâm móng và dây chằng trâm - móng, trâm - hàm làm thành một dải hay bó: bó hoa Rioland chia khoang này thành hai phần:

-+ Khoang trước trâm hay trước dưới mang tai: gồm vùng tuyến mang tai

và vùng cạnh amiđan Trong khoang này có các mạch máu và thần kinh quan trọng như: động mạch và tĩnh mạch cảnh ngoài, động mạch mặt, động mạch khẩu cái lên, các dây thần kinh hàm dưới và thần kinh lưỡi

+ Khoang sau trâm hay sau dưới mang tai: có động mạch và tĩnh mạch cảnh trong, các dây thần kinh sọ não số IX, X, XI và XII, thần kinh giao cảm

Thần kinh vận động chủ yếu do nhánh trong của dây IX và dây XI

Mạch bạch huyết

Đổ vào các hạch sau họng, hạch Gillette, hạch dưới cơ nhị thân và hạch dãy cảnh

1.1.2 Mô học và sinh lý

Dưới kính hiển vi, amiđan có 3 thành phần gồm tổ chức liên kết, các nang lympho và biểu mô phủ của amiđan Amiđan được chia ra làm nhiều tiểu thùy, do các vách của tổ chức liên kết ngăn cách Vách này là các bè từ

vỏ tiến vào, làm cái sườn chống đỡ cho các tiểu thùy và mạng mạch máu, thần kinh cung cấp cho amiđan và các đường bạch mạch ly tâm Mỗi tiểu thùy hình chữ U, có một khe ổ ở giữa, vây quanh các khe là các nang lympho, có trung tâm mầm ở giữa làm nhiệm vụ sản sinh ra các tế bào lympho Mặt tự do của amiđan cũng như niêm mạc che phủ các trụ, được bao bọc bởi một lớp biểu mô lát tầng của đường tiêu hóa trên Biểu mô này còn kéo dài vào trong các khe ổ, có từ 8 đến 20 khe ổ, chạy ngoằn ngoèo từ mặt tự do của amiđan tiến vào trung tâm, có khi tới tận vỏ bọc của amiđan Càng đi sâu vào khe ổ, biểu mô phủ càng mỏng đi có khi tách rời nhau, để bạch cầu dễ dàng thoát vào khe ổ làm nhiệm vụ bảo vệ Cấu tạo tổ chức học giải thích cho vị trí xuất phát của 2 loại ung thư là biểu mô và liên kết

Amiđan sẽ phát triển mạnh từ khi 3 - 4 tuổi đến năm 12 - 13 tuổi, sau

đó sẽ thoái triển dần đến năm 30 tuổi Ngoài nhiệm vụ cơ năng tham gia vào chức năng nuốt, thì quan trọng hơn đó là nhiệm vụ bảo vệ Amiđan tham gia vào sản xuất ra các lympho bào, kháng thể, là bộ phận quan trọng của vòng waldeyer, làm nhiệm vụ ngăn cản, phá hủy các vi trùng và dị vật lạ đi vào cơ thể bằng ngã tư đường ăn, đường thở

triển khác [11]

Theo Sherman, trong các ung thư đầu cổ: 40% xảy ra ở miệng, 25% ở

thanh quản, 15% ở họng, 7% ở tuyến nước bọt và 13% ở vị trí còn lại [12]

Trong các ung thư ở họng miệng, amiđan là vị trí hay gặp nhất, xếp thứ hai trong các ung thư đường hô hấp trên sau ung thư hạ họng thanh quản, điều này tương tự thống kê ở Connecticut (Hoa Kỳ), của Bopp hay

của Maltz [13],[14]

Tỷ lệ mắc ung thư amiđan chuẩn theo tuổi trong hai năm 1990 - 1991 ở nam là 15,5/100.000 dân, ở nữ chỉ là 6,3/100.000 dân (ghi nhận ở Connecticut) [15] Số người mắc bệnh tăng theo thời gian, đến năm 1998 số

ca mới mắc bệnh đã tăng lên 8600 trường hợp (nam: 6500, nữ: 2100) [11] Qua nghiên cứu 14.253 trường hợp ung thư biểu mô khoang miệng của Kroll và Hoffman có 5 % là ung thư amiđan [16]

Ở Pháp, Viện ung thư Gustave Roussy nghiên cứu thấy ung thư amiđan đứng thứ 7, thứ 8 trong các ung thư đầu cổ, chiếm 1 - 1,5% tổng số các ung thư, tương tự như nghiên cứu của Maltz từ 1,5 - 3% [14]

1.2.1.2 Tại Việt Nam

Theo tác giả Trần Phương Hạnh, ung thư amiđan có tỷ lệ 1-3% trong tổng số các loại ung thư [17] Ghi nhận ung thư Thành phố Hồ Chí Minh năm

1996 - 1997, ung thư họng miệng ở vị trí thứ 7, chiếm 2,8% trong tổng các

loại ung thư [16] Ghi nhận ung thư hai năm 1996 - 1997 của tác giả Phạm

Hoàng Anh và cộng sự cho biết: tỷ lệ mắc chuẩn ung thư họng miệng của nam giới Hà Nội là 2,2/100.000 dân, nữ giới là 0,8/100.000 dân; ở Thành phố

Hồ Chí Minh có tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi cao hơn: nam giới là 3,3/100.000 dân, nữ giới là 0,6/100.000 dân [18]

