Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa cytochrome p450 từ DNA metagenome suối nước nóng bình châu

3: Thành phần các đoạn đọc thô trong mẫu đọc trình tự DNA metagenome của suối nước nóng sở dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 27 Hình 3.7: Số lượng các cytochrome P450

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

NGUYỄN VĂN TỤNG

TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CYTOCHROME P450 TỪ DNA METAGENOME

SUỐI NƯỚC NÓNG BÌNH CHÂU

Chuyên ngành: Công nghệ nano sinh học

Mã số: Chuyên ngành đào tạo thí điểm

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ NANO SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Kim Thoa

TS Hà Thị Quyến

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Kim Thoa, TS Hà Thị Quyến, đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong quá trình học tập cũng như đã trực tiếp hướng dẫn, động viên em trong suốt quá trình làm thực nghiệm

Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô trong Bộ môn công nghệ nano sinh học, khoa Vật lý kỹ thuật và công nghệ nano Trường đại học Công nghệ - Đại học Quốc gia Hà Nội đã cung cấp cho em những kiến thức cần thiết và tạo điều kiện để em hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, em xin cảm ơn các cán bộ nghiên cứu phòng Công nghệ Vật liệu sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâmkhoa học và công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu tại phòng

Hà Nội, tháng 9 năm 2017 Nguyễn Văn Tụng

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn thạc sĩ này là do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn, chỉ bảo của TS Nguyễn Kim Thoa và TS Hà Thị Quyến Tôi xin cam đoan trong luận văn này không sao chép các tài liệu, công trình nghiên cứu của người khác mà không chỉ rõ trong tài liệu tham khảo Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường

Người cam đoan

Nguyễn Văn Tụng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Hệ enzyme cytochrome P450 2

1.1.1 Hệ enzyme cytochrome P450 ở vi sinh vật 3

1.1.2 Hệ thống truyền điện tử của P450 5

1.1.3 Hệ enzyme cytochrome P450 bền nhiệt ở vi sinh vật 6

1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450 7

1.2 Kỹ thuật metagenomic trong quá trình khai thác các gen mới 10

1.3 Khai thác DNA metagenome bằng công cụ tin sinh 11

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Vật liệu 14

2.1.1 Vật liệu 14

2.1.2 Vi sinh vật 14

2.1.3 Vector 14

2.1.4 Mồi sử dụng 14

2.1.5 Các môi trường sử dụng 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử 15

2.2.1.1 Tách chiết DNA metagenome 15

2.2.1.2 Giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 16

2.2.1.3 Thiết kế mồi 16

2.2.1.4 Khuếch đại gen P450-T2 16

2.2.1.5 Chuẩn bị tế bào Escherichia coli khả biến xung điện 17

2.2.1.6 Tạo vector biểu hiện pET17b gắn đoạn gen P450-T2 (pET17b-T2) 17

2.2.1.7 Biến nạp vào E coli bằng phương pháp xung điện 18

2.2.1.8 Chọn lọc dòng E coli mang vector pET17b-T2 18

2.2.1.9 Biểu hiện gen P450-T2 18

2.2.2 Các phương pháp hóa sinh 19

2.2.2.1 Tinh sạch protein P450-T2 tái tổ hợp 19

2.2.2.2 Điện di SDS-PAGE 19

2.2.2.3 Xác định phổ hấp thụ phân tử UV-Vis và phương pháp xác định nồng độ cytochrome P450 20

2.2.2.4 Xác định pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của P450-T2 tái tổ hợp 21

2.2.2.5 Xác định độ bền nhiệt của P450-T2 tái tổ hợp 21

2.2.2.6 Xác định các redox partner trong hệ thống truyền điện tử của P450-T2 22 2.2.2.7 Xác định các phổ cơ chất tiềm năng của P450-T2 22

2.2.3 Các phương pháp tin sinh học 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Tách chiết DNA metagenome từ mẫu suối nước nóng Bình Châu 24

3.2 Giải trình tự DNA metagenome bằng thiết bị HiSeq Illumina 25

3.3 Xây dựng cơ sở dữ liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu các gen mã hóa cytochrome P450 bằng các công cụ tin sinh học 25

3.3.1 Giải trình tự và tiền xử lý dữ liệu 25

3.3.2 Lắp ráp de novo metagenome 26

3.3.3 Dự đoán gen và xây dựng cơ sở dữ liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu cụm gen mã hoá cytochrome P450 27

3.3.4 Dự đoán nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các P450 tiềm năng trong cơ sở dữ liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu 29

3.4 Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa cytochrome P450 từ DNA metagenome suối nướcnóng Bình Châu 30

3.4.1 Phân lập gen mã hóa cytochrome P450 30

3.4.2 Lựa chọn ORF hoàn chỉnh mã hóa cytochrome P450 31

3.4.3 Phân tích trình tự gen mã hoá cytochrome P450 tổng hợp nhân tạo (P450-T2) 31

3.4.4 Thiết kế hệ vector biểu hiện gen mã hóa P450-T2 34

3.4.5 Biểu hiện gen mã hóa P450-T2 34

3.5 Tinh sạch P450-T2 tái tổ hợp 36

3.6 Xác định một số tính chất của P450-T2 37

3.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH lên hoạt tính của enzyme tái tổ hợp 37

3.6.2 Độ bền nhiệt và nhiệt độ biến tính toàn phần (Tm) của P450-T2 38

3.7 Redox partner thích hợp trong chuỗi truyền điện tử của P450-T2 40

3.8 Phổ cơ chất tiềm năng của P450-T2 41

KẾT LUẬN 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 51

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

APS Ammonium Persulfate

CD Circular Dichroism(Quang phổ lưỡng sắc tròn)

CYP Cytochrome P450 DTE Dithioerythritol

FDA Flavin adenine dinucleotide FMN Flavin mononucleotide

LDL Low-density lipoprotein(Lipoprotein tỉ trọng

thấp) NADH Nicotinamide adenine dinucleotide

ORF Open reading frame PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

electrophoresis(Điện di trên gel Polyacrylamide)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Kết quả lắp ráp de novo metagenome suối

nước nóng Bình Châu 26 Bảng 3.2: Cơ sở dữ liệu metagenome suối nước

nóng Bình Châu cụm gen mã hóa cytochrome P450 28 Bảng 3.3: Sàng lọc cơ chất của P450-T2 dựa trên sự

thay đổi UV-Vis từ trạng thái LS sang trạng thái HS 42

Châu được lựa chọn để lấy mẫu 24 Hình 3.2: DNA metagenome của mẫu nước suối nước

Hình 3 3: Thành phần các đoạn đọc thô trong mẫu

đọc trình tự DNA metagenome của suối nước nóng

sở dữ liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình

Châu

27

Hình 3.7: Số lượng các cytochrome P450 trong cơ sở

dữ liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu 29 Hình 3.8: Phân bố Tm của các cytochrome P450 tiềm

năng được mã hoá bởi 38 ORF hoàn chỉnh từ cơ sở

dữ liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu

30

Hình 3.9: Cây phả hệ giữa cytochrome P450 mã hóa

bởi gen phân lập từ DNA metagenome suối nước

nóng Bình Châu và một số cytochrome P450 khác

32

Hình 3.10: Kết quả so sánh trình tự axit amin của

P450-T2 và một số cytochrome P450 khác 33 Hình 3.11: Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen mã

Hình 3.12: Nồng độ P450-T2 tái tổ hợp trong E coli

BL21(DE3) và JM109(DE3) Mô hình biểu hiện được

thực hiện trong bình tam giác nhẵn có thể tích 250 mL

chứa 50 mL môi trường TB

35

Hình 3.13: Màu sắc tế bào E coli C43(DE3) tái tổ

hợp mang vector pET17b-T2 (A) và hiệu suất biểu

hiện P450-T2 của hai hệ thống bình tam giác và

chủng E coli khác nhau

36

Hình 3.14A: Điện di đồ SDS-PAGE của dịch enzyme

P450-T2 thô (1) và dịch enzyme tinh sạch (2) 37 Hình 3.14B: Phổ đặc trưng của cytochrome P450 của

enzyme tái tổ hợp P450-T2 khi bị khử bởi

Na-dithionite và bão hoá trong CO

Hình 3.17: Đường cong biểu diễn các giá trị hấp thụ ở

bước sóng 211 nm của P450-T2 khi thay đổi nhiệt độ

từ 30-90oC

39

Hình 3.18: Đường cong biểu diễn biến thiên hoạt tính

P450-T2 ở 40 và 50oC theo thời gian 40 Hình 3.19: Sàng lọc các hệ redox partner thích hợp

MỞ ĐẦU

Cytochrome P450 (P450) là họ enzyme phân bố rộng rãi và đa dạng nhất nhất, đóng vai trò quan trọng trong rất nhiều con đường chuyển hóa vật chất trong cơ thể cũng như trong tự nhiên P450 có mặt ở hầu hết các giới trong hệ thống sinh vật học, rất đa dạng về cấu trúc và chức năng, thậm chí các P450 của một loài cũng có thể có cấu trúc, chức năng và tính chất khác nhau, đặc biệt là tính đặc hiệu cơ chất Chính vì vậy P450 được ứng dụng rộng rãi nhất trong tất cả lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, môi trường, y dược…

Để đáp ứng được yêu cầu của các quy trình sản xuất một số các sản phẩm sinh học ở quy mô công nghiệp như thực hiện phản ứng ở nhiệt độ cao, trong sự có mặt của một số loại dung môi đòi hỏi các enzyme tham gia vào các quy trình này phải có tính chất đặc biệt như bền nhiệt, chịu dung môi, chịu áp… Vì vậy, việc tìm kiếm các P450 bền nhiệt mới từ tự nhiên hoặc gây đột biến định hướng để nâng cao tính bền nhiệt của các P450 đã được đặc biệt quan tâm nghiên cứu

Các enzyme bền nhiệt thường được thu nhận từ các vùng địa nhiệt như suối nước nóng, miệng núi lửa, giàn khoan dầu khí… Một trong những lợi thế của Việt Nam là có một mạng lưới hơn ba trăm suối nước nóng vô cùng phong phú, trải dài từ Bắc tới Nam Tuy nhiên, các nghiên cứu đánh giá về khu hệ vi sinh vật ưa nhiệt ở các suối nước nóng để có thể thấy được tiềm năng và vai trò của chúng đối với hệ sinh thái

và con người còn hạn chế Cho đến nay, những nghiên cứu về vi sinh vật ưa nhiệt và

hệ enzyme của chúng đã được nghiên cứu tại Việt Nam, chủ yếu tập trung vào nhóm

vi sinh vật phân lập được cũng như hệ enzyme thủy phân của chúng như amylase, protease, cellulase… Mặt khác, suối nước nóng thường có số lượng vi sinh vật rất thấp, chỉ 0,1% tổng số vi sinh vật có thể phân lập được trực tiếp bằng phương pháp truyền thống Kỹ thuật metagenomic ra đời cho phép các nhà nghiên cứu tiếp cận sâu hơn với hệ gen của vi sinh vật không thông qua nuôi cấy Trong những năm gần đây