1.2.2 Yếu tố nguy cơ

Hầu hết các trường hợp ung thư amiđan không tìm được nguyên nhân sinh bệnh Song đã có rất nhiều công trình nghiên cứu công nhận: những người có thói quen hút thuốc có nguy cơ ung thư đầu cổ cao gấp đôi so với người không hút thuốc Rượu cũng là yếu tố nguy cơ của các ung thư đầu cổ nếu cả hai yếu tố này hợp lại sẽ tăng khả năng mắc bệnh lên vài chục lần Như vậy, hai yếu tố thuận lợi chính dẫn tới ung thư amiđan là thói quen hút thuốc

và uống rượu

Ngoài ra, còn một số yếu tố thuận lợi khác như: bụi khói, hơi hay tập

tục nhai trầu của nữ giới, các viêm nhiễm trường diễn, vệ sinh răng miệng

kém cũng góp phần làm tăng nguy cơ mắc bệnh

Gần đây, một số nghiên cứu thấy có sự liên quan gần giữa virut sinh u nhú ở người (HPV) hay sự đột biến gen P53 với ung thư amiđan [19],[20]

1.2.3 Triệu chứng lâm sàng [10]

1.2.3.1 Triệu chứng cơ năng

- Trong giai đoạn đầu, triệu chứng cơ năng thường nghèo nàn:

+ Nuốt vướng

+ Nuốt đau

+ Nổi hạch cổ cùng bên

+ Đôi khi có khạc máu

- Giai đoạn muộn thấy các triệu chứng do khối u xâm lấn gây ra:

+ Nuốt đau, liên tục, đau nhói lên tai

1.2.4 Mô bệnh học của ung thư amiđan

Amiđan có tổ chức biểu mô và tổ chức liên kết Vì vậy khối u ác tính của nó cũng được chia làm hai nhóm là ung thư biểu mô và ung thư tổ chức liên kết Trong ung thư amiđan, ung thư biểu mô là loại hay gặp Ung thư biểu

mô amiđan gồm ung thư biểu mô tế bào vảy, ung thư biểu mô kém biệt hóa và ung thư biểu mô không biệt hóa, trong đó ung thư biểu mô vảy chiếm phần lớn (trên 90%)

Ung thư biểu mô tế bào vảy là một loại ung thư của tế bào biểu mô - tế bào vảy Tế bào vảy có nhiều ở da và các bộ phận khác như đường tiêu hóa: môi, họng miệng, thực quản, ở phổi, bàng quang, âm đạo

Về hình thái đại thể của ung thư biểu mô vảy có các hình thái sùi, loét, thâm nhiễm

Về hình thái vi thể, thường phát sinh từ biểu mô Malpighi, với các mức

độ biệt hóa khác nhau

* Phân độ mô học của Broders:

Ung thư biểu mô vảy được phân độ mô học (độ ác tính) thành 4 độ: I, II, III, IV theo tiêu chuẩn phân độ mô học của Broders kết hợp thêm mức độ sừng hóa của mô u, số nhân chia trên 1 vi trường ở độ phóng đại 400 lần ( lấy trung bình từ 20 vi trường) số tế bào không điển hình và phản ứng viêm của cơ thể với

mô ung thư Cách tính điểm để phân độ mô học dựa trên tiêu chuẩn ở bảng sau:

Bảng 1.1 Cách tính điểm phân độ mô học

Số tế bào không điển hình <25% 25-50% 50-75% >75%

Độ mô học được được đánh giá bằng tổng điểm cộng của các thông số như sau

Độ I: 8 - 10 điểm

Độ II: 5 - 7 điểm

Độ III: 3 - 4 điểm

Độ IV: 0 - 2 điểm

1.2.5 Chẩn đoán ung thư amiđan

1.2.5.1 Chẩn đoán xác định

Chẩn đoán xác định dựa vào lâm sàng và mô bệnh học, trong đó mô bệnh học là tiêu chuẩn vàng để xác định và phân loại mô bệnh học theo TCYTTG [21]

1.2.5.2 Chẩn đoán giai đoạn

Sắp xếp giai đoạn ung thư amiđan nằm trong nhóm các ung thư họng miệng Phân loại giai đoạn theo TNM của tổ chức phòng chống ung thư quốc

tế (UICC-2002)

U nguyên phát (Primary tumour - T):

Tx : không thể đánh giá được khối u nguyên phát

T0: không có bằng chứng của khối u nguyên phát

Tis: ung thư biểu mô tại chỗ

vòm miệng cứng, và xương hàm dưới

T4b: khối u xâm lấn bất kỳ cấu trúc tiếp theo: cơ cánh bướm bên, bản xương bướm, thành bên mũi họng, nền sọ, hoặc bao động mạch cảnh

N - Hạch lympho (Nodal involvement-N):

Nx: không thể đánh giá được hạch lympho vùng

N0: không có di căn hạch lympho vùng

N1: di căn đơn hạch cùng bên với u, có đường kính ≤ 3 cm

N2:

+ N2a: di căn đơn hạch cùng bên với u có đường kính từ 3 đến 6 cm + N2b: di căn nhiều hạch cùng bên đường kính nhỏ hơn 6 cm

+ N2c: di căn hạch hai bên hoặc đối bên với đường kính nhỏ hơn 6 cm N3 : di căn hạch lympho có đường kính lớn hơn 6 cm

(Lưu ý: các hạch lympho di căn ở giữa được xem như hạch cùng bên)

M - Di căn xa (Distant Metastasis - M):

Mx: không thể đánh giá được di căn xa

M0: không có di căn xa

M1: có di căn đi xa

Bảng 1.2 Phân nhóm giai đoạn bệnh cho ung thư họng miệng

M0 M0

T4a

N2 N0,N1,N2

M0 M0

Bất kỳ T

Bất kỳ N N3

M0 M0

1.2.5.3 Chẩn đoán phân biệt

Nói chung, ở giai đoạn muộn việc chẩn đoán không mấy khó khăn, tuy nhiên những trường hợp bệnh ở giai đoạn sớm, thể thâm nhiễm chưa có chẩn đoán mô bệnh học, thường phải phân biệt với các trường hợp sau:

Với một khối u loét thâm nhiễm, cần phân biệt với lao hoặc giang mai amiđan bằng cách làm phản ứng huyết thanh và các xét nghiệm về lao

Với thương tổn loét, phân biệt với viêm họng Vincent, nhưng bệnh này diễn biến cấp tính với đặc điểm loét không đều, đáy ổ loét bẩn có mủ, máu hoặc giả mạc bao phủ, bờ ổ loét không rắn, thường có hạch phản ứng viêm Phân biệt bằng thử vi trùng có thoi xoắn khuẩn Vincent

Với thể thâm nhiễm làm amiđan to, cần chú ý phân biệt sự phát triển của bản thân amiđan hoặc amiđan bị các khối u vùng lân cận đẩy lồi ra (u bên họng,

u tuyến mang tai, hạch cổ to hoặc do u của vòm, mặt sau màn hầu, ngã ba

họng thanh quản ) Các u hỗn hợp của vùng màn hầu ở giai đoạn cuối có thể loét và lan tới amiđan, nhưng tính chất phát triển chậm, hay tái phát nên ít nhầm Các trường hợp có triệu chứng đầu tiên của bệnh chỉ là nổi hạch cổ, cần phân biệt với các hạch lao, u lympho ác tính biểu hiện ở amiđan, bệnh bạch

cầu cấp có hạch phản ứng

1.2.6 Điều trị ung thư amiđan

Cả phẫu thuật lẫn xạ trị đơn thuần đều có thể áp dụng điều trị cho bệnh ở giai đoạn I - II Xạ trị có thể đạt được kết quả tương tự như phẫu thuật nếu không nói là có thể tốt hơn cho việc kiểm soát bệnh tại chỗ, sống thêm toàn

bộ và thường được ưa thích hơn vì mang lại kết quả bảo tồn chức năng tốt hơn Khi bệnh ở giai đoạn muộn, kết hợp đa phương thức điều trị là cần thiết Sự lựa chọn gồm phẫu thuật và xạ trị hậu phẫu có hoặc không kèm theo hóa trị Cũng có thể xạ trị đơn thuần hoặc tiếp theo là vét hạch cổ nếu còn lại sau xạ

1.2.6.1 Phẫu thuật trong ung thư amiđan

Các phương pháp cắt amiđan tuy có khác nhau nhưng nhìn chung đều dựa vào một số cơ sở giải phẫu học như: hố amiđan, khoang quanh amiđan, chân cuống amiđan và động mạch amiđan, đặc biệt là khoang kế cận amiđan

và các mối liên hệ mạch máu, thần kinh vùng cổ

12.6.2 Xạ trị trong ung thư amiđan

Xạ trị là cách dùng các tia bức xạ ion hoá có năng lượng cao để tiêu diệt

tế bào và mô ung thư Xạ trị cùng với phẫu thuật và hoá trị liệu là ba phương pháp cơ bản điều trị ung thư

Mục đích và chỉ định của xạ trị

- Điều trị triệt căn: thường chỉ định cho những tổn thương ung thư còn khu trú, bệnh ở giai đoạn tương đối sớm còn có thể chữa khỏi được

- Điều trị tạm thời: với những ung thư amiđan ở giai đoạn muộn, không

còn khả năng chữa khỏi, việc xạ trị tạm thời có một ý nghĩa xã hội và nhân văn lớn Nó đã cải thiện, nâng cao chất lượng sống trong những ngày còn lại ở người bệnh và thường nhằm những mục đích cụ thể, rõ ràng:

+ Chống đau: ung thư amiđan giai đoạn muộn thường xâm lấn hoặc di căn vào xương gây đau đớn dữ dội, chỉ định xạ trị chống đau mang lại hiệu quả cao và rõ rệt, điều này đã được kiểm chứng trong thực tế lâm sàng

+ Giảm sự phát triển mạnh, giảm sự chèn ép của u và của hạch di căn + Chống chảy máu: chiếu xạ vào vùng chảy máu một liều xạ lớn, tập trung sẽ làm xơ hoá các mạch máu bị vỡ, giảm tình trạng viêm nhiễm, vì thế cầm máu rất nhanh và có hiệu quả rõ rệt

1.2.6.3 Hoá trị bệnh ung thư amiđan

Hơn 70% ung thư amiđan ở nước ta có cấu tạo mô bệnh học là ung thư biểu mô vảy, đó là loại ít nhạy cảm với phương pháp xạ trị và ít đáp ứng với hóa chất

Mặt khác, đa phần bệnh nhân ung thư amiđan đến bệnh viện điều trị khi bệnh ở giai đoạn muộn, tổn thương xâm lấn rộng và có nguy cơ di căn xa cao

Xạ trị chỉ kiểm soát tại chỗ, tại vùng, ở giai đoạn muộn u lan rộng nên khó kiểm soát do vậy tỷ lệ tái phát và di căn xa cao