đã có rất nhiều công bố khai thác những gen mới, protein/enzyme mới của vi sinh vật nhờ kỹ thuật này Chính vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi đặt mục tiêu tìm kiếm gen mới mã hóa cho cytochrome P450 từ suối nước nóng Bình Châu – một trong những suối nước nóng có nhiệt độ nóng nhất tại Việt Nam với hy vọng sẽ tìm thấy P450 bền nhiệt mới bằng kỹ thuật không nuôi cấy Để thực hiện được mục tiêu này, chúng tôi đã thực hiện những nội dung nghiên cứu như sau:

- Thu nhận, tách chiết DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu, giải trình tự và xây dựng cơ sở dữ liệu về nhóm gen mã hóa cho P450

- Biểu hiện gen mã hóa P450 mới, tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất của P450 tái tổ hợp

- Nghiên cứu hệ thống truyền điện tử và xác định phổ cơ chất tiềm năng của enzyme thu được

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Hệ enzyme cytochrome P450

Cytochrome P450 (viết tắt là CYP hoặc P450) là các protein enzyme có chứa phân tử sắt, đã được phát hiện và nghiên cứu trên 55 năm nay Có thể nói, P450 là họ enzyme phân bố rộng rãi nhất, đa dạng nhất và có mặt trong tất cả các giới trong hệ thống sinh vật học, từ vi sinh vật đến thực vật, động vật và con người [1] Sở dĩ nhóm enzyme có tên gọi cytochrome P450 vì chúng có phổ hấp thụ cực đại ở bước sóng 450

nm khi bão hòa trong khí CO Các P450 là các monooxygenase bên ngoài, do đó, chúng cần một chất cho điện tử để khởi động quá trình oxi hóa và hydroxyl hóa cơ chất (Bernhardt, 2006) như sơ đồ phản ứng sau:

R H + O 2 + NAD(P)H + H +R OH + H 2 O + NAD(P) +

Số lượng các gen mã hóa cho các P450 ở tất cả các loài trong hệ thống sinh vật học hiện nay là khoảng hơn 37.000 trình tự được công bố trên Ngân hàng gen và số lượng này tiếp tục được tăng lên khi các nhóm nghiên cứu tìm ra được các gen P450 mới ở các loài sinh vật khác nhau Năm 2009, Nelson và cộng sự [2] đã tổng kết có khoảng 3282 gen P450 của động vật, 1015 gen P450 của vi khuẩn, 22 gen P450 của cổ khuẩn và 2 gen P450 từ virus thì hiện nay đã có 30171 gen P450 của động vật, 7606 gen P450 của vi khuẩn, 70 gen P450 của cổ khuẩn và 14 gen P450 của virus

Mặc dù có rất nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau nhưng cytochrome P450 có một vài hạn chế như độ ổn định kém, hoạt tính thấp [3], [4] Việc tìm ra cytochrome P450 bền nhiệt có thể cải thiện độ ổn định của enzyme này [5] Sự phân

bố rộng rãi của chúng trong tự nhiên là tiềm năng lớn cho việc khám phá và khai thác cytochrome P450 bền nhiệt từ các chủng vi sinh vật chịu nhiệt [6], [7] Lý do số lượng các P450 mới tiếp tục tăng lên nhanh chóng, thu hút sự tập trung nghiên cứu của các nhà khoa học là do nhóm enzyme này có khả năng ứng dụng rất rộng rãi trong các ngành công nghiệp, môi trường, y học, dược học, nông nghiệp khi chúng tham gia vào hơn 20 loại phản ứng xúc tác khác nhau bao gồm hydroxyl hóa các hợp chất hydrocarbon, các hợp chất vòng thơm, các hợp chất nitơ, dealkyl hóa các hợp chất nitơ, các hợp chất oxy, các hợp chất lưu huỳnh, epoxide hóa các hợp chất alkene, các hợp chất arene, oxy hóa các hợp chất nitơ, các hợp chất lưu huỳnh, các hợp chất alkyne, deamine oxy hóa, oxy hóa khử các hợp chất halogen, oxy hóa các hợp chất alcohol và aldehyde, dehydro hóa, dehydrate hóa, khử các hợp chất N-oxide, khử các hợp chất epoxide, khử NO, phân nhánh hóa và oxi hóa mối liên kết C-C… Tương ứng với sự đa dạng về chức năng xúc tác của các P450 là sự đa dạng về cơ chất của chúng, bao gồm các axit béo, các steroid, các prostaglandin cũng như các hợp chất khác như thuốc, thuốc mê, các dung môi hữu cơ, ethanol, các hydrocarbon alkylaryl, các chất trừ sâu và các chất gây ung thư [8]

1.1.1 Hệ enzyme cytochrome P450 ở vi sinh vật

Với các đặc trưng như tốc độ phản ứng nhanh hơn so với các P450 khác, có khả năng hòa tan nên các enzyme P450 của vi khuẩn thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhóm nhà khoa học vì có thể dựa vào hệ enzyme P450 của vi khuẩn để phát triển các mô hình chuyển hóa sinh học trong tự nhiên Cũng giống như các P450 của các giới sinh vật khác, P450 của vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa các cơ chất khác nhau như để sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong tái tạo môi trường, dược phẩm và nông nghiệp [9] Chính vì vậy, số lượng các P450 của vi sinh vật ngày càng tăng cao với khoảng hơn 1000 tên chú thích Trong

số các P450 của vi sinh vật thì P450cam (CYP101) từ loài Pseudomonas putida và P450BM3 (CYP102) từ loài B megaterium được nghiên cứu đầy đủ nhất P450cam

xúc tác cho quá trình hydroxyl hóa từ (+)-camphor thành 5-exo-hydroxy camphor với

sự tham gia của 2 enzyme trong chuỗi truyền điện tử là putidaredoxin reductase và putidaredoxin [10] trong khi P450BM3 có một chuỗi polypeptide đơn chứa đồng thời nhân sắt và enzyme khử (reductase) xúc tác quá trình hydroxyl hóa axit béo ω-2

Các xạ khuẩn thường mang các gen P450 thuộc CYPome (cytochrome P450 complement) tham gia vào các quá trình sinh tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh

học tự nhiên ứng dụng trong y dược (các loài thuộc giống Streptomyces) như các hợp

chất kháng sinh (erythromycin, vancomycin), các hợp chất kháng nấm (nystantin, amphotericin), hay hợp chất có tác dụng diệt sâu, côn trùng (avermectin) Các loài xạ khuẩn khác nhau có số lượng gen mã hóa cho các P450 khác nhau Ví dụ các loài myxobacteria tham gia vào quá trình chuyển hóa lipid, ứng dụng trong quá trình sản xuất các loại thuốc chống ung thư như epothilone có số lượng các gen P450 lớn và đa

dạng [11] trong khi loài xạ khuẩn Bifidobacterium longum chỉ có duy nhất một gen mã

hóa cho một P450 mà hiện nay chưa rõ chức năng [12]

Sự đa dạng của các P450 từ vi sinh vật trong quá trình tái tạo môi trường là rất

có ý nghĩa Bên cạnh sự tham gia của loài nấm trắng P chrysosporium, một số P450 của các sinh vật hoại sinh như Aspergillus oryzae, S coelicolor hay Mycobacterium smegmatis cũng tham gia vào quá trình này [13], [14] Malandain và cộng sự đã chứng

minh được khả năng phân hủy các chất phụ gia dầu mỏ như methyl tert-butyl ether, ethyl tert-butyl ether và tert-amyl butyl ether là do CYP249 từ các chủng thuộc giống

Rhodococcus và Gordonia[15] Một trong những vai trò quan trọng nữa của các P450

từ vi sinh vật là tham gia vào chu trình chuyển hóa nitơ CYP55, một loại enzyme của

nấm Fusarium oxysporum tham gia tích cực vào quá trình phản nitrite/nitrate hóa, do

đó nấm mốc được ghi nhận là một trong những nhân tố tích cực tham gia vào quá trình phản nitrite/nitrate hóa ở các vùng đồng cỏ, đất bán khô cằn hoặc đất rừng làm tăng độ màu mỡ của đất Gần đây, Pedrini và cộng sự [16] cho rằng các enzyme P450 của một

số chủng nấm như Beauveria bassiana tham gia quá trình tổng hợp các hợp chất phân

giải lớp biểu bì của côn trùng Lớp biểu bì này là hỗn hợp của các hợp chất lipid bao

gồm các alkane chuỗi dài, alkene, các ester sáp và các axit béo [16] Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm của hệ P450 từ vi sinh vật là xúc tác tổng hợp nên những hợp chất có hoạt tính sinh học có lợi cho con người, những enzyme này cũng tham gia vào

quá trình tổng hợp nên các độc tố Ví dụ CYP619 từ chủng nấm A clavatus xúc tác

quá trình tổng hợp patulin, là một loại độc tố vi nấm Patulin thường có trong táo bị thối rữa, và trong quá trình chế biến các sản phẩm từ táo, hàm lượng patulin được coi

là thước đo để đánh giá chất lượng táo nguyên liệu Patulin có khả năng kháng khuẩn nhưng cũng có độc tính gen, do đó có thể gây ung thư [17] Trong một ví dụ khác, Healy và cộng sự phát hiện ra quá trình sinh tổng hợp thaxtomin, một loại độc tố thực

vật gây bệnh đóng vảy ở khoai tây, có sự tham gia của P450 từ chủng S acidiscabies

trong giai đoạn hydroxyl hóa chuỗi dipeptide vòng thơm [18]

Việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của P450 từ vi sinh vật là cần thiết, tuy nhiên để có thể ứng dụng được hệ enzyme này trong công nghiệp hay trong tái tạo sinh học thì cần phải sử dụng hệ thống chuyển hóa bằng tế bào (whole cell

biotransformation) Một số các chủng nấm mốc như Penicillium citrinum, S carbophilus được sử dung để tổng hợp nên các hợp chất như mevastatin và hydroxyl hóa tiền chất này để tổng hợp nên Rất nhiều loài Candida spp có mang gen CYP52

nhưng không phải CYP52 nào cũng xúc tác sinh tổng hợp axit dicarboxylic Hiệu suất

quá trình tổng hợp axit ,ω-dicarboxylic của chủng C tropicalis ATCC 20336 được

nâng cao khi khóa con đường oxi hóa ở vị trí - Ưu điểm của quá trình chuyển hóa bằng tế bào là tận dụng luôn chất cho điện tử từ hệ thống tế bào để khởi động hoạt tính

xúc tác của P450 trong khi nếu sử dụng hệ thống chuyển hóa in vitro bên ngoài thì sẽ

phải bổ sung yếu tố này, do đó làm tăng giá thành chuyển hóa cũng như làm thay đổi tính đặc hiệu cơ chất, tính đặc hiệu ví trí hydroxyl hóa sản phẩm Hiện nay các kỹ thuật gen và protein được ứng dụng để nâng cao hiệu suất xúc tác của toàn bộ hệ thống

tế bào cũng như enzyme CYP101 và CYP102 là hai trong những P450 đầu tiên được nghiên cứu gây đột biến để nâng cao hiệu suất xúc tác của enzyme

Mặc dù số lượng các P450 của vi sinh vật không ngừng tăng lên, tuy nhiên các nhà khoa học dự đoán rằng rất nhiều P450 từ vi sinh vật vẫn đang tồn tại trong tự nhiên và chưa được khai thác, đặc biệt ở những vùng có hệ sinh thái môi trường cực trị

mà không thể thu nhận các vi sinh vật hoặc enzyme bằng cách nuôi cấy thông thường Những vùng sinh thái này là những nguồn gen từ tự nhiên để các nhà nghiên cứu tìm kiếm và khai thác các enzyme có tính chất mới hoặc xúc tác các quá trình chuyển hóa mới Viện Công nghệ sinh học biển Nhật Bản đã phát triển phương pháp “cassette PCR” để sàng lọc trình tự các gen mã hóa cho các hợp chất sinh học đích Phương pháp này cho phép thu nhận các đoạn DNA đích từ metagenome của môi trường và thiết kế các tổ hợp gen mã hóa cho protein đánh dấu để sàng lọc hoạt tính Kubota và

cộng sự [19] đã áp dụng phương pháp này để thu nhận 16 gen CYP153A mới từ nhiều

nguồn môi trường khác nhau như vùng đất nhiễm dầu, nước ngầm và chủng

Alcanivorax borkumesis SK2 Các gen CYP153A mới xúc tác quá trình hydroxyl hóa

không chỉ với cơ chất n-alkane mà còn với các cơ chất khác như cyclohexane, octene, n-butylbenzene Việc tìm ra các P450 từ những loài mới hoặc có tính chất mới tiếp tục thu hút sự nghiên cứu khai thác của các nhà khoa học thông qua các DNA metagenome Các P450 có tính chất tự xúc tác như P450BM3 là một trong những đối tượng được ưu tiên tìm kiếm bởi những ưu điểm vượt trội của chúng không cần bổ sung các enzyme trong chuỗi truyền điện tử khi tham gia chuyển hóa cơ chất Việc định hướng khai thác các gen mã hóa cho các P450 mới ở các vùng sinh thái khác nhau thông qua các DNA metagenome là cần thiết và cần tiếp tục có những nghiên cứu sâu hơn để đưa được các P450 có khả năng ứng dụng cao vào các quy trình sản xuất ở quy mô công nghiệp

1-1.1.2 Hệ thống truyền điện tử của P450

Vì các P450 là các monooxygenase bên ngoài, do vậy chúng cần chất cho điện

tử để khởi động chuỗi truyền điện tử và chuyển hóa cơ chất Năm 2007, Hannemann

và cộng sự đã chia hệ thống truyền điện tử của họ enzyme này thành 10 nhóm

(Hannemann et al., 2007), trong đó có 4 nhóm chính dựa trên cấu tạo và chức năng

của các yếu tố trong chuỗi truyền điện tử Nhóm I bao gồm hầu hết các hệ thống P450 của vi khuẩn và P450 ti thể của một số eukaryote Hệ thống này bao gồm 3 protein riêng rẽ: FAD chứa protein đóng vai trò khử (reductase) truyền điện tử từ NADH hoặc NADPH đến ferredoxin, rồi từ ferredoxin truyền đến P450 để chuyển hóa cơ chất Cả

3 protein đều là dạng hòa tan ở hệ thống P450 của vi khuẩn (Hình 1A) Ở hệ thống P450 ti thể, chỉ có ferredoxin là protein hòa tan trong mạng lưới ti thể trong khi reductase và P450 là các protein liên kết màng và protein thuộc màng trong của ti thể (Hình 1B) (Bernhardt, 1996 and 2006, Gunsalus and Sligar, 1978, Lambeth, 1991,

Hannemann et al., 2007)

Các P450 có hệ thống truyền điện tử thuộc nhóm II đại diện cho các P450 thuộc nhóm eukaryote Nhóm P450 này được ghi nhận có khả năng xúc tác đa dạng cho các loại phản ứng khác nhau Hệ thống monooxygenase của nhóm này được tìm thấy ở mạng lưới nội chất (ER) của tế bào eukaryote bao gồm hai protein liên kết màng: P450

và reductase phụ thuộc NADPH (Hình 1C) Reductase chứa cả nhóm FAD và FMN, đóng vai trò truyền điện tử từ NADPH tới một trong các isozyme của P450 (Hanukoglu, 1996)

Hình 1.1: Sơ đồ một số hệ thống truyền điện tử điển hình của các nhóm P450

A) Hệ thống P450 của vi khuẩn (Nhóm Ia); B) Hệ thống P450 ty thể (Nhóm Ib); C) Hệ thống P450 tế bào (Nhóm II); D) Hệ thống tự xúc tác CYP102A1 (Nhóm VIII)

(Bernhardt, 2006; Hannemann et al., 2007)

1.1.3 Hệ enzyme cytochrome P450 bền nhiệt ở vi sinh vật

Một trong số các tiêu chí đối với các enzyme triển khai ở quy mô công nghiệp

là tính bền, trong đó có tính bền nhiệt Tuy nhiên, sự không ổn định của các P450 trong các điều kiện sản xuất công nghiệp ở nhiệt độ cao, xúc tác trong sự có mặt của dung môi đã hạn chế những ứng dụng của hệ enzyme này ở quy mô sản xuất lớn [20] Chính vì vậy, việc tìm kiếm các P450 bền nhiệt từ tự nhiên hoặc gây đột biến định hướng để nâng cao tính bền nhiệt của các P450 đã biết đã được quan tâm nghiên cứu Các P450 bền nhiệt có thể được ứng dụng trong các quy trình sản xuất các hợp chất hữu cơ có giá trị Syed và cộng sự cho rằng độ bền nhiệt của enzyme cũng sẽ ảnh hưởng làm tăng độ bền của protein trong điều kiện pH cực trị hoặc có mặt của dung môi [21] Hơn nữa, sử dụng các P450 bền nhiệt còn có lợi thế trong việc xây dựng hệ thống chuyển hóa bằng 2 pha lỏng Các cơ chất của P450 bền nhiệt (thường là các hợp chất hữu cơ trong tự nhiên) có thể tương tác với các enzyme trong pha dung môi để chuyển hóa thành các sản phẩm khuếch tán sang pha nước Các sản phẩm này thường

là các hợp chất hữu cơ ưa nhiệt trong tự nhiên [22]

P450 bền nhiệt đầu tiên (CYP119) được phát hiện ở loài cổ khuẩn Sulfolobus solfataricus[23] Những nghiên cứu ban đầu về tính chất của enzyme này cho thấy

nhiệt độ biến tính toàn phần của nó xấp xỉ 90oC, cao hơn so với các loại P450 ưa ấm khác đã được công bố CYP119 có khả năng xúc tác phản ứng epoxide hóa styrene và

cis-stilbene cũng như hydroxyl hóa các axit béo [24], [25, p 119] Để giải thích cho

tính chất bền nhiệt của CYP119 ở mức độ phân tử, một số nghiên cứu đã xây dựng cấu trúc 3D của enzyme này và dựa đoán rằng sự gia tăng một số lượng lớn các tương tác giữa các axit amin vòng thơm và các cầu liên kết muối là nguyên nhân dẫn đến độ bền

nhiệt của protein Tuy nhiên việc dự đoán chi tiết về các tương tác trong phân tử enzyme chỉ dựa vào cấu trúc 3D của nó gặp rất nhiều khó khăn và thường không chính xác vì độ tương đồng giữa các P450 là rất thấp Năm 2000, Yano và cộng sự đã kết tinh được protein CYP119 và xác định được cấu trúc tinh thể của enzyme này bằng phương pháp tia X So sánh cấu trúc của CYP119 và năm cấu trúc của P450 ưa ấm khác cho thấy độ bền nhiệt của CYP119 là chủ yếu là do sự gia tăng một số lượng lớn các tương tác giữa các axit amin vòng thơm và các cầu liên kết muối Kết luận này cũng tương tự như dự đoán của nhóm McLean và nhóm Chang khi xây dựng cấu trúc 3D của protein [26] Sau đó, Maves và Sligar tiếp tục nghiên cứu tạo ra thư viện các thể đột biến ngẫu nhiên CYP119 và sàng lọc các thể đột biến có độ bền nhiệt thấp hơn CYP119 nguyên bản Từ đặc điểm phân tử của các thể đột biến và enzyme nguyên bản, nhóm nghiên cứu thấy rằng độ bền nhiệt của CYP119 chủ yếu do các tương tác tĩnh điện bao gồm các tương tác giữa các cầu muối, tương tác giữa các ion mang điện tích kết hợp với các yếu tố ảnh hưởng khác như sự gia tăng một số lượng lớn tương tác giữa các axit amin vòng thơm dẫn đến tăng thể tích các chuỗi bên của các axit amin kỵ nước [27]

Cho đến nay, chỉ có 5 enzyme P450 bền nhiệt thu nhận từ các chủng cổ khuẩn phân lập được ngoài tự nhiên bao gồm CYP119A1, CYP119A2, CYP175A1,