Chính vì những lý do trên mà hoá chất đã được sử dụng để điều trị ung thư amiđan ở giai đoạn muộn Giai đoạn trước những năm 80, hầu hết các công thức đều có Methotrexat kết hợp với Cisplatin, Bleomycin, 5FU, hoặc Vincristin được coi như là một thành phần của phác đồ điều trị ung thư biểu

mô vảy giai đoạn muộn [22]

Hoá chất điều trị amiđan có tác dụng như là những tác nhân làm tăng mức

độ nhạy cảm của tế bào ung thư với tia bức xạ đồng thời làm hạn chế vi di căn

1.3 VAI TRÒ CỦA CẮT LỚP VI TÍNH (CLVT) TRONG UNG THƯ AMIĐAN CLVT là một thăm dò cận lâm sàng rất quan trọng trong việc xác định

chính xác vị trí, kích thước, sự xâm lấn, phá hủy lan tràn và mối liên quan của khối u với các cấu trúc lân cận đặc biệt khi khối u xâm lấn mạch máu, thần kinh và phá hủy các cấu trúc xương [23] Trong ung thư, chụp CLVT giúp phát hiện được các hạch di căn mà bằng thăm khám lâm sàng không phát hiện được

- Ưu điểm của CLVT: cho phép đánh giá sự xâm lấn, phá hủy các cấu trúc xương tốt hơn cộng hưởng từ

1.4 MỐI LIÊN QUAN GIỮA UNG THƯ AMIĐAN VÀ HPV

1.4.1 Đặc điểm sinh vật học HPV

1.4.1.1 Cơ sở phân loại và phân loại

- Papillomavirus là nhóm virus có DNA nhỏ gây bệnh trên người và động vật có xương sống bậc cao Tính đặc hiệu gây bệnh cho loài của Papillomavirus rất cao nên khó có thể tìm thấy loại Papillomavirus loài này

lại gây bệnh cho loài khác [24] Papillomavirus gây bệnh trên người (Human Papillomavirus - HPV) là một loại duy nhất, có khả năng thích ứng ở biểu mô

sừng và niêm mạc gây tăng sinh tế bào biểu mô hình thành mụn cóc, u sùi và khối ung thư ở da, miệng, thực quản, hầu họng và đường hậu môn-sinh dục

- Về việc phân loại, ban đầu Papillomavirus được xếp cùng nhóm với Polyomavirus thuộc Papovaviridae Nhưng sau này, những nghiên cứu về

sinh học chức năng và sinh học phân tử đã cho thấy sự khác biệt rõ ràng về đặc điểm di truyền cũng như tính chất sinh vật học của hai nhóm virut trên, từ

đó cho phép phân loại Papillomavirus một cách hoàn chỉnh và tách hoàn toàn riêng biệt khỏi nhóm Polyomavirus Như vậy, tất cả Papillomavirus chỉ là một nhóm duy nhất, thuộc họ Papillomaviridae [25]

- Các Papillomavirus được chia thành các nhóm, có 16 nhóm ký hiệu

từ A - P

Các nhóm Papillomavirus lại được chia thành các type Papillomavirus

là một trong những virus có nhiều type nhất Có gần 200 type được biết đến, nhưng chỉ có khoảng 100 type đã được xác định, trong đó khoảng 40 type có khả năng lây truyền qua đường sinh dục

Việc định type của Papillomavirus dựa trên mức độ giống nhau của

thành phần nucleotide và mức độ tương đồng giữa các thành phần acid amin

của các chuỗi gen E6, E7 và L1 Do đó, các type của Papillomavirus thường

được gọi là các genotype Khi một genotype HPV có ít nhất 10% gene vùng E6, E7, L1 khác với các type đã biết trước đó thì sẽ được xem là một genotype mới [26]

Mỗi type lại có nhiều phân type Mỗi phân type lại có hàng chục biến thể, còn gọi là chủng virut Các type và chủng rất đa dạng và biến động gây khó khăn cho việc xác định [27]

Mỗi genotype của Papillomavirus có một sự thích nghi cao với một loại

biểu mô nhất định Ví dụ như type 1, 2, 3, 10, 27… thường gây bệnh ở da, còn các genotype 16, 11, 18… lại chủ yếu tấn công cơ quan sinh dục người Điều này phụ thuộc vào cách tác động khác nhau của những vùng gen khác nhau ở mỗi genotype đối với protein bao phủ tế bào chủ tại những vị trí khác

nhau trên cơ thể [26]

Hình 1.5 Cây phả hệ của HPV [26]

1.4.1.2 Hình dạng và cấu trúc và sự nhân lên của HPV [27]

HPV (Human Papillomavirus) là nhóm gây bệnh trên người Nó có cấu

trúc DNA, sợi vòng, không có vỏ bọc, có đối xứng hình khối, đường kính: 55cm Capsid HPV có đối xứng hình khối được tạo thành bởi hai protein cấu trúc và tạo nên cấu trúc 72 Bộ gen của HPV là DNA vòng bao gồm khoảng 8.000 bp Bộ gen này chứa khoảng 7-8 gen sớm (từ E1-E8), phụ thuộc vào virut, và chứa hai gen muộn (L1-L2) là những điều hòa gen cấu trúc Các gen này quyết định sự phiên mã và dịch mã trong quá trình nhân lên của virut Các gen này đều nằm trên DNA bổ sung Gen của HPV có thể tồn tại ở dạng plasmid tự do hoặc tích hợp vào DNA tế bào lớp đáy và tái hoạt động khi có điều kiện Sự nhân lên của HPV phụ thuộc vào cơ chế phiên mã của tế bào biểu mô da hoặc niêm mạc HPV bám vào bề mặt tế bào biểu mô qua các receptor chưa được xác định, HPV được phiên mã ở trong nhân của tế bào