CYP231A2 và CYP154H1 được công bố [28] Ngoài CYP119 từ S solfataricus, CYP175A1 từ Thermus thermophilus HB27 là enzyme P450 bền nhiệt thứ hai được

phát hiện và ghi nhận là P450 đầu tiên có khả năng hydroxyl hóa -carotene [29] Nhiệt độ biến tính toàn phần của CYP175A1 là 88oC trong khi nhiệt độ biến tính toàn phần của các P450 ưa ấm chỉ dao động từ 47-61oC Nghiên cứu cấu trúc tinh thể của enzyme này cho thấy mặc dù mức độ tương đồng của enzyme này với các P450 khác rất thấp nhưng vẫn tồn tại các vùng bảo thủ Cấu trúc CYP175A1 thiếu hẳn một mạng lưới cấu trúc vòng thơm lớn như ở cấu trúc của CYP119 Ngoài ra, thể tích thực của protein CYP119 nhỏ hơn so với các P450 ưa ấm khác, các vòng (loop) và các vùng nối giữa các tiểu phẩn enzyme ngắn hơn Các yếu tố này có thể là nguyên nhân dẫn đến tính bền nhiệt của CYP175A1

Từ những kết quả nghiên cứu trên Thế giới có thể thấy rằng số lượng các P450 bền nhiệt từ các nhóm vi sinh vật vẫn còn khá hạn chế mặc dù có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp rất lớn Chính vì thế việc tìm kiếm, khai thác để thu nhận, nghiên cứu cấu trúc, tính chất và ứng dụng các P450 bền nhiệt mới từ tự nhiên là cần thiết và

có ý nghĩa

1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450

Các P450 có thể tham gia xúc tác rất nhiều loại phản ứng sinh hóa khác nhau,

do đó ứng dụng của họ enzyme này rất rộng rãi Một trong những ứng dụng thành công nhất của họ enzyme P450 ở quy mô công nghiệp là quá trình tổng hợp

pravastatin của công ty Daiichi-Sankyo Co Ltd (Nhật Bản) Pravastatin là loại thuốc chống tăng lipid máu thuộc nhóm chất ức chế HMG - CoA reductase, có tác dụng ức chế tổng hợp cholesterol, làm giảm cholesterol trong gan, kích thích tổng hợp thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL), và làm tăng vận chuyển LDL từ máu, do đó làm giảm hàm lượng cholesterol trong huyết tương Hiện nay loại thuốc này được sử dụng để điều trị mỡ máu cho hàng triệu bệnh nhân ở hơn 100 quốc gia Quá trình tổng hợp pravastin từ compactin bằng cách hydroxyl hóa ở vị trí 6 được xúc tác bởi enzyme

CYP105A3 (P450sca-2) của chủng Streptomyces carbophilus[30]

Quá trình gắn nhóm hydroxyl vào cơ chất của họ enzyme P450 thường dẫn đến việc thay đổi tính chất của cơ chất như thay đổi tính hòa tan, tính đặc hiệu và độc tính

Do vậy họ enzyme này thường được sử dụng để tổng hợp các hợp chất hữu cơ khó thu nhận bằng con đường hóa học hoặc để phân giải các chất hữu cơ khó phân hủy ngoài môi trường ô nhiễm Một ví dụ khác về sự ứng dụng của enzyme CYP trong công nghiệp là quá trình chuyển hóa vitamin D3 thành 1α,25-dihydroxyvitamin D3 (1α,25(OH)2D3) nhờ sự xúc tác của một số loại P450 (1α,25(OH)2D3) được sử dụng trong điều trị các bệnh cường giáp, bệnh xốp xương, suy thận mãn Nếu sản phẩm này được tổng hợp bằng con đường hóa học thì phải tiến hành qua khoảng 20 bước để thu nhận (1α,25(OH)2D3), hơn nữa hiệu suất của quá trình lại rất thấp Chính vì vậy vậy việc tìm cách sinh tổng hợp đơn giản –chỉ qua một bước xúc tác đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học Sasaki và cộng sự đã thiết lập hệ thống chuyển hóa 25- và 1-hydroxyvitamin D3 thành 1α,25(OH)2D3 nhờ chủng

Streptomyces sp [31], chuyển hóa vitamin D3 thành 1α,25(OH)2D3 từ 25(OH)D3 nhờ

xúc tác của enzyme vitamin 25-hydroxylase của chủng Amycolata sp [32] hay của chủng A.autotrophica, sau này được phân loại lại là chủng Pseudonocardia autotrophica[33] Gần đây, P450VD25 (CYP105A2) tái tổ hợp ở tế bào S lividans, CYP105A1 từ chủng S griseolus[34, p 450] và CYP107 [35] được ghi nhận có hoạt

tính 25-hydroxylase và hiện nay đang được sử dụng để sản xuất 1α,25(OH)2D3 ở quy

mô công nghiệp sau khi gây đột biến để nâng cao hoạt tính xúc tác

Steroid, các dẫn xuất steroid là các sản phẩm có ý nghĩa trong dược phẩm cũng được quan tâm nghiên cứu Hiện nay quá trình sản xuất các steroid công nghiệp được phối hợp giữa con đường tổng hợp hóa học và chuyển hóa sinh học nhờ các enzyme trong họ P450 xúc tác Ví dụ cortisol hiện nay được tổng hợp từ 11-deoxycortisol nhờ xúc tác hydroxyl hóa của P450lun ở vị trí 11β- Công ty Schering AG (CHLB Đức) hiện nay là một trong những công ty lớn nhất sản xuất steroid cortisol từ những tế bào

cố định hệ sợi chủng Curvularia lunata mang gen P450lun với năng suất khoảng 100

tấn/năm Ngoài ra, một loạt các P450 trong cơ thể người cũng đóng vai trò xúc tác trong con đường chuyển hóa steroid, từ cholesterol thành cortisol như CYP11A1, CYP17A1, CYP21A2 (hoặc CYP21B2) và CYP11B1 [36] Năm 2012, Nguyen và

cộng sự đã biểu hiện thành công thể đột biến CYP106A2 từ chủng B

megateriumATCC 13368 để sản xuất dẫn xuất 11-hydroxyprogesterone có tác dụng

điều trị các rối loạn nội tiết tố nữ hoặc sử dụng trong thuốc tránh thai, hoặc kết hợp điều trị bệnh vảy nến… [37]

Bên cạnh các hợp chất steroid, các P450 của vi khuẩn cũng được sử dụng để xúc tác quá trình tổng hợp các hợp chất như axit epoxyeicosatrienoic, leukotoxin B và các epoxide eicosanoid khác [38] Một số kháng sinh như tetracenomycin hay erythromycin được tổng hợp cũng có sự tham gia xúc tác của P450eryF (CYP107) Tương tự như vậy, Jennewein và cộng sự đã chứng minh được một số P450 của thực vật tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các taxol – hợp chất chống ung thư hiện nay đang được sử dụng trong các phác đồ hóa trị liệu [39] Tuy nhiên việc nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp cũng như tách chiết các hợp chất có khả năng chống ung thư từ vi sinh vật các sản phẩm tự nhiên cũng gặp nhiều thách thức, do đó các sản phẩm này hiện nay chủ yếu được thu nhận bằng con đường bán tổng hợp hóa học

Các hợp chất terpene oxy hóa được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm (tạo hương vị thực phẩm) hoặc mỹ phẩm (nước hoa) cũng thu hút sự nghiên cứu của các nhóm Các enzyme xúc tác quá trình hydroxyl hóa ở các vị trí carbon khác nhau của các hợp chất terpene chủ yếu thuộc họ P450 Việc tổng hợp các hợp chất này bằng con đường hóa học rất khó khăn do sự tương đồng cao về mặt điện tích trong cấu trúc bậc 1 và bậc 2 của các nhóm allyl và thường dẫn đến các sản phẩm epoxide phụ

Bên cạnh những ứng dụng của họ P450 trong các con đường chuyển hóa sinh học, nhóm enzyme này còn được ứng dụng rộng rãi trong việc làm nguyên liệu để sản xuất biosensor Năm 2003, Joseph và cộng sự đã phát triển biosensor có gắn enzyme CYP3A4 lên điện cực âm trong khi gắn các thành phần khác trong chuỗi truyền điện

tử của nó lên điện cực dương để tìm kiếm và sàng lọc một số loại thuốc là cơ chất đặc hiệu của CYP3A4 [40] Sau đó, năm 2009, Mie và cộng sự đã phát triển phương pháp xác định nồng độ thuốc trong huyết tương bằng biosensor có gắn enzyme P450 Thông thường, các xét nghiệm về nồng độ thuốc trong huyết tương được tiến hành bằng các

kỹ thuật hiện đại như GC-MS hoặc LC-MS có chi phí cao và mất nhiều thời gian Do vậy, việc xác định bằng biosensor có nhiều ưu điểm hơn ở chỗ phương pháp này cho phép xác định nồng độ thuốc trong thời gian ngắn ở mức chi phí thấp (do phương pháp không đòi hỏi phải có enzyme tinh khiết và việc chuẩn bị các điện cực rất đơn giản, thuận tiện) Phương pháp biosensor cũng có thể mở rộng phạm vi áp dụng để xác định khả năng chuyển hóa các hợp chất trong tế bào do xúc tác của họ P450 như cholesterone, 25-hydroxyvitamin D3 và các axit béo