50-nhờ enzym sao mã ngược transcriptase Gen sớm bắt đầu cho sự tổng hợp DNA của HPV phiên mã và chuyển thể, gen muộn phiên mã cho các protein cấu trúc Chỉ có các gen sớm gây chuyển và tạo nên kháng nguyên K

1.4.1.3 Đường lây truyền của HPV [28]

HPV có thể lây truyền trực tiếp qua da, đường tình dục, miệng, giác mạc Virut không xâm nhập được qua biểu mô lành được nên chúng chỉ xâm nhập qua các vết xây xước hoặc vết thương, các mô chưa trưởng thành HPV khá bền vững và và nó có thể tồn tại ở một thời gian ở môi trường bên ngoài

và gây ra lây nhiễm

1.4.1.4 Cơ chế gây bệnh

- Xâm nhập chuỗi gen của HPV vào tế bào chủ

Bộ gen HPV xâm nhập vào chuỗi gen của vật chủ ở dạng episome (DNA dạng vòng ở ngoài nhiễm sắc thể vật chủ) đối với HPV nhóm “nguy cơ thấp” hoặc xâm nhập vào nhiễm sắc thể vật chủ đối với HPV nhóm “nguy cơ cao”, gây biến đổi cấu trúc tế bào

- Gây bất tử hóa tế bào

- Bất ổn định gen tế bào chủ

- Biến đổi đáp ứng với phá hủy DNA

Có thể gây mất khả năng đáp ứng của cơ thể với sự phá hủy DNA Khi

có sự phá hủy DNA, cơ thể đáp ứng bởi hoạt hóa p53 tạo ra protein điều hòa quá trình nghỉ giữa hai chu trình nhân lên của tế bào E6 và E7 có khả năng ức chế quá trình nghỉ giữa quá trình phân bào được điều khiển bởi p53 E6 chỉ kết hợp và bất hoạt p53, nhưng E7 không chỉ gây rối loạn chức năng yếu tố điều hòa chu trình tế bào, Rb mà bất hoạt p21, chất ức chế men kinase phụ thuộc cycline, yếu tố cần thiết xuất hiện do p53 hoạt hóa

- Tăng sinh và biệt hóa tế bào

Trong khi các tế bào bình thường bên trên tế bào đáy thoát khỏi chu trình nhân lên của tế bào, E6 và E7 của HPV có khả năng tái thiết lập chương trình

ở tế bào sừng bị nhiễm tiếp tục tổng hợp DNA và các phần phụ giúp vi rút nhân lên

1.4.1.5 Các phương pháp xác định HPV [28]

- Xét nghiệm tế bào học: xác định hình dạng của tế bào bị tổn thương (tế bào rỗng)

- Quan sát dưới kính hiển vi điện tử: xác định cấu trúc của virut

- Phương pháp huyết thanh học: kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang: xác định kháng nguyên của virus

- Xét nghiệm sinh học phân tử PCR: xác định DNA của virut

- Nuôi cấy: không có giá trị

Phương pháp huyết thanh học thường không thể xác định một cách đầy

đủ, còn kỹ thuật sinh học phân tử và đặc biệt là PCR và kĩ thuật lai phân tử

rất có giá trị trong chẩn đoán HPV [29]

1.4.2 Các nghiên cứu phát hiện HPV trong ung thư biểu mô vảy amiđan

HPV được biết đến là một nguyên nhân gây ra các bệnh ung thư đường sinh dục

Đến năm 1983, khi được cho là có liên quan đến ung thư hầu họng, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về mối liên quan giữa chúng [30]

- Năm 1989, Brandsma và Abramson là người đầu tiên báo cáo sự hiện diện DNA của HPV - 16 trong 27 mẫu ung thư bạch huyết vùng waldayer

sử dụng kĩ thuật lai phân tử southern blot vào năm 1989 [31]

- Một năm sau, Ishibashi và đồng nghiệp cũng đã xác định được sự có mặt của HPV trong ung thư hạnh nhân vùng hầu họng và trong các hạch bạch huyết di căn [32]

- Năm 2002, Mellin và đồng nghiệp đã phân tích 84 mẫu ung thư hạnh nhân vùng waldayer và đã tìm thấy 39 mẫu có HPV trong đó [33]

Các yếu tố nguy cơ ung thư hầu họng trong đó có amiđan thường biết đến

là uống rượu và hút thuốc lá Tuy nhiên, ngày càng có nhiều cá nhân trẻ tuổi và phụ nữ cao tuổi mắc bệnh ung thư vùng họng miệng nói chung và ung thư amiđan nói riêng mà không sử dụng các chất là yếu tố nguy cơ gây ung thư trên Bởi số người hút thuốc lá thì giảm đi nhưng ung thư khu vực họng miệng lại tăng lên [34] Thật vậy, các nghiên cứu trong thập kỷ qua cho thấy một tỷ lệ đáng kể của ung thư họng miệng và hạch hạnh nhân có liên quan với HPV