Một trong những ứng dụng quan trọng nhất của họ P450 là tái tạo các môi trường bị ô nhiễm Không khí, nước và đất chủ yếu bị ô nhiễm bởi các hợp chất như các hydrocarbon đa vòng thơm (PAH), polychlorinated dibenzo-p-dioxin (PCDD) và polychlorinated biphenyl (PCB) [41], [42] Hiện nay, các enzyme như angular

dioxygenase, P450, lignin peroxidase, và dehalogenase được sử dụng để chuyển hóa các hợp chất dioxin hoặc các ứng dụng khác như phân giải các hợp chất lignin ứng dụng trong chuyển hóa sinh khối Các P450 của động vật như CYP1A1, CYP1A2, và CYP1B1 được chứng minh có khả năng phân giải các hợp chất PAH [43]–[45] Hơn

thế nữa, các chủng tái tổ hợp như Saccharomyces cerevisiae, Basidiomycetes, Dehalococcoides và các chủng Rhodococcus sp biểu hiện các thể đột biến của gen CYPA1 còn có khả năng phân giải cả các hợp chất Tuy nhiên, đối với các hợp chất PCB, hiện nay chỉ có gen CYP2B11 của chó được ghi nhận có khả năng phân giải các hợp chất này Chủng nấm trắng Phanerochaete chrysosporium được chứng minh có

khả năng phân giải các hợp chất DD, 2,7-DCDD, và 2,3,7,8-TCDD Phân tích cơ sở

dữ liệu về hệ gen của P chrysosporium cho thấy có tất cả 148 gen P450 và có lẽ chính

vì vậy các P450 của chủng nấm này có khả năng phân giải các hợp chất PCDD

Trong nông nghiệp, việc sử dụng các thuốc diệt cỏ và thuốc trừ sâu là cần thiết

để nâng cao năng suất cây trồng Tuy nhiên, việc lạm dụng các loại thuốc này dẫn đến những tồn dư của chúng trong đất, nước ngầm và không khí, do đó gây những bất lợi tiềm tàng cho chính cây trồng và vật nuôi, môi trường, và sức khỏe con người Một số P450 của vi khuẩn và thực vật có khả năng chuyển hóa các loại thuốc này từ dạng độc

thành dạng không độc như CYP73A1, CYP76B1 từ cây cúc vu (Helianthus tuberosus

L), CYP71A11 từ cây thuốc lá và CYP71A10 từ đậu tương [46] Quá trình tẩy các chất độc trong môi trường ô nhiễm có thể được tiến hành bằng cách cố định các enzyme CYP lên các bề mặt đất, nước Gần đây, các nhóm nghiên cứu về công nghệ tế

bào thực vật cũng đã chuyển một số gen P450 như CYP1A1, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19 vào một số loại cây để tái tạo môi trường ô nhiễm chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu

bằng thực vật (phytoremediation) Ví dụ như cây lúa chuyển gen CYP2C9-57R2 có khả năng kháng hợp chất sulfonylureas, trong khi cây lúa chuyển gen CYP2C19-12R1 không chỉ kháng lại sulfonylureas mà còn kháng được một số chất diệt cỏ như atrazine, norflurazon và metolachlor [47] Rylott và cộng sự đã biểu hiện gen P450

xp1A có khả năng phân giải cyclotrimethylenetrinitramine (RDX) ở Arabidopsis thaliana Cây chuyển gen này có khả năng mọc được trên môi trường nhiễm RDX, tạo

ra các rễ và chồi non to hơn so với các cây tự nhiên [48]

1.2 Kỹ thuật metagenomictrong quá trình khai thác các gen mới

Kỹ thuật metagenomic được sử dụng lần đầu tiên bởi Jo Handelsman và cộng

sự [49] Metagenomic đươ ̣c đi ̣nh nghĩa là mô ̣t ứng du ̣ng của kỹ thuâ ̣t di truyền hiê ̣n đa ̣i

để nghiên cứu một hệ sinh thái vi sinh vật trực tiếp từ môi trường sống mà không cần phân lâ ̣p riêng rẽ các chủng như các kỹ thuâ ̣t truyền thống , là phương pháp phân tích

hệ gen của một quần xã vi sinh vật Cũng giống như kỹ th uâ ̣t DGGE , metagenomic đươ ̣c áp du ̣ng để tìm những nguồn di truyền phong phú , là cơ sở để phát hiện ra các gen mới, enzyme hoă ̣c các sản phẩm mới trong tự nhiên Ngoài ra, nó cũng được sử dụng để đánh giá những tác động của ô nhiễm lên các hê ̣ sinh thái hay làm sa ̣ch các

chất đô ̣c ha ̣i tồn đo ̣ng ở môi trường Mô ̣t khi lợi nhuâ ̣n từ viê ̣c tổng hợp ra các enzyme xúc tác vẫn tiếp tục tăng thì ảnh hưởng của metagenomic lên sự phát triển của các ngành sinh ho ̣c, nông ho ̣c, hóa học, dược ho ̣c là rất lớn

Hầu hết sản phẩm sinh học tự nhiên được thu từ các chủng vi sinh vật có thể phân lập và nuôi cấy được trong phòng thí nghiệm Mặc dù số lượng vi sinh vật có thể phân lập được ngày càng tăng do sự xuất hiện những kỹ thuật nuôi cấy mới [50] nhưng

số lượng những loài này vẫn là rất nhỏ so với ước tính Kết quả phong phú thu được từ việc nghiên cứu các vi sinh vật không nuôi cấy được bằng kỹ thuật metagenomic có tiềm năng to lớn trong sự phát triển các chất xúc tác sinh học mới [51] Dellagnezze và cộng sự đã thu nhận được một số dòng gen từ DNA metagenome giàn khoan dầu khí

để đánh giá khả năng phân hủy một số hợp chất dầu mỏ như các n-alkane (từ C14 đến C33), isoprenoid (phytane và pristine) cũng như phân hủy các hợp chất vòng thơm phenanthrene và methylphenanthrenes của chúng Kết quả cho thấy tiềm năng sử dụng các dòng gen này để phân hủy một số hợp chất dầu mỏ, làm sạch môi trường biển tại khu vực giàn khoan [52]

Kỹ thuật metagenomic nghiên cứu metagenome quần xã sinh vật thông qua ba bước chính, bao gồm: (i) tách chiết nucleic acid từ mẫu thu thập; (ii) thiết lập thư viện metagenome hoặc giải trình tự DNA metagenome sử dụng thiết bị giải trình tự thế hệ mới; (iii) phân tích, sàng lọc gen bằng các kỹ thuật tin sinh học hoặc phân lập gen dựa vào số liệu giải trình tự, qua đó tạo tiền đề cho việc tách dòng và biểu hiện gen [53] Metagenomics tạo ra dữ liệu khổng lồ của metagenome đang mở ra rất nhiều hướng khai thác trong cả nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng Các bộ dữ liệu metagenome chỉ có thể được phân tích hiệu quả khi sử dụng các công cụ tin sinh học

1.3 Khai thác DNA metagenome bằng công cụ tin sinh

Tin sinh học là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ của ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê, khoa học máy tính và toán sinh học để giải quyết các vấn đề sinh học Trong những năm gần đây, thiết bị giải trình tự thế hệ mới (NGS) cùng với sự phát triển của phương pháp metagenomic đã cách mạng hóa lĩnh vực nghiên cứu hệ sinh thái vi sinh vật Lượng dữ liệu metagenomic được tạo ra ngày càng lớn kéo theo sự ra đời của những công cụ tin sinh học cho phép xử lý dữ liệu loại này [54] Tương ứng với từng công nghệ đọc trình tự là các phương pháp xử lý dữ liệu do công nghệ đó tạo ra [55] như loại bỏ dữ liệu chất lượng kém trước khi phân tích, loại

bỏ nhiễu trong quá trình giải trình tự Các bài toán đặc trưng của tin sinh học trong xử

lý dữ liệu metagenomic bao gồm xác định mức độ đa dạng sinh học, lắp ráp những trình tự DNA chất lượng cao từ những đoạn DNA ngắn, dự đoán và chú giải gen trong

dữ liệu tổng thể

Trong kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới, DNA được cắt ra nhiều đoạn nhỏ Do

đó, bước đầu tiên khi tiến hành phân tích là lắp ráp dữ liệu nhằm tại tạo lại hệ gen ban

đầu của vi sinh vật [56] Quá trình và thuật toán lắp ráp phụ thuộc nhiều vào loại thiết

bị giải trình tự Các phương pháp giải trình tự hiện nay tạo ra lượng dữ liệu lớn hơn nhưng độ dài đoạn đọc ngắn hơn và tỉ lệ lỗi cũng cao hơn phương pháp Sanger truyền thống [57] điều này gây ra nhiều khó khăn trong quá trình lắp ráp Để khắc phục những khó khăn này, hầu hết các thuật toán lắp ráp hiện này đều dựa trên đồ thị De Bruijin [58]

Bước khởi đầu trong việc định danh loài hoặc một cá thể là việc giải trình tự, lắp ráp hệ gen và phân tích của có thể đó Hệ thống giải trình tự thế hệ mới đang có mặt trên thị trường, tất cả đều thể hiện một vài đặc tính quan trọng khiến chúng khác biệt đối với các hệ thống giải trình tự thế hệ cũ Máy giải trình tự thế hệ mới tạo ra các đoạn trình tự đọc ngắn thông qua các phản ứng tổng hợp song song và tạo ra một lượng lớn dữ liệu trong mỗi thí nghiệm, bên cạnh đó còn giảm đáng kể chi phí giải trình tự Tuy nhiên, các đoạn đọc do các hệ thống này tạo ra ngắn hơn rất nhiều so với

hệ máy đầu tiên, nên cần độ bao phủ cao hơn để thỏa mãn tiêu chí xác định bằng sự chồng lặp Tất nhiên sự bao phủ cao sẽ dẫn đến lượng dữ liệu lớn hơn, sự phức tạp

theo đó cũng tăng lên Thuật toán lắp ráp de novo và các ứng dụng của nó đang được

xây dựng để đáp ứng các thách thức tồn tại đối với dữ liệu giải trình tự mới Rất nhiều

thuật toán lắp ráp de novo đã được thực thi, mỗi loại có những tiên đề, điểm mạnh yếu

riêng Mỗi chương trình lắp ráp mang tính chất đặc thù riêng, tuy nhiên chúng đều có

cơ sở chung và tất cả đều giải quyết sự phức tạp của dữ liệu giải trình tự thế hệ mới

Hình 1.2: Quy trình xây dựng và phân tích hệ gen từ dữ liệu giải trình tự

Giải trình tự gen thế hệ mới tạo ra một lượng dữ liệu khổng lồ, gia tăng sự phức tạp trong việc tính toán lắp ráp theo dung lượng dữ liệu Nhiều chương trình lắp ráp quản lý lượng lớn dữ liệu dưới dạng K-mer K-mer là một tập hợp các base với độ dài

là K với K là số dương bất kỳ Thay vì tìm kiếm các đoạn trùng, các công cụ lắp ráp tìm kiếm các đoạn đọc có chung K-mer, bởi việc tìm K-mer chung sẽ dễ dàng hơn việc tìm các đoạn lặp Thuật toán tìm K-mer có độ phức tạp cao hơn thuật toán tìm đoạn trùng lặp tuy nhiên thuật toán này lại có độ nhạy cao hơn

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Vật liệu

- Mẫu nước thu từ suối nước nóng Bình Châu

2.1.2 Vi sinh vật

- Chủng Escherichia coli TOP10F‟ (sử dụng trong thí nghiệm nhân dòng gen)

- Chủng Escherichia coli C43(DE3) (sử dụng trong thí nghiệm biểu hiện gen)

- Chủng Escherichia coli BL21(DE3) (sử dụng trong thí nghiệm biểu hiện gen)

- Chủng Escherichia coli JM109(DE3) (sử dụng trong thí nghiệm biểu hiện

Môi trường SOC (g/L)

Bacto Tryptone 20 Cao nấm men 5

Sau khi khử trùng bổ sung 20 ml dung dịch glucose 1M vô trùng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử

2.2.1.1 Tách chiết DNA metagenome

Quá trình tách chiết và tinh sạch DNA metagenome từ hệ vi sinh vật ở suối nước nóng Bình Châu được tiến hành như sau: Khoảng 500 L nước đã được bơm trực tiếp từ điểm phun của suối nước nóng Bình Châu vào bể chứa vô trùng Khi nhiệt độ nguội xuống khoảng 30oC, thực hiện lọc qua phin lọc Ultrafilter (UF – Westerntech, Việt Nam) với kích thước lỗ 0,1 m, áp suất lọc 1,5 kgf/cm2 Toàn bộ “cặn” của quá trình lọc được giữ trong lõi lọc sau đó được chuyển sang bình Scott vô trùng Tiến hành lọc lần 2 bằng hệ thống lọc hút chân không (Millipore) qua giấy lọc với kích thước lỗ 0,2 m Thu mẫu giấy lọc và chuyển vào PowerWater® Bead Tube (MO BIO).Quy trình tách chiết sau đó được thực hiện theo kit PowerWater® DNA Isolation

DNA metagenome được kiểm tra chất lượng bằng cách chạy điện di trên gel agarose 0,8% Nồng độ và độ tinh sạch DNA được xác định trên máy quang phổ NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) ở bước sóng 260 và 280 nm Nồng độ DNA được tính theo công thức:

Nồng độ DNA (μg/ml) = A260× f × xε

Trong đó:

A260: Độ hấp phụ ở bước sóng 260 nm

f: Hệ số pha loãng

xε: Hệ số hấp phụ của sợi kép DNA ở bước sóng A260 = 50 μg/ml

Độ tinh sạch của DNA được đánh giá thông qua tỷ lệ A260/A280 Protein được coi là sạch, đủ chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo khi tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8 ÷ 2,0

2.2.1.2 Giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu

DNA metagenome của khu hệ vi sinh vật ở suối nước nóng Bình Châu được gửi

đi giải trình tự bằng thiết bị giải trình tự thế hệ mới Hiseq Illumina tại công ty BGI (Hongkong) Dữ liệu sau khi đọc trình tự sẽ được lưu ở dạng file fasstq

2.2.1.3 Thiết kế mồi

Các cặp mồi khuếch đại gen được thiết kế dựa trên cơ sở dữ liệu bao gồm trình

tự các gen mã hóa cytochrome P450 bền nhiệt đã của khu hệ vi sinh vật suối nước nóng Bình Châu Cặp mồi phù hợp cần đạt các tiêu chí sau:

 Bám một cách chính xác vào DNA mẫu

 Chiều dài cặp mồi phù hợp, thường từ 18 – 30 nucleotide

 Tỉ lệ %GC phù hợp, thường từ 50 – 60%

 Tránh hình thành dạng xoắn cặp tóc, cặp mồi tránh bắt cặp với nhau

 Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm nhỏ hơn nhiệt độ của Taq polymerase, thường nằm trong khoảng 50 – 60oC

Các cặp mồi được tổng hợp tại công ty sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ) Danh sách các cặp mồi được trình bày tại Phụ lục 3

2.2.1.4 Khuếch đại gen P450-T2

Đoạn khung đọc mở của gen nhân tạo P450-T2 được khuếch tại từ vector

pUC19 mang đoạn gen này

Thành phần phản ứng cho tổng thể tích 50 µl như sau:

5X Phusion HK Buffer 10 µl Mồi 35152f (10 pmol) 2 µl Mồi 35152r (10 pmol) 2 µl Khuôn pUC19-T2 (10 ng) 2,5 µl

Sản phẩm PCR chạy kiểm tra trên gel agarose 0,8% và được làm sạch theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất Kit GeneJET PCR Purification (Thermo Fisher Scientific)

2.2.1.5 Chuẩn bị tế bào Escherichia coli khả biến xung điện

Một khuẩn lạc E coli mới được hoạt hóa lại trên đĩa môi trường LB thạch được

lựa chọn để cấy vào 10 ml môi trường LB lỏng Nuôi vi khuẩn qua đêm ở 37oC với tốc

độ lắc 200 vòng/phút Hôm sau, dịch tế bào được chuyển vào bình tam giác thể tích 2

L chứa 1 L môi trường LB với tỷ lệ giống 1% và tiếp tục nuôi ở 37oC, lắc 200 vòng/phút cho đến khi OD600 đạt 0,4-0,6 Đặt bình nuôi tế bào vào đá 15 phút trước khi ly tâm thu tế bào ở tốc độ 4000 vòng/phút, 4oC trong 15 phút Cặn tế bào được rửa sạch trong nước cất vô trùng lạnh 2 lần và trong 20 ml dung dịch 10% glycerol lạnh

Ly tâm thu cặn tế bào ở tốc độ 4000 vòng/phút, 4oC trong 15 phút Hòa cặn tế bào vào 1,5-2 ml dung dịch 10% glycerol và chia vào các ống eppendorf vô trùng, mỗi ống 50

µl dịch Làm đông tế bào đột ngột trong nitơ lỏng và bảo quản tế bào ở -80oC cho đến khi sử dụng

Tế bào khả biến được kiểm tra sự tạp nhiễm và tính khả biến với vector pUC19 nguyên bản (Novagen)

2.2.1.6.Tạo vector biểu hiện pET17b gắn đoạn gen P450-T2 (pET17b-T2)

Vector pET17b (Novagen) mang T7 promoter ở đầu N, vùng tạo dòng, T7

terminator, pBR322 origin được cắt mở vòng với hai enzyme giới hạn HindIII và NdeI

(NEB) và loại gốc phosphate với CIP (NEB) Thành phần phản ứng mở vòng như sau:

Mặt khác, sản phẩm khuếch đại gen trong mục 2.2.1.4 cũng được cắt tạo đầu

dính với 2 enzyme tương ứng Hind IIIvà NdeI (NEB) Làm sạch đoạn gen bằng Kit

GenJET Gel extraction (Thermo Fisher Scientific)

Đoạn gen P450-T2 được gắn vào vector pET17b đã mở vòng tại 2 vị trí HindIII

và NdeI bằng Kit Fast Link DNA ligation (Epicenter) với thành phần phản ứng như

Hỗn hợp được ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng (22-25oC) trước khi bất hoạt enzyme

ở 70oC trong 15 phút

2.2.1.7.Biến nạp vào E coli bằng phương pháp xung điện

Hỗn hợp gắn ở mục 2.2.1.6 (3 µl) được trộn vào tế bào khả biến E coli

TOP10F‟ và để trên đá 5-10 phút Đồng thời các cuvette cũng được đặt trên đá Chuyển dịch tế bào trộn hỗn hợp gắn vào cuvette và tiến hành xung điện ở điện thế 1800-2000V Phục hồi tế bào trong 1 ml môi trường SOC, lắc trong 1 giờ ở 37oC Dịch biến nạp sau đó được cấy trải (100 µl) trên đĩa môi trường LB có bổ sung ampicillin (100 µg/ml)

2.2.1.8.Chọn lọc dòng E coli mang vector pET17b-T2

Khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường LB (sản phẩm mục 2.2.1.7) được tách sạch

và nuôi riêng rẽ trên môi trường LB lỏng có kháng sinh qua đêm ở 37oC Tách plasmid bằng Kit GeneJET Plasmid miniprep (Thermo Fisher Scientific) và cắt kiểm tra bằng

hai enzyme giới hạn HindIII và NdeI Sản phẩm cắt kiểm tra được chạy điện di trên gel

agarose 0,8% Những dòng plasmid nào có xuất hiện hai băng (kích thước tương ứng khoảng hơn 3000 bp và 1000 bp) thì được giữ lại và gửi đi đọc trình tự gen tại Phù sa Biochem Ltd

Các dòng có trình tự gen đảm bảo đủ và đúng bộ ba mã hóa từ promoter đến mã khởi đầu của gen P450-T2 được bảo quản ở -20oC cho thí nghiệm tiếp theo

2.2.1.9.Biểu hiện gen P450-T2

Dòng plasmid pET17b-T2 đã xác định trình tự đảm bảo đủ và đúng mã di

truyền sẽ được biến nạp vào các tế bào E coli BL21(DE3), JM109(DE3) và C43(DE3)

bằng phương pháp xung điện (như mục 2.2.1.7)

Các dòng tế bào E coli tái tổ hợp ban đầu được nhân trong bình tam giác chứa

môi trường LB bổ sung ampicillin (100 µg/ml) ở 37oC qua đêm làm giống Chuyển 1% giống vào môi trường TB và tiếp tục lắc ở 37oC trong 3-4h cho đến khi OD600 đạt 0,8 – 1 thì bổ sung 1 mM IPTG và 0,5 mM -amino levulinic acid và hạ nhiệt độ xuống 30oC Sau 48 giờ, ly tâm thu cặn tế bào và bảo quản cặn tế bào ở -20oC cho thí nghiệm sau

2.2.2 Các phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Tinh sạch protein P450-T2 tái tổ hợp

Cặn tế bào được rã đông và được hòa tan trong 50 ml đệm A (50 mM Kpi pH 7,4; 500 mM Na-acetate; 0,1 mM EDTA; 1,5% Na-Cholate; 0,1 mM PMSF và 0,1

mM DTE) Tế bào sau đó được phá bằng sóng siêu âm trong 15 phút Dịch phá tế bào được ly tâm ở 35.000 vòng/phút trong 30 phút để thu dịch thô enzyme Xác định nồng

độ của enzyme tái tổ hợp theo phương pháp của Omura và Sato [59]

Cột sắc ký IMAC-Ni2+ được cân bằng bằng đệm B (50 mM Kpi pH 7,4; 500

mM Na-acetate; 1% Na-Cholate; 0,1 mM PMSF và 0,1 mM DTE) Đưa mẫu enzyme thô vào cột và rửa bằng 50 ml đệm B Tiếp tục rửa bằng 50 ml đệm C (50 mM Kpi pH 7,4; 0,1 mM EDTA; 1% Na-Cholate; 0,1 mM PMSF và 0,1 mM DTE; 0,1 mM ATP) Protein tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột bằng đệm D (50 mM Kpi pH 7,4; 400 mM Imidazol AcO; 1% Na-Cholate; 0,1 mM PMSF và 0,1 mM DTE) thành các phân đoạn (2 ml/phân đoạn) với tốc độ 1 ml/phút