- Một số nghiên cứu ở Mỹ đã trải qua một sự gia tăng về số lượng các trường hợp ung thư cổ họng, trong đó có ung thư amiđan do virut u nhú ở người (HPV) type 16 Ung thư cổ họng liên quan đến HPV đã được ước tính

đã tăng từ 0,8 trường hợp/ 100.000 dân vào năm 1988 đến 2,6/ 100.000 vào năm 2004 [35]

- Trong số các bệnh ung thư không phải là sinh dục, ung thư amiđan có mối liên hệ chặt chẽ nhất với HPV Năm 2002, khi tổng hợp các nghiên cứu về HPV

và ung thư hầu họng, có 432 trường hợp ung thư amiđan được phân tích HPV DNA Tỷ lệ phát hiện là 51%, trong đó typ 16 chiếm 84% Ngoài ra, còn tìm thấy HPV các typ 18, 33, 6, 11… trong mẫu bệnh phẩm ung thư amiđan [33] Qua các nghiên cứu trên, chứng tỏ, HPV có liên quan đến ung thư hầu họng nói chung và ung thư amiđan nói riêng

Ở Việt Nam, có rất nhiều những nghiên cứu về HPV và ung thư đường sinh dục, song chưa một nghiên cứu cụ thể nào về sự liên quan giữa ung thư amiđan và HPV

1.5 KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ PHÁT HIỆN HPV - PCR VÀ REAL - TIME PCR

1.5.1 Nguyên lý của phản ứng PCR

- PCR (Polymerase chain reaction) - phản ứng tổng hợp dây truyền nhờ men polymerase, do Kary Mullis phát minh năm 1985, là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực sinh học phân tử

- Nguyên tắc của phương pháp PCR: dựa vào đặc tính hoạt động của enzym DNA Polymerase, cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn

- Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng biệt Đây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao [36]

1.5.2 Đặc điểm phương pháp Real - time PCR

Trong kỹ thuật PCR, sau khi hoàn tất khuếch đại đoạn DNA đích, người

ta phải làm tiếp một số bước thí nghiệm để đọc kết quả xác định có sản phẩm khuếch đại mong muốn trong ống phản ứng hay không, và giai đoạn này được gọi là giai đoạn điện di DNA Kỹ thuật PCR mà cần phải có giai đoạn thí nghiệm để đọc và phân tích sau khi hoàn tất phản ứng khuếch đại, ngày nay gọi là PCR cổ điển

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hàng tỷ bản sao, được hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên người làm thí nghiệm không cần thiết phải làm tiếp các thao tác sau đó để phát hiện sản phẩm nhân bản

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu về đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng

Đối tượng nghiên cứu gồm 50 bệnh nhân được chẩn đoán xác định là ung thư biểu mô vảy amiđan bằng lâm sàng và mô bệnh học từ năm 2012 -7/2014

* Tiêu chuẩn lựa chọn: là những bệnh nhân

- Được chẩn đoán xác định ung thư biểu mô vảy amiđan

- Được khám nội soi Tai Mũi Họng

- Có chẩn đoán giải phẫu bệnh ung thư biểu mô vảy amiđan và phân độ

mô học

- Có chụp CLVT

* Tiêu chuẩn loại trừ:

- Không có chẩn đoán giải phẫu bệnh về ung thư biểu mô vảy amiđan và phân độ mô học

- Ung thư tổ chức liên kết

- Ung thư biểu mô kém biệt hóa

- Ung thư biểu mô không biệt hóa

- Không khám nội soi Tai – Mũi – Họng

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu về nguy cơ nhiễm HPV

Chọn 20 bệnh nhân được chẩn đoán ung thư biểu mô vảy amiđan trong nhóm đối tượng nghiên cứu lâm sàng, cận lâm sàng làm xét nghiệm Real - Time PCR định tính và định type HPV

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

- Nghiên cứu thống kê mô tả: mô tả từng trường hợp qua khám lâm sàng,

tra cứu hồ sơ bệnh án về triệu chứng, khai thác yếu tố nguy cơ, đặc điểm CLVT và mô bệnh học Đối chiếu kết quả HPV với lâm sàng

2.2.2 Phương pháp chọn mẫu

- Chọn mẫu tiện lợi: chọn những bệnh nhân được chẩn đoán ung thư biểu mô vảy amiđan từ năm 2012 - 7/2014 tại bệnh viện K Hà Nội và bệnh viện Tai - Mũi - Họng Trung ương

2.2.3 Các nội dung nghiên cứu

Mô tả các quy trình chuẩn cho các kỹ thuật sẽ được sử dụng trong nghiên cứu

- Quy trình thông tin và khám sàng lọc từ đối tượng nghiên cứu:

+ Thông báo cho khoa phòng bệnh viện K Hà Nội và bệnh viện Tai – Mũi - Họng Trung ương về đề tài nghiên cứu để khám và khai thác thông tin bệnh nhân

+ Giải thích cho bệnh nhân về vấn đề nghiên cứu để bệnh nhân hiểu và hợp tác

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Bệnh nhân ung thư amiđan

- Khám

- Tra cứu bệnh án

Lấy bệnh phẩm ung thư amiđan

Đối chiếu lâm sàng

2.2.3.1 Thực hiện mục tiêu 1

Thu thập thông tin về triệu chứng lâm sàng, mô bệnh học, CLVT của các bệnh nhân được lựa chọn qua việc khám và tra cứu hồ sơ, điền đầy đủ thông

tin vào bệnh án mẫu về:

- Triệu chứng cơ năng

- Thời gian phát hiện bệnh

- U nguyên phát: vị trí, hình thái, kích thước

- Hạch cổ: nhóm hạch di căn, bên xuất hiện, kích thước

- Yếu tố nguy cơ:

+ Thuốc lá (thuốc lào): số lượng điếu/ ngày, số năm hút thuốc

+ Rượu: số lượng (ml)/ ngày, số năm uống

+ Tình trạng viêm họng, amiđan: trung bình bao nhiêu lần/ năm, liên tục trong bao thời gian bao lâu

+ Điều kiện sinh hoạt: môi trường sống, lối sống…

- Đánh giá kết quả giải phẫu bệnh: các tiêu bản mô bệnh học được kiểm định tại khoa Giải phẫu bệnh bệnh viện K và Tai - Mũi - Họng Trung ương Các tiêu bản của các bệnh nhân được xét nghiệm mô bệnh học theo phương pháp nhuộm Hematoxylin Eosin:

+ Lấy bệnh phẩm qua sinh thiết

 Được đánh giá kết quả trước và sau khi tiêm thuốc cản quang

 Sử dụng phần mềm 3D tái tạo theo bình diện Coronal (đứng ngang) và Sagital (đứng dọc)

- Lấy mẫu bệnh phẩm ở khối u của bệnh nhân ung thư biểu mô vảy amiđan

Mô sinh thiết được đựng trong ống nhựa Eppendort bảo quản ở nhiệt độ -20ºC

và gửi đến Bộ môn Y sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội

- Bộ môn Y sinh học - Di truyền tập hợp số lượng mẫu để tiến hành xét

nghiệm Real - Time PCR với cặp mồi MY11/MY09 và GP5+/GP6+ để định

tính HPV, nếu kết quả dương tính sẽ tiếp tục làm xét nghiệm Reverse Dot

Blot ( RDB) để định 25 type gen HPV

- Phân tích, đối chiếu kết quả Real - time PCR với lâm sàng và mô bệnh

học để khảo sát mối liên quan giữa ung thư biểu mô vảy amiđan và HPV

2.2.3.3 Quy trình thực hiện Real - Time PCR

a Cặp mồi

Chúng tôi sử dụng các oligonucleotide có trình tự đã công bố (Van Den

Brule và cộng sự, 2002) do công ty Integrated AND Technologies (IDT – Hoa

Kỳ) tổng hợp được trình bày trong bảng dưới đây:

MY09 5’CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC 3’

GP5+ 5’TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC 3’

GP6+ 5’GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT C 3’

b Qui trình thực hiện RT - PCR

- Thành phần phản ứng Real - Time PCR

+ DNA của HPV được chiết tách từ mô ung thư

+ Mồi xuôi và mồi ngược: MY11/MY09; GP5+/GP6+

+ Taq DNA Polymerase

+ Buffer 1X

+ dNTD

+ dH20

Thể tích: 25µl

- Phân tích kết quả:

Phân tích chứng dương và chứng âm: chỉ chọn giếng chứng dương và

âm, chọn màu FAM rồi đến màu Hex Thí nghiệm đạt yêu cầu và tiếp tục các bước phân tích kết quả nếu:

+ Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính)

+ Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính

và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính

Phân tích mẫu: chọn mẫu FAM Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước, kết luận “Mẫu dương tính” Mẫu có đường biểu diễn dương tính không rõ ràng và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “Mẫu nghi ngờ” và đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hiện lại xét nghiệm sau 1 - 3 tháng Mẫu có đường biểu diễn âm tính, kết luận “không tìm thấy virut trong mẫu” Những mẫu dương tính chỉ cần chọn màu FAM để phân tích, không cần quan tâm đến chứng nội, chứng nội có thể dương hoăc âm Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu âm tính thực sự

2.2.3.4 Qui trình kỹ thuật lai phân tử Reverse Dot Blot (RDB):

a Mẫu dò: gồm 25 mẫu dò đặc hiệu

Sử dụng các oligonucleotide có trình tự đã công bố (Van Den Brule &cs, 2002) do công ty Integrated AND Technologies (IDT – Hoa Kỳ) tổng hợp được trình bày trong bảng dưới đây:

HPV6 5'ATC CGT AAC TAC ATC TTC CAC ATA CAC CAA 3' HPV11 5' ATC TGT GTC TAA ATC TGC TAC ATA CAC TAA 3' HPV16 5' GTC ATT ATG TGC TGC CAT ATC TAC TTC AGA 3' HPV18 5' TGC TTC TAC ACA GTC TCC TGT ACC TGG GCA 3' HPV31 5' TGT TTG TGC TGC AAT TGC AAA CAG TGA TAC 3' HPV33 5' TTT ATG CAC ACA AGT AAC TAG TGA CAG TAC 3' HPV35 5' GTC TGT GTG TTC TGC TGT GTC TTC TAG TGA 3' HPV39 5' TCT ACC TCT ATA GAG TCT TCC ATA CCT TCT 3' HPV42 5' CTG CAA CAT CTG GTG ATA CAT ATA CAG CTG 3' HPV43 5' - TCTACTGACCCTACTGTGCCCAGTACATAT - 3' HPV45 5' ACA CAA AAT CCT GTG CCA AGT ACA T 3'

HPV51 5' AGC ACT GCC ACT GCT GCG GTT TCC CCA ACA 3' HPV52 5' TGC TGA GGT TAA AAA GGA AAG CAC ATA TAA 3' HPV53 5' TGT CTA CAT ATA ATT CAA AGC 3'

HPV56 5' GTA CGT CTA CAG AAC AGT TAA GTA AAT ATG 3'

HPV58 5' ATT ATG CAC TGA AGT AAC TAA GGA AGG TAC 3' HPV59 5' TCT ACT ACT KCT TCT ATT CCT AAT GTA TAC 3' HPV61 5' TAC TGC TAC ATC CCC CCC TGT ATC TGA ATA 3' HPV66 5' TAT TAA TGC AGC TAA AAG CAC ATT AAC TAA 3' HPV68 5' TCT ACT ACT ACT GAA TCA GCT GTA CCA AT 3'

 Pha probe amino: 50 - 200pmol/µl trong dung dịch NaHCO3 0.5M - pH8.4, đặt lên màng để 10p Đặt màng lai 10 phút trong 100ml dung dịch NaOH 0.1M, nhiệt độ phòng

 Rửa màng lai 5 phút trong dung dịch SSPE 2X – SDS 0.1% ở 60oC

 Rửa màng lai 15 phút trong dung dịch EDTA 0.02M, pH8, nhiệt độ phòng (nếu sử dụng liền, không cần bước này)

 Giữ màng lai ở 4oC trong hộp nhựa chuyên dụng cho đến khi sử dụng Lai và phát hiện: (Tùy theo kích cỡ màng lai, thể tích các dung dịch sẽ thay đổi):

 Biến tính sản phẩm PCR (DIG hoặc biotin) trong 5 phút với cùng HB một thể tích của dung dịch DB

 Cho vào dung dịch HB (đã ủ ở 42oC), lắc ủ cùng với màng lai đã xử lý

 Rửa màng lai với dung dịch WB2, 42oC trong 10 phút

 Đặt màng lai vào dung dịch WB3, 2 lần ở nhiệt độ phòng trong 5’

 Ủ màng lai với dung dịch SB + 2% NBT/BCIP trong 15-60’

c Phân tích kết quả RDB:

- Phân tích mẫu: những tín hiệu dương tính mạnh có thể thấy rõ ràng trong hộp đặc hiệu đựng mẫu lai, những tín hiệu dương tính yếu phải lấy màng lai ra khỏi hộp và đưa lên trước bóng đèn huỳnh quang để thấy tín hiệu tốt nhất Tín hiệu tròn xanh xuất hiện tại vị trí tương ứng genotype nào thì kết luận mẫu nhiễm genotype đó, một mẫu có thể đồng nhiễm nhiều genotype Những mẫu dương tính với các genotype có thể dương tính tại vị trí chứng

dương hoặc không Những mẫu âm tính với các genotype và dương tính tại vị trí chứng dương được kết luận “Mẫu nhiễm HPV genotype khác ngoài 24 genotype của bộ kit đang dùng”

- Tín hiệu tròn xanh dương tính có thể xanh đậm hoặc rất nhạt tương ứng với mức độ nhiễm bệnh, tín hiệu này rất đặc trưng, nằm ngay tại vị trí tương ứng với genotype và có thể nìn thấy rõ ràng từ cả hai mặt của màng lai Những vệt xanh không đặc hiệu thường không nằm tại các vị trí tương ứng với các genotype và chỉ nhìn thấy từ trên mặt màng lai

- In hình kết quả: chụp hình màng lai của mỗi mẫu và lưu lại thành file trên máy tính Chèn hình vào trang trả kết quả, chú thích các vị trí “chứng dương”, “các genotype dương tính”

2.2.5 Địa điểm nghiên cứu

- Bệnh viện Tai - Mũi - Họng Trung ương

- Bệnh viện K Hà Nội

- Bộ môn Y sinh học - Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội

2.2.6 Thiết bị nghiên cứu

- Máy nội soi Tai – Mũi – Họng: nguồn sáng, camera, màn hình

- Bộ thiết bị làm Real - Time PCR

+ Máy tính, phần mềm Clustal X 1.81, Annhyp 4.913

+ Nồi hấp, tủ sấy

+ Tủ lạnh 4ºC, -20oC

+ Máy nước cất 1 lần, máy nước cất 2 lần

+ Buồng nuôi cấy vô trùng cấp II

Hình 2.3 Hệ thống máy Real - Time PCR

(Bộ môn Y sinh học - Di truyền ĐH Y Hà Nội)

2.2.7 Đạo đức nghiên cứu

- Nghiên cứu nhằm mang lại lợi ích cho bệnh nhân Tất cả bệnh nhân nghiên cứu đều được giải thích rõ ràng về mục đích của nghiên cứu, về các lợi ích lâu dài do nghiên cứu mang lại, các xét nghiệm tiến hành và bệnh nhân đồng ý tham gia

- Bệnh nhân không phải trả chi phí xét nghiệm định tính và định genotype HPV bằng PCR Cách lấy mẫu tiến hành xét nghiệm PCR được tiến hành như lấy mẫu gửi giải phẫu bệnh, không ảnh hưởng đến thể chất và tinh thần của đối tượng nghiên cứu

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CLVT VÀ MÔ BỆNH HỌC

(p = 0.026 < 0,05: có ý nghĩa thống kê)

3.1.1.2 Phân bố theo giới (n=50)

Biểu đồ 3.1 Phân bố theo giới

Nhận xét:

- Tỷ lệ ung thư amiđan ở nam giới chiếm (94%), cao hơn ở nữ (6%)

- Tỷ lệ nam cao gấp 16 lần của nữ