Các phân đoạn được đo quang phổ UV-Vis từ bước sóng 700 đến 200 nm Thu nhận các phân đoạn có tỉ lệ A417/A280 từ 1,6-1,8 Các phân đoạn được lựa chọn sẽ được hòa chung, loại imidazol bằng phương pháp thẩm tích và cô lại đến thể tích mong muốn bằng Centriprep 30 kDa Mẫu protein tinh sạch được kiểm tra trên bản điện di SDS-PAGE và xác định nồng độ cytochrome P450

2.2.2.2 Điện di SDS-PAGE

Điện di SDS-PAGE được thực hiện theo phương pháp của Laemmli[60] Gel được chuẩn bị làm 2 pha

Pha 1 (pha phân tách) được chuẩn bị thành phần như sau:

Dung dịch gốc Nồng độ acrylamid cuối cùng10%

Hỗn hợp thành phần pha 1 được đổ cẩn thận vào khoảng giữa 2 lớp kính Bổ sung nước cất đến tràn mặt kính và chờ quá trình polymer hóa gel ở nhiệt độ phòng Loại bỏ lớp nước phía trên để đổ pha 2 (pha gom) lên phía trên bản gel Pha 2 được chuẩn bị như sau:

Dung dịch gốc Nồng độ bis acrylamide 5%

Sau khi chạy điện di, bản gel được tháo rời khỏi hai lớp kính và được nhuộm với dung dịch nhuộm xanh coomasie (0.1% Coomassie Brilliant Blue G-250; 40% Methanol; 10% Acetic acid) trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng Quá trình tẩy màu sau đó được thực hiện với dung dịch tẩy (25% Methanol; 10% Acetic acid) 2-3 lần cho đến khi nhìn rõ các vạch protein trên bản gel Bản gel cuối cùng được làm khô bằng máy Model 583 gel dryer (BioRad) nhằm bảo quản

Nồng độ cytochrome P450 được xác định bằng máy đo quang phổ Difference được tính toán bằng công thức ε(459–490) =91 mM-1 cm-1 dựa theo phương pháp của Omura and Sato [59] Phổ UV-vis của cytochrome P450 được ghi lại ở nhiệt

CO-độ phòng bằng máy đo quang phổ UV2101PC, Shimadzu, Kyoto, Japan

2.2.2.3 Xác định phổ hấp thụ phân tử UV-Vis và phương pháp xác định nồng độ cytochrome P450

Enzyme tinh sạch được đo trên máy quang phổ Shimadzu Photometer (UV2101PC, Kyoto, Japan) ở bước sóng từ 200-700 nm nhằm xác định phổ hấp thụ phân tử UV-Vis

Nồng độ cytochrome P450 được xác định dựa theo phương pháp của Omura và Sato [59] Cytochrome P450 hấp thụ cực đại ở bước sóng 450 nm khi chúng bị khử thành phức hợp Fe-CO Nồng độ P450 được tính theo công thức:

C(P450) =

C(P450): nồng độ cytochrome P450 [mM]

A450-A490: Hiệu số độ hấp thụ ở 2 bước sóng 450 nm 490 nm

ε: Độ hấp thụ phân tử (molar extinction coefficient) [91 mM-1×cm-1]

d: Đường kính hoặc chiều dài của cuvette [cm]

2.2.2.4 Xác định pH tối ưu và nhiệt độ tối ưu của P450-T2 tái tổ hợp

Enzyme tái tổ hợp tinh sạch được hoà trong đệm 50 mM Kpi với dải pH từ 2-9 trong 15 phút Ly tâm 12.000 vòng/phút thu dịch trong Xác định hoạt tính của enzyme theo phương pháp của Omura và Saito để xác định giá trị pH cho nồng độ P450 cao nhất

Enzyme tiếp tục được hoà trong đệm 50 mM Kpi ở pH tối ưu và ủ ở các nhiệt

độ 40, 50, 60 và 70oC trong 15 phút Ly tâm 12.000 vòng/phút thu dịch trong Xác định hoạt tính của enzyme theo phương pháp của Omura và Saito để xác định giá trị nhiệt độ cho nồng độ P450 cao nhất

2.2.2.5 Xác định độ bền nhiệt của P450-T2 tái tổ hợp

Thông số phản ánh độ bền nhiệt của enzyme là thời gian bán rã của protein (T50) Giá trị T50được xác định bằng cách ủ protein tinh sạch tại các nhiệt độ 40oC,

50oC và 60oC đồng thời xác định hoạt tính enzyme còn lại sau mỗi khoảng thời gian

15 phút

Đường cong biến tính của enzyme được xác định thông qua đặc điểm của vùng hấp thụ tia UV xa (far UV) sử dụng hệ thống quang phổ lưỡng sắc tròn (Circular dichroism - CD)JASCO J-715 Enzyme tinh sạch được hoà trong đệm 10 mM Kpi pH 7,4 đến nồng độ cuối cùng là 2 µM Phổ hấp thụ được đo trong vùng UV xa từ bước sóng 190 đến 260 nm Mỗi lượt đo cách nhau 1 phút với tốc độ 0,5s/nm và chiều rộng của băng 5 nm Mỗi phổ hấp thụ được tiến hành đo độc lập 3 lần Đường cong biểu diễn nhiệt độ nóng chảy của enzyme được xây dựng trên giá trị CD của bước sóng 211

nm từ giải nhiệt độ 30 đến 90oC, với sự gia tăng nhiệt độ 1oC/ phút Ở mỗi giá trị nhiệt

độ, enzyme lại được đưa về giá trị cân bằng 30 giây trước khi đo phổ CD Giá trị nhiệt

độ nóng chảy - Tm được xác định bằng phương trình bậc 2 của đường cong biến tính

(A450-A490) x hệ số pha loãng

 x d

2.2.2.6 Xác định các redox partner trong hệ thống truyền điện tử của P450-T2

Enzyme tái tổ hợp tinh sạch P450-T2 được trộn chung với các hệ ferredoxin reductase và ferredoxin khác nhau, bao gồm: (i) hệ adrenodoxin reductase/ adrenodoxin rút gọn (4-108) của người; (ii) hệ ferredoxin reductase arh1/ ferredoxin etp1 của nấm men; (ii) hệ ferredoxin reductase BmCPR/ ferredoxin Fdx2 và (iii) hệ

ferredoxin reductase BmCPR/ ferredoxin Fdx3 từ Bacillus megaterium[61].Tính tương

thích được xác định dựa trên khả năng truyền electron (tính khử) từ NADPH đến ferredoxin reductase, tiếp đến ferredoxin và cuối cùng là đến P450 Các hệ redox partner tương thích sẽ khử P450 và hình thành nên phức Fe-CO và có peak hấp phụ tối

đa ở bước sóng 450 nm

Phản ứng được thực hiện trong đệm HEPES pH 7,2 với tỷ lệP450:Fdx:FdR là 1:20:3 (M) Bổ sung 1mM NADPH, trộn đều và chia vào hai cuvette thạch anh CV10Q700 (Thorlabs) Sau thời gian 1 phút, một cuvette được sục bão hòa CO Đo mức độ hấp thụ của mẫu từ bước sóng 400-500 nm bằng máy quang phố Shimadzu Photometer (UV2101PC, Kyoto, Japan) Ở mẫu đối chứng dương, sự khử được thực hiện bằng sodium dithionite, mẫu đối chứng âm thay P450 bằng nước

2.2.2.7 Xác định các phổ cơ chất tiềm năng của P450-T2

Một số hợp chất bao gồm: Caffeic acid, L-Mimosine, Piceatamol, L-Resveratro, Butein, Emodin, Luteolin, Morine, Isoscopoletine, Nalixic acid, Scopoletin là những hợp chất tự nhiên nằm trong thư viện chất của Khoa Hóa sinh, Trường Đại học Tổng hợp Saarland, CHLB Đức Các hợp chất này được lựa chọn để thử nghiệm xác định phổ cơ chất tiềm năng của P450-T2 Cơ chất tiềm năng của P450-T2 được đánh giá

dựa trên sự thay đổi phổ hấp thụ cực đại UV-Vis của P450 từ dạng low-spin (hâp thụ

cực đại ở 415-417 nm) khi không có mặt cơ chất chuyển thành dạng high spin (hâp thụ cực đại ở 390-394 nm) khi có mặt cơ chất Phản ứng được thực hiện trong cuvette thạch anh CV10Q700 (Thorlabs) chứa đệm HEPES pH 7,2 với tỷ lệ cơ chất:enzyme là 20:1 Cuvette đối chứng là cuvette không chứa enzyme Đo mức độ hấp thụ của mẫu

từ bước sóng 200-700 nm bằng máy quang phố Shimadzu Photometer (UV2101PC, Kyoto, Japan)

2.2.3 Các phương pháp tin sinh học

DNA metagenome của khu hệ vi sinh vật ở suối nước nóng Bình Châu được giải trình tự bằng thiết bị giải trình tự thế hệ mới Illumina Dữ liệu giải trình tự được lưu ở định dạng fastq Chất lượng đọc trình tự được đánh giá bằng phần mềm FastQC Quá trình tiền xử lý dữ liệu nhằm loại bỏ trình tự chất lượng kém được thực hiện bằng công cụ Trimmomatic [62] Ngày nay, các thiết bị đọc trình tự mới chỉ đọc được các ngắn khoảng từ 100 đến 1000 bp, nên các DNA cũng bị chia thành nhiều đoạn nhỏ khi đọc trình tự Do đó, để tiến hành phân tích, trước tiên các đoạn trình tự cần được lắp ráp thành contig Quy trình lắp ráp và phân tích dữ liệu được trình bày như hình 2.3

Dữ liệu DNA metagenome của khu hệ vi sinh vật ở suối nước nóng Bình Châu được lắp ráp để tạo thành contigs bằng phần mềm SOAPdenovo2 [63] với các thông số mặc định Công cụ Bowtie2 [64] được sử dụng nhằm gióng hàng các đoạn đọc ngắn với những contig được lắp ráp, qua đó những đoạn trình tự lỗi được loại bỏ Kết quả lắp ráp được đánh giá bằng phần mềm QUAST [65] Sau khi lắp ráp, chỉ những contig có

độ dài lớn hơn 500 bp được sử dụng cho các bước phân tích tiếp theo

Hình 2.1: Quy trình lắp ráp và xử lý số liệu

MetaGeneMark v2.10 [66] được sử dụng để dự đoán khung đọc mở (ORFs) dựa trên kết quả lắp ráp Tất các khung đọc mở sau đó được so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI [67] bằng công cụ Blast++ nhằm tìm ra trình tự protein có mức độ tương đồng cao nhất, qua đó dự đoán chức năng của các protein và sàng lọc ORF mã hóa cytochrome P450 Tất các gen tiềm năng mã hóa cytochrome P450 được đối chiếu với

cơ sở dữ liệu cytochrome P450 của vi khuẩn [2] Công cụ Tm Index [68] được sử dụng

để dự đoán nhiệt độ mà tại đó 50% cấu trúc một protein bị duỗi xoắn, qua đó loại bỏ những gen mã hóa cytochrome P450 không bền nhiệt

Gen mã hóa cytochrome P450 được dịch mã sang axit amin bằng phần mềm ExPASy Trình tự axit amin của gen được phân lâp từ DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu và các cytochrome P450 tương đồng được sắp hàng bằng Clustal Omega[69] và thể hiện thành hình ảnh nhờ công cụ ESPript3 [70] Cây phả hệ giữa các cytochrome P450 được xây dựng bằng phần mềm MEGA7 [71]

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Suối nước nóng Bình Châu thuộc xã Bưng Riềng, huyện Xuyên Mộc, tỉnh Bà Rịa là có hơn 70 điểm phun nước lộ thiên, chảy len lỏi qua rừng tràm, nằm trong khu rừng cấm nguyên sinh của quốc gia có diện tích khoảng 7 ha Các kết quả nghiên cứu địa chất cho thấy suối nước nóng Bình Châu là quá trình hậu của núi lửa, khi núi lửa ngừng phun, các lò mắc ma vẫn tiếp tục đưa hơi nóng, khí và khoáng chất lên trên mặt đất tạo thành một dòng suối nóng Những thân cây chết và lá tràm rụng xuống suối đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa vật chất của vùng này Suối nước nóng có nhiệt độ ở gần miệng giếng phun là 82-84oC, pH 7,5 – 7,7 Suối nước nóng Bình Châu đã được một nhà khoa học người Pháp phát hiện từ những năm đầu của thế

kỷ XX, tuy nhiên do những thăng trầm của lịch sử, mãi đến những năm cuối của thế

kỷ trước, các nhà khoa học nước ta và quốc tế mới có những nghiên cứu đánh giá bổ sung về nguồn suối khoáng nóng này với mục tiêu phục vụ sức khỏe con người

Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện tại địa phận của Công ty cổ phần du lịch Sài Gòn – Bình Châu với quy mô 33 ha nằm giữa rừng tràm với những vị trí khu trú các điểm sôi chính Vị trí lấy mẫu có tọa độ 10o36‟03.9” Bắc và 107o33‟30.0” Đông Tại nơi này, các điểm sôi tập trung đã được quy hoạch lại thành các giếng luộc trứng ngoài trời Chỉ tiêu hoá lý của mẫu nước thu nhận từ suối nước nóng Bình Châu

được trình bày tại phụ lục 1

Hình 3.1:Vị trí các điểm sôi của suối nước nóng Bình Châu được lựa

chọn để lấy mẫu

3.1 Tách chiết DNA metagenome từ mẫu suối nước nóng Bình Châu

Quá trình tách chiết DNA metagenome được thực hiện theo hướng dẫn sử dụng kit PowerWater® DNA Isolation(MO BIO) Kết quả tách chiết DNA metagenome của mẫu nước suối nước nóng Bình Châu được thể hiện trong ảnh điện di

ở hình 3.2 cho thấy DNA metagenome của mẫu nước suối nước nóng Bình Châu có chất lượng tốt, DNA không bị đứt gãy Nồng độ của mẫu được đo bằng máy quang phổ Nano Drop 1000 đạt 139,3 ng/µl, A260:A280 đạt 1,84 đủ điều kiện để giải trình tự

Hình 3.2:DNA metagenome của mẫu nước suối nước nóng Bình Châu (Giếng

1) M: thang DNA chuẩn 1kb

3.2 Giải trình tự DNA metagenome bằng thiết bị HiSeq Illumina

DNA metagenome của suối nước nóng Bình Châu được gửi đi giải trình tự tại Công ty BGI (Hongkong)

3.3 Xây dựng cơ sở dữ liệumetagenome suối nước nóng Bình Châu các gen mã hóa cytochrome P450 bằng các công cụ tin sinh học

3.3.1 Giải trình tự và tiền xử lý dữ liệu

Kết quả giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu ở công ty BGI (Hongkong) thu được 10.2 Gb dữ liệu thô Phân tích bằng phần mềm FastQC cho thấy có 0.04% dữ liệu không xác định được là A,T,G hay C; 0,41% là trình tự mồi đọc trình tự, 6,97% dữ liệu có chất lượng kém (Q<20) (Hình 3.3)

Hình 3.3:Thành phần các đoạn đọc thô trong mẫu đọc trình tự DNA

metagenome của suối nước nóng Bình Châu

Sử dụng phần mềm Trimmomatic nhằm loại bỏ trình tự chất lượng kém, kết quả thu được 93.999.534 đoạn trình tự (9,4 Gb dữ liệu) chất lượng cao, phần lớn trình tự

có điểm chất lượng Q > 30 (Hình 3.4)

92.58%

0.41% 6.97% 0.04%

Trình tự chất lượng tốt Adapter

Trình tự chất lượng thấp

Hình 3.4:Chất lượng dữ liệu sau khi tiền xử lý bằng Trimmomatic

3.3.2 Lắp ráp de novo metagenome

Ngày nay, các thiết bị đọc trình tự mới chỉ đọc được các đoạn ngắn khoảng từ

100 đến 1000 bp, nên các DNA cũng bị chia thành nhiều đoạn nhỏ khi đọc trình tự Do

đó, để tiến hành phân tích, trước tiên các đoạn trình tự cần được lắp ráp thành contig

Dữ liệu DNA metagenome của khu hệ vi sinh vật ở suối nước nóng Bình Châu được lắp ráp để tạo thành contigs bằng phần mềm SOAPdenovo2 và đánh giá chất lượng lắp ráp bằng công cụ Quast (Quality Assessment Tool for Genome Assemblies) SOAPdenovo2 lắp ráp 61.212.496 đoạn trình tự tạo ra 51.346 contigs có độ dài trên

500 bp, trong đó contig dài nhất là 1.767.609 bp (Bảng 3.1) Phân bố độ dài của các contig được thể hiện trong Hình 3.5 cho thấy các contig có độ dài từ 500-999 bp có tỷ

lệ cao nhất, chiếm 42,9%, tiếp sau là các contig có độ dài từ 1000-1499 bp có tỷ lệ 17,8%

Bảng 3.1:Kết quả lắp ráp de novo metagenome suối nước nóng Bình Châu

Hình 3.5: Phân bố độ dài contig sau khi lắp rápbằng phần mềm SOAPdenovo2 3.3.3 Dự đoán gen và xây dựng cơ sở dữ liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu cụm gen mã hoá cytochrome P450

Sử dụng chức năng dự đoán ORF dành cho dữ liệu metagenomic của phần mềm MetaGeneMark v2.10 với 51.346 contig thu được 156.093 khung đọc mở tiềm năng Phân bố độ dài của các khung đọc mở được thể hiện trong hình 3.6 cho thấy các đoạn gen có độ dài từ 500-999 bp có tỉ lệ 47,2%, tiếp theo là các đoạn gen có chiều dài 1000-1499 bp và chiều dài từ 1500-1999 bp có tỷ lệ lần lượt là 20,4% và 6,9%

Hình 3.6:Phân bố độ dài các gen được dự đoán từ cơ sở dữ liệu DNA

metagenome suối nước nóng Bình Châu

Tất các khung đọc mở sau đó được so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI [67] bằng công cụ Blast++ nhằm tìm ra trình tự protein có mức độ tương đồng cao nhất, qua đó dự đoán chức năng của các protein và sàng lọc ORF mã hóa cytochrome P450

Có tất cả 106.903 khung đọc mở tiềm năng đã được chú giải, trong đó có 68 gen tiềm năng mã hóa cytochrome P450 bao gồm 38 gen hoàn chỉnh, 14 gen thiếu mã mở đầu, 9 gen thiếu mã kết thúc và 7 gen thiếu cả hai đầu (Bảng 3.2)

Bảng 3.2: Cơ sở dữ liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu cụm gen mã

- Nhóm 1 bao gồm 15 enzyme tham gia chuyển hóa Terpenoid và Polyketides hoặc tham gia vào quá trình phân hủy Limonene và pinene với mức độ tương đồng protein với các cytochrome P450 đã công bố từ 41-81%

- Nhóm 2 bao gồm 2 enzyme tham gia chuyển hóa lipid và các chất béo với mức độ tương đồng lần lượt là 42 và 61%

- Nhóm 3 bao gồm 1 protein có độ tương đồng 61% với cytochrome P450 của người (CYP4V)

- Nhóm 4 bao gồm 20 cytochrome P450 chưa rõ chức năng có mức độ tương đồng protein với các cytochrome P450 đã công bố từ 28-100%

Hình 3.7: Số lượng các cytochrome P450 trong cơ sở dữ liệu metagenome suối

nước nóng Bình Châu được chia thành 4 nhóm: Nhóm 1 - enzyme tham gia chuyển hóa Terpenoid và Polyketides hoặc tham gia vào quá trình phân hủy Limonene và pinene; Nhóm 2 - enzyme tham gia chuyển hóa lipid và các chất béo; Nhóm 3- enzyme tương đồng với CYP4V; Nhóm 4- nhóm chưa rõ chức năng

3.3.4 Dự đoán nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các P450 tiềm năng trong cơ sở dữ liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu

Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của một protein là giá trị nhiệt độ mà tại đó 50% cấu trúc protein đó bị duỗi xoắn [72] Protein của cả sinh vật ưa nhiệt cao và sinh vật ưa

ấm đều được cấu tạo từ cùng 20 axit amin như nhau, tuy nhiên khả năng chịu nhiệt của protein là đặc tính vốn có của axit amin cấu tạo nên protein đó Tm của 38 ORF hoàn chỉnh mã hóa cho các cytochrome P450 tiềm năng được dự đoán trực tiếp từ trình tự protein của gen đó thông qua phần mềm Tm Index[68] Kết quả cho thấy có 13 đoạn ORF (34,21%) được dự đoán có Tmcủa protein cao hơn 65oC, 23 ORF (60,53%) mã hoá cho các protein có Tm nằm trong khoảng từ 55oC đến 65oC và 2 ORF (5,26%) mã hoá cho các protein cóTm thấp hơn 55oC (Hình 3.8)

0 5 10 15 20 